JP6893000B2 - 酸性ホスファターゼ突然変異体及びニコチンアミドリボシドの調製方法 - Google Patents
酸性ホスファターゼ突然変異体及びニコチンアミドリボシドの調製方法 Download PDFInfo
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Description
(a)アミノ酸配列がSEQ ID NO:3に示されるタンパク質、
(b)SEQ ID NO:3に示されるアミノ酸配列において1つ又は複数のアミノ酸が置換、欠失又は追加され、且つニコチンアミドモノヌクレオチドを基質とし、アミノ酸配列がSEQ ID NO:2に示される酸性ホスファターゼ親よりも高い触媒活性を有し、(a)から誘導されるタンパク質、又は、
(c)与(a)又は(b)において限定されたタンパク質のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し且つニコチンアミドモノヌクレオチドを基質とし、アミノ酸配列がSEQ ID NO:2に示される酸性ホスファターゼ親よりも高い触媒活性を有するタンパク質である。
(a)アミノ酸配列がSEQ ID NO:3に示されるタンパク質、
(b)SEQ ID NO:3に示されるアミノ酸配列において1つ又は複数のアミノ酸が置換、欠失又は追加され、且つニコチンアミドモノヌクレオチドを基質とし、アミノ酸配列がSEQ ID NO:2に示される酸性ホスファターゼ親よりも高い触媒活性を有し、(a)から誘導されるタンパク質、又は、
(c)(a)又は(b)において限定されたタンパク質のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し且つニコチンアミドモノヌクレオチドを基質とし、アミノ酸配列がSEQ ID NO:2に示される酸性ホスファターゼ親よりも高い触媒活性を有するタンパク質。
PCR技術により酸性ホスファターゼ親の遺伝子配列を増幅し、次に、増幅産物を発現ベクターに挿入して、組換えプラスミドを得て、シーケンシングにより確認した後、組換えプラスミドを宿主細胞に形質転換して培養及び発現誘導を行い、発現終了後、細胞を収集して細胞破壊処理を行い、上澄み液を収集して酸性ホスファターゼ親の粗酵素液を得ることを含む、酸性ホスファターゼ親を調製するステップ1)と、
逆PCR技術により突然変異部位のプライマー配列を設計し、設計したプライマーを用いて、ステップ1)の組換えプラスミドをテンプレートとして逆PCR増幅を行い、次に、増幅産物をDpn I酵素消化テンプレートで処理した後、宿主細胞に形質転換して培養及び発現誘導を行い、発現終了後、細胞を収集して細胞破壊処理を行い、上澄み液を収集して酸性ホスファターゼ突然変異体の粗酵素液を得ることを含む、酸性ホスファターゼ突然変異体を調製するステップ2)と、
アガロースゲルをニッケル担体として、塩化ニッケル溶液をニッケルに塗布して、1×PBS+10mMイミダゾール溶液を用いてニッケルカラムを平衡化する、ニッケルカラムを製造するステップa)と、酸性ホスファターゼ親及び/又は突然変異体の粗酵素液とニッケルフィラーを均一に混合した後、氷浴において1−2hインキュベートし、次に、インキュベートした混合物をステップa)で製造されたニッケルカラムに注入する、サンプル注入のステップb)と、まず、1×PBS+10mMイミダゾール溶液を用いて一回目の溶出を行い、次に、1×PBS+(200−500)mMイミダゾール溶液を用いて二回目の溶出を行い、溶出液を収集して酸性ホスファターゼ親及び/又は突然変異体の精製酵素液を得る、溶出ステップc)とを含む、ニッケルカラムを用いて酸性ホスファターゼ親及び/又は突然変異体の粗酵素液を精製するステップ3)と、
ステップ3)で得られた精製後の酵素液に0.2−0.8M K2HPO4を加えて、pH値を7.5−9.5に調整し、次に固相樹脂を加えて、室温で12−24h撹拌し、濾液をろ過除去して、酸性ホスファターゼ固定化酵素を得ることを含む、固相樹脂で固定化するステップ4)と、を含む。
酸性ホスファターゼ親に比べて、本発明による酸性ホスファターゼ突然変異体は、酵素活性、温度安定性及びpH安定性のいずれも著しく向上する。本発明によるニコチンアミドリボシドの調製方法では、基質であるニコチンアミドモノヌクレオチドの転化率が99%と高く、調製されたニコチンアミドリボシドの純度が99%以上に達する。
<酸性ホスファターゼ親の調製>
図1に示すように、プライマー対として5′−GGAATTCCATATGATGACCATTGCGAAGGATTACCGT−3′、及び5′−CCGGAATTCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGT−3′を用いて、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)由来のSEQ ID NO:1に示される酸性ホスファターゼ遺伝子NS−3(そのアミノ酸配列は、SEQ ID NO:2に示される)をPCR増幅技術により増幅し、得たPCR増幅産物を酵素切断断すると同時に、発現ベクターpET22b(+)のNdeI及びEcoR I部位に挿入し、組換えプラスミドpET22b−NS3を得た。シーケンシングにより確認した後、組換えプラスミドを大腸菌Rosetta(de3)に形質転化した。得た組換え大腸菌を小体積のLB培地(100μg/mLのAmpを含有する)に接種して、30〜37℃で一晩培養した後、1〜5%の接種量で一定の体積のLB培地(100μg/mLのAmpを含有する)に移し、30〜37℃でOD600が0.6〜1.0となるまで培養し続け、最終濃度0.1mM〜1mMのイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)を加え、20〜37℃で発現誘導を10〜20h行った後、菌体を遠心分離により収集した。
<酸性ホスファターゼ突然変異体の調製>
突然変異部位:K44C、K115F、K115I、D206I、S240E、K115I/S240E、K115F/K44C/D206I、K115I/S240E/D206Iを設計し、表1に示される突然変異プライマー配列を用いて、実施例1で構築された組換えプラスミドpET22b−NS3をテンプレートとして逆PCRを行い、PCR系及びPCRプログラムは、以下のとおりである。
PCR系:
PrimeSTAR(登録商標) GXL DNA Polymerase 0.5ul
5×PrimeSTAR GXL Buffer(MG2+ plus)*2 10ul
テンプレートプラスミド 1ul
dNTP(2.5mM each) 4ul
突然変異プライマー1 1ul
突然変異プライマー2 1ul
滅菌水 up to 50ul
PCRプログラム:
98℃ 3min
98℃ 10s
30× 50-65℃ 15s
72℃ 7min
30回サイクル
72℃ 10min
PCR産物をゲル回収キッドで精製した後、Dpn Iで酵素切断を行い、酵素切断後、産物を大腸菌DH5αに形質転化し、Amp平板のスクリーニングをした後、菌落を選択してシーケンシングに供し、K44C、K115F、K115I、D206I、S240E、K115I/S240E、K115F/K44C/D206I、K115I/S240E/D206I部位での突然変異が成功した突然変異組換えプラスミド形質転化大腸菌Rosetta(de3)が得られたことを確認した。得られた突然変異体組換え大腸菌を小体積のLB培地(100μg/mLのAmpを含有する)に接種して、30〜37℃で一晩培養した後、1〜5%の接種量で一定の体積のLB培地(100μg/mLのAmpを含有する)に移し、30〜37℃でOD600が0.6〜1.0となるまで培養し続け、最終濃度0.1mM〜1mMのイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)を加えて、20〜37℃で発現誘導を10〜20h行った後、菌体を遠心分離により収集した。
<酸性ホスファターゼ粗酵素液の調製>
発酵して収集した菌体を、その質量に対して4倍の1×PBS+10mMイミダゾール溶液で再懸濁させた後、高圧ホモジナイザーで菌体を破砕し、均質化終了後、撹拌しながら全体積0.5−1%のポリエチレンイミン(PEI)を加えてpHを7.0−8.0に調整し、遠心分離により上層の透明酵素液を収集し、酵素液を0.45μLろ過膜でろ過し、濾液を収集して、酸性ホスファターゼの粗酵素液を得た。
<ニッケルカラムの調製>
a)カラムをきれいに洗浄した後、アガロースゲルをニッケル担体として、ニッケルフィラー(ml):菌体(g)=1:2の割合でアガロースゲルを準備し、ddH2O及び1×PBSを用いてそれぞれ5カラム体積でアガロースゲルを順次洗浄した。
b)0.2mol/L塩化ニッケル溶液を調製してニッケルに塗布し、ニッケルを十分に塗布するために、繰り返して塗布してもよい。
c)5カラム体積のddH2Oで未結合のNi2+を洗い落とし、次に、5−10カラム体積の1×PBS+10mMイミダゾール溶液(pH=8.0)を用いてニッケルカラムを平衡化した。
<サンプル注入及び溶出>
a)実施例3で得られた酸性ホスファターゼの粗酵素液とニッケルフィラーを均一に混合した後、三角フラスコに移して、回転数100rmのシェーカーにおいて氷浴により1−2hインキュベートした。
b)1×PBS+10mMイミダゾール溶液(pH=8.0)を用いて夾雑タンパク質を溶出し、次に、1×PBS+200mMイミダゾール溶液(pH=8.0)を用いて目標タンパク質を十分に溶出し、溶出液を収集して酸性ホスファターゼの精製酵素液を得た。
<酵素活性の比較実験>
酵素活性の測定方法:最終濃度200mMのKCl及び400mMのMgCl2を補因子として、200uLの反応系に最終濃度2mmolのNMNを加え、次に、希釈後の精製酵素液10uLを加え、空白対照では、精製酵素液の代わりに緩衝液を用い、37℃、pH7.0の条件で、均一に混合して10min反応させた直後、10%トリクロロ酢酸溶液200uLを加えて均一に混合し、反応を終了させ、サンプリングしてメタノールで50倍希釈した後、HPLCが産物を検出できるほどの量で注入し、酵素活性単位Uを計算した。
酸性ホスファターゼ酵素活性Uの定義:37℃、pH7.0の条件で、1分間内で基質NMNを加水分解して1umolを放出するために必要な酵素量であり、1つの酵素活性国際単位(U)と呼ばれる。
酸性ホスファターゼ親及び本発明の酸性ホスファターゼ突然変異体の酵素活性及びその安定性の比較実験の結果を表2に示し、そのうち、温度安定性及びpH安定性とは、目標酵素を対応する保存条件で12h保存した後の残留活性≧90%である保存範囲である。
<ニコチンアミドリボシドの調製>
全系2Lを設計して、基質の最終濃度を100g/Lに設定し、きれいな3L三口フラスコを準備し、ddH2O 1Lを加えて、次にKCl 30g及び無水MgCl2 80gを加え、撹拌して溶解させ、溶液の温度が室温になると、NMN 200gを加えて5M NaOHでpHを6−7に調整して、完全に溶解させた。反応温度を37℃に設定して、実施例5で得られた酸性ホスファターゼ突然変異体K115Iの精製酵素液900mlを加えて、2L系となるまでpH7.0のリン酸ナトリウム緩衝液を補充し、反応系をpH7.2に調整して、反応を開始させた。2h反応後、反応液を純水で50〜100倍希釈し、マイクロポーラスろ過をした後、高速液体クロマトグラフィーにより反応の結果を分析し、分析方法は、表3に示され、そのHPLCスペクトルは、図2に示された。検出結果から明らかなように、基質NMNは、明らかに分解しており、約42%の基質が分解し、残りのNMNがNRに転化する転化率は、99.9%であった。
全系2Lを設計して、基質の最終濃度を100g/Lに設定し、きれいな3L三口フラスコを準備し、ddH2O 1Lを加えて、次にKCl 30g及び無水MgCl2 80gを加え、撹拌して溶解させ、溶液の温度が室温になると、コンニャクグルコマンナン20gを加えて、次にNMN 200gを加えて5M NaOHでpHを6−7に調整して、完全に溶解させた。反応温度を37℃に設定して、実施例5で得られた酸性ホスファターゼ突然変異体K115Iの精製酵素液900mlを加えて、2L系となるまでpH7.0のリン酸ナトリウム緩衝液を補充し、反応系をpH7.2に調整して、反応を開始させた。2h反応後、反応液を純水で50〜100倍希釈し、マイクロポーラスろ過をした後、高速液体クロマトグラフィーにより反応の結果を分析し、分析方法は、表3に示され、そのHPLCスペクトルは、図3に示された。検出結果から明らかなように、基質NMNは、明らかなに分解しておらず、NMNがNRに転化する転化率は99.8%であった。
全系2Lを設計して、基質の最終濃度を100g/Lに設定し、きれいな3L三口フラスコを準備し、ddH2O 1Lを加えて、次にKCl 30g及び無水MgCl2 80gを加え、撹拌して溶解させ、溶液の温度が室温になると、コンニャクグルコマンナン20gを加えて、次にNMN 200gを加えて5M NaOHでpHを6−7に調整して、完全に溶解させた。反応温度を37℃に設定して、実施例5で得られた酸性ホスファターゼ親の精製酵素液900mlを加えて、2L系となるまでpH7.0のリン酸ナトリウム緩衝液を補充し、反応系をpH7.2に調整して、反応を開始させた。2h反応後、反応液を純水で50〜100倍希釈し、マイクロポーラスろ過をした後、高速液体クロマトグラフィーにより反応の結果を分析し、分析方法は、表3に示され、そのHPLCスペクトルは、図4に示された。検出結果から明らかなように、基質NMNは、明らかなに分解しておらず、NMNがNRに転化する転化率は、72.5%であった。
ニコチンアミドリボシドを調製する触媒が完全に反応した後、200−400メッシュの濾布で酵素反応液をろ過して、それにおける酸性ホスファターゼを除去し、得られた濾液に2−6M塩酸を加えてPHを約5.0に調整し、さらに、0.45μmのマイクロポーラスろ過膜で精密ろ過し、精密ろ過液を収集し、表4に示された制御条件の分取液相で精密ろ過液を精製し、NR画分の溶出液を収集すると、ニコチンアミドリボシド純度が99%より大きい水溶液を得て、次に、得られた純度が99%より大きいニコチンアミドリボシド水溶液を25℃以下の温度でナノろ過して濃縮させ、ニコチンアミドリボシドの濃度を50−60g/Lに向上させ、次に、塩酸を加えてPHを3−4に調整し、濃度90g/Lでニコチンアミドリボシド水溶液にコンニャクグルコマンナンを加えて、十分に溶解して均一に撹拌し、凍結乾燥装置において昇華温度を25℃以下に制御しながら乾燥させ、24時間後、純度99%以上の白色粉末状のニコチンアミドリボシド精製品を得た。上記実施例7、8、9の酵素反応液を分離精製して得たニコチンアミドリボシド精製品の収量及び純度を表5に示した。
Claims (9)
- 酸性ホスファターゼ突然変異体であって、
SEQ ID NO:2に示される酸性ホスファターゼ親のアミノ酸配列と比較して、K115I、S240E、K115I/S240E、K115F/K44C/D206I又はK115I/S240E/D206Iの突然変異を有し、且つニコチンアミドモノヌクレオチドを基質とし、アミノ酸配列がSEQ ID NO:2に示される酸性ホスファターゼ親よりも高い触媒活性を有するタンパク質であることを特徴とする酸性ホスファターゼ突然変異体。 - ニコチンアミドリボシドの調製方法であって、
KCl及び無水MgCl2が存在する条件で、酸性ホスファターゼ突然変異体を用いてニコチンアミドモノヌクレオチドを触媒してニコチンアミドリボシドに転化することを含み、前記酸性ホスファターゼ突然変異体は、SEQ ID NO:2に示される酸性ホスファターゼ親のアミノ酸配列と比較して、K115I、S240E、K115I/S240E、K115F/K44C/D206I又はK115I/S240E/D206Iの突然変異を有し、且つニコチンアミドモノヌクレオチドを基質とし、アミノ酸配列がSEQ ID NO:2に示される酸性ホスファターゼ親よりも高い触媒活性を有するタンパク質であることを特徴とするニコチンアミドリボシドの調製方法。 - KCl及び無水MgCl2を水に溶解して、KClとMgCl2の混合溶液を得るステップ1)と、
室温に冷却するステップ2)と、
KClとMgCl2の混合溶液にニコチンアミドモノヌクレオチドを加えて溶解し、pH値を6−7に調整するステップ3)と、
前記酸性ホスファターゼ突然変異体を加えて、pH値を6.8−7.3に調整するステップ4)と、
37±5℃で少なくとも1.5時間反応させるステップ5)とを順次含むことを特徴とする請求項2に記載のニコチンアミドリボシドの調製方法。 - 前記酸性ホスファターゼ突然変異体でニコチンアミドモノヌクレオチドを触媒してニコチンアミドリボシドに転化する酵素反応が開始する前に、反応系にコンニャクグルコマンナン及び/又はレバウディオサイドAを加えることをさらに含むことを特徴とする請求項2又は3に記載のニコチンアミドリボシドの調製方法。
- 前記酸性ホスファターゼ突然変異体は、純粋な酵素液の形態で投入され、
前記純粋な酵素液とは、前記酸性ホスファターゼ突然変異体遺伝子を含有する微生物について発現を誘導した後、細胞を破壊し、沈殿を遠心去除した粗酵素液をニッケルカラムで精製処理して得た前記酸性ホスファターゼ含有溶液であることを特徴とする請求項2又は3に記載のニコチンアミドリボシドの調製方法。 - 前記酸性ホスファターゼ突然変異体は、固定化酵素であり、
前記固定化酵素は、前記酸性ホスファターゼ突然変異体に0.2−0.8M K2HPO4を加えて、pH値を7.5−9.5に調整し、次に固相樹脂を加えて室温で12−24h撹拌し、ろ過により濾液を除去する方法により調製されることを特徴とする請求項2又は3に記載のニコチンアミドリボシドの調製方法。 - 前記酸性ホスファターゼ突然変異体でニコチンアミドモノヌクレオチドを触媒してニコチンアミドリボシドに転化する酵素反応液からニコチンアミドリボシド精製品を精製する後処理をさらに含み、
前記後処理には、
酵素反応液をろ過して、濾液を収集するステップ1)と、
濾液のpH値を5.0±0.5に調整するステップ2)と、
ステップ2)でpHが調整された濾液を精密ろ過して、濾液を収集するステップ3)と、
ステップ3)で精密ろ過して得た精密ろ過液を、ポリスチレンを分取カラムのフィラー、エタノール及び水を移動相として勾配溶出を行い、目標ピークの溶出液を収集する分取液相で精製するステップ4)と、
ステップ4)で収集した溶出液を凍結乾燥させて、ニコチンアミドリボシド精製品を得るステップ5)とを含むことを特徴とする請求項2又は3に記載のニコチンアミドリボシドの調製方法。 - 請求項1に記載の酸性ホスファターゼ突然変異体およびその親を含む酸性ホスファターゼ固定化酵素の調製方法であって、
PCR技術により酸性ホスファターゼ親の遺伝子配列を増幅し、次に、増幅産物を発現ベクターに挿入して、組換えプラスミドを得て、シーケンシングにより確認した後、組換えプラスミドを宿主細胞に形質転換して培養及び発現誘導を行い、発現終了後、細胞を収集して細胞破壊処理を行い、上澄み液を収集して酸性ホスファターゼ親の粗酵素液を得ることを含む、酸性ホスファターゼ親を調製するステップ1)と、
逆PCR技術により突然変異部位のプライマー配列を設計し、設計したプライマーを用いて、ステップ1)の組換えプラスミドをテンプレートとして逆PCR増幅を行い、次に、増幅産物をDpn I酵素消化テンプレートで処理した後、宿主細胞に形質転換して培養及び発現誘導を行い、発現終了後、細胞を収集して細胞破壊処理を行い、上澄み液を収集して酸性ホスファターゼ突然変異体の粗酵素液を得ることを含む、酸性ホスファターゼ突然変異体を調製するステップ2)と、
アガロースゲルをニッケル担体として、塩化ニッケル溶液をニッケルに塗布して、1×PBS+10mMイミダゾール溶液を用いてニッケルカラムを平衡化する、ニッケルカラムを製造するステップa)と、酸性ホスファターゼ親及び/又は突然変異体の粗酵素液とニッケルフィラーを均一に混合した後、氷浴において1−2hインキュベートし、次に、インキュベートした混合物をステップa)で製造されたニッケルカラムに注入する、サンプル注入のステップb)と、まず、1×PBS+10mMイミダゾール溶液を用いて一回目の溶出を行い、次に、1×PBS+(200−500)mMイミダゾール溶液を用いて二回目の溶出を行い、溶出液を収集して酸性ホスファターゼ親及び/又は突然変異体の精製酵素液を得る、溶出ステップc)とを含む、ニッケルカラムを用いて酸性ホスファターゼ親及び/又は突然変異体の粗酵素液を精製するステップ3)と、
ステップ3)で得られた精製後の酵素液に0.2−0.8M K2HPO4を加えて、pH値を7.5−9.5に調整し、次に固相樹脂を加えて、室温で12−24h撹拌し、濾液をろ過除去して、酸性ホスファターゼ固定化酵素を得ることを含む、固相樹脂で固定化するステップ4)と、を含むことを特徴とする方法。 - 組換えベクター、組換え細胞又は組換え微生物を含む生物材料であって、
請求項1に記載の酸性ホスファターゼ突然変異体をコードする遺伝子を含有することを特徴とする生物材料。
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