CN117362400A - 一种鱼类病毒病防治的共表位疫苗及其制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，公开了一种鱼类病毒病防治的共表位疫苗及其制备与应用。本发明通过免疫信息学分析，筛选出大口黑鲈弹状病毒和乌鳢水泡病毒的共表位抗原G₄₀₅，进一步构建能够表达共表位抗原G₄₀₅的重组表达载体，并在大肠杆菌中成功表达，再以细菌纳米纤维素作为递送介质，构建共表位疫苗。本发明提供的共表位疫苗能够显著提升大口黑鲈和乌鳢血清中的抗体水平，并在大口黑鲈感染大口黑鲈弹状病毒或乌鳢感染乌鳢水泡病毒后提供良好的保护作用，本发明为鱼类弹状病毒病的免疫防控提供重要参考。

Description

一种鱼类病毒病防治的共表位疫苗及其制备与应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种鱼类病毒病防治的共表位疫苗及其制备与应用。

背景技术

弹状病毒是一类能够引起鱼类和其他无脊椎动物发病致死的病原，其宿主范围广、毒株种类繁多、病毒毒力强。弹状病毒为单链RNA病毒，其基因组主要编码5种结构蛋白，分别为糖蛋白（Glycoprotein，G）、基质蛋白（Matrix protein，M或M2）、核蛋白（Nucleoprotein，N）、磷酸化蛋白（Phosphoprotein，P）以及RNA聚合酶（Lymerases，L）。研究表明，G蛋白位于病毒的表面，具有较强的免疫原性，并决定着病毒的血清学特征，因此G蛋白常用于疫苗的构建。在病毒的入侵过程中，位于病毒表面的G蛋白会和细胞上的受体相结合，使得病毒成功入侵宿主，弹状病毒的G蛋白在细胞内传递过程中会发生构象改变，介导病毒的核酸物质进入细胞质中。

大口黑鲈弹状病毒（Micropterus salmoides rhabdovirus，MSRV）和乌鳢水泡病毒（SHVV，snakehead vesiculovirus）均系弹状病毒科（Rhabdoviridae）病毒。其中，MSRV引起的大口黑鲈弹状病毒病死亡率可达到85%，尤其在水体温度达到25~28℃、溶氧和透明度降低、水质恶化时最易感染，进而造成大口黑鲈死亡。病鱼主要症状是烂身、烂鳍、停止摄食，濒死鱼在水面漫游，严重者体色发黑。解剖病鱼可见肝脏严重肿大、充血；脾脏肿大、充血；肾脏肿大等。SHVV是一种乌鳢病毒性病原，患病乌鳢主要表现为肝脏、脾脏肿大，表面有大小不等的出血点，鱼鳔严重出血等症状。

渔用疫苗被认为是防控水产病害的有效措施，但传统的疫苗大多数针对单一病原体，难以应对多种病毒的流行。因此，开发出对上述两种病毒甚至多种病毒具有免疫功能的疫苗是渔用疫苗的研究难点和重点，这对于鱼类养殖业具有重要的贡献意义。

发明内容

本发明通过免疫信息学分析筛选MSRV和SHVV的共表位抗原，并通过原核表达得到共表位蛋白G₄₀₅，采用细菌纳米纤维素（Bacterial nanocellulose，BNC）作为载体，通过化学连接等技术构建纳米载体亚单位疫苗，最后将制得的疫苗通过浸泡免疫接种大口黑鲈和乌鳢，评价疫苗的相对保护率。基于上述技术思路，本发明提供以下详细的技术方案。

本发明首先提供一种共表位重组蛋白G₄₀₅，所述共表位重组蛋白G₄₀₅是大口黑鲈弹状病毒和乌鳢水泡病毒的共表位重组蛋白；所述共表位重组蛋白G₄₀₅的氨基酸序列如SEQID No:1所示。

进一步，所述共表位重组蛋白由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列编码。

本发明还提供所述共表位重组蛋白G₄₀₅的制备方法，包括：

构建能够表达共表位重组蛋白G₄₀₅的重组表达载体；将所述重组表达载体转入大肠杆菌，得到重组大肠杆菌；IPTG诱导重组大肠杆菌表达共表位重组蛋白G₄₀₅；纯化出共表位重组蛋白G₄₀₅，冻干保存。

进一步，在上述制备方法中，共表位重组蛋白G₄₀₅的纯化方法为：将诱导表达后的菌液10000r/min室温离心收集菌体沉淀，将菌体沉淀用浓度为0.01mol/L、pH=7.2的PBS溶液重悬，每10mL PBS溶液重悬1g湿润菌体，重悬后的菌液连续冻融3次，在冰浴条件下超声波破碎，对破碎后的菌液于4℃、12000r/min离心收集菌液沉淀，将所述菌液沉淀用8M尿素溶液溶解获得重组蛋白溶液，之后将重组蛋白溶液用截留分子量为10000的透析袋分别在6M、4M、2M尿素溶液中透析12h，在清水中透析24h，每4h更换一次透析液，将透析完成的重组蛋白溶液进行冷冻干燥48h，得到纯化的共表位重组蛋白G₄₀₅粉末。

本发明还请求保护一种重组表达载体，所述重组表达载体含有能够表达所述共表位重组蛋白G₄₀₅的核苷酸序列。

本发明还请求保护一种重组菌，所述重组菌含有所述重组表达载体。

本发明还提供所述共表位重组蛋白在制备鱼类病毒病防治的共表位疫苗中的应用。

进一步，在上述应用中，所述病毒病包括大口黑鲈弹状病毒（MSRV）和乌鳢水泡病毒（SHVV）；所述共表位疫苗是由共表位重组蛋白G₄₀₅和细菌纳米纤维素载体制备而成。

本发明还提供所述共表位疫苗的制备方法，包括：

细菌纳米纤维素羧基化：取干重为4g的细菌纳米纤维素，放入搅拌机中混匀，加入蒸馏水至总体积300mL，依次加入2,2,6,6-四甲基哌啶-氮-氧化物64mg、溴化钠400mg和5mmol/L的次氯酸钠10mL，室温搅拌12h，期间控制pH在10.5，加入5mL无水乙醇终止反应，之后用蒸馏水将反应液抽滤至pH≤8，再用70%的浓硫酸与抽滤后的纤维素混合，50℃下加热搅拌2h，再加入蒸馏水500mL终止反应，制得200~300nm规格的羧基化纳米纤维素，透析并冷冻干燥得到羧基化细菌纳米纤维素；

制备羧基化细菌纳米纤维素混悬液：分别取羧基化细菌纳米纤维素100mg、1-乙基-3-（二甲胺丙基）碳二亚胺（EDAC）4mg、N-羟基丁二酰亚胺（NHS）6mg混合在pH值为6.0的吗啉乙磺酸缓冲液10mL中室温搅拌4h，之后加入1.4μL巯基乙醇终止反应。

重组蛋白重悬液制备：将共表位重组蛋白G₄₀₅粉末20mg重悬到pH=7.2的1mL磷酸盐缓冲液中。

羧基化细菌纳米纤维素混悬液与重组蛋白重悬液混合：将上述制备的羧基化细菌纳米纤维素混悬液与上述制备的重组蛋白重悬液按照体积比为1:1的比例混合，室温搅拌4h，制得成品疫苗。

本发明还请求保护一种鱼类病毒病防治的共表位疫苗，所述共表位疫苗使用上述方法制得。

与现有技术相比，本发明“一种鱼类病毒病防治的共表位疫苗及其制备与应用”具有以下有益效果：

本发明在生物信息学分析和免疫原性预测的基础上，筛选得到对MSRV和SHVV均具有良好免疫原性且一致性较高的重组蛋白G₄₀₅，通过原核表达获得共表位重组蛋白G₄₀₅，并用细菌纤维素（BNC）作为载体，成功制备MSRV和SHVV共表位疫苗。

本发明制备的共表位疫苗，浸泡免疫大口黑鲈后，能够显著提升大口黑鲈血清中的抗体水平，并在第4周达到最高；浸泡免疫乌鳢后，能够显著提升乌鳢血清中的抗体水平，并在第4周达到最高。

本发明提供的共表位疫苗，对大口黑鲈感染MSRV后的相对保护率为64.29%；对乌鳢感染SHVV后的相对保护率为86.67%，效果显著。

综上，本发明制备的共表位疫苗，能够显著提升大口黑鲈和乌鳢血清中的抗体水平，并在大口黑鲈感染MSRV或乌鳢感染SHVV后提供良好的保护作用。本发明为大口黑鲈或乌鳢病毒病防治疫苗的研究与应用奠定理论基础，对渔业可持续发展和水产品安全生产具有重要意义。

附图说明

图1是重组表达载体pET-28a-G₄₀₅鉴定结果。其中，M1泳道为DL 2000 Plus DNAMarker；1泳道为pET-28a-G₄₀₅重组质粒PCR后电泳分析结果；2泳道为pET-28a-G₄₀₅重组质粒单酶切分析结果；3泳道为pET32a-rSS重组质粒双酶切（EcoR I/Xho I）分析结果；M2泳道为DL 15000 DNA Marker。

图2为重组蛋白G₄₀₅的SDS-PAGE检测结果图。其中，M1泳道为蛋白Marker；1泳道为未经IPTG诱导的携带空载体BL21（pET-28a）的菌液；2泳道为经IPTG诱导的携带空载体BL21（pET-28a）的菌液；3泳道为未经IPTG诱导的携带重组载体BL21（pET-28a-G₄₀₅）的菌液；4泳道为IPTG诱导的携带重组载体BL21（pET-28a-G₄₀₅）的菌液；5泳道为IPTG诱导的携带重组载体BL21（pET-28a-G₄₀₅）的上清液；6泳道为经IPTG诱导的携带重组载体BL21（pET-28a-G₄₀₅）的沉淀。

图3是各组大口黑鲈经浸泡免疫的在不同时间的血清抗体水平检测结果图。不同字母表示差异显著（p<0.05）。

图4是各组乌鳢经浸泡免疫的在不同时间的血清抗体水平检测结果图。不同肩标字母表示差异显著（p<0.05）。

图5是各组大口黑鲈感染MSRV后的存活率。

图6是各组乌鳢感染SHVV后的存活率。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例提供了共表位蛋白G₄₀₅的分析筛选方法。

通过DNAman软件对MSRV-FJ985（MT818233.1）、MSRV-YH01（MK397811.2）MSRV-2021（OK272491.1）和SHVV-C1207（KC519324.1）四种病毒毒株G蛋白氨基酸序列进行多序列比对。结果表明四种病毒毒株G蛋白的序列一致性为95.45%，序列相似性较高。

通过ABCpred、BCPreds和CTLpred等工具对不同株型的MSRV和SHVV的B细胞和T细胞抗原表位进行预测，对预测生成的抗原表位进行比较，筛选得到共同抗原表位重叠度较高的片段G₄₀₅，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

通过C-ImmSim程序对氨基酸片段G₄₀₅进行计算机模拟免疫，结果显示其可以很好地介导体液免疫和细胞免疫以及先天性免疫应答，即选取片段G₄₀₅作为MSRV和SHVV的共表位蛋白。

实施例2

本实施例提供了重组表达载体的构建和共表位重组蛋白G₄₀₅的表达。

合成质粒pET-28a-G₄₀₅，所述质粒含有能够表达所述共表位重组蛋白G₄₀₅的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。将合成的质粒作为重组表达载体转入E.coliBL21（DE3）中，涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜，然后挑取单菌落进行菌落PCR。

将菌落PCR阳性的菌落接种至含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、180r/min培养12~16h。按Omega质粒提取试剂盒提取质粒，对其进行PCR和双酶切鉴定，其中PCR引物为：

G₄₀₅-F：GAATTCATGAAAAAAACTTTA；

G₄₀₅-R：CTCGAGGCAGTTATCTTCTGG。

取PCR和双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳条件：120V电压、30min，结果如图1所示。图1中的M1泳道为DL 2000 Plus DNA Marker；1泳道为重组表达载体pET-28a-G₄₀₅电泳结果；2泳道为重组表达载体pET-28a-G₄₀₅单酶切电泳结果；3泳道为重组表达载体pET-28a-G₄₀₅双酶切（EcoR I/Xho I）电泳结果；M2泳道为DL 15000 DNA Marker。如图1所示，PCR结果显示在250bp~500bp处有一条清晰的条带，与预期结果相符（417bp），证明目的条带扩增成功；质粒单酶切（Xho I）结果显示在5000bp~8000bp处有一条清晰条带，对应质粒酶切成线性时的大小（约5800bp）；质粒双酶切（Xho I/EcoR I）结果显示在250bp~500 bp和5000bp~8000bp处各有一条清晰条带，分别对应目的条带（417bp）和pET-28a空载体（约5300bp），以上鉴定均符合预期结果，表明质粒构建正确。

重组大肠杆菌诱导表达共表位重组蛋白G₄₀₅：将构建完成的BL21（pET-28a-G₄₀₅）用接种环挑取少量的菌液，划线接种于LB固体培养基平皿，37℃静置培养12~16h后，挑单菌落接种于LB液体培养基中，置于37℃、以180r/min培养12~16h作为种子液，然后将其按1%（V/V）接种至LB培养基，同时加入卡那霉素至终浓度50μg/mL。37℃培养5~7h，至菌液OD₆₀₀值为1.1~1.3时，加入IPTG至终浓度为0.001mol/L，37℃诱导表达6h。

图2为重组蛋白G₄₀₅的SDS-PAGE检测结果图。其中，M1泳道为蛋白Marker；1泳道为未经IPTG诱导的携带空载体BL21（pET-28a）的菌液；2泳道为经IPTG诱导的携带空载体BL21（pET-28a）的菌液；3泳道为未经IPTG诱导的携带重组载体BL21（pET-28a-G₄₀₅）的菌液；4泳道为IPTG诱导的携带重组载体BL21（pET-28a-G₄₀₅）的菌液；5泳道为IPTG诱导的携带重组载体BL21（pET-28a-G₄₀₅）的上清液；6泳道为经IPTG诱导的携带重组载体BL21（pET-28a-G₄₀₅）的沉淀。由此表明，IPTG诱导重组蛋白G₄₀₅表达成功，且蛋白主要存在于菌液沉淀中。

纯化共表位重组蛋白G₄₀₅：将诱导表达后的菌液10000r/min室温离心收集菌体沉淀，将菌体沉淀用浓度为0.01mol/L、pH=7.2的PBS溶液重悬，每10mL PBS溶液重悬1g湿润菌体，重悬后的菌液连续冻融3次，在冰浴条件下超声波破碎，对破碎后的菌液于4℃、12000r/min离心收集菌液沉淀，将所述菌液沉淀用8M尿素溶液溶解获得重组蛋白溶液，之后将重组蛋白溶液用截留分子量为10000的透析袋分别在6M、4M、2M尿素溶液中透析12h，在清水中透析24h，每4h更换一次透析液，将透析完成的重组蛋白溶液进行冷冻干燥48h，得到纯化的共表位重组蛋白G₄₀₅粉末。

实施例3

本实施例提供了共表位疫苗的制备。

细菌纤维素前处理：

细菌纳米纤维素羧基化：取237g湿状细菌纤维素（干重约4g），放入搅拌机中混匀，加入蒸馏水至总体积300mL，依次加入2,2,6,6-四甲基哌啶-氮-氧化物64mg、溴化钠400mg以及5mmol/L的次氯酸钠10mL，室温搅拌12h，期间控制pH在10.5，加入5mL无水乙醇终止反应，之后用蒸馏水将反应液抽滤至pH≤8，再用70%的浓硫酸与抽滤后的纤维素混合，50℃下加热搅拌2h，再加入蒸馏水500mL终止反应，制得200~300nm规格的羧基化纳米纤维素，透析并冷冻干燥得到羧基化细菌纳米纤维素。

制备羧基化细菌纳米纤维素混悬液：分别取羧基化细菌纳米纤维素100mg、1-乙基-3-（二甲胺丙基）碳二亚胺（EDAC）4mg、N-羟基丁二酰亚胺（NHS）6mg混合在pH值为6.0的吗啉乙磺酸缓冲液10mL中室温搅拌4h，之后加入1.4μL巯基乙醇终止反应。

制备共表位疫苗：

重组蛋白重悬液制备：将共表位重组蛋白G₄₀₅粉末20mg重悬到pH=7.2的1mL磷酸盐缓冲液中。

羧基化细菌纳米纤维素混悬液与重组蛋白重悬液混合：将上述制备的羧基化细菌纳米纤维素混悬液与上述制备的重组蛋白重悬液按照体积比为1:1的比例混合，室温搅拌4h，制得成品疫苗。

实施例4

本实施例提供了共表位纳米载体疫苗的免疫效果评价。

取3.0~4.5g的健康大口黑鲈140尾，5.0~6.5g的健康乌鳢140尾，分别均分为4组（35尾/组），其中1组为对照组，其余3组为试验组。各处理方式分别如下：

PBS组（对照组）：磷酸缓冲盐溶液（PBS）浸泡处理大口黑鲈/乌鳢8小时后转入正常养殖用水；

G₄₀₅组：10mg/L重组蛋白G₄₀₅重悬液浸泡处理大口黑鲈/乌鳢8小时后转入正常养殖用水；

BNC组：10mg/L细菌纳米纤维素（BNC）混悬液浸泡处理大口黑鲈/乌鳢8小时后转入正常养殖用水；

BNC-G₄₀₅组：10mg/L共价表位疫苗浸泡处理大口黑鲈/乌鳢8小时后转入正常养殖用水。

在7、14、21、28天分别采集各组大口黑鲈/乌鳢血液，将采集的血液在室温下静置2h，放入4℃冰箱过夜。第二天，以5000×G的离心力于低温冷冻离心机中离心15min，取上层血清，于-20℃中保存。

血清抗体水平通过间接ELISA进行测定，具体步骤如下：

将所述血清用包被稀释液稀释200倍，以每孔100μL加入至96孔酶标板中，每个样品三个重复，4℃过夜包被。结束后，弃去孔中液体，加入5%脱脂奶粉置37℃封闭1h，封闭结束后，用TBST洗涤3遍，每遍3min。

将重组蛋白G₄₀₅稀释至2μg/mL后，以每孔100μL加入至96孔酶标板中，37℃放置40~60min。然后用TBST洗涤3遍，每遍3min。

将鼠源His-tag单克隆抗体（1:1000）进行稀释，每孔100μL加入至96孔酶标板中，于37℃孵育30~60min，然后用TBST洗涤3遍，每遍3min。

将辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG（1:5000）进行稀释，每孔100μL加入至96孔酶标板中，于37℃孵育30~60min，然后用TBST洗涤3遍，每遍3min。

每孔加入100μL四甲基联苯胺（TMB）显色液，置于37°C避光放置5~10min；每孔加入终止液50μL终止反应，20min内测定450nm波长下的吸光度。

大口黑鲈和乌鳢的免疫效果分别如图3和图4所示。在图3和图4中，BNC-G₄₀₅组各周的抗体水平均显著（p<0.05）高于其他组，说明本发明提供的共价表位疫苗能够显著提升大口黑鲈和乌鳢血清抗体水平。

实施例5

本实施例提供了大口黑鲈和乌鳢感染病毒后的免疫保护率检测。

上述大口黑鲈和乌鳢免疫28天后，用MSRV（TCID₅₀=10^-3.125/mL）对各组大口黑鲈进行腹腔注射攻毒感染，病毒原液稀释100倍，每尾注射100μL，各组大口黑鲈感染MSRV后的存活率如图5所示。图5中，G₄₀₅组和BNC-G₄₀₅组的相对免疫保护率分别为38.78%和64.29%。用SHVV（TCID₅₀=10^-2.67/mL）对各组乌鳢进行腹腔注射攻毒感染，病毒原液稀释100倍，每尾注射100μL，各组乌鳢感染SHVV后的存活率如图6所示。图6中，G₄₀₅组和BNC-G₄₀₅组的相对免疫保护率分别为53.33%和86.67%。上述相对免疫保护率的计算方法均为：相对保护率=（1-实验组死亡率/对照组死亡率）×100%。该结果表明本发明提供的共价表位疫苗具有对MSRV和SHVV感染的免疫保护作用。

以上所述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。在依据本发明构思的条件下本领域普通技术人员进行的相关推演和替换，在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (9)

1.一种共表位重组蛋白G₄₀₅，其特征在于，所述共表位重组蛋白G₄₀₅是大口黑鲈弹状病毒和乌鳢水泡病毒的共表位重组蛋白；

所述共表位重组蛋白G₄₀₅的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示。

2.根据权利要求1所述的共表位重组蛋白G₄₀₅，其特征在于，所述共表位重组蛋白由SEQID NO:2所示的核苷酸序列编码。

3.权利要求1所述的共表位重组蛋白G₄₀₅的制备方法，其特征在于，包括：

构建能够表达共表位重组蛋白G₄₀₅的重组表达载体；

将所述重组表达载体转入大肠杆菌，得到重组大肠杆菌；

IPTG诱导重组大肠杆菌表达共表位重组蛋白G₄₀₅；

纯化出共表位重组蛋白G₄₀₅，冻干保存。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，共表位重组蛋白G₄₀₅的纯化方法为：将诱导表达后的菌液10000r/min室温离心收集菌体沉淀，将菌体沉淀用浓度为0.01mol/L、pH=7.2的PBS溶液重悬，每10mL PBS溶液重悬1g湿润菌体，重悬后的菌液连续冻融3次，在冰浴条件下超声波破碎，对破碎后的菌液于4℃、12000r/min离心收集菌液沉淀，将所述菌液沉淀用8M尿素溶液溶解获得重组蛋白溶液，之后将重组蛋白溶液用截留分子量为10000的透析袋分别在6M、4M、2M尿素溶液中透析12h，在清水中透析24h，每4h更换一次透析液，将透析完成的重组蛋白溶液进行冷冻干燥48h，得到纯化的共表位重组蛋白G₄₀₅粉末。

5.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体含有能够表达权利要求1所述的共表位重组蛋白G₄₀₅的核苷酸序列。

6.一种重组菌，其特征在于，所述重组菌含有权利要求5所述的重组表达载体。

7.权利要求1所述的共表位重组蛋白G₄₀₅在制备鱼类病毒病防治的共表位疫苗中的应用；

所述病毒包括大口黑鲈弹状病毒和乌鳢水泡病毒；

所述共表位疫苗是由共表位重组蛋白G₄₀₅和细菌纳米纤维素载体制备而成。

8.一种共表位疫苗的制备方法，其特征在于，包括：

细菌纳米纤维素羧基化：取干重为4g的细菌纳米纤维素，放入搅拌机中混匀，加入蒸馏水至总体积300mL，依次加入2,2,6,6-四甲基哌啶-氮-氧化物64mg、溴化钠400mg和5mmol/L的次氯酸钠10mL，室温搅拌12h，期间控制pH在10.5，加入5mL无水乙醇终止反应，之后用蒸馏水将反应液抽滤至pH≤8，再用70%的浓硫酸与抽滤后的纤维素混合，50℃下加热搅拌2h，再加入蒸馏水500mL终止反应，制得200~300nm规格的羧基化纳米纤维素，透析并冷冻干燥得到羧基化细菌纳米纤维素；

制备羧基化细菌纳米纤维素混悬液：分别取羧基化细菌纳米纤维素100mg、1-乙基-3-（二甲胺丙基）碳二亚胺4mg、N-羟基丁二酰亚胺6mg混合在pH值为6.0的吗啉乙磺酸缓冲液10mL中室温搅拌4h，之后加入1.4μL巯基乙醇终止反应；

重组蛋白重悬液制备：将权利要求3制备的共表位重组蛋白G₄₀₅冻干粉末20mg重悬到pH=7.2的1mL磷酸盐缓冲液中；

羧基化细菌纳米纤维素混悬液与重组蛋白重悬液混合：将上述制备的羧基化细菌纳米纤维素混悬液与上述制备的重组蛋白重悬液按照体积比为1:1的比例混合，室温搅拌4h，制得成品疫苗。

9.一种鱼类病毒病防治的共表位疫苗，其特征在于，使用权利要求8所述的方法制得。