CN113512096A

CN113512096A - 一种鲈鱼弹状病毒重组g2蛋白及其应用

Info

Publication number: CN113512096A
Application number: CN202111066177.8A
Authority: CN
Inventors: 王高学; 朱斌; 凌飞; 郭孜饶; 焦铁军
Original assignee: Shenzhen Wankesen Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shenzhen Wankesen Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-09-13
Filing date: 2021-09-13
Publication date: 2021-10-19
Anticipated expiration: 2041-09-13
Also published as: CN113512096B

Abstract

本发明通过原核重组表达获得G2蛋白，该蛋白片段具有良好的免疫原性，能够刺激机体产生较高的抗体水平，该片段相对于G蛋白整体以及其他片段具有更好的免疫原性和免疫保护性能，基于G2蛋白与功能性碳纳米管结合制备得到的碳纳米管载体亚单位疫苗免疫鲈鱼21天后攻毒MSRV FJ985毒株，鲈鱼免疫保护率为86%，高于现有报道的保护率，且基于特定蛋白片段的选取，其相比原始的G蛋白以及基于免疫分析得到的其他G蛋白片段具有更好的保护效力，免疫鲈鱼后可产生较好的保护作用，并能使鲈鱼有效抵御MSRV强毒的攻击。

Description

一种鲈鱼弹状病毒重组G2蛋白及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鲈鱼弹状病毒重组G2蛋白及其应用。

背景技术

由鲈鱼弹状病毒（Micropterus salmoides rhabdovirus，MSRV）引起的鲈鱼弹状病毒病危害最为严重，其流行地域广，发病时间长，发病死亡率可达85%以上，给鲈鱼养殖带来了巨大经济损失。MSRV为单链RNA病毒，病毒粒子大小为（100～430）nm×（45～100）nm，形态似棒状或子弹状。MSRV基因组主要编码5个结构蛋白，分别为核蛋白（nucleoprotein N），磷蛋白（phosphoprotein P）、基质（mitrix M）蛋白、糖蛋白（glycoprotein G）以及RNA聚合酶（RNA polymerise L）。

G蛋白即糖蛋白，主要负责与宿主细胞受体的结合，是病毒的主要抗原蛋白。根据推导的氨基酸序列推测，G蛋白与其他弹状病毒相似，呈典型的跨膜蛋白，在氨基端有一段疏水性的信号肽，切除信号肽后组成成熟的糖蛋白。亲水性分析，G蛋白含有两个疏水性区域，分别构成信号肽和跨膜区域。G蛋白在病毒表面形成三聚体状的囊膜粒子，与细胞上的受体结合，介导病毒的内吞作用。G蛋白作为病毒最主要的抗原，诱导机体产生中和抗体并刺激细胞免疫，决定了病毒的血清学特征。

目前针对MSRV所引起的相关疾病仍旧缺乏有效的治疗方式。有研究表明，中草药作为预防和治疗鲈鱼弹状病毒病的药物，具有毒副作用小、资源丰富和兼有药性等优点，在鱼病防治过程中，能起到一定的预防与治疗效果。疫苗作为预防病毒感染最有效的方式在MSRV的预防上也有一定的报道。Chen等（The antiviral defense mechanisms in mandarin fish induced by DNA vaccination against a rhabdovirus,Veterinary Microbiology,157 (2012) 264–275）通过构建抗弹状病毒的糖蛋白G质粒，注射鱼体后发现，该糖蛋白质粒可以触发I型IFN抗病毒免疫应答，显著减少病毒感染后肌肉组织受损程度，并且能够抑制病毒复制，所以对MSRV的G蛋白的研究显得尤为重要；Sun-jian LYU等（Zhejiang Univ-Sci B (Biomed & Biotechnol) 2019 20(9):728-739）构建MSRV病毒糖蛋白（G蛋白）的杆状病毒表达***，并利用杆状病毒表达***获得了高丰度的病毒糖蛋白,可结合家蚕可用于后续口服疫苗的研发，但并未进行疫苗的开发和免疫效果验证；Zi-RaoGuo等（Fish and Shellfish Immunology 99 (2020) 548-554）报道了一种由MSRV糖蛋白(G)复合而成的浸渍型单壁碳纳米管负载亚单位疫苗，并评估了其对大口黑鲈的保护作用，其采用原核表达的G蛋白全序列与单壁碳纳米管组合制备得到单壁碳纳米管-糖蛋白，结果表明单壁碳纳米管-糖蛋白(SWCNTs-G)是一种很有前途的浸入式亚单位疫苗候选者，可以对抗 MSRV 引起的死亡，在 SWCNTs 的帮助下，SWCNTs-G 组（40 mg/L）的免疫保护率达到70.1%，相比单纯采用G蛋白提高了30.6%。

目前针对MSRV所引起的相关疾病仍旧缺乏有效的治疗方式，疫苗作为预防病毒感染最有效的方式在MSRV的预防上也有一定的报道，然而，目前仍没有MSRV亚单位疫苗面市。因此，尽快研发出安全高效的针对MSRV的亚单位疫苗，才能解决鲈鱼养殖业与市场的困局，促进水产养殖业的健康发展。目前渔用疫苗在大规模产业化应用方面仍然存在一些理论和技术瓶颈，特别是在免疫途径和免疫效果方面。其中，注射免疫保护效果最好，但由于操作技术和生产成本等原因使其难以满足大规模产业化要求；浸泡和口服免疫虽然操作技术简单、生产成本低，但同时也存在体表皮肤和肠道屏障限制作用、酶解失活、免疫保护率低等一系列难以克服的技术问题。因此，如何通过进一步提高疫苗的免疫效果，是如今亟待解决的问题。

发明内容

为解决鲈鱼养殖业与市场的困局，促进水产养殖业的健康发展，本发明旨在提供一种鲈鱼弹状病毒重组G2蛋白及其应用，通过反复设计和试验，选用MSRV G蛋白的部分片段为制备得到重组G2蛋白，经试验表明，该重组G2蛋白相对其他片段具有更好的免疫原性，能够应用于亚单位疫苗的制备，将所述重组蛋白结合碳纳米管组合制备得到碳纳米管-甘露糖化的G2糖蛋白亚单位疫苗，其对于鲈鱼的攻毒保护率大大提高。

为解决以上技术问题，本发明采用如下技术手段：

一种鲈鱼弹状病毒重组G2蛋白，其特征在于，所述重组G2蛋白的氨基酸序列如SEQID No：2所示。

编码所述鲈鱼弹状病毒重组G2蛋白的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列如SEQID No：1所示。

一种表达鲈鱼弹状病毒重组G2蛋白的重组载体，其特征在于，所述重组载体包括序列为SEQ ID No：1所示的核酸序列。

优选的，所述重组载体是将核酸序列为SEQ ID No：1所示的鲈鱼弹状病毒重组G2蛋白基因克隆至pET-32a表达载体上获得重组质粒pET32a-G2。

一种用于表达鲈鱼弹状病毒重组G2蛋白的重组菌株，所述重组菌株包括重组质粒pET32a-G2。

优选的，所述重组菌株为将重组质粒pET32a-G2转化至E. coli BL21（DE3）中得到的。

一种制备鲈鱼弹状病毒重组G2蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

步骤一，G2目的基因扩增；

步骤二，表达G蛋白的重组大肠埃希氏菌E. coli BL21/pET32a-G2的构建；

步骤三，重组菌E. coli BL21/pET32a-G2的诱导表达；

步骤四，菌液处理与超声破碎：发酵产物经管式离心机12000r/min室温离心，收集菌体，用PBS洗涤2次，将收集的菌体按湿菌和PBS溶液质体比1∶9的比例进行重悬，2～8℃高压均质机破碎细菌，细菌连续通过均质机两次以后，将破碎的菌液涂片，使用0.1%结晶紫溶液染色0.5分钟，显微镜下取3～5个视野进行观察，破碎完全时视野内全为细胞碎片而看不到完整的菌体，破碎菌液至细菌的破碎率不再发生变化为止；管式离心机12000r/min室温离心，收集蛋白沉淀；

步骤五，蛋白的纯化：采用镍Ni^2＋螯合亲和层析柱进行蛋白的纯化，并将纯化后的蛋白进行透析，透析结束后，收集透析后的蛋白液4℃保存备用；

步骤六，内毒素去除：向透析后的蛋白液中，加入Triton X-114至终浓度1.5%，4℃搅拌1小时。处理后将样品温度恢复至30℃维持40分钟，高速离心机17000r/min，离心去除沉淀，收集上清液，上清液按上述方法重复处理三次。

本发明还请求保护所述鲈鱼弹状病毒重组G2蛋白在制备用于治疗和/或预防鲈鱼弹状病毒病的药物中的应用。

优选的，所述药物为疫苗，优选为亚单位疫苗，所述亚单位疫苗是由G2蛋白和碳纳米管佐剂制备而成，所述G2蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No：2。

所述亚单位疫苗是将功能化单壁碳纳米管（o-SWCNTs）加入到2-（N-吗非啉）乙磺酸水溶液中后超声处理2h得混合物，向混合物中加入乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺和N-羰基琥珀酸亚胺，然后超声处理2h、离心，将离心得到的沉淀加入PBS缓冲液中，向PBS缓冲液中再加入G2抗原蛋白，然后超声处理2h、室温搅拌48h，搅拌后在纯水中透析24-48h，透析后离心、真空干燥，即得碳纳米管载体亚单位疫苗干粉。

基于以上技术方案，本发明具有如下优点和有益效果：

本发明在大量分析和试验的基础上，筛选得到糖蛋白中具有良好免疫原料的G2蛋白片段，通过原核重组表达获得G2蛋白，该蛋白片段具有良好的免疫原性，能够刺激机体产生较高的抗体水平，该片段相对于G蛋白整体以及其他片段具有更好的免疫原性和免疫保护性能，基于G2蛋白与功能性碳纳米管结合制备得到的碳纳米管载体亚单位疫苗免疫鲈鱼21天后攻毒MSRV FJ985毒株，鲈鱼免疫保护率为86%，高于现有报道的保护率，且基于特定蛋白片段的选取，其相比原始的G蛋白以及基于免疫分析得到的其他G蛋白片段具有更好的保护效力，免疫鲈鱼后可产生较好的保护作用，并能使鲈鱼有效抵御MSRV强毒的攻击。

附图说明

图1为PCR扩增CO细胞培养物电泳图。图1中M表示DNA Marker 2000；图1中1表示CO细胞培养物；图1中2表示MSRV阳性质粒样品；图1中3表示阴性对照。

图2为重组质粒pET32a-G2鉴定结果图。图2中a为G2基因PCR扩增产物：M表示DL2000 DNA Marker，1表示G2基因，2表示阴性对照。图2中b为重组表达质粒双酶切分析：M表示DL5000 DNA Marker；1表示pET32a-G2重组质粒；2表示pET32a-G2重组质粒双酶切。

图3为重组蛋白G2的SDS-PAGE检测图。图3中M表示蛋白Marker；图3中1表示未诱导的包含pET32a-G2质粒的E. coli BL21菌体蛋白；图3中2表示IPTG诱导的包含pET32a-G2质粒的E. coli BL21上清中的菌体蛋白；图3中3表示IPTG诱导的包含pET32a-G2质粒的E. coli BL21沉淀中的菌体蛋白。

图4为重组蛋白G2的Western blot检测图。图4中M表示Marker；图4中1表示阴性对照；图4中2表示纯化G2蛋白。

图5为不同蛋白片段免疫后的抗体水平检测结果图。

图6为不同蛋白片段亚单位疫苗的免疫后的抗体水平检测结果图。

图7为不同蛋白片段亚单位疫苗的攻毒后存活率（保护率）。

具体实施方式

实施例1：重组大肠埃希氏菌E. coli BL21/pET32a-G2株的构建和鉴定

G2目的基因扩增

参照病毒RNA提取试剂盒说明书，以CO细胞培养的MSRV FJ985株病毒液（MSRVFJ985毒株由西北农林科技大学提供，具体见Fei Yang等，Evaluation on the antiviral activity of ribavirin against Micropterus salmoides rhabdovirus (MSRV) in vitro and in vivo，Aquaculture，Volume 543，网络公开时间：2021年5月27日）为材料，提取MSRV病毒RNA。琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，微量核酸分析仪测定样品RNA浓度和质量。并用反转录试剂盒将提取的RNA样品反转为cDNA。

经过大量设计选取氨基酸序列为SEQ ID No:2的G2片段，采用MSRV-G-F/R和VP7-F/R引物对扩增G2基因，其中MSRV-G-F：5’- GAACTGTGGATGGAATAACG-3’（SEQ ID No：6）；MSRV-G-R：5’- GTCTGACGGCGTACCCAA-3’（SEQ ID No：7）。

取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳条件：120V电压30分钟。电泳产物切胶、回收、经凝胶回收试剂盒纯化DNA产物，纯化产物与pMD19-T载体连接，将重组产物命名为pMD19T-G2。将转化子转化至大肠埃希氏菌DH5α感受态中，经蓝白斑筛选获取阳性菌株，并提取质粒进行PCR扩增检测及测序鉴定。结果如图1所示。

表达G蛋白的重组大肠埃希氏菌（E. coli BL21/pET32a-G2）的构建

原核表达载体pET32a-G2的构建：将重组pMD19T-G2质粒进行双酶切，并克隆至pET-32a表达载体上相应的酶切位点之间，获得重组质粒pET32a-G2。

重组质粒pET32a-G2的转化与筛选：分别将重组质粒pET32a-G2转化至E. coliBL21（DE3）中，涂布含有氨苄的LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜。然后挑取单菌落进行针对G2的菌落PCR检测鉴定。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后于凝胶成像仪下观察扩增产物目的条带大小，如图2-a所示，与预期的G2 414bp相符的菌落为重组菌E. coli BL21/ pET32a-G2。

重组质粒pET32a-G2的鉴定：将菌落PCR阳性的菌落接种至含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养液中，于37℃、以180r/min培养12～16小时，按Omega质粒提取试剂盒操作说明进行质粒的提取，测定质粒的浓度后，取8μl质粒溶液、1μL 10×酶切Buffer和各0.5μl限制性内切酶，混匀，37℃酶切5分钟。将酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。结果如图2-b所示。

重组菌E. coli BL21/pET32a-G2的诱导表达

将生产用菌种用接种环挑取少量的菌液，划线接种于LB固体培养基平皿，37℃静置培养12～16小时后，挑单菌落接种于LB液体培养基中，置于37℃、以180r/min培养12～16小时作为一级种子；将一级种子以1%（V/V）接种于LB液体培养基中，置于37℃、以180r/min培养12～16小时作为二级种子。将二级种子按1%（V/V）接种至改良LB培养基，同时加入氨苄青霉素至终浓度100μg/ml。37℃通气发酵培养5～7小时，溶氧30%～40%，至菌液的OD₆₀₀值为1.1～1.3时，加入IPTG至终浓度为0.001mol/L，37℃诱导培养6小时，停止发酵。

菌液处理与超声破碎

发酵产物经管式离心机12000r/min室温离心，收集菌体，用PBS（0.015mol/l，pH7.2）洗涤2次，将收集的菌体按湿菌和PBS溶液（0.015mol/l，pH7.2）质体比1∶9的比例进行重悬，2～8℃高压均质机破碎细菌，细菌连续通过均质机两次以后，将破碎的菌液涂片，使用0.1%结晶紫溶液染色0.5分钟，显微镜下取3～5个视野进行观察，破碎完全时视野内全为细胞碎片而看不到完整的菌体，破碎菌液至细菌的破碎率不再发生变化为止。管式离心机12000r/min室温离心，收集蛋白沉淀。

蛋白的纯化

按每克蛋白沉淀用10ml溶解液（5mmol/L咪唑，0.5mmol/L氯化钠，8 M尿素，20mmol/L Tirs-HCl，pH7.9）的比例进行溶解，室温下200r/min振荡溶解2小时后，4℃10000r/min离心30分钟，收集上清。用平衡缓冲液（5mmol/L咪唑，0.5mmol/L氯化钠，8 M尿素，20mmol/L Tirs-HCl，pH7.9）充分平衡金属（镍Ni^2＋）螯合亲和层析柱后，按2倍柱体积上样，再用平衡缓冲液平衡，然后用洗脱缓冲液（0.5mol/L咪唑，0.5 mmol/L氯化钠，8 M尿素，20 mmol/L Tirs-HCl，pH7.9）洗脱，收集蛋白。将纯化好的200ml蛋白置于SnakeSkin™透析袋（10K MWCO），直接完全浸入到10L的复性液中（150 mM NaCl、2.5 mM KCl、10 mM Na₂HPO₄、2 mM KH₂PO₄、1%吐温-20、10mM β-环糊精、1ML-半胱氨酸，3 mM还原型和1 mM氧化型谷胱甘肽，pH7.9）中，4℃透析12 h，期间，每6h换液一次，透析结束后，收集透析后的蛋白液4℃保存备用。

内毒素去除

向透析后的蛋白液中，加入Triton X-114至终浓度1.5%，4℃搅拌1小时。处理后将样品温度恢复至30℃维持40分钟，高速离心机17000r/min，离心去除沉淀，收集上清液。上清液按上述方法重复处理三次。

重组蛋白的检测

SDS-PAGE：向破菌后上清及重悬沉淀后溶液加入等体积的2×凝胶上样缓冲液，另取不经超声波破碎，直接加入等体积的2×凝胶上样缓冲液。煮沸10分钟，SDS-PAGE电泳检测，分离胶的丙烯酰胺浓度为15%。考马斯亮蓝染色，脱色液脱色至条带清晰为止。同时设立不加IPTG诱导的E. coli BL21/pET32a-G2培养物作为对照。结果如图3所示。

鉴定：先将重组蛋白作SDS-PAGE电泳，方法同上。电泳结束后，取一片胶片置于转膜仪上，200mA条件下转膜1小时。将载有蛋白的PVDF膜置于塑料洗盒中，加入25ml的5%脱脂乳在室温下封闭2小时，倒掉脱脂乳，用TBST洗3次后，加入30ml一抗鼠源组氨酸单克隆抗体（抗体稀释液稀释，比例1∶1000），室温缓慢振荡反应2小时，倒掉一抗，用TBST洗5次后，加入30ml辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗（抗体稀释液稀释，比例1∶2000稀释），室温缓慢振荡反应2小时，倒掉二抗，用TBST洗5次后，将膜放入平皿中，置于暗室。先加入1ml去离子水，再加入DAB显色液(A液和B液各1滴)，用移液器反复冲洗膜表面1分钟，至显色完全后，用去离子水冲洗、晾干、成像，显色后在约30KDa有特异性条带，表明样品中存在表达正确的G2蛋白。结果如图4所示。

实施例2：重组蛋白的免疫效力评价

在研发过程中，设计了不同的片段，采用实施例1的方法分别制得了不同的糖蛋白片段以及完整的糖蛋白，糖蛋白片段G1（氨基酸序列为SEQ ID No：3）、糖蛋白片段G3（氨基酸序列为SEQ ID No：4）蛋白和完整糖蛋白（氨基酸序列为SEQ ID No：5），分别验证了以上蛋白片段的免疫效力。具体采用如下免疫效力评价试验：取健康鲈鱼300尾，随机分为6组，包括对照组（PBS）、G1蛋白组（40 mg/L），G2蛋白组（40 mg/L）、G3蛋白组（40 mg/L）、G蛋白组（40 mg/L）、G蛋白组（80 mg/L），所有鲈鱼均通过浴液接种相应的疫苗，浸泡6小时。随后，接种疫苗的鲈鱼被转移到不同的水箱中，并每天进行监测。在每一组中，每周一次选择三条鱼进行取样测试和制备血浆，持续到第四周，使用前血浆储存在−20°C，以含3%脱脂牛奶的PBS稀释的血清作为一级抗体，37℃孵育约1.5小时。然后，以纯化的G蛋白（含his-tag）作为抗原，随后，用1:1500稀释的抗His标记抗体和山羊-小鼠IgG抗体，以TMB为比色底物，测定OD₄₅₀，分析血清中的平均抗体水平。具体结果如图5所示。

基于图5的结果可知，糖蛋白及其片段均在免疫后第21天达到最高的抗体水平，其中本发明所选取的G2片段重组蛋白相对于G1蛋白片段、G3蛋白片段和完整的G蛋白具有更好的免疫原性，因而，本发明的G2重组蛋白是相对最优的亚单位疫苗的抗原蛋白。

实施例3：亚单位疫苗的制备

单壁碳纳米管功能化修饰

采用混酸氧化法对单壁碳纳米管进行结构修饰，步骤如下：

（1）将2g单壁碳纳米管样品放入150mL浓H₂SO₄和50mL浓HNO₃中，常温条件下置于磁力搅拌器100 rpm 搅拌48 h；

（2）将上一步获得的碳纳米管混酸混合物用循环水式真空泵进行抽滤，用纯水洗至液体的 pH=7.4，然后置于 60℃条件下烘干，在研钵中研磨成粉末状，过300目的筛子，所得产物即为功能化单壁碳纳米管（o-SWCNTs）。

碳纳米管载体亚单位疫苗的制备

取酸化的单壁碳纳米管样品（0.5g）加入到2-（N-吗非啉）乙磺酸水溶液中（0.1M，pH=5.6，400mL）并超声（40KHz，500W）处理2h得混合物，然后向混合物中加入4g乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺（EDAC）和3.5g N-羰基琥珀酸亚胺（NHS）并超声（40KHz，500W）处理2h，然后于6000rpm条件下离心8min，去上清，沉淀加入到PBS缓冲液中（pH=7.4，300mL）进行超声（40KHz，500W）混合，均匀后向PBS缓冲液中再加入1g G2蛋白，先超声（40KHz，500W）处理2h，再室温搅拌48h。搅拌后用截留量为10万的透析袋在纯水中透析48h，透析完的产物于3000rpm离心20min，沉淀即为单壁碳纳米管载G2抗原蛋白复合物（SWCNT-G2），于30-45℃下真空干燥后4℃，即得碳纳米管载体亚单位疫苗干粉，低温保存。

将碳纳米管载体亚单位疫苗配成1mg/ml的溶液，通过BCA蛋白检测试剂盒新型蛋白含量测定，计算疫苗***中抗原蛋白的含量。

实施例4：亚单位疫苗的安全检验和免疫效力评价

浸浴用亚单位疫苗的配制：采用生理盐水溶解碳纳米管载体亚单位疫苗干粉，使得其中抗原蛋白的浓度为10mg/mL，即得到亚单位疫苗工作液。

安全检验：取0.5～1g（60日龄以上）健康鲈鱼200尾，分为免疫组和对照组，每组100尾。免疫组采用亚单位疫苗工作液的稀释液进行免疫，免疫剂量为2ml/L，对照组用生理盐水代替疫苗，浸泡免疫6小时后转入正常养殖水体，连续观察14日，结果表明，免疫组合对照组的鲈鱼全部健活，且试验期间摄食、游动、精神状态均正常，无临床不良反应。

效力检验-血清学评价

基于实施例3相同的方法，分别制备得到基于糖蛋白片段G1（氨基酸序列为SEQ IDNo：3）、糖蛋白片段G3（氨基酸序列为SEQ ID No：4）蛋白和完整糖蛋白（氨基酸序列为SEQID No：5）的碳纳米管载体亚单位疫苗干粉，且均配置成抗原蛋白的浓度为10mg/mL的疫苗工作液，用作对比比较。具体采用如下免疫效力评价试验：取健康鲈鱼500尾，随机分为5组，包括对照组（PBS）、G1蛋白亚单位疫苗组，G2蛋白亚单位疫苗组、G3蛋白亚单位疫苗组、G蛋白亚单位疫苗组，所有鲈鱼均通过浴液接种相应的疫苗，浸泡6小时。随后，接种疫苗的鲈鱼被转移到不同的水箱中，并每天进行监测。在每一组中，每周一次随机选择三条鱼进行取样测试和制备血浆，持续到第四周，使用前血浆储存在−20°C，以含3%脱脂牛奶的PBS稀释的血清作为一级抗体，37℃孵育约1.5小时。然后，以纯化的G蛋白（含his-tag）作为抗原，随后，用1:1500稀释的抗His标记抗体和山羊-小鼠IgG抗体，以TMB为比色底物，测定OD₄₅₀，分析血清中的平均抗体水平。具体结果如图6所示。

基于图6的结果可知，采用亚单位疫苗进行浸浴，均在第21天时达到最高的抗体水平，而G2蛋白亚单位疫苗组相对而言达到了更高的抗体浓度，其表明，本发明所选取的G2片段所制备得到的G2蛋白亚单位疫苗相对而言具有更好地免疫保护效果，能够更好的刺激机体产生中和抗体。

效力检验-免疫攻毒保护：在以上“效力检验-血清学评价”进行到第21天时，随机从各组中选取健活的鱼苗50尾，分别以鲈鱼弹状病毒FJ985株进行腹腔注射攻毒，15μl（病毒含量为100TCID₅₀/ml）/尾。攻毒后连续观察14日，定时检查、记录发病和死亡情况，计算得到攻毒后的存活率，经计算，其中G2亚单位苗组存活率最高，达到86%；其次为G-亚单位苗组，其存活率为74%，而G1亚单位苗组和G3亚单位苗组的存活率分别为52%和60%，具体结果见图7所示。由此可见，本发明基于特定蛋白片段的选取，其相比原始的G蛋白以及基于免疫分析得到的其他G蛋白片段具有更好的保护效力，取得了本领域技术人员所不可预期的保护效果。

以上记载的仅为本发明的优选实施例，不能以此来限定本发明之权利范围，因此，依据本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。

序列表

<110> 深圳万可森生物科技有限公司

<120> 一种鲈鱼弹状病毒重组G2蛋白及其应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 420

<212> DNA/RNA

<213> 鲈鱼弹状病毒(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

atgaactgtg gatggaataa cgtgttgact gagtcccaag aattcaccac tttgacttca 60

caccctgtta aattggatgc ctactctttc atattaattg acagcatgtt tgagggagga 120

cggtgtcaat caaaagagtg tcctgtggtg ttccatcaag ggatgtggat tgctgatcaa 180

gaagctttcg gattttgcaa agacttggac aaacacaggg gactactttt caaaactgga 240

ttgaggaatt cactgggaga aattgtcaga caagagtgga atctgaattc ggtattccag 300

ccagagatag gaagggaaaa acatttcaag ggtgcctgta aaatgtcgta ctgcgggaat 360

tcaggggtta gattttctga tagagagtgg tttcaattgg gtacgccgtc agacaattga 420

<210> 2

<211> 139

<212> PRT

<213> 鲈鱼弹状病毒(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 2

Met Asn Cys Gly Trp Asn Asn Val Leu Thr Glu Ser Gln Glu Phe Thr

1 5 10 15

Thr Leu Thr Ser His Pro Val Lys Leu Asp Ala Tyr Ser Phe Ile Leu

20 25 30

Ile Asp Ser Met Phe Glu Gly Gly Arg Cys Gln Ser Lys Glu Cys Pro

35 40 45

Val Val Phe His Gln Gly Met Trp Ile Ala Asp Gln Glu Ala Phe Gly

50 55 60

Phe Cys Lys Asp Leu Asp Lys His Arg Gly Leu Leu Phe Lys Thr Gly

65 70 75 80

Leu Arg Asn Ser Leu Gly Glu Ile Val Arg Gln Glu Trp Asn Leu Asn

85 90 95

Ser Val Phe Gln Pro Glu Ile Gly Arg Glu Lys His Phe Lys Gly Ala

100 105 110

Cys Lys Met Ser Tyr Cys Gly Asn Ser Gly Val Arg Phe Ser Asp Arg

115 120 125

Glu Trp Phe Gln Leu Gly Thr Pro Ser Asp Asn

130 135

<210> 3

<211> 141

<212> PRT

<213> 鲈鱼弹状病毒(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 3

Met Gln Glu Val Arg Arg Ala Arg Glu Thr Lys Ala Val Ser Asp Trp

1 5 10 15

Leu Leu Ser Met Met Ser Pro Phe Ser Glu Gly Ile Gly Lys Val Tyr

20 25 30

Arg Ile His Arg Gly Met Leu Glu Ser Thr Val Gly Phe Tyr Arg Lys

35 40 45

Val Val Leu Glu Gly Asp Gly Thr Pro Glu Arg Leu Gly Val Gly Leu

50 55 60

Asp Lys Lys Pro Val Ser Trp Asp Gln Phe Val Val Lys Thr Asn Asp

65 70 75 80

Thr Arg Ile Gln Ser Met Phe Asn Gly Asn Thr Val Val Asn Gly Lys

85 90 95

Ile Lys Trp Val Lys Asn Val Leu Gly Ala His Ile Leu Asp Glu Ile

100 105 110

Ser Ala Leu Glu Phe Asp Val Pro Leu Ile Pro His Pro His Leu Asp

115 120 125

Gly Leu Lys Phe Asn Glu Ser His Thr Ile Ser Ser His

130 135 140

<210> 4

<211> 141

<212> PRT

<213> 鲈鱼弹状病毒(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 4

Met Arg Phe Ser Asp Arg Glu Trp Phe Gln Leu Gly Thr Pro Ser Asp

1 5 10 15

Asn Gly Ile Lys Lys Ile Ile Glu Gly Leu Pro Glu Cys Gly Glu Asp

20 25 30

Asn Leu Ile His Ser His Asp Thr Ser Asn Thr Leu Lys Glu Leu Ala

35 40 45

Glu His Val Asp Glu Ile Ala Leu Asn Ala Ile Cys Leu Gln Glu Val

50 55 60

Arg Arg Ala Arg Glu Thr Lys Ala Val Ser Asp Trp Leu Leu Ser Met

65 70 75 80

Met Ser Pro Phe Ser Glu Gly Ile Gly Lys Val Tyr Arg Ile His Arg

85 90 95

Gly Met Leu Glu Ser Thr Val Gly Phe Tyr Arg Lys Val Val Leu Glu

100 105 110

Gly Asp Gly Thr Pro Glu Arg Leu Gly Val Gly Leu Asp Lys Lys Pro

115 120 125

Val Ser Trp Asp Gln Phe Val Val Lys Thr Asn Asp Thr

130 135 140

<210> 5

<211> 519

<212> PRT

<213> 鲈鱼弹状病毒(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 5

Met Asn Thr Leu Ile Lys Ile Leu Leu Ile Ile Ile Ile Leu Arg Glu

1 5 10 15

Ala Arg Ser His Ile Val Leu Val Pro Leu Asp Leu Gly Glu Trp Arg

20 25 30

Thr Thr Glu Ala Asp Gln Leu Asp Cys Pro Met His Gly Asp Leu Ser

35 40 45

Asn Gln Gly Thr Gln Ala Ile Glu Leu Glu Tyr His Thr Ala Ser Trp

50 55 60

Gly Leu Lys Asn Asn Ile Ala Gly Ser Leu Cys Val Thr Ala Lys Trp

65 70 75 80

Ser Ile Thr Cys Asp Tyr Arg Trp Tyr Gly Ser Lys Tyr Ile Ser Thr

85 90 95

Val Ile Glu Tyr Leu Pro Thr Thr Pro Glu Met Cys Lys Glu Ala Lys

100 105 110

Arg Ala Ser Asp Arg Gly Glu Ser Leu Ala Pro His Phe Pro Thr Glu

115 120 125

Asn Cys Gly Trp Asn Asn Val Leu Thr Glu Ser Gln Glu Phe Thr Thr

130 135 140

Leu Thr Ser His Pro Val Lys Leu Asp Ala Tyr Ser Phe Ile Leu Ile

145 150 155 160

Asp Ser Met Phe Glu Gly Gly Arg Cys Gln Ser Lys Glu Cys Pro Val

165 170 175

Val Phe His Gln Gly Met Trp Ile Ala Asp Gln Glu Ala Phe Gly Phe

180 185 190

Cys Lys Asp Leu Asp Lys His Arg Gly Leu Leu Phe Lys Thr Gly Leu

195 200 205

Arg Asn Ser Leu Gly Glu Ile Val Arg Gln Glu Trp Asn Leu Asn Ser

210 215 220

Val Phe Gln Pro Glu Ile Gly Arg Glu Lys His Phe Lys Gly Ala Cys

225 230 235 240

Lys Met Ser Tyr Cys Gly Asn Ser Gly Val Arg Phe Ser Asp Arg Glu

245 250 255

Trp Phe Gln Leu Gly Thr Pro Ser Asp Asn Gly Ile Lys Lys Ile Ile

260 265 270

Glu Gly Leu Pro Glu Cys Gly Glu Asp Asn Leu Ile His Ser His Asp

275 280 285

Thr Ser Asn Thr Leu Lys Glu Leu Ala Glu His Val Asp Glu Ile Ala

290 295 300

Leu Asn Ala Ile Cys Leu Gln Glu Val Arg Arg Ala Arg Glu Thr Lys

305 310 315 320

Ala Val Ser Asp Trp Leu Leu Ser Met Met Ser Pro Phe Ser Glu Gly

325 330 335

Ile Gly Lys Val Tyr Arg Ile His Arg Gly Met Leu Glu Ser Thr Val

340 345 350

Gly Phe Tyr Arg Lys Val Val Leu Glu Gly Asp Gly Thr Pro Glu Arg

355 360 365

Leu Gly Val Gly Leu Asp Lys Lys Pro Val Ser Trp Asp Gln Phe Val

370 375 380

Val Lys Thr Asn Asp Thr Arg Ile Gln Ser Met Phe Asn Gly Asn Thr

385 390 395 400

Val Val Asn Gly Lys Ile Lys Trp Val Lys Asn Val Leu Gly Ala His

405 410 415

Ile Leu Asp Glu Ile Ser Ala Leu Glu Phe Asp Val Pro Leu Ile Pro

420 425 430

His Pro His Leu Asp Gly Leu Lys Phe Asn Glu Ser His Thr Ile Ser

435 440 445

Ser His His Pro Asn Gly Lys Gly Val Asn Phe Val Glu Ser Val Thr

450 455 460

His Trp Ala Gly Gly Leu Trp Glu Ser Ile Gly Ser Ser Ala Val Ile

465 470 475 480

Ile Val Val Leu Leu Ile Cys Ala Phe Val Ala Val Lys Phe Cys Gln

485 490 495

Arg Leu Val Pro Ser Arg Arg Pro Pro Thr Arg Glu Ser Ser Glu Asn

500 505 510

Val Phe Met Leu Arg Thr Val

515

<210> 6

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 鲈鱼弹状病毒(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 6

gaactgtgga tggaataacg 20

<210> 7

<211> 18

<212> DNA/RNA

<213> 鲈鱼弹状病毒(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 7

gtctgacggc gtacccaa 18

Claims

1.一种鲈鱼弹状病毒重组G2蛋白，其特征在于，所述重组G2蛋白的氨基酸序列如SEQID No：2所示。

2.编码权利要求1所述鲈鱼弹状病毒重组G2蛋白的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列如SEQ ID No：1所示。

3.一种表达权利要求1所述的鲈鱼弹状病毒重组G2蛋白的重组载体，其特征在于，所述重组载体包括序列为SEQ ID No：1所示的核酸序列。

4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体是将核酸序列为SEQ IDNo：1所示的鲈鱼弹状病毒重组G2蛋白基因克隆至pET-32a表达载体上获得重组质粒pET32a-G2。

5.一种用于表达鲈鱼弹状病毒重组G2蛋白的重组菌株，所述重组菌株包括权利要求4所述的重组质粒pET32a-G2。

6.根据权利要求5所述的用于表达鲈鱼弹状病毒重组G2蛋白的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为将重组质粒pET32a-G2转化至E. coli BL21（DE3）中得到的。

7.一种制备权利要求1所述的鲈鱼弹状病毒重组G2蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

步骤一，G2目的基因扩增；

步骤三，重组菌E. coli BL21/pET32a-G2的诱导表达；

步骤六，内毒素去除：向透析后的蛋白液中，加入Triton X-114至终浓度1.5%，4℃搅拌1小时；处理后将样品温度恢复至30℃维持40分钟，高速离心机17000r/min，离心去除沉淀，收集上清液，上清液按上述方法重复处理三次。

8.权利要求1所述的鲈鱼弹状病毒重组G2蛋白在制备用于治疗和/或预防鲈鱼弹状病毒病的药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，所述药物为亚单位疫苗。

10.一种用于预防的鲈鱼弹状病毒的药物，其特征在于，所述药物包括权利要求1所述的鲈鱼弹状病毒重组G2蛋白。