CN117362172B - 一种壬基酚半抗原及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种壬基酚半抗原及其制备方法和应用，所述壬基酚半抗原结构如式I所示：

Description

一种壬基酚半抗原及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于壬基酚半抗原领域，以及食品内分泌干扰素检测领域，涉及一种壬基酚半抗原及其制备方法和应用。
背景技术
壬基酚（Nonyl Phenol，NP）是一种典型的内分泌干扰物，具有明显的***效应，可以干扰人体内分泌的正常作用。作为重要的精细化工原料和中间体，NP被广泛应用于食品包装材料、食品贮藏容器以及工业洗涤剂、塑料增塑剂和稳定剂等，且食品用量正在逐年增加。有研究表明在矿泉水、碳酸饮料、罐头类食品中均有检出，人类通过摄食食品而暴露于这类物质中，据报道人体的尿液、血清和母乳中都存在着不同水平的NP。NP在环境中很难降解，且毒性大、滞留时间较长，通过食物链进入到人体中，也可以通过皮肤、呼吸、消化道等途径接触从而影响肝、肾、脾、肺等多种器官的健康。
壬基酚目前的检测方法主要有气相色谱法和气-质联用法、液相色谱法和液-质联用法等。样品前处理方法主要包括液液萃取、固相萃取、基质固相分散萃取和加速溶剂萃取等。这些方法存在选择性差、有机溶剂使用量大、操作复杂和不同基质间重现性差等缺点，而且操作繁琐、仪器昂贵。免疫化学分析法在抗原抗体的定性定量方面具有独特的优势，其操作简便快速、成本低、灵敏度较高、分析样本量大，弥补了理化分析的不足。
影响免疫化学分析质量的主要因素是抗体的特异性与亲和性，这些性质又决定于免疫半抗原分子的结构，因此免疫半抗原的分子设计与合成是产生特异性抗体和建立小分子物质残留快速检测技术的最基础、最关键的步骤。
发明人在前的专利CN109959785A公开了一种壬基酚半抗原，结构式如下：
。
但是该半抗原最终所得抗体用于检测复杂基质中壬基酚还存在检测限较高，灵敏度不够的缺陷。
发明内容
为了解决现有技术中壬基酚半抗原涉及的复杂基质，比如食品中检测壬基酚的检测限，灵敏度还不能满足实际需要，本发明的目的是提供一种壬基酚半抗原其制备方法和用途。本发明最终所得抗体用于壬基酚检测，检测限低，灵敏度高，对壬基酚残留检测具有重大价值。
本发明通过以下技术方案解决上述技术问题：
本发明第一个目的是提供一种壬基酚半抗原，其结构如式I所示：
(I)。
本发明第二个目的是提供上述式(I)所示的壬基酚半抗原的制备方法，合成路线如下：
。
进一步地，式(I)所示的壬基酚半抗原的制备方法，包括以下步骤：
(S1)壬基酚和2-溴甲基-4-甲氧基苯甲酸甲酯在碱存在下反应制备得到中间体式(II)化合物；
(S2)式(II)化合物依次经过水解、中和得到式(I)化合物。
进一步地，步骤(S1)中，壬基酚和2-溴甲基-4-甲氧基苯甲酸甲酯的摩尔比为1-3:1，碱为氢化钠和/或氢化钾，加入量是壬基酚质量的5-10wt%；反应在有机溶剂中进行，有机溶剂选自DMF、DMSO中至少一种，有机溶剂用量和壬基酚的比例为1mL：50-80mg；反应条件是在温度50-70℃反应5-10h。反应结束后，降温至4-8 ℃，加入水淬灭反应，萃取，干燥，过滤，减压浓缩，硅胶层析柱提纯得到中间体(II)。
更进一步地，步骤(S1)中，硅胶层析柱提纯是以乙酸乙酯上样，乙酸乙酯用量和壬基酚的比例为10-20mL：1g；石油醚：乙酸乙酯=80-100：1的洗脱液洗脱，收集主产物，减压浓缩得到油状产物，为中间体式(II)化合物。
进一步地，步骤(S2)中，所述水解是油状产物用甲醇溶解，加入碱在40-50℃条件下水解完全，碱为浓度1-2M的NaOH和/或KOH的水溶液，碱的用量是中间体式(II)化合物摩尔量的1-2倍；所述中和是加入0.5-2M的HCl水溶解，使体系pH为2-3。
进一步地，步骤(S2)的后处理是乙酸乙酯萃取，干燥、过滤、浓缩，得到产物式(I)化合物。
本发明第三个目的是提供一种壬基酚抗原，为所述式(I)化合物和载体蛋白偶联得到。
进一步地，所述载体蛋白选自牛甲状腺球蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清白蛋白和卵清蛋白中的至少一种。优选为牛血清白蛋白（BSA）或卵清蛋白（OVA）。
其中，所述壬基酚半抗原（式I）与所述载体蛋白偶联的摩尔比为10-15:1，优选为11-13:1。在本发明一个具体实施方式中，为11.99:1。
在本发明一个具体实施方式中，所述壬基酚抗原通过包括以下步骤的制备方法制得：
（1）将式(I)所示壬基酚半抗原化合物溶解于二甲基甲酰胺（DMF）中，然后加入羧基活化剂活化，得到溶液A；
进一步地，所述羧基活化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的复配；更进一步地，式(I)所示的壬基酚半抗原化合物、二甲基甲酰胺（DMF）、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的配比为20-30 mg：1-1.5 mL：18-21.5 mg：10-13 mg；活化过程是在室温下搅拌2-3h，搅拌转速500-1000rpm。
（2）将载体蛋白置于碳酸氢钠缓冲液中，搅拌充分溶解，得到溶液B；得到溶液B；
进一步地，碳酸氢钠溶液浓度为0.1-0.2M，所述载体蛋白与碳酸氢钠的配比为40-50mg：3.5mL；
（3）溶液A和所述溶液B混合，在0-4℃条件下搅拌24-48h，之后用磷酸盐缓冲液透析，得到壬基酚抗原。
进一步地，溶液A和溶液B混合，是500-1000rpm的搅拌条件下，溶液A缓慢滴加溶液B中，溶液A的滴加速度为1-2mL/min，溶液A和溶解B的体积用量满足溶液A中的壬基酚半抗原化合物和溶解B中的载体蛋白质量之比为1：1.5-2，优选1：1.67-2；磷酸盐缓冲液pH为7-7.5，比如pH为7.1、7.2、7.3、7.4；透析时间为3-5天，比如3天。
本发明第四个目的是提供一种壬基酚抗体，是由上述壬基酚抗原免疫动物得到。
进一步地，所述抗体选自单克隆抗体、多克隆抗体或抗血清
本发明第五个目的是提供上述式(I)所示的壬基酚半抗原的任一如下应用：
(i)在制备壬基酚抗原或者壬基酚抗体中的用途；
(ii)在制备用于检测壬基酚的设备中的用途；
(iii)在检测壬基酚方面的用途。
所述检测壬基酚的设备包括但不限于试剂盒、试剂管、免疫亲和柱、胶体金检测卡。
本发明第六个目的是提供一种检测壬基酚的方法，使用上述壬基酚抗体。
进一步地，所述检测方法包括免疫分析方法、生物传感方法、表面增强拉曼散射；更进一步地，所述免疫分析方法包括免疫亲和柱层析法、酶联免疫分析法、胶体金免疫层析法、化学发光免疫分析法、悬浮陈列法。
更进一步地，所述检测方法包括与超高效液相色谱、质谱任意一种或者两种联用。
本发明所提供的壬基酚半抗原，以及所述壬基酚抗原，合成方法简单、纯度高、产率高，对于壬基酚抗体的制备，以及壬基酚药物残留检测具有重大价值。
附图说明
图1是实施例1所得产物式(I)所示的壬基酚半抗原质谱图；
图2是实施例1所得产物式(I)所示的壬基酚半抗的核磁共振氢谱；
图3是实施例2中载体蛋白BSA MALDI-TOF检测结果；
图4是实施例2中免疫原壬基酚-BSA MALDI-TOF检测结果
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、壬基酚半抗原的制备
一、壬基酚半抗原的制备
(S1)100ml反应瓶中加入壬基酚990mg(4.5mmol)，N,N-二甲基甲酰胺（DMF）15ml搅拌溶解后加入氢化钠50mg，室温反应30 min；再加入 2-溴甲基-4-甲氧基苯甲酸甲酯774mg(3mmol)，60℃反应6小时，完成后使反应溶液降温至4℃；加入50ml水淬灭反应，加入50ml乙酸乙酯萃取，加入10g无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩后称重；加入10 mL乙酸乙酯将残留物溶解，加入2倍重量的硅胶拌样，旋蒸干燥，使用200-300目硅胶柱进行层析分离，利用石油醚：乙酸乙酯=80:1洗脱，收集主产物，减压浓缩得到油状产物，称重；
(S2)步骤(S1)所得油状产物用甲醇溶解，加入油状产物2倍摩尔量的2-3M的NaOH溶液，40 ℃下加热反应，待水解反应完全；用2 M的 HCl溶液调节至pH 2，35℃减压蒸除甲醇，50mL乙酸乙酯萃取，10g无水硫酸钠干燥，过滤后滤液减压浓缩得式I所述化合物。
合成如下：
。
二、壬基酚半抗原的结构鉴定
图1是实施例1所得产物式(I)所示的壬基酚半抗原质谱图，结果显示其化学结构式如式I所示，即为壬基酚半抗原。起始原料壬基酚仅含有一个酚羟基，目标半抗原的分子量为384.23，其分子离子峰M+Na，m/z 407.21，质谱图上m/z 407出现强峰。
图2是实施例1所得产物式(I)所示的壬基酚半抗的核磁共振（Nuclear MagneticResonance, NMR）氢谱。由图1和图2 结果可知半抗原结构正确。
实施例2、壬基酚人工抗原的制备及结构鉴定
1、免疫原的合成
（1）将30mg壬基酚半抗原用1.5mL DMF溶解，200rpm搅拌10min，加入EDC 21.5mg溶解后再加入NHS 13mg，室温搅拌（500rpm）活化2-3h。
（2）称取BSA 50mg溶于3.5mL 0.1M碳酸氢钠溶液中，200rpm搅拌10min，使其充分溶解，冰浴降温0-4℃，1000rpm搅拌下，将步骤1反应液逐滴加入（1mL/min），500rpm搅拌反应24h。
（3）将反应产物装入蒸馏水冲洗干净透析袋（10cm），1L0.01M PBS（1×，pH7.2）4℃搅拌（100rpm）透析3d，每天换液3次（早中晚各一次），共计换液9次，将透析产物5000rpm离心6min，1.5mL/管分装，将抗原编号，-20℃保存备用。
2、包被原的合成
（1）将30mg壬基酚半抗原用1.5mL DMF溶解，200rpm搅拌10min，加入EDC 21.5mg溶解后再加入NHS 13mg，室温搅拌（500rpm）活化2-3h。
（2）称取OVA 33.6mg溶于3.5mL 0.1M碳酸氢钠溶液中，200rpm搅拌10min，使其充分溶解，冰浴降温0-4℃，1000rpm搅拌下，将步骤1反应液逐滴加入（1mL/min），500rpm搅拌反应24h。
（3）将反应产物装入蒸馏水冲洗干净透析袋（10cm），1L0.01M PBS（1×，pH7.2）4℃搅拌（100rpm）透析3d，每天换液3次（早中晚各一次），共计换液9次，将透析产物5000rpm离心6min，1.5mL/管分装，将抗原编号，-20℃保存备用。
3、抗原的鉴定
（1）采用紫外吸收法测定所合成免疫原和包被原的浓度。采用0.01 M PBS作空白对照，紫外分光光度计（NanoDrop 2000）测定蛋白溶液的OD280 nm、OD260 nm，然后按下列公式计算蛋白浓度：蛋白浓度（mg/mL）=1.45 × OD280 nm- 0.74 × OD260 nm
测得免疫原和包被原的结果分别是：9.06 mg/mL和12.14 mg/mL。
（2）用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）方法对免疫原进行鉴定，图3是载体蛋白BSAMALDI-TOF检测结果，图4是免疫原壬基酚-BSA MALDI-TOF检测结果。经计算，式(I)所示壬基酚半抗原与牛血清白蛋白（BSA）偶联的摩尔比为：R=（69232.348-64623.919）/384.23=11.99：1。
实施例3、壬基酚人工抗原免疫动物制备单克隆抗体
1、动物免疫
用实施例2制备出的免疫原（NP-BSA）按100μg/只，以生理盐水溶解免疫原与弗氏完全佐剂等体积混匀，颈背部皮下注射免疫6~8周龄Balb/c雌鼠，初次免疫后第7、14、28天以免疫原与弗氏不完全佐剂等体积混匀，各追加免疫一次，融合前3天以免疫复合物100μg/只，不加弗氏佐剂再追加免疫一次。
2、抗血清的筛选
第四次免疫后第7天，通过小鼠的眼眶静脉丛采血，室温放置2 h，4000 rpm离心10min后取上层抗血清检测；采用间接 ELISA方阵法确定包被原、抗体的最佳工作浓度，再采用间接竞争ELISA方法检测抗体的特异性。选取血清效价高、IC50低的小鼠用于细胞融合。从表1可以看出，3#小鼠的血清效价相对较高且抑制效果最佳，因此选择该小鼠进行后续的细胞融合试验。
表1 小鼠的血清效价与抑制情况
。
3、细胞融合与克隆
取3#免疫小鼠的脾细胞与处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）混合，然后在45s内缓慢加入预热的融合剂（PEG4000）进行融合，用HAT培养基悬浮均匀，再加入适量的饲养细胞，培养于96孔培养板，于37℃，5％CO2培养箱中培养，5天后用HT培养基半换液，9天时候进行全换液。
待细胞长到培养孔面积的1/4时，采用分步筛选法筛选杂交瘤细胞。初选采用间接ELISA方法检测细胞培养上清，结果显示30块细胞培养板（96孔/板）共有阳性孔563孔，其中强阳性孔（效价>9000，OD max>1.8）187孔；筛选出的强阳性孔再用间接竞争ELISA方法进行检测，挑选阳性强且抑制率高的细胞培养孔进行亚克隆筛选，经多次亚克隆筛选后阳性率大100%，最终获得多株能分泌壬基酚单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其中所分泌抗体效价较高、抑制最好的细胞株为13F8。
结论：细胞株13F8细胞培养上清效价为1：81000，IC50为0.09 ng/mL。
4、单克隆抗体的制备及纯化
采用小鼠体内诱生腹水法制备壬基酚单克隆抗体。向8~10周龄Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.5 mL/只，7~10 d后腹腔注射杂交瘤细胞1~2×105/只，7~10 d后抽取小鼠腹水，4℃，5000rpm离心10 min，去除上层油脂和下层沉淀，然后用辛酸-饱和硫酸铵法对其进行纯化得到壬基酚单克隆抗体，-20 ℃保存。
所述辛酸-饱和硫酸铵单克隆抗体纯化方法如下：
①取5 mL离心后的腹水加10 mL 0.06 M pH4.0醋酸缓冲溶液，用NaOH调至pH4.5；②辛酸与稀释后腹水的比例为11 μL：1 mL，室温搅拌下逐滴加入165 μL辛酸，30 min内加完，4 ℃静置2 h，10000 rpm离心30 min；③取上清，用NaOH或HAc调至pH 7.4，边加边搅拌，在4℃下加入饱和硫酸铵至45%饱和度，作用 30 min，静置2 h；④10000 rpm离心30 min；⑤沉淀溶于等体积0.01M PBS（pH7.4）中，4℃冰箱中透析2 d，每天换两次透析液；⑥4000 rpm离心10 min，收集上清；测量抗体浓度后，-20℃保存备用。
5、单克隆抗体浓度的测定
采用0.01 M PBS作空白对照，紫外分光光度计（NanoDrop 2000）测定纯化后壬基酚单克隆抗体溶液的OD280 nm、OD260 nm，然后按下列公式计算：
蛋白浓度（mg/mL）= 1.45 × OD280 nm- 0.74 × OD260 nm。
结果：本发明所制备壬基酚单克隆抗体的浓度为2.35 mg/mL。
6、特异性测试
通过间接竞争ELISA方法测试本发明所制备单克隆抗体对壬基酚结构/功能类似物交叉反应率，包括：对壬基酚、十二烷基酚、辛基酚、双酚A、2,2',4,4'-四溴二苯醚、己烯雌酚。结果如表2所示。交叉反应率（%）= IC50 (壬基酚)/ IC50 (类似物)× 100%。
表2 壬基酚单克隆抗体交叉反应测试结果
。
从表2数据可以看出，本发明的壬基酚单克隆抗体对壬基酚的类似结构的其他化合物，交叉反应率很低，避免了假阳性检测的可能，检测准确度高。
实施例4、免疫亲和磁珠的制备及应用
通过EDC/NHS方法将本发明制备的壬基酚单克隆抗体偶联到磁微粒上，用于复杂基质中壬基酚的净化和富集。
1）取100 mL羧基磁珠（10 mg/mL），放入磁力架磁分离15 min，液体澄清后，弃去液体；
2）加入100 mL MEST（0.1M，pH 6.0）溶液，充分混匀，进行磁分离，弃去液体；
3）向100 mL MEST（0.1M，pH 6.0）中加入1.0 g NHS和1.0 g EDC，通过超声（2min）溶解、摇匀后，加入到上述清洗后的磁珠中，室温振荡反应1.0 h；
4）取8 mL壬基酚抗体（2.35 mg/mL）加入到上述磁珠溶液中，室温振荡反应2.0 h；
5）经磁分离后，弃去液体，加入含0.1% BSA的100 mL MEST（0.1M，pH 6.0），室温振荡反应2.0 h；
6）经磁分离，弃液，利用100 mL MEST（0.1M，pH 6.0）溶液洗涤一次，通过磁分离弃液后用磁珠抗体复溶液定容至100 mL，于2-8 ℃避光保存，备用。
实施例5、壬基酚间接竞争酶联免疫检测方法的建立
通过棋盘法确定包被原、壬基酚单克隆抗体的最佳用量及最适包被液。具体操作如下：
1）抗原包被：用包被液将包被原NP-OVA稀释成系列浓度（1:1000，1:3000，1:9000，1:27000，1:81000，1:243000），分别按照100 μL/孔加入96孔板中，37℃孵育2 h；其中，测试筛选两种包被液：0.05 M 碳酸盐缓冲液（pH 9.6）和0.01 M磷酸盐缓冲液（pH 7.2）。
2）洗涤：倾去孔内液体，用洗涤液（PBST）洗3遍，270 μL/孔，在吸水纸上拍干。
3）封闭：加入封闭液200 μL/孔，37℃孵育2 h，封闭结束后用洗涤液（PBST）洗3遍，270 μL/孔，在吸水纸上拍干。
4）加样：加入系列浓度的壬基酚标准品（0.00 ng/mL、0.005 ng/mL、0.015 ng/mL、0.045 ng/mL、0.135ng/mL、0.405 ng/mL和1.215 ng/mL）50 μL/孔，再加入适当稀释壬基酚单克隆抗体50 μL/孔，37℃孵育30 min；其中，测试的壬基酚单克隆抗体的稀释梯度包括：1:1000，1:3000，1:9000，1:27000，1:81000，1:243000。
5）洗涤：倾去孔内液体，用洗液（PBST）洗3遍，270 μL/孔，在吸水纸上拍干。
6）加酶辣根过氧化物酶标记的二抗：加入HRP-羊抗鼠IgG（1:5000稀释）100 μL/孔，37 ℃孵育30 min。
7）洗涤：倾去孔内液体，用洗液洗3遍，270 μL/孔，在吸水纸上拍干。
8）显色：加入新鲜配制的TMB底物溶液，100 μL/孔，避光显色10 min。
9）终止：加入终止液，50 μL/孔。
10）测定：用酶标仪读取各孔OD450 nm值（双波长：630 nm为参考滤光片波长）。
结果：通过棋盘法测试，筛选得到最适包被液为0.05 M 碳酸盐缓冲液（pH 9.6），包被原NP-OVA的最佳包被浓度为450 ng/mL，壬基酚单克隆抗体的最适浓度为 29 ng/mL。
实施例6、壬基酚免疫磁珠及ELISA检测方法的应用
1、样本前处理
对于动物源性样品（鸡肉、鸭肉、猪肉、鱼肉、鸡蛋等），样品均质后准确称取5.00(±0.01) g于50 mL离心管中，加入20 mL乙腈涡旋混匀约1 min，超声提取10 min，12000rpm离心5 min，转移上清至另一离心管中；沉淀中再加入20 mL乙腈重复提取一次，合并两次上清，50 ℃氮气吹干，加入5 mL含5%甲醇的10 mM PBS（pH 8.0）混合溶液，涡旋溶解备用。向上述提取液中加入上述制备的免疫磁珠150 μL，室温结合反应10 min，经磁吸移去上清；加入5 mL 10 mM PBS（pH 8.0）涡旋混匀30 s，磁吸2 min，弃去上清；加入1 mL 20 mMPBS（pH8.0），混匀后放入金属浴（100 ℃）中加热2 min，然后经磁吸后，转移上清至另一离心管中备用，待测。
2、检测步骤
（1）将NP-OVA（9.57 mg/mL）使用0.05 M碳酸盐缓冲液做1:27000稀释，按照100 μL/孔加入96孔板中，37℃孵育2 h，倾去孔内液体，用洗涤液（PBST）洗3遍，270 μL/孔，在吸水纸上拍干。
（2）加入封闭液200 μL/孔，37℃孵育2 h，封闭结束后弃去孔内液体，用洗涤液（PBST）洗3遍，270 μL/孔，在吸水纸上拍干。
（3）将50 μL各浓度的壬基酚标准品工作液（或待测样品溶液）分别加入对应的标准品（或待测样品孔）中，再向每孔中加入50 μL壬基酚单克隆抗体（29 ng/mL），震荡混匀，37℃孵育30 min；记录下各标准品和样品的位置，建议均做双孔平行。
（4）弃去孔内液体，用洗涤液（PBST）洗3遍，270 μL/孔，在吸水纸上拍干。
（5）加入HRP-羊抗鼠IgG（1:5000稀释）100 μL/孔，37 ℃孵育30 min。
（6）弃去孔内液体，用洗涤液（PBST）洗3遍，270 μL/孔，在吸水纸上拍干。
（7）盖好盖板膜，轻轻振荡酶标板10 s，充分混匀，室温下（25±2 ℃），避光反应30min。
（8）倒掉板孔中液体，在每孔加入260 μL洗涤工作液，充分洗涤4次，每次浸泡15-30 s。
（9）倒掉板孔中液体，将酶标板倒置于吸水纸上，拍干。
（10）加入新鲜配制的TMB底物溶液，100 μL/孔，避光显色10 min。
（11）终止：加入终止液，50 μL/孔。
（12）测定：用酶标仪读取各孔OD450 nm值（双波长：630 nm为参考滤光片波长）。
（13）结果计算或判定
①各标准品（或待测样品）的平均吸光度值，除以零标（浓度为0 ng/mL的标准品）吸光度值，乘以100，可以得到各标准品对应的吸光度的百分比，即百分吸光度值；②以各标准品的百分吸光度值为纵坐标，以对应的壬基酚浓度为横坐标绘制标准曲线；③将待测样品的百分吸光度值代入标准曲线方程，可得出待测样品对应的浓度，再乘以相应样品的稀释倍数，方得待测原样品中壬基酚的实际含量。
实施例7、壬基酚免疫磁珠及酶联免疫检测方法的评价及应用
1、最低检测限测定
取20份空白样品进行检测，根据标准曲线求出测定值，计算出其平均值，再加上3倍标准差，即为最低检测限。结果如下表3所示。
表3 空白样品测定结果统计表（µg/kg）
。
结果如表3所示，本发明提供的壬基酚酶联免疫试剂盒在鸡肉中的检测限为0.0093μg/kg，在鸭肉中的检测限为0.0101 μg/kg，在猪肉中的检测限为0.0106 μg/kg，在鱼肉中的检测限为0.0103 μg/kg，在鸡蛋中的检测限为0.0104 μg/kg。
2、方法准确度和精密度的测定
准确度是指测定值与真实值的符合程度，在ELISA测定中，准确度常以回收率表示，精密度常以变异系数来表示。取空白鸡肉、鸭肉、猪肉、鱼肉、鸡蛋样品，按0.001 µg/kg、0.002 µg/kg壬基酚标准品进行添加，每个添加5个平行。用3个批次的试剂盒测定，计算添加回收率及批内批间变异系数。结果如下表4所示。
表4 准确度和精密度检测结果
/>
结果表明，鸡肉、鸭肉、猪肉、鱼肉、鸡蛋样品各添加浓度的回收率在83.04%～113.35%之间，批内变异系数2.74~9.10%，批间变异系数8.84~11.76%。

Claims (7)

1.一种壬基酚半抗原，其特征在于，其结构如式I所示：
(I)。
2.权利要求1所述式(I)所示的壬基酚半抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
；
(S1)壬基酚和2-溴甲基-4-甲氧基苯甲酸甲酯在碱存在下反应制备得到中间体式(II)化合物；
(S2)式(II)化合物依次经过水解、中和得到式(I)化合物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(S1)中，壬基酚和2-溴甲基-4-甲氧基苯甲酸甲酯的摩尔比为1-3:1，碱为氢化钠和/或氢化钾，加入量是壬基酚质量的5-10wt%；反应在有机溶剂中进行，有机溶剂选自DMF、DMSO中至少一种，有机溶剂用量和壬基酚的比例为1mL：50-80mg；反应条件是在温度50-70℃反应5-10h；反应结束后，降温至4-8℃，加入水淬灭反应，萃取，干燥，过滤，减压浓缩，硅胶层析柱提纯得到中间体(II)；和/或
步骤(S2)中，所述水解是式(II)化合物用甲醇溶解，加入碱在40-50℃条件下水解完全，碱为浓度1-2M的NaOH和/或KOH的水溶液，碱的用量是中间体式(II)化合物摩尔量的1-2倍；所述中和是加入0.5-2M的HCl水溶解，使体系pH为2-3。
4.一种壬基酚抗原，其特征在于，为权利要求1所述式(I)化合物和载体蛋白偶联得到。
5.根据权利要求4所述的壬基酚抗原，其特征在于，所述载体蛋白选自牛甲状腺球蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清白蛋白和卵清蛋白中的至少一种；
所述壬基酚半抗原（式I）与所述载体蛋白偶联的摩尔比为10-15:1。
6.一种壬基酚单克隆抗体，其特征在于，是由权利要求4或5所述壬基酚抗原免疫动物得到。
7.权利要求1所述式(I)所示的壬基酚半抗原的任一如下应用：
(i)在制备壬基酚抗原或者壬基酚抗体中的用途；
(ii)在制备用于检测壬基酚的设备中的用途；
(iii)在检测壬基酚方面的用途；
所述检测壬基酚的设备包括试剂盒、试剂管、免疫亲和柱、胶体金检测卡。
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