CN115746015B

CN115746015B - 一种虾夷扇贝毒素半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN115746015B
Application number: CN202211300672.5A
Authority: CN
Inventors: 王恒; 严剑波; 王玉超
Original assignee: ZHOUSHAN DISEASE PREVENTION CONTROL CENTRAL
Current assignee: ZHOUSHAN DISEASE PREVENTION CONTROL CENTRAL
Priority date: 2022-10-21
Filing date: 2022-10-21
Publication date: 2024-02-09
Anticipated expiration: 2042-10-21
Also published as: CN115746015A

Abstract

本发明公开了一种虾夷扇贝毒素半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用。所述虾夷扇贝毒素半抗原的结构式如式(I)所示，应用该半抗原制备得到用于检测虾夷扇贝毒素的人工抗原和抗体。采用本发明提供的虾夷扇贝人工抗原、抗体制备的酶联免疫试剂盒对虾夷扇贝毒素的检测灵敏度为0.001ng/mL，IC₅₀为0.11ng/mL，线性范围为0.001～0.75ng/mL。该酶联免疫试剂盒，使用方便、检测成本低，检测方法快速、高效、准确，适合海洋藻类、贝类组织中虾夷扇贝毒素残留的现场控制和大量样本的筛查，具有良好的应用前景。

Description

一种虾夷扇贝毒素半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及食品检测技术领域，更具体地，涉及一种虾夷扇贝毒素半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用。

背景技术

虾夷扇贝毒素(Yessotoxin，YTX)及其衍生物是一类含有2个磺酰基的脂溶性多环聚醚类化合物，它们的化学结构极为相近，其中有些是由海洋甲藻产生的，部分为滤食性贝类体内代谢转化而来。目前已检出的体内含有YTXs的贝类等海洋生物分布于中国、日本、新西兰、挪威、意大利、加拿大和美国等国家附近海域。生物毒理学研究显示YTX是一种毒性较强的细胞毒素，急性致死率很高，小鼠致死剂量在100μg/kg左右，半致死剂量(LC50)则随着生物的不同而各有差异，数值在80-750000μg/kg之间。欧盟制定了相关的法律法规，将YTX的食用安全浓度规定为1mg/kg贝肉，2013年将安全限量调整为3.75mg/kg贝肉。YTX能降低细胞内cAMP浓度，诱导激活人的成神经细胞癌细胞系、肝细胞、肝癌细胞、Hela细胞及鼠成肌细胞系凋亡相关的Capase家族蛋白，因而被认为是一种肿瘤促进剂。

目前，虾夷扇贝毒素测定方法的文献报道不多，包括小鼠生物法、薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)以及色谱-质谱联用法(LC-MS/MS)。小鼠生物法是一种传统的检测贝类毒素的方法，1994年小鼠法在我国被广泛用于海洋毒素的检测，该方法可以获得检测物质的毒性大小，但是其缺乏对YTX检测的特异性，检测的灵敏度低，在提取YTX毒素的过程中由于其他海洋毒素的干扰进而造成测试结果的假阳性。从动物道德伦理方面考虑，欧盟目前已经废止了小鼠法用于海洋毒素的测定工作。TLC法主要用于YTX毒素的分离和纯化，检测灵敏度低。HPLC-FLD法由于共流出物背景干扰，采用荧光检测在灵敏度和选择性方面存在问题。采用色谱质谱法(LC-MS/MS)检测，可提高选择性和灵敏度，但设备昂贵，对专业技术人员要求较高，2011年欧盟将该方法确定为定量检测YTX的标准方法。免疫分析检测技术是基于抗原抗体反应的原理，利用毒物与标记毒物竞争性结合抗体检测毒物的方法，可用于某些毒药物的筛选试验。免疫分析检测法，具有样本前处理简便、操作简单、快速、灵敏的高通量等特点，在食品安全领域具有广阔的应用前景，但是对于免疫分析法而言，抗体作为核心原材料，抗体的效果很大程度上取决于引起相应动物发生免疫反应的抗原结构。因此，为了确保食品安全和对外出口贸易的发展，建立准确可靠，灵敏度高，对仪器设备和人员要求低的虾夷扇贝毒素免疫分析检测技术，进而适合现场监控和大规模样本筛选的定性定量方法是十分必要的。而免疫检测方法的建立，关键在于设计出合适的虾夷扇贝毒素人工抗原并获得灵敏度高、特异性强的抗体，但是目前还未见有关于虾夷扇贝毒素的半抗原、人工抗原、抗体等的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中缺少虾夷扇贝毒素半抗原、人工抗原、抗体的缺陷和不足，提供一种虾夷扇贝毒素半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用。

本发明的第一个目的在于提供一种虾夷扇贝毒素半抗原。

本发明的第二个目的在于提供所述虾夷扇贝毒素半抗原的制备方法。

本发明的第三个目的在于提供一种虾夷扇贝毒素人工抗原。

本发明的第四个目的在于提供所述虾夷扇贝毒素人工抗原的制备方法。

本发明的第五个目在于提供一种虾夷扇贝毒素抗体。

本发明的第六个目在于提供一种检测虾夷扇贝毒素的试剂盒。。

本发明的第七个目在于提供一种检测虾夷扇贝毒素的免疫分析方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一种虾夷扇贝毒素半抗原，所述半抗原的结构式如式(I)所示：

本发明提供的式(I)所述的虾夷扇贝毒素半抗原具活性的-Br基团，可与载体蛋白、抗体、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等分子上的氨基结合，制备多种检测试剂。所述虾夷扇贝毒素半抗原最大程度地保留了虾夷扇贝毒素的分子骨架结构，有利于高特异性抗体的诱导。

本发明还提供所述虾夷扇贝毒素半抗原的制备方法，包括如下步骤：

S1.将虾夷扇贝毒素溶于溶剂中，加入缓冲液，再加入1,2-乙二硫醇反应，反应完毕后萃取并合并有机相，洗涤、干燥、过滤，除溶剂，干燥得黄色固体；

S2.将步骤S1所得黄色固体溶于溶剂中，加入环氧溴丙烷反应，反应完毕后去除溶剂及过量的环氧溴丙烷，得黄色膏体，再多次重结晶，干燥得黄色固体，即为式(I)所示虾夷扇贝毒素半抗原。

优选地，所述溶剂为四氢呋喃。

优选地，所述缓冲液为pH 7.4，0.1M的磷酸铵缓冲液。

优选地，步骤S1所述反应为室温反应6h，通过TLC指示反应是否完成。

优选地，萃取所用萃取剂为乙酸乙酯。

优选地，所述洗涤为采用稀盐酸，所述干燥为采用无水硫酸钠干燥。

优选地，步骤S1所述除溶剂采用减压蒸除溶剂。

优选地，所述虾夷扇贝毒素与1,2-乙二硫醇的摩尔比为1:20～100。

进一步优选地，所述虾夷扇贝毒素与1,2-乙二硫醇的摩尔比为1:40～80；再优选地，所述虾夷扇贝毒素与1,2-乙二硫醇的摩尔比为1:50～60。

优选地，步骤S2所述反应为40℃恒温反应3h，通过TLC指示反应是否完成。

优选地，步骤S2所述去除溶剂采用旋转蒸发法。

优选地，所述重结晶采用体积比为1:1的丙酮和正己烷混合溶剂。

优选地，所述虾夷扇贝毒素与环氧溴丙烷的摩尔比为1:5～15。

进一步优选地，所述虾夷扇贝毒素与环氧溴丙烷的摩尔比为1:8～12；再优选地，虾夷扇贝毒素与环氧溴丙烷的摩尔比为1:9～11。

本发明还提供所述虾夷扇贝毒素半抗原在制备虾夷扇贝毒素人工抗原中的应用。

一种虾夷扇贝毒素人工抗原，所述虾夷扇贝毒素人工抗原的结构式如式(II)所示：

优选地，所述载体蛋白选自牛血清白蛋白(BSA)或鸡卵白蛋白(OVA)。

本发明还提供所述虾夷扇贝毒素人工抗原的制备方法，是将式(I)所述虾夷扇贝毒素半抗原溶于溶剂后，滴加到含有载体蛋白的缓冲液中反应，再加入乙醇胺封闭，调节pH至7.2～7.5，4～6℃反应，透析纯化，即得式(II)所示虾夷扇贝毒素人工抗原。

优选地，所述虾夷扇贝毒素半抗原与载体蛋白的摩尔比为10～70:1。

进一步优选地，所述虾夷扇贝毒素半抗原与载体蛋白的摩尔比为30～60:1；再优选地，所述虾夷扇贝毒素半抗原与载体蛋白的摩尔比为40～50:1。

优选地，所述虾夷扇贝毒素半抗原与乙醇胺的摩尔比为1:10～60。

进一步优选地，所述虾夷扇贝毒素半抗原与乙醇胺的摩尔比为1:20～50；再优选地，所述虾夷扇贝毒素半抗原与乙醇胺的摩尔比为1:30～40。。

作为一种优选地可实施方式，所述虾夷扇贝毒素人工抗原的制备方法，包括如下步骤：

以DMF为溶剂，溶解虾夷扇贝毒素半抗原，滴加到10～20mg/mL的载体蛋白溶液，搅拌，调节pH至7.4，室温反应18h；再加入乙醇胺封闭，调pH 7.4，4℃搅拌过夜；对0.01M，pH7.2磷酸盐缓冲液透析6次，即得虾夷扇贝毒素人工抗原。

本发明还提供上述任一所述虾夷扇贝毒素人工抗原在制备虾夷扇贝毒素抗体中的应用。

本发明还提供一种虾夷扇贝毒素抗体，是以上述式(II)所示虾夷扇贝毒素人工抗原为免疫原免疫动物制备得到。

优选地，所述虾夷扇贝毒素抗体为虾夷扇贝毒素单克隆抗体。

本发明还提供上述任一所述虾夷扇贝毒素人工抗原、虾夷扇贝毒素抗体在制备用于检测海洋藻类、贝类组织中虾夷扇贝毒素残留的试剂盒中的应用。

本发明还提供一种检测虾夷扇贝毒素的试剂盒，包含上述任一所述虾夷扇贝毒素人工抗原作为包被原和上述任一所述虾夷扇贝毒素抗体作为检测抗体。

优选地，所述试剂盒为酶联免疫试剂盒。

进一步优选地，所述试剂盒还包含酶联免疫反应相关试剂。

本发明还提供一种检测虾夷扇贝毒素的免疫分析方法，是以上述任一所述虾夷扇贝毒素人工抗原作为包被原，以上述任一所述虾夷扇贝毒素抗体作为检测抗体进行检测。所述免疫分析方法包括但不局限于酶免疫分析、免疫层析、免疫传感、免疫胶体金等。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了虾夷扇贝毒素半抗原，所述虾夷扇贝毒素半抗原具活性的-Br基团，可与载体蛋白、抗体、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等分子上的氨基结合，制备多种检测试剂。所述虾夷扇贝毒素半抗原最大程度地保留了虾夷扇贝毒素的分子骨架结构，有利于高特异性抗体的诱导。同时，本发明提供由的虾夷扇贝毒素半抗原直接偶联载体蛋白得到的人工抗原，合成方法简单，纯度、产率较高。虾夷扇贝毒素人工抗原免疫实验动物后使机体产生针对虾夷扇贝毒素的抗体。通过本发明提供的虾夷扇贝毒素人工抗原制备的单克隆抗体具有效价高、亲和力强、交叉反应率低等特点，与虾夷扇贝毒素其他组分和其他贝类毒素无交叉反应，即在免疫检测过程中不会受到这些结构类似物的干扰，极大的降低了检测过程的假阳性或假阴性。采用本发明提供的虾夷扇贝抗原抗体制备的酶联免疫试剂盒对虾夷扇贝毒素的检测灵敏度为0.001ng/mL，IC₅₀为0.11ng/mL，线性范围为0.001～0.75ng/mL。该酶联免疫试剂盒，使用方便、检测成本低，检测方法快速、高效、准确，适合海洋藻类、贝类组织中虾夷扇贝毒素残留的现场控制和大量样本的筛查，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为虾夷扇贝毒素半抗原合成路线图。

图2为虾夷扇贝毒素人工抗原SDS凝胶电泳图。

图3为虾夷扇贝毒素ELISA标准曲线。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1虾夷扇贝毒素半抗原的合成与鉴定

1、虾夷扇贝毒素半抗原的合成，合成路线如图1所示；

(1)将50mg的虾夷扇贝毒素用1mL四氢呋喃溶解，滴入5mL，pH 7.4，0.1M的磷酸铵缓冲液，不断搅拌，之后滴入1,2-乙二硫醇，虾夷扇贝毒素与1:2-乙二硫醇的摩尔比为1:55，室温反应6h，TLC显示反应完毕，再加入等体积的乙酸乙酯萃取，合并有机相，稀盐酸洗涤后经过无水硫酸钠干燥，过滤，过滤液减压蒸除溶剂，60℃干燥得黄色固体即为产物1；

(2)用5mL的四氢呋喃溶解产物1，加入环氧溴丙烷，升温至40℃，在磁子搅拌下恒温反应3h，TLC显示反应完毕，旋转蒸发去除四氢呋喃和过量的环氧溴丙烷，得到黄色膏体，用2mL比例为1:1的丙酮和正己烷混合溶剂多次重结晶，60℃干燥，制得黄色固体为产物2，其中虾夷扇贝毒素与环氧溴丙烷的摩尔比为1:10。

2、虾夷扇贝毒素半抗原的鉴定

将上述制备得到的产物2送至北京中科汇仁科技有限公司进行核磁鉴定，具体结果如下：¹H NMR:δ1.19-2.42(50H,1.28(ddddd,J＝12.8,8.8,6.7,5.5,1.5Hz),1.33(dddd,J＝13.0,6.8,1.6,1.5Hz),1.36(ddddd,J＝12.8,10.3,8.8,5.5,2.7Hz),1.36(ddddd,J＝12.8,5.5,3.1,2.7,1.4Hz),1.40(dddd,J＝12.9,7.4,3.1,2.7Hz),1.41(dddd,J＝13.0,9.5,7.5,6.7Hz),1.41(ddddd,J＝10.1,7.4,6.2,3.7,2.3Hz),1.44(ddddd,J＝12.8,7.5,6.8,5.5,1.4Hz),1.43(ddd,J＝13.2,4.5,4.3Hz),1.47(dddd,J＝12.9,10.3,6.2,2.7Hz),1.48(ddd,J＝13.1,4.6,4.2Hz),1.50(ddd,J＝13.1,10.1,9.9Hz),1.50(dddt,J＝9.6,4.6,3.6,1.8Hz),1.52(ddddd,J＝9.5,4.5,3.7,1.8,1.6Hz),1.52(dt,J＝13.1,10.2Hz),1.55(dddd,J＝13.1,4.5,3.1,1.6Hz),1.58(ddd,J＝13.0,8.1,7.7Hz),1.59(dddd,J＝13.0,8.8,7.1,1.4Hz),1.63(ddddd,J＝10.2,8.1,3.6,2.9,2.5Hz),1.62(ddd,J＝13.1,2.3,1.9Hz),1.65(dddd,J＝12.9,8.7,4.5,2.4Hz),1.67(ddd,J＝13.0,7.9,7.8Hz),1.69(dddd,J＝13.1,8.7,5.9,3.7Hz),1.69(ddd,J＝13.1,2.1,1.8Hz),1.70(ddd,J＝13.1,2.9,2.6Hz),1.71(ddd,J＝13.0,4.7,2.5Hz),1.72(dddd,J＝13.3,10.1,8.8,1.4Hz),1.73(dddd,J＝13.0,6.3,1.7,1.4Hz),1.74(ddd,J＝13.2,2.0,1.8Hz),1.78(ddd,J＝13.0,2.0,,1.8Hz),1.83(dddd,J＝13.3,6.3,1.7,1.4Hz),1.83(dddd,J＝12.9,5.9,3.2,1.6Hz),1.86(ddd,J＝13.0,9.6,9.4Hz),1.87(ddddd,J＝10.3,4.3,3.0,2.6,2.0Hz),1.93(ddddd,J＝10.1,7.8,7.6,1.8,1.7Hz),1.95(ddddd,J＝9.9,4.2,3.0,2.1,1.9Hz),1.96(ddtd,J＝7.7,7.1,4.7,1.7Hz),2.01(ddd,J＝14.8,2.0,1.5Hz),2.09(ddd,J＝14.8,5.2,3.9Hz),2.10(ddddd,J＝7.9,7.7,3.7,3.1,2.0Hz),2.10(ddd,J＝13.0,1.8,1.6Hz),2.16(dt,J＝14.5,7.9Hz),2.23(ddd,J＝14.5,4.2,3.9Hz),2.25(ddd,J＝14.8,3.4,2.7Hz),2.28(ddd,J＝14.8,5.7,4.3Hz),2.30(dd,J＝7.1,6.6Hz),2.30(dd,J＝7.1,6.6Hz),2.32(ddd,J＝14.8,1.9,1.4Hz),2.33(ddd,J＝14.8,2.9,2.1Hz),2.35(dd,J＝14.2,5.4Hz)),2.53(1H,dd,J＝14.2,7.8Hz),3.62(1H,dd,J＝4.8,2.8Hz),3.76(1H,ddd,J＝4.8,3.2,2.4Hz),3.88(1H,ddd,J＝5.2,3.9,1.5Hz),4.15-4.41(9H,4.21(ddd,J＝9.4,4.8,1.6Hz),4.23(ddd,J＝3.9,2.2,2.0Hz),4.23(ddd,J＝4.3,2.2,1.9Hz),4.26(ddd,J＝5.7,4.6,1.4Hz),4.29(ddd,J＝7.8,5.4,3.9Hz),4.28(ddd,J＝4.6,3.4,2.1Hz),4.29(td,J＝2.9,2.7Hz),4.32(ddd,J＝7.8,7.7,4.2Hz),4.33(ddd,J＝7.9,7.6,3.9Hz)),4.79-5.11(5H,4.86(dd,J＝10.3,1.7Hz),4.92(t,J＝6.6Hz),5.03(dd,J＝17.4,1.7Hz),5.06(d,J＝1.5Hz),5.06(d,J＝1.5Hz)),5.60(1H,dt,J＝15.7,7.1Hz),6.01(1H,dd,J＝15.7,10.3Hz),6.48(1H,dt,J＝17.4,10.3Hz).C₆₅H₁₀₀Br₂O₁₅S₄,Exact Mass 1406.43Molecularweight1409.55m/z:1408.43；

可知所述虾夷扇贝毒素半抗原的结构式如式(I)所示：

实施例2虾夷扇贝毒素人工抗原的合成

将10mg的实施例1合成的虾夷扇贝毒素半抗原用0.2mL的DMF溶解，滴加到1mL浓度为13mg/mL的牛血清白蛋白磷酸盐缓冲液(0.1M，pH 7.4)中，搅拌，室温反应18h；再加入12mg的乙醇胺封闭，调pH 7.4，4℃搅拌过夜；对0.01M，pH 7.2磷酸盐缓冲液透析6次，即得虾夷扇贝毒素人工抗原YTX-BSA，分装，-20℃保存。

SDS-PAGE鉴定：采用SDS-PAGE跑胶鉴定上述人工抗原，浓缩胶的电压选用90V，分离胶的电压选用120V，上样时，每孔的蛋白含量约为2～5μg。跑完胶后，考马斯亮蓝染色液染色2h，接着用考马斯亮蓝脱色液脱色过夜，脱色完全后，凝胶成像***拍照，保存并分析结果。

结果如图2所示，可以看出人工偶联产物YTX-BSA的电泳条带分别与载体蛋白BSA的条带相比分子量增加，增加大约20000Da，说明YTX半抗原与大分子载体蛋白偶联成功。

实施例3虾夷扇贝毒素单克隆抗体制备

(1)虾夷扇贝毒素人工抗原免疫动物

将实施例2制备的虾夷扇贝毒素人工抗原YTX-BSA作为免疫抗原，对6-8周龄的雌性BALB/c小鼠进行免疫，免疫剂量50μg/只，首次免疫为弗氏完全佐剂，之后使用弗氏不完全佐剂，第五次免疫结束后，10天后尾静脉采血，分离血清测试免疫血清的特异性。最后一次免疫三天后摘取小鼠脾脏，做细胞融合。

(2)细胞融合

取免疫的BALB/c小鼠脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞按10:1的比例混合，1000rpm离心15min，弃上清，置40℃水浴预热，90s内加完预热至38℃的0.6mL50％ PEG1500，然后在5min内加入30mL预热至37℃的DMEM不完全培养基，室温静置10min，弃上清，加入20mL，20％ FCS和HAT的DMEM培养基重悬。加入到已有饲养细胞的96孔板上，培养7-11d后，观察细胞的生长状况，取上清进行抗体检测。

(3)抗虾夷扇贝毒素抗体杂交瘤细胞的筛选

虾夷扇贝毒素人工抗原YTX-BSA(蛋白含量4mg/mL)用包被液为0.05mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液，10000倍稀释包被ELISA板，100μL/孔，置37℃包被3h；PBST洗涤3次，以300μL/孔，5％的BSA封闭液封闭，37℃放置2h；将细胞上清、1:500稀释的阳性参考血清和1:500稀释的阴性参考血清，加入相应孔内，100μL/孔，37℃孵育40min；洗涤后加入1:10000稀释的酶标羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃放置30min，洗涤后加入100μL/底物TMB-H₂O₂溶液，避光显色10min；每孔加入50μL，2mol/L硫酸溶液终止反应。经酶标仪测定OD₄₅₀nm值：以空白对照调零，当阳性参考血清的OD₄₅₀nm值与阴性参考血清的OD₄₅₀nm值的比值≥2.1，检测孔判为阳性，当阳性参考血清的OD₄₅₀nm值与阴性参考血清的OD₄₅₀nm值的比值＜1.5的检测孔判为阴性，比值介于中间判为可疑。

(4)有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行亚克隆

采用有限稀释法对阳性孔进行亚克隆。9天后取细胞上清，及时进行ELISA检测。选择阳性的单克隆细胞再进行同样的亚克隆3次以上，直至所有细胞孔上清液检测均为阳性；将多次亚克隆培养后的阳性细胞扩大培养和冻存，获得稳定分泌虾夷扇贝毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株命名为12D-9。

(5)抗虾夷扇贝毒素单克隆抗体的生产

BALB/c小鼠腹腔接种0.25mL弗氏不完全佐剂，3天后，腹腔接种6×10⁵杂交瘤细胞，13天后，处死小鼠，无菌条件下将腹水吸出。室温静止30min，5000rpm，离心20min，收集上清，分装，-70℃冻存备用。

实施例4虾夷扇贝毒素单克隆抗体的特异性试验

(1)虾夷扇贝毒素ELISA标准曲线的制作

将虾夷扇贝毒素人工抗原YTX-BSA包被原用碳酸盐缓冲液稀释到0.5μg/mL的浓度，加入到酶标板中，4℃过夜包被。将虾夷扇贝毒素标准品(购自大连精检生物科技有限公司，货号D-00891)用0.01M，pH7.2的磷酸盐缓冲液(含15％甲醇)系列稀释，每孔加入50μL，之后加入适当稀释的抗虾夷扇贝毒素单克隆抗体，37℃温浴30min，洗板，加入羊抗鼠酶标二抗反应30min，洗涤酶标板后，加入TMB-H₂O₂底物，显色后2M硫酸加入终止反应，酶标仪测试OD值。用每个浓度的标准品溶液得吸光度值除以第一个标准品溶液(0标准)的吸光度值(B₀)再乘以100％，得到百分比吸光度值。以虾夷扇贝毒素标准品浓度(ng/mL)的浓度为X轴，百分比吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。得到的标准曲线如图3所示。

百分比吸光度值％＝B/B₀×100％

(2)抗虾夷扇贝毒素抗体的交叉反应率

采用间接竞争ELISA测试抗体的交叉反应率，将其他药物系列稀释，待测药物代替步骤(1)中所测虾夷扇贝毒素。具体步骤如下：

将虾夷扇贝毒素人工抗原YTX-BSA包被原用碳酸盐缓冲液稀释到0.25μg/mL的浓度，加入到酶标板中，4℃过夜包被。将虾夷扇贝毒素结构类似物标准品用0.01M，pH7.2的磷酸盐缓冲液(含10％甲醇)系列稀释，每孔加入50μL，之后加入适当稀释的虾夷扇贝毒素单克隆抗体，37℃温浴30min，洗板，加入羊抗鼠酶标二抗反应30min，洗涤酶标板后，加入TMB底物，显色后2M硫酸加入终止反应，酶标仪测试OD值。

根据检测结果绘制浓度-抑制率曲线，计算各竞争物的IC₅₀值，同时用下式计算各竞争物与虾夷扇贝毒素单克隆抗体的交叉反应率。

交叉反应率＝[IC₅₀(YTX)/IC₅₀(YTX结构类似的竞争物)]×100％

虾夷扇贝毒素单克隆抗体与虾夷扇贝毒素类似物以及其他贝类毒素的交叉反应率见表1。由表1可以看出，虾夷扇贝毒素与虾夷扇贝毒素类似物无交叉反应，检测过程中，不受虾夷扇贝毒素类似物或其他贝类毒素的影响，表明本发明的制备的虾夷扇贝毒素单克隆抗体特异性强，在免疫检测过程中不会受到这些结构类似物的干扰，极大的降低了检测过程的假阳性或假阴性。

表1虾夷扇贝毒素单克隆抗体(12D-9)的交叉反应率

实施例5虾夷扇贝毒素酶联试剂盒的准确度试验

虾夷扇贝贝柱样品的前处理：虾夷扇贝样本，洗净去壳，准确称取5g虾夷扇贝贝柱组织，加入20mL，80％甲醇水溶液，40000转，均质2min，定容至25ml，10000rpm离心20min，去沉淀，取100μL上清与加900μL样本稀释液，即可用于酶联免疫分析，样本稀释倍数为50。采用实施例4中的方法制备的酶标板，取三个浓度的虾夷扇贝毒素标准品溶液，分别为1.0μg/kg、2.5μg/kg、5.0μg/kg，分别对样品进行添加回收试验，每个浓度做3个平行，分别计算回收率。

结果如表2所示，虾夷扇贝毒素在虾夷扇贝样本中添加回收率在85.7％～92.7％之间，表明由本发明提供的虾夷扇贝抗原、抗体制备的虾夷扇贝毒素检测试剂盒的准确度较高。

表2虾夷扇贝毒素ELISA添加回收率试验

实施例6虾夷扇贝毒素酶联试剂盒的精密度试验

从每批实施例4中的方法制备的酶标板中，各抽出10个微孔，测定1ng/mL标准溶液的吸光度值(OD值)，重复3次，计算变异系数CV％(表3)。

表3所示，批内变异系数范围在12.3-15.6％之间，符合变异系数小于20％的规定，说明本试剂盒标准品精密度达到了标准。

表3虾夷扇贝毒素ELISA试剂盒精密度试验

实验例7虾夷扇贝毒素酶联试剂盒稳定性试验

试剂盒保存条件为2～8℃，经过6个月的测定，试剂盒的最大吸光度值(零标准)、50％抑制浓度、虾夷扇贝毒素添加实际测定值均在正常范围之内。37℃加速老化实验，结果表明该试剂盒各项指标符合要求。

以上示例性实施方式所呈现的描述仅用以说明本发明的技术方案，并不想要成为毫无遗漏的，也不想要把本发明限制为所描述的精确形式。显然，本领域的普通技术人员根据上述教导做出很多改变和变化都是可能的。选择示例性实施方式并进行描述是为了解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的其它技术人员便于理解、实现并利用本发明的各种示例性实施方式及其各种选择形式和修改形式。本发明的保护范围意在由所附权利要求书及其等效形式所限定。

Claims

1.一种虾夷扇贝毒素半抗原，其特征在于，所述半抗原的结构式如式（I）所示：

。

式（I）

2.权利要求1所述虾夷扇贝毒素半抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S2.将步骤S1所得黄色固体溶于溶剂中，加入环氧溴丙烷反应，反应完毕后去除溶剂及过量的环氧溴丙烷，得黄色膏体，再多次重结晶，干燥得黄色固体，即为式（I）所示虾夷扇贝毒素半抗原。

3.权利要求1所述虾夷扇贝毒素半抗原在制备虾夷扇贝毒素人工抗原中的应用。

4.一种虾夷扇贝毒素人工抗原，其特征在于，所述虾夷扇贝毒素人工抗原的结构式如式（II）所示：

。

式（II）

5.根据权利要求4所述虾夷扇贝毒素人工抗原，其特征在于，所述载体蛋白选自牛血清白蛋白或鸡卵白蛋白。

6.权利要求4或5所述虾夷扇贝毒素人工抗原的制备方法，其特征在于，将权利要求1所述虾夷扇贝毒素半抗原溶于溶剂后，滴加到含有载体蛋白的缓冲液中反应，再加入乙醇胺封闭，调节pH至7.2～7.5，4～6℃反应，透析纯化，即得式（II）所示虾夷扇贝毒素人工抗原。

7.权利要求4或5所述虾夷扇贝毒素人工抗原在制备虾夷扇贝毒素抗体中的应用。

8.一种虾夷扇贝毒素抗体，其特征在于，是以权利要求4或5所述虾夷扇贝毒素人工抗原为免疫原免疫动物制备得到。

9.一种检测虾夷扇贝毒素的试剂盒，其特征在于，包含权利要求4或5所述虾夷扇贝毒素人工抗原和权利要求8所述虾夷扇贝毒素抗体。

10.一种非疾病诊断目的的检测虾夷扇贝毒素的免疫分析方法，其特征在于，以权利要求4或5所述虾夷扇贝毒素人工抗原为包被原，以权利要求8所述虾夷扇贝毒素抗体为检测抗体进行检测。