CN115124443B - 一种尼卡巴嗪代谢物半抗原、人工抗原及其制备方法与应用 - Google Patents

一种尼卡巴嗪代谢物半抗原、人工抗原及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种尼卡巴嗪代谢物半抗原、人工抗原及其制备方法与应用。本发明所提供的尼卡巴嗪代谢物半抗原，合成方法简单、纯度高、产率高。将该尼卡巴嗪代谢物半抗原分别与血蓝蛋白和卵清蛋白偶联，分别作为免疫原和包被原。所述免疫原免疫动物制备得到尼卡巴嗪代谢物单克隆抗体，结合所述包被原和羊抗鼠IgG，用于制备尼卡巴嗪代谢物酶联免疫试剂盒、尼卡巴嗪代谢物胶体金检测试剂盒和尼卡巴嗪代谢物时间分辨荧光定量检测试剂盒。上述试剂盒用于检测动物肉和蛋类等样品中的尼卡巴嗪代谢物，灵敏度高、重复性好、准确性好、特异性高，在常温下保存期达一年。

Description

一种尼卡巴嗪代谢物半抗原、人工抗原及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及药物残留检测技术领域，具体地，涉及一种尼卡巴嗪代谢物半抗原、人工抗原及其制备方法与应用。
背景技术
尼卡巴嗪(Nicarbazin)是1955年由美国默克(Merk)公司研制合成，又名球虫净、硝脲嘧啶，是一种广谱、高效、性能稳定、抗药性小的饲料添加剂，可广泛用于鸡和火鸡球虫病的防治。它是一类由4,4'-二硝基苯脲(DNC)和2-羟基-4,6-二甲基嘧啶(HDP)组成的等分子复合物，复合物中的HDP成分在动物体内可迅速经尿排出体外，而抗球虫活性成分DNC通过粪便***较缓慢，因此国际上将二硝基均二苯脲(DNC)规定为尼卡巴嗪残留代谢标识物。
已有研究显示当长期摄入尼卡巴嗪正常剂量的80倍后，雄鼠***畸变率明显增加。尼卡巴嗪对产蛋母鸡的繁殖性能也具有一定的影响，所以临床上禁止将尼卡巴嗪用于产蛋鸡。长期食用尼卡巴嗪残留超标的鸡肉，会对人体健康存在潜在的风险。美国食品与药物管理局(FAD)公布禁止在进出口动物性食品中检出尼卡巴嗪。国际食品法典委员会(CAC)规定禽肌肉、肝脏、皮和肾中尼卡巴嗪最大残留限量为0.2mg/kg，每日允许摄入量为0～400μg/kg。在我国的《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》(GB 31650—2019)中规定，尼卡巴嗪在鸡的肌肉中的最大残留限量值为200μg/kg。
在所有必检药物中尼卡巴嗪是唯一超标的抗球虫药，且其被检测到的阳性率逐年有上升趋势，因此对鸡肉及其它禽类副产品中尼卡巴嗪的残留检测十分有必要。
如今，关于尼卡巴嗪残留标识物的检测方法主要有仪器分析法和免疫学分析法。仪器分析方法结果准确，具有高度选择性和快速高效等优点，但是仪器方法也有设备昂贵、耗时长，不适于基层现场监控及大规模快速筛查等不足。免疫分析方法是除仪器方法外最常见的检测方法，是以抗原、抗体特异性结合为基本特征的快速检测分析技术，因其特异性强、时间短、灵敏度高、成本低、通量高等特点可应用于饲料生产、养殖、畜禽产品流通及销售等各个环节，目前普遍应用于动物性食品中药物残留快速检测中。然而，迄今为止，国内外采用免疫分析方法对尼卡巴嗪在动物性食品中的残留分析方法报导很少，难以满足实际样本筛查尼卡巴嗪的检测需求。例如，2005年Huet等报道了竞争ELISA 方法检测鸡蛋和鸡肉组织中尼卡巴嗪，作者利用HSA-PNA免疫家兔获得多抗血清，抗体的IC50为0. 08ng/mL，检测范围是3～10μg/kg；2004年Hagren等用时间分辨荧光测定法检测鸡蛋和鸡肝脏中尼卡巴嗪残留，定性检测限是0.1ng/mL，鸡蛋和肝脏的定量检测限分别是3.2μg/kg和11.3μg/kg。因此，动物性食品中尼卡巴嗪的免疫分析方法还有待加强。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的上述不足，提供一种尼卡巴嗪代谢物半抗原、人工抗原及其制备方法与应用。
本发明的第一个目的是提供一种尼卡巴嗪代谢物半抗原。
本发明的第二个目的是提供一种尼卡巴嗪代谢物半抗原的制备方法。
本发明的第三个目的是提供所述的尼卡巴嗪代谢物半抗原在制备尼卡巴嗪代谢物人工抗原中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种尼卡巴嗪代谢物人工抗原。
本发明的第五个目的是提供所述尼卡巴嗪代谢物人工抗原在制备尼卡巴嗪代谢物人工抗体中的应用。
本发明的第六个目的是提供一种尼卡巴嗪代谢物人工抗原组合。
本发明的第七个目的是提供所述尼卡巴嗪代谢物人工抗原组合在制备尼卡巴嗪代谢物检测试剂盒中的应用。
本发明的第八个目的是提供一种尼卡巴嗪代谢物检测试剂盒。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
一种尼卡巴嗪代谢物半抗原，其分子结构式如式Ⅱ所示：
一种尼卡巴嗪代谢物半抗原的制备方法，具体步骤如下：
S1：混合对硝基苯异氰酸酯和对苯二胺，搅拌，点板反应，反应停止后，去溶剂，得到黄色固体；
S2：混合步骤S1的黄色固体与丙酮，搅拌反应，反应停止后，去沉淀和溶剂，得产物Ⅰ；
S3：混合步骤S2的产物Ⅰ和丁二酸酐，回流搅拌反应，乙酸乙酯萃取，洗涤，干燥，硅胶柱层析纯化，得到尼卡巴嗪代谢物半抗原；
所述尼卡巴嗪代谢物半抗原的分子结构式如式Ⅱ所示：
优选地，步骤S1中，对硝基苯异氰酸酯和对苯二胺的摩尔浓度相同，搅拌反应溶剂为无水THF，搅拌温度为4～6℃，搅拌时间为23～25h；
点板反应溶剂为异丙醇：氯仿＝1：5，Rf＝0.65～0.75。
更优选地，步骤S1中，搅拌温度为5℃，搅拌时间为24h；
点板反应溶剂为异丙醇：氯仿＝1：5，Rf＝0.7。
优选地，步骤S3中，产物Ⅰ和丁二酸酐的摩尔浓度相同，回流搅拌反应溶剂为无水THF，回流搅拌反应温度为68～72℃，回流搅拌时间为23～25h。
更优选地，步骤S3中，回流搅拌反应温度为70℃，回流搅拌时间为24h。
优选地，步骤S3中，回流搅拌完成后，用冰水降温，HCl调pH到3，乙酸乙酯萃取3～4次，饱和食盐水洗涤3～4次，无水硫酸钠干燥，蒸干溶剂。
更优选地，步骤S3中，回流搅拌完成后，用冰水降温，HCl调pH到3，乙酸乙酯萃取3次，饱和食盐水洗涤3次。
所述的尼卡巴嗪代谢物半抗原在制备尼卡巴嗪代谢物人工抗原中的应用。
一种尼卡巴嗪代谢物人工抗原，为所述的尼卡巴嗪代谢物半抗原与载体蛋白偶联所得，所述尼卡巴嗪代谢物人工抗原的结构式如式Ⅳ所示：
优选地，所述载体蛋白为血蓝蛋白、乳铁蛋白、卵清蛋白和/或牛血清白蛋白。
所述尼卡巴嗪代谢物人工抗原在制备尼卡巴嗪代谢物人工抗体中的应用。
一种尼卡巴嗪代谢物人工抗原组合，包括免疫原和包被原，所述免疫原由所述半抗原偶联血蓝蛋白或乳铁蛋白得到的，所述包被原由所述半抗原偶联卵清蛋白或牛血清白蛋白得到的。
优选地，所述免疫原由所述半抗原偶联血蓝蛋白得到的，所述包被原由所述半抗原偶联卵清蛋白得到的。
所述尼卡巴嗪代谢物人工抗原组合在制备尼卡巴嗪代谢物检测试剂盒中的应用。
一种尼卡巴嗪代谢物检测试剂盒，所述试剂盒中含有所述的尼卡巴嗪代谢物人工抗原组合。
一种尼卡巴嗪代谢物检测试剂盒，所述试剂盒中含有包被原和抗体，所述包被原为所述的尼卡巴嗪代谢物半抗原与卵清蛋白或牛血清白蛋白偶联所得到的尼卡巴嗪代谢物人工抗原，所述抗体是以所述尼卡巴嗪代谢物半抗原与血蓝蛋白或乳铁蛋白偶联得到的人工抗原为免疫原免疫动物制备得到。
优选地，所述包被原为所述的尼卡巴嗪代谢物半抗原与卵清蛋白偶联所得到的尼卡巴嗪代谢物人工抗原，所述抗体是以所述尼卡巴嗪代谢物半抗原与血蓝蛋白偶联得到的人工抗原为免疫原免疫动物制备得到。
优选地，所述尼卡巴嗪代谢物检测试剂盒为尼卡巴嗪代谢物酶联免疫试剂盒、尼卡巴嗪代谢物胶体金检测试剂盒和/或尼卡巴嗪代谢物时间分辨荧光定量检测试剂盒；
所述尼卡巴嗪代谢物酶联免疫试剂盒含有酶标板、所述的抗体和IgG羊抗鼠作为二抗，所述酶标板包被有所述的包被原；
所述尼卡巴嗪代谢物胶体金检测试剂盒含有尼卡巴嗪代谢物胶体金检测卡，所述尼卡巴嗪代谢物胶体金检测卡包括样品吸收垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸水垫、PVC板和结合物释放垫；所述硝酸纤维素膜的检测区包被有所述的包被原，作为T线；所述硝酸纤维素膜的质控区包被有羊抗鼠 IgG，作为C线；所述胶体金垫包被有所述的抗体；
所述尼卡巴嗪代谢物时间分辨荧光定量检测试剂盒含有尼卡巴嗪代谢物时间分辨荧光微球免疫检测卡，所述尼卡巴嗪代谢物时间分辨荧光微球免疫检测卡包括在样品吸收垫、结合物释放垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC板；所述硝酸纤维素膜的检测区包被有所述的包被原，作为T线；所述硝酸纤维素膜的质控区包被有羊抗鼠IgG，作为C线；所述结合物释放垫包被有所述的抗体。
更优选地，所述包被原为所述的尼卡巴嗪代谢物半抗原与卵清蛋白偶联所得到的尼卡巴嗪代谢物人工抗原，所述抗体是以所述尼卡巴嗪代谢物半抗原与血蓝蛋白偶联得到的人工抗原为免疫原免疫动物制备得到。
更优选地，所述尼卡巴嗪代谢物酶联免疫试剂盒中，所述酶标板的包被原浓度为0.125～1mg/L。
更优选地，所述尼卡巴嗪代谢物酶联免疫试剂盒中，所述酶标板的包被原浓度为0.5mg/L。
更优选地，所述尼卡巴嗪代谢物胶体金检测卡中，羊抗鼠IgG的包被浓度为0.4～0.6mg/mL，包被量为5～10μL/cm；包被原的包被浓度为0.5～0.7mg/mL，包被量为5～10μL/cm。
更优选地，所述尼卡巴嗪代谢物胶体金检测卡中，羊抗鼠IgG的包被浓度为0.5mg/mL，包被量为5～10μL/cm；包被原的包被浓度为0.6mg/mL，包被量为5～10μL/cm。
更优选地，所述尼卡巴嗪代谢物时间分辨荧光微球免疫检测卡中，羊抗鼠IgG的包被浓度为 0.25～0.35mg/mL，包被量为5～10μL/cm；包被原的包被浓度为0.15～1mg/mL，包被量为5～10 μL/cm。
更优选地，所述尼卡巴嗪代谢物时间分辨荧光微球免疫检测卡中，羊抗鼠IgG的包被浓度为0.35 mg/mL，包被量为5～10μL/cm；包被原的包被浓度为0.5mg/mL，包被量为5～10μL/cm。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明公开了一种尼卡巴嗪代谢物半抗原、人工抗原及其制备方法与应用。本发明所提供的尼卡巴嗪代谢物半抗原，合成方法简单、纯度高、产率高。将该尼卡巴嗪代谢物半抗原分别与血蓝蛋白和卵清蛋白偶联，分别作为免疫原和包被原。所述免疫原免疫动物制备得到尼卡巴嗪代谢物单克隆抗体，结合所述包被原和羊抗鼠IgG，用于制备尼卡巴嗪代谢物酶联免疫试剂盒、尼卡巴嗪代谢物胶体金检测试剂盒和尼卡巴嗪代谢物时间分辨荧光定量检测试剂盒。上述试剂盒用于检测动物肉和蛋类等样品中的尼卡巴嗪代谢物，灵敏度高、重复性好、准确性好、特异性高，在常温下保存期达一年。
附图说明
图1为尼卡巴嗪代谢物半抗原合成路线图。
图2为半抗原、载体蛋白及人工抗原紫外扫描图。
图3为不同包被原/抗体稀释倍数对标准曲线的影响(n＝3)。
图4为尼卡巴嗪代谢物酶联免疫试剂盒标准曲线图。
图5为尼卡巴嗪代谢物胶体金检测卡示意图。
图6为尼卡巴嗪代谢物胶体金检测试剂盒灵敏度检验结果。
图7为尼卡巴嗪代谢物胶体金检测试剂盒特异性检验结果。
图8为尼卡巴嗪代谢物胶体金检测试剂盒稳定性结果。
图9为尼卡巴嗪代谢物时间分辨荧光微球免疫检测卡示意图。
图10为尼卡巴嗪代谢物时间分辨荧光微球免疫检测卡中抗体用量的影响。其中A为试纸条测试图，B为标准曲线。
图11为尼卡巴嗪代谢物时间分辨荧光微球免疫检测卡中包被原和二抗的影响。其中A为试纸条测试图，B为标准曲线。
图12为尼卡巴嗪代谢物时间分辨荧光微球免疫检测卡中鸡蛋和鸡肉基质的灵敏度结果。其中A 为鸡蛋试纸条测试图，B为鸡肉试纸条测试图，C为标准曲线。
图13为尼卡巴嗪代谢物时间分辨荧光微球免疫检测卡特异性反应结果。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1制备尼卡巴嗪代谢物半抗原
尼卡巴嗪代谢物半抗原的合成路线见图1，具体如下：
1)合成产物Ⅰ
称取对硝基苯异氰酸酯2.3g(14mmol)、对苯二胺1.5g(14mmol)置于50mL无水四氢呋喃(THF)中，在5℃的低温反应器中搅拌24h，点板反应，异丙醇：氯仿＝1：5，Rf＝0.7，反应停止后，减压除去溶剂，得到黄色粉末，然后将黄色粉末在1L热丙酮(40～50℃)中搅拌，当产生的沉淀不再增加时，过滤除去沉淀，再减压除去溶剂，得到2.5g黄色粉末产物Ⅰ，即为结构式如式Ⅰ所示的化合物。
(2)合成产物Ⅱ，即尼卡巴嗪代谢物半抗原
称取1.4g(5mmol)产物Ⅰ溶解于50mL无水四氢呋喃(THF)中，添加丁二酸酐0.5g(5mmol)，70℃回流搅拌反应24h。反应结束后，得反应物，将反应物倒入50mL冰水中，用1MHCl调pH到 3左右，用乙酸乙酯(100mL×3)萃取3次。合并3次萃取的萃取液，用饱和食盐水(50mL×3) 洗涤3次，无水硫酸钠干燥，蒸干溶剂后，用硅胶柱层析纯化得到黄色粉末，即为1.1g产物Ⅱ，即为结构式如式Ⅱ所示的化合物，尼卡巴嗪代谢物半抗原。
尼卡巴嗪代谢物半抗原核磁数据为：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)＝9.92(s,1H),9.39(s,1H), 8.82(s,1H),8.18(m,2H),7.69(m,2H),7.50(m,2H),7.37(m,2H)ppm；13C NMR(100MHz,DMSO-d6) ＝173.9,169.8,151.9,146.4,140.9,134.3,134.0,125.1,119.5,119.1,117.4,30.9,28.8ppm。MS(ESI)m/z[M+H+]计算C17H17O6N4＝373.1143，实测值373.1142。
所述式Ⅰ和式Ⅱ的结构式如下所示：
尼卡巴嗪代谢物(4,4'-二硝基苯脲(DNC))的分子结构式如式Ⅲ所示：
实施例2制备及鉴定尼卡巴嗪代谢物人工抗原
一、实验方法
1、制备免疫原——尼卡巴嗪代谢物半抗原与血蓝蛋白(KLH)和乳铁蛋白(LF)偶联得到免疫原。
取8mg实施例1制备的尼卡巴嗪代谢物半抗原、16.2mg N,N'-二环己基碳化二亚胺(DCC)和 8mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于1mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，4℃搅拌反应过夜，得到活化的尼卡巴嗪代谢物半抗原。
称取血蓝蛋白(KLH)或乳铁蛋白(LF)各10mg溶于4mL CBS缓冲溶液(0.1M，pH 9.6)中，得到血蓝蛋白溶液和乳铁蛋白溶液，搅拌状态下在血蓝蛋白或乳铁蛋白溶液中逐滴加入活化的尼卡巴嗪代谢物半抗原，4℃下搅拌反应12h，得反应液1-KLH或反应液1-LF。所述CBS缓冲溶液的溶剂为蒸馏水，溶质及其浓度如下：Na2CO3 1.65g/L和NaHCO3 2.65g/L。所述反应液1-KLH为血蓝蛋白制备得到，反应液1-LF为乳铁蛋白制备得到。
取反应液1-KLH或反应液1-LF装入透析袋中，4℃下用PBS(0.01M，pH 7.4)透析3天，每天换3次透析液，得到人工抗原(DNC-4C-KLH或DNC-4C-LF)，即免疫原。用PBS调整人工抗原 (DNC-4C-KLH或DNC-4C-LF)浓度为1mg/mL，每管500μL分装于1.5mL离心管中，-20℃保存备用。所述DNC-4C-KLH由反应液1-KLH制备得到，DNC-4C-LF由反应液1-LF制备得到。
2、制备包被原——尼卡巴嗪代谢物半抗原与卵清蛋白(OVA)和牛血清白蛋白(BSA)偶联得到包被原。
称取卵清蛋白(OVA)或牛血清白蛋白(BSA)各10mg溶于4mL CBS缓冲溶液(0.01M，pH 9.6)中，得到卵清蛋白溶液或牛血清白蛋白溶液，搅拌状态下在卵清蛋白溶液或牛血清白蛋白溶液中加入活化的尼卡巴嗪代谢物半抗原，4℃下搅拌反应12h，得反应液2-OVA或反应液2-BSA。所述反应液2-OVA为卵清蛋白制备得到，反应液2-BSA为牛血清白蛋白制备得到。
取反应液2装入透析袋中，4℃下用PBS(0.01M，pH 7.4)透析3天，每天换3次透析液，得到人工抗原(DNC-4C-OVA或DNC-4C-BSA)即包被原。用PBS调整人工抗原(DNC-4C-OVA或 DNC-4C-BSA)浓度为1mg/mL，每管500μL分装于1.5mL离心管中，-20℃保存备用。所述DNC-4C-OVA由反应液2-OVA制备得到，DNC-4C-BSA由反应液2-BSA制备得到。
按合成免疫原反应所用尼卡巴嗪代谢物半抗原、载体蛋白KLH、LF与偶联产物DNC-4C-KLH、 DNC-4C-LF的比例；合成包被原反应所用尼卡巴嗪代谢物半抗原、载体蛋白OVA、BSA和偶联产物 DNC-4C-OVA、DNC-4C-BSA的比例，进行紫外(200nm～400nm)扫描测定，通过比较半抗原、载体蛋白和偶联产物三者分别在260nm和280nm的吸光值计算其结合比。
二、实验结果
如图2所示，偶联产物DNC-4C-KLH、DNC-4C-LF、DNC-4C-BSA和DNC-4C-OVA的最大吸收峰与尼卡巴嗪代谢物半抗原、载体蛋白KLH、LF、BSA和OVA的最大吸收峰相比发生了明显的变化，表明成功合成了偶联产物DNC-4C-KLH、DNC-4C-LF、DNC-4C-BSA和DNC-4C-OVA。尼卡巴嗪代谢物人工抗原的结构式如式Ⅳ所示：
实施例3尼卡巴嗪代谢物人工抗原免疫动物制备单克隆抗体
一、实验方法
(1)获得杂交瘤细胞
1)首次免疫：将实施例2制备的免疫原DNC-4C-KLH或DNC-4C-LF分别与等量的弗氏完全佐剂充分乳化，皮下注射4周龄的Balb/c小鼠，每只0.15mL；
2)加强免疫两次：从首次免疫开始，第2、4和8周加强免疫，用弗式不完全佐剂代替弗氏完全佐剂，方法和剂量同首次免疫；
3)最后一次加强免疫一周后尾部静脉取少量血，充分离心，取上清测效价和抑制，选择抗血清测定效价及抑制率高的小鼠进行细胞融合实验：腹腔注射不加任何佐剂的免疫原DNC-4C-KLH或 DNC-4C-LF溶液0.2mL，浓度为1mg/mL，三天后处死小鼠，取其脾脏分别与骨髓瘤细胞融合；
4)采用间接竞争酶联免疫分析方法测定步骤3)融合细胞的上清液，若经尼卡巴嗪代谢物阻断后的细胞OD450nm值下降到对照孔的50％以下，则判为阳性，经2～3次检测都为阳性的孔的细胞，用于扩大培养，建株，得到尼卡巴嗪代谢物单克隆抗体杂交瘤细胞株，并冻存部分细胞于-80℃液氮罐。
(2)单克隆抗体的制备
1)细胞复苏：取出尼卡巴嗪代谢物单克隆抗体杂交瘤细胞株冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养；
2)制备腹水与抗体纯化：采用体内诱生法，对8周龄以上的Balb/c的小鼠腹腔注射液体石蜡，剂量为0.5mL/只。7天后，对每只老鼠注射1mL含有1×106个复苏的尼卡巴嗪代谢物单克隆抗体杂交瘤细胞的基础培养基，接种细胞后每天观察小鼠状态，大概7天后采集腹水。用Protein G亲和层析法进行纯化，得到尼卡巴嗪代谢物单克隆抗体溶液，浓度为5.71mg/mL(-20℃保存)。
(3)尼卡巴嗪代谢物免疫原和包被原的筛选
分别利用实施例2的DNC-4C-KLH或DNC-4C-LF作为免疫原免疫动物后得到的抗体，通过间接竞争ELISA方法进行包被原的筛选，以实施例2制备得到的人工抗原DNC-4C-OVA或DNC-4C-BSA 作为包被原；采用间接竞争ELISA法测定获得血清效价和抑制率来选择最佳的免疫原和包被原；具体如下：
1)包被：用包被缓冲液将实施例2制备的包被原(DNC-4C-OVA或DNC-4C-BSA)各稀释成1 mg/L，以每孔100μL的量加入96孔酶标板微孔中，37℃水浴孵育过夜。
包被缓冲液：pH 9.6，0.1mol/L的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(溶剂为蒸馏水，溶质及其浓度如下： Na2CO3 1.65g/L和NaHCO3 2.65g/L)。
2)封闭：倾去孔内液孔，每孔加洗涤液300μL，洗涤2次，甩干。每孔加入120μL封闭液， 37℃水浴封闭3h，甩干孔内液体，于37℃烘箱烘干，1h后取出放4℃备用。
封闭液：含有1％(体积百分含量)脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液，pH 7.4。
3)竞争反应：用PBS缓冲液将实施例3取得的最后一次加强免疫一周后的小鼠抗体血清倍比稀释成七个梯度，即1：4000、1：8000、1：16000、1：32000、1：64000、1：128000、1：256000，同时用PBS缓冲液设置为空白对照孔，并将尼卡巴嗪代谢物药物稀释至1μg/mL；
效价效：每孔加50μL的PBS缓冲
液，再将倍比稀释得到抗体按每孔50μL依次加入孔内，最后一个孔不加抗体，用50μLPBS缓冲液代替；
抑制效：每孔加50μL稀释好的尼卡巴嗪代谢物
药物，再将倍比稀释得到抗体按每孔50μL依次加入孔内，最后一个孔不加抗体，用50μLPBS缓冲液代替；37℃水浴反应40min，洗涤5次，拍干。
PBS缓冲液(0.01M，pH 7.4)：溶剂为蒸馏水，溶质及其浓度如下：2.9g/L的NaH2PO4·12H2O、 8.5g/L的NaCl、0.2g/L的KCl、0.2g/L的KH2PO4。
4)加酶标二抗：取辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG抗体，按体积比1：5000倍稀释后，按100μL/ 孔的量加入，37℃水浴反应30min，洗涤5次，拍干。
5)显色：将显色液按100μL/孔的量加入，37℃显色10min。
显色液：由A液(底物工作液)和B液(底物缓冲液)组成，使用时将A液和B液按体积比1： 1的比例混合；其中A液为pH为5.0，含有过氧化脲的磷酸-柠檬酸缓冲液；B液为pH为5.0，含有 3,3,5,5-四甲基联苯胺的的磷酸-柠檬酸缓冲溶液。
6)终止和测定：加入终止液(2M H2SO4)50μL/孔，并用酶标仪测定各孔在450nm处读取OD 值。效价是OD450为1.0左右所对应的抗体稀释倍数。抑制率＝(效价的OD值-抑制的OD值)/抑制的OD值*100％。
(4)棋盘法
当抗体浓度与包被原浓度组合最佳时，抗体才能最大限度地结合分析物。本实施例采用棋盘法确定抗体与包被原的最佳组合，通过步骤(3)筛选到的最佳尼卡巴嗪代谢物免疫原和包被原，将包被原和抗体按照下表1梯度稀释后进行测试(表中-代表结果待检测；尼卡巴嗪代谢物单克隆抗体浓度原始浓度为5.71mg/mL，包被原原始浓度为1mg/mL)，选用Amax在1～1.5的组合进行下一步实验。
表1包被原和抗体稀释倍数棋盘法
(5)间接竞争ELISA标准曲线建立
利用上述棋盘法确定的最佳抗体浓度与包被原浓度的组合，分别作为间接竞争ELISA反应条件，分别按照实施例3中步骤(3)的方法进行测定并用Origin 9.1软件中的拟合竞争标准曲线。其中B 为添加了药物的吸光值，B0代表没有添加药物的吸光值，IC50代表B/B0为0.5时(即抑制率为50％) 的药物浓度。
二、实验结果
(1)尼卡巴嗪代谢物免疫原和包被原的筛选
表2不同免疫原与包被原组合的血清效价和抑制率
从表2中可以看出，不同的尼卡巴嗪代谢物人工抗原作为免疫原免疫的小鼠产生的抗体均有一定的效价；所得的抗体对目标分析物尼卡巴嗪代谢物均有不同程度的抑制效果。其中，编号1中的免疫原与DNC-4C-OVA组合所示的效价1：128000和抑制率为89.84％，高于其他免疫原和包被原组合的效价和抑制率，故选择DNC-4C-KLH作为最佳的免疫原、DNC-4C-OVA作为最佳的包被原。
(2)棋盘法
通过棋盘法初步确定抗体(单克隆抗体原始浓度5.71mg/mL)稀释倍数与包被原浓度的最佳组合，选择Amax在1～1.5时的组合，根据表3结果，选择
1000/128000(包被原浓度/抗体稀释倍数)、2000/64000、4000/32000和8000/16000组合建立尼卡巴嗪代谢物间接竞争ELISA标准曲线。
表3包被原和抗体稀释倍数棋盘法
(3)间接竞争ELISA标准曲线建立
根据棋盘法选择1000/128000(包被原浓度/抗体稀释倍数)、2000/64000、4000/32000和8000/16000 组合建立尼卡巴嗪代谢物间接竞争ELISA标准曲线。结果如图3所示，在包被原/抗体稀释倍数为 2000/64000时，IC50最小。所以选择包被原/抗体稀释倍数为2000/64000的组合，因此包被原的最佳浓度为0.5mg/L，抗体的最佳浓度为0.09mg/L，此时间接竞争ELISA法测定尼卡巴嗪代谢物单克隆抗体的IC50为：0.05ng/mL，表明实施例3制备的尼卡巴嗪代谢物单克隆抗体对尼卡巴嗪代谢物有很好的灵敏度。
实施例4尼卡巴嗪代谢物酶联免疫试剂盒
1、尼卡巴嗪代谢物酶联免疫试剂盒的组装
(1)尼卡巴嗪代谢物酶联免疫试剂盒的组成
1)配置尼卡巴嗪代谢物标准品溶液：准确称取尼卡巴嗪代谢物标准品溶液，用色谱级甲醇稀释成1mg/mL，再用0.01mol/L PBS缓冲液分别配制浓度为0ng/mL、0.1ng/mL、0.3ng/mL、0.9ng/mL、 2.7ng/mL和8.1ng/mL的尼卡巴嗪代谢物溶液，4℃保存。所述PBS缓冲液溶剂为蒸馏水，溶质及其浓度如下：2.9g/L的NaH2PO4·12H2O、8.5g/L的NaCl、0.2g/L的KCl、0.2g/L的KH2PO4。
2)制备包被有尼卡巴嗪代谢物抗原的酶标板，具体制备方法与实施例3的包被与封闭步骤相同，包被原的浓度进行1：2000稀释，包被浓度为0.5mg/L制备完成后，用铝箔袋真空密封4℃保存。
3)配置尼卡巴嗪代谢物抗体工作液：为抗体稀释液将抗体(抗体的原浓度为5.71mg/mL)进行 1：64000稀释，抗体稀释液为P液，抗体的浓度为0.09mg/L。抗体稀释液配方为7.25g/L的 NaH2PO4·12H2O、21.25g/L的NaCl、5g/L的KCl和5g/L的KH2PO4，溶剂为蒸馏水。所述抗体为实施例3制备得到的尼卡巴嗪代谢物单克隆抗体。
4)配置酶标记物工作液：辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG(10mg/mL)，作为二抗。
5)配置样品稀释液：0.01M，pH 7.4的PBS缓冲液，所述PBS缓冲液溶剂为蒸馏水，溶质及其浓度如下：2.9g/L的NaH2PO4·12H2O、8.5g/L的NaCl、0.2g/L的KCl、0.2g/L的KH2PO4。
6)配置20倍浓缩洗涤液：0.01M，pH 7.4的PBST溶液，所述PBST溶液溶剂为蒸馏水，溶质及其浓度如下：48g/L的NaH2PO4·12H2O、160g/L的NaCl、12mL/L Tween-20。
7)配置底物液：由A液(底物工作液)和B液(底物缓冲液)组成，使用时将A液和B液按体积比1：1的比例混合，即可得到显色液；其中A液为pH为5.0，含有过氧化脲的磷酸-柠檬酸缓冲液；B液为pH为5.0，含有3,3,5,5-四甲基联苯胺的的磷酸-柠檬酸缓冲溶液。
8)配置终止液(10％H2SO4)：20mL浓硫酸(98％)缓慢加入180mL蒸馏水。
9)配置样品复溶液：0.05M，pH 7.4的PB缓冲液，所述PB缓冲液溶剂为蒸馏水，溶质及其浓度如下：14.3g/L的NaH2PO4·12H2O、1g/L的KCl、1.35g/L的KH2PO4。
10)盖板膜。
(2)尼卡巴嗪代谢物酶联免疫试剂盒的试剂分装情况如下：
将各试剂测定合格后无菌分装，尼卡巴嗪代谢物抗体工作液7mL/瓶；酶标记物工作液7mL/瓶；各浓度尼卡巴嗪代谢物标准品溶液1mL/瓶；底物工作液7mL/瓶；底物缓冲液7mL/瓶；终止液7mL/ 瓶；样品复溶液50mL/瓶；20倍浓缩洗涤液50mL/瓶。采用不同颜色盖的透明塑料瓶分装后贴标签，注明批号和有效期，4℃保存。
(3)尼卡巴嗪代谢物酶联免疫试剂盒的组装情况如下：
分别将上述包被有尼卡巴嗪代谢物抗原的酶标板1块，尼卡巴嗪代谢物抗体工作液、酶标记物工作液、底物工作液、底物缓冲液、20倍浓缩洗涤液、终止液、样品复溶液各1瓶、各浓度尼卡巴嗪代谢物标准品工作液共6瓶和使用说明书1份置于试剂盒内指定位置，试剂盒检验合格后封装，4℃保存。
2、尼卡巴嗪代谢物酶联免疫试剂盒的使用方法
(1)样品前处理
1)动物肉和组织(如鸡肉、鸭肉、猪肉等)
将待测动物肌肉样品去皮、脂肪，得廋肉样本，用均质器均质，取1g±0.05g廋肉样本，置于50 mL离心管；向离心管中加入乙腈6mL，剧烈振荡5min(如果一次检测较多样品，建议把每个待检样品都先进行剧烈振荡使得组织呈现肉糜状态，再剧烈振荡5min，防止组织结成团状，振散不开，从而降低提取效率影响检测结果)；室温(20～25℃)4000rpm离心5min，移取上清液2mL，置于 65℃水浴中吹干；加入2mL正已烷溶解残渣，然后加入1mL 75％甲醇(需自配，如75mL甲醇加入25mL纯净水中混匀)振荡1min；室温4000r/min，离心2min；移取下层液体100μL至2mL离心管中，再加入400μL样品复溶液，混均得样品待测液，待检。
2)鸡蛋
准确称取2g±0.05g均质后的鸡蛋样品置于50mL离心管；向离心管中加入乙腈8mL，剧烈振荡2min，加入3g CaCl2，立即充分涡动30s；室温(20～25℃)4000rpm离心5min，移取上清液2 mL，置于65℃水浴中吹干；加入2mL正已烷溶解残渣，振荡1min；移取下层液体100μL至2mL 离心管中，再加入400μL样品复溶液，混均得样品待测液，待检。
(2)检测步骤
1)加样：将所需数量的酶标板的板条固定于板架，加入50μL样品待测液或标准品到酶标板中，将50μL酶标记物工作液加入微孔中，再加入50μL尼卡巴嗪代谢物抗体工作液到酶标板中，用盖板膜盖好，充分振荡混匀；
2)温育：置室温(25℃)温育30min；
3)洗涤：弃去孔内液体，将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水稀释成1倍，稀释后的洗涤液注满各孔，静置5～10s，弃去孔内洗涤液；重复洗4次后拍干；
4)显色：每孔加入底物缓冲液50μL，再加入底物工作液50μL，振荡混匀(或将底物缓冲液和底物工作液以1：1比例混合得到底物液后，再加入100μL底物液作为显色液)，置室温(25℃)温育10～15min；
5)终止：每孔加入终止液50μL，轻拍混匀；
6)读值：用酶标仪读值，在单波长450nm或双波长450nm/630nm下读取各孔吸光度值。
(3)检测结果计算与分析
抑制率(％)＝B/B0×100(％)
式中：B是不同浓度尼卡巴嗪代谢物的标准品溶液孔或待测样品孔的吸光度值，B0为0浓度尼卡巴嗪代谢物标准品溶液的吸光度值。
以抑制率为纵坐标，以尼卡巴嗪代谢物标准品溶液浓度的对数为横坐标绘制标准曲线，以尼卡巴嗪代谢物的吸光值代入上述标准曲线中求出待测样品中尼卡巴嗪代谢物的含量。
不考虑检测人员操作熟练程度的影响，整个检测过程仅仅需要70min左右即可完成。检测结果的分析还可以利用计算机专业软件进行计算与分析。
(4)标准曲线
通过对标准品溶液的检测结果分析得到尼卡巴嗪代谢物标准曲线图(如图4所示)，表明了本发明试剂盒对尼卡巴嗪代谢物的线性检测范围为0.1～8.1ng/mL，灵敏度为0.05ng/mL，检出限为0.011 ng/mL。
实施例5尼卡巴嗪代谢物酶联免疫试剂盒性能评价
(1)尼卡巴嗪代谢物标准品溶液的重复性实验
从3批按照实施例4中的方法制备的酶标板中，各随机抽出16个微孔，按照实施例4中试剂盒的检测方法测定尼卡巴嗪代谢物标准品溶液的吸光度值，重复16次，计算变异系数(CV，％)
(2)样本重复性与准确度实验
准确度是指测得值与真值的符合程度，在酶联免疫测定中，准确度常以回收率表示，精密度常以变异系数来表示。在空白样品中，添加尼卡巴嗪代谢物至终浓度为0.05、0.1和0.2μg/kg，每个浓度各10个平行，测定3批。计算平均值、添加回收率及批内与批间变异系数。
(3)单克隆抗体特异性的测定
抗体特异性是指它同特异性抗原结合的能力与同该类抗原类似物结合能力的比较，用交叉反应率作为评价标准。交叉反应越小，抗体的特异性则越高。通过各种药物的标准曲线分别得到其50％抑制浓度(即IC50)。用下式计算试剂盒对其它药物(新霉素、盐霉素、地克珠利、硝基咪唑类、庆大霉素和磺胺类药物)的交叉反应率：
交叉反应率(％)＝(尼卡巴嗪标志物IC50/尼卡巴嗪标志物类似物IC50)×100％
(4)试剂盒稳定性实验
将同一批次包被好的酶标板用铝箔袋封好后置于37℃，分别0、2、4和6d进行间接竞争ELISA 实验，得到Amax和IC50。
二、实验结果
(1)尼卡巴嗪代谢物标准品溶液的重复性
结果如表4所示。
表4尼卡巴嗪代谢物标准品溶液重复性试验
批内变异系数：同一次测定中各平行样本的变异系数。
批间变异系数：同一样本在不同批次测定结果的变异系数，取其平均值。
结果表明，实施例4的试剂盒标准品溶液检测的批内变异系数范围在3.25％～8.57％之间，批间变异系数为6.82％～11.27％。可知CV<15％，说明实施例4的方法准确度好，实施例4的试剂盒适用于实际样品中尼卡巴嗪代谢物的检测。
(2)样本重复性与准确度
结果见表5。
表5样本重复性与准确度试验结果
结果表明，鸡肉样品的平均添加回收率在90.63％～105.43％之间，批内变异系数在1.73％～ 6.94％，批间变异系数2.13％～9.74％之间；鸡蛋样品的平均添加回收率在92.61％～97.45％之间，批内变异系数在1.52％～6.35％，批间变异系数1.78％～7.46％之间；变异系数均小于15％，实施例 4的试剂盒稳定性良好。
(3)单克隆抗体特异性
测得本发明实施例4的尼卡巴嗪代谢物检测试剂盒对尼卡巴嗪代谢标识物的交叉反应率为100％，对新霉素、盐霉素、地克珠利、硝基咪唑类、庆大霉素和磺胺类药物等均无交叉反应。
(4)试剂盒保存期
结果如表6所示，37℃放置放置0～6d内的IC50和Amax变化不大，CV小于10.4％，说明实施例 4制备的试剂盒稳定性良好。研究表明，试剂盒在37℃放置1d相当于4℃放置45d，经计算表明实施例4制备的试剂盒在4℃条件下保存时间达半年以上。
表6稳定性实验(n＝3)
实施例6尼卡巴嗪代谢物胶体金检测试剂盒尼卡巴嗪代谢物
1、尼卡巴嗪代谢物胶体金检测试剂盒的组装
(1)尼卡巴嗪代谢物胶体金检测卡的制备
1)胶体金溶液的制备
量取100mL的去离子水，移入500mL的平底烧瓶中，用锡箔纸封住瓶口，将烧瓶置于可加热的磁力搅拌器的加热套内，打开搅拌旋钮和加热旋钮，加热至沸腾。加入1％的氯金酸溶液(w/v)1.0 mL，继续搅拌加热2min，然后一次性迅速加入1％柠檬酸三钠水溶液(w/v)4mL，继续搅拌加热 20min，溶液呈透亮的红色。关掉加热旋扭，冷却至室温，用去离子水恢复到原体积，得胶体金溶液， 2～8℃保存。
2)金标抗体溶液的制备
用0.1mol/L K2CO3水溶液调节实施例6步骤1制备的胶体金溶液的pH至8.2，然后取10mL移入50mL烧杯中，置于电磁搅拌器进行250r/min搅拌，在搅拌的状态下，缓慢逐滴加入100μL用 0.05mol/L PB(实施例4的样品复溶液)稀释成0.57mg/mL的尼卡巴嗪代谢物单克隆抗体溶液，持续搅拌10～15min，随后加入100μL 10％BSA(w/v)水溶液，持续搅拌10～15min后进行分装，以 4℃15000rpm离心15min，弃去上清，往底部沉淀加入2mL 0.2mol/LpH7.4的磷酸盐缓冲溶液 (包含0.3％Tween-20
(v/v)、0.5％BSA(w/v)、5％蔗蔗(w/v)、0.3％PVP(w/v)、0.03％procline-300(v/v))震荡使其分布均匀，得金标抗体溶液，置于4℃保存。
3)胶体金垫的制备
分别剪取规格为20×4mm的玻璃纤维棉，然后将实施例6步骤1制备的金标抗体溶液用喷点平台***均匀喷洒于玻璃纤维棉上，喷涂量为0.1～0.3mL/cm2
喷涂完后在相对湿度不超过30％的环境中37℃条件下干燥18～24h，得胶体金垫，加入干燥剂密封保存，后置于4℃保存。
4)硝酸纤维素膜(NC膜)的制备
用0.01M pH 7.4的PBS(实施例4的样品稀释液)将羊抗鼠IgG抗体调节至0.5mg/mL，通过喷点平台***包被在硝酸纤维素膜(NC)膜上形成质控线(C线)，包被量为5～10μL/cm；再用 0.01M pH 7.4的PBS将实施例2制备得到的包被原调节至0.6mg/mL，通过喷点平台***包被在NC 膜上形成检测线(T线)，包被量为5～10μL/cm，以形成中间相距0.5cm的1条检测线和1条质控线。将包被好的硝酸纤维素膜置于37℃干燥过夜，置于干燥环境中备用。
5)胶体金检测卡的组装
如图5所示，在PVC底板上依次粘贴样品吸收垫，胶体金垫，硝酸纤维素膜，吸水垫；其中，结合物释放垫从起始端有1/3区域被样品吸收垫覆盖，结合物释放垫的末端与硝酸纤维素膜的始端连接，硝酸纤维素膜的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫的始端与PVC底板的始端对齐，吸水垫的末端与PVC底板的末端对齐；所述硝酸纤维素膜上的检测线和质控线与所述试纸条的长相呈垂直的条状带；检测线位于靠近结合物释放垫的末端的一侧；质控线位于远离结合物释放垫的末端的一侧；组装完成后剪切成3.6mm的宽度，即成为免疫层析试纸条。把免疫层析试纸条固定在塑料底卡上，试纸条表面用面卡压紧，面卡在对应试纸条样品吸收垫和NC膜的部分分别预留加样孔和检测窗，得尼卡巴嗪代谢物胶体金检测卡，装入铝箔袋，加入干燥剂封口，放置于室温干燥环境下保存，保存期达12个月。
(2)尼卡巴嗪代谢物胶体金检测试剂盒的组成
尼卡巴嗪代谢物检测试剂盒包括：实施例6中组装的尼卡巴嗪代谢物胶体金检测卡、样品复溶液 1瓶(与实施例4的样品复溶液相同)、使用说明书1份置于试剂盒内指定位置，试剂盒检验合格后封装，得尼卡巴嗪代谢物胶体金检测试剂盒，4℃保存。
2、尼卡巴嗪代谢物胶体金试纸条的使用方法及结果判定
(1)样品前处理
a.样品前处理方法如实施例4的样品前处理所示，得样品待测液。
b.消除基质效应：用0.05mol/L PB溶液(实施例4的样品复溶液)稀释步骤a中的上清提取液至消除基质效应，得到消除基质效应的样品提取液。其中，将鸡蛋提取液稀释6倍得到鸡蛋提取稀释液；动物肉和组织提取液分别稀释4倍，得到动物肉和组织提取稀释液。
(2)检测方法
1)使用前将所述待测的提取稀释液恢复至室温；
2)用移液枪吸取120μL样品待测液滴于尼卡巴嗪代谢物胶体金检测卡的样品孔中；
3)室温温育5～8min后，取出尼卡巴嗪代谢物胶体金检测卡，根据显色情况判定结果，其它时间判读无效。
(3)判定结果
1)阴性(－)：质控线(C线)显色，若检测线(T线)也显色，表示样品中不含有尼卡巴嗪代谢物或其含量低于0.12μg/kg，判为阴性；
2)阳性(+)：质控线(C线)显色，若检测线(T线)不显红色，表示样品中含有尼卡巴嗪代谢物且其含量高于0.12μg/kg，判为阳性；
3)无效：当质控线(C线)不显红色时，无论检测线(T线)是否显色，均表示实验结果无效。
实施例7尼卡巴嗪代谢物胶体金检测试剂盒性能评价
一、实验方法
(1)尼卡巴嗪代谢物胶体金检测试剂盒的灵敏度实验
向阴性鸡肉样品组织中分别添加不同含量的尼卡巴嗪代谢物，尼卡巴嗪代谢物的添加含量分别为 0(空白对照)、0.02μg/kg、0.04μg/kg、0.08μg/kg、0.12μg/kg和0.16μg/kg。将添加含不同量的尼卡巴嗪代谢物样品分别使用实施例6中的检测试剂盒进行检测。
(2)尼卡巴嗪代谢物胶体金检测试剂盒的特异性测定
向样品复溶液中分别添加0.12μg/L的尼卡巴嗪代谢物、新霉素、盐霉素、地克珠利、硝基咪唑类、庆大霉素和磺胺类药物，震荡混匀，使用实施例6中的尼卡巴嗪代谢物胶体金检测试剂盒进行检测。
(3)尼卡巴嗪代谢物胶体金检测试剂盒的稳定性实验
将尼卡巴嗪代谢物胶体金检测卡置于铝箔袋密封保存，然后置于37℃的烘箱中，于1、7、14、 21、28d分别按照实施例6中所述方法对2g鸡肉阴性样品进行检测，观察试纸条颜色变化情况。
二、实验结果
(1)尼卡巴嗪代谢物胶体金检测试剂盒的灵敏度实验
结果见表7和图6。
表7不同含量的尼卡巴嗪代谢物的检测结果
经过反复的验证，由图6可看出，当尼卡巴嗪代谢物添加浓度为0.08μg/kg时，检测线(T线) 显色，判定为阴性，而当尼卡巴嗪代谢物添加浓度为0.12μg/kg时，检测线(T线)不显色，判定为阳性，因此实施例6制备的尼卡巴嗪代谢物胶体金检测试剂盒在实际样品时的检出限为0.12μg/kg。
(2)尼卡巴嗪代谢物胶体金检测试剂盒的特异性测定
结果如图7所示，本发明尼卡巴嗪代谢物胶体金检测试剂盒对尼卡巴嗪代谢标识物的交叉反应率为100％，对新霉素、盐霉素、地克珠利、硝基咪唑类、庆大霉素和磺胺类药物等均无交叉反应。
(3)尼卡巴嗪代谢物胶体金检测试剂盒的稳定性实验
结果见图8，本发明尼卡巴嗪代谢物胶体金检测卡在37℃保存1、7、14、21、28d后的检测效果均较好，检测结果间无明显差异，说明尼卡巴嗪代谢物胶体金检测卡稳定性较好，在常温(25℃)保存至少半年以上。
实施例8尼卡巴嗪代谢物时间分辨荧光定量检测试剂盒检测尼卡巴嗪代谢物
1、尼卡巴嗪代谢物时间分辨荧光定量检测试剂盒的组装
(1)尼卡巴嗪代谢物时间分辨荧光微球免疫检测卡的制备
1)时间分辨荧光微球标记尼卡巴嗪代谢物单克隆抗体的制备：
a.溶解：往各离心管加入pH为6.0的200μL 0.05M MES缓冲溶液，然后加入20μL表面修饰有羧基官能团的时间分辨荧光微球(所用荧光微球美国来源于Bangs Laboratories公司，粒径约为100nm，固含10％，分散介质是水(含0.01％MIT(抗菌剂))，混匀溶解，超声1min；15000r/min，4℃离心10min，弃上清，加入200μL0.05 M MES缓冲溶液复溶，超声1min，得溶解液。所述0.05M MES 缓冲溶液溶剂为蒸馏水，溶质及其浓度如下：9.76g/L吗啉乙磺酸。
b.活化：向溶解液中加入6μL 0.5mg/mL的NHS，混匀10s，迅速加入5μL 0.5mg/mL的EDC，混匀，使用恒温培养摇床振荡(600r/min，37℃)活化反应15min；反应完毕后15000r/min，25℃离心15min，弃上清，加入200μL 0.04mol/L BB缓冲溶液，超声重悬1min，得活化液。所述0.04mol/L BB缓冲液溶剂为蒸馏水，溶质及其浓度如下：1.15g/L的H3BO3、1.73g/L的NaB4O7·10H2O。
c.标记：用0.04mol/L BB缓冲液将实施例3中的尼卡巴嗪代谢物单克隆抗体稀释成1.0mg/mL，向活化液中加入2μL稀释后的尼卡巴嗪代谢物单克隆抗体溶液，置恒温25℃培养摇床振荡反应20min，得标记液；
d.封闭：向每管标记液中加入1mL的封闭缓冲液(0.2g/L的BSA，溶剂为蒸馏水)，超声重悬 1min，恒温振荡封闭20min，得封闭后的溶液；
e.离心：将封闭后的溶液15000r/min离心15min(25℃)，标记抗体沉淀于离心管底部；
f.重悬：弃上清，用复溶液为pH＝7.4的0.05mol/LPB溶液(含有10％Tween-20(v/v)、5％蔗蔗(w/v)、0.5％BSA(w/v)、10％PVP(w/v)和3％procline-300(v/v))复溶至200μL，超声重悬，得时间分辨荧光微球标记的尼卡巴嗪代谢物单克隆抗体，置4℃备用。
2)喷涂有时间分辨荧光微球标记的尼卡巴嗪代谢物单克隆抗体的结合物释放垫的制备：
将结合物释放垫用含0.1～0.5％牛血清白蛋白(质量分数)、pH7.4的0.01～0.05MTris-HCl(含 0.1～5％的蔗蔗(w/v)和0.01～1％Tween-20(v/v))缓冲液浸泡2h，37℃下烘干过夜备用。用喷膜仪将时间分辨荧光微球标记的尼卡巴嗪代谢物单克隆抗体喷涂至结合物释放垫上，每1cm结合物释放垫喷涂0.05～0.1mL荧光微球标记的尼卡巴嗪代谢物单克隆抗体，37℃干燥2h，置于干燥环境中备用。
3)硝酸纤维素膜(NC膜)的制备
用0.01M pH 7.4的PBS(实施例4的样品稀释液)将羊抗鼠IgG抗体稀释至0.35mg/mL，通过喷点平台***包被在硝酸纤维素膜(NC膜)上形成质控区(C线)，包被量为5～10μL/cm；再用 0.01M pH 7.4的PBS将实施例2制备得到的包被原稀释至0.5mg/mL，通过喷点平台***包被在NC 膜上形成检测线(T线)，包被量为5～10μL/cm，以形成中间相距0.5cm的1条检测线和1条质控线。将包被好的硝酸纤维素膜置于37℃干燥过夜，置于干燥环境中备用。
4)尼卡巴嗪代谢物时间分辨荧光微球免疫检测卡的组装
如图9所示，在PVC底板上依次粘贴样品吸收垫，喷涂有时间分辨荧光微球标记的尼卡巴嗪代谢物单克隆抗体的结合物释放垫，喷涂有包被原作为检测线和羊抗鼠IgG抗体作为质控线的硝酸纤维素膜，吸水垫；其中，结合物释放垫从起始端有1/3区域被样品吸收垫覆盖，结合物释放垫的末端与硝酸纤维素膜的始端连接，硝酸纤维素膜的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫的始端与PVC底板的始端对齐，吸水垫的末端与PVC底板的末端对齐；所述硝酸纤维素膜上的检测线和质控线与所述试纸条的长相呈垂直的条状带；检测线位于靠近结合物释放垫的末端的一侧；质控线位于远离结合物释放垫的末端的一侧；组装完成后剪切成3.6mm的宽度，即成为免疫层析试纸条。把免疫层析试纸条固定在塑料底卡上，试纸条表面用面卡压紧，面卡在对应试纸条样品吸收垫和NC膜的部分分别预留加样孔和检测窗，得尼卡巴嗪代谢物时间分辨荧光微球免疫检测卡，装入铝箔袋，加入干燥剂封口，放置于室温干燥环境下保存，保存期达12个月。
(2)尼卡巴嗪代谢物时间分辨荧光定量检测试剂盒的组成
尼卡巴嗪代谢物时间分辨荧光定量检测试剂盒包括：实施例8制备的尼卡巴嗪代谢物时间分辨荧光微球免疫检测卡、计算芯片1枚、样本复溶液1瓶(实施例4的样品复溶液)、使用说明书1份置于试剂盒内指定位置，试剂盒检验合格后封装，得尼卡巴嗪代谢物时间分辨荧光定量检测试剂盒，常温保存。
2、尼卡巴嗪代谢物时间分辨荧光定量检测试剂盒的使用方法及结果判定
(1)样品前处理
a.样品前处理方法如实施例4的样品前处理所示，得样品待测液。
b.消除基质效应：用0.05mol/L PB溶液(实施例4的样品复溶液)稀释步骤a中的上清提取液至消除基质效应，得到消除基质效应的样品提取液。其中，将鸡蛋提取液稀释6倍得到鸡蛋提取稀释液；动物肉和组织提取液分别稀释4倍，得到动物肉和组织提取稀释液。
(2)检测方法
撕开装有尼卡巴嗪代谢物时间分辨荧光微球免疫检测卡的铝箔袋，取出尼卡巴嗪代谢物时间分辨荧光微球免疫检测卡，将其放于洁净操作台上。用1mL移液枪吸取样品待测液，滴加3滴样品待测液(每滴约30μL)于尼卡巴嗪代谢物时间分辨荧光微球免疫检测卡样品孔，垂直缓慢滴加。滴加完成后，等待10～15min，将尼卡巴嗪代谢物时间分辨荧光微球免疫检测卡放入免疫荧光分析仪中进行检测，采用免疫层析分析仪读取检测线和质控线的荧光强度，并给出T/C值，分析仪可通过内置的标准曲线计算出样品中尼卡巴嗪代谢物的浓度，并判断阴阳性；或者采用目测方法判定结果。
(3)结果分析
1)定性判定结果的方法(目视法)
将反应后的尼卡巴嗪代谢物时间分辨荧光微球免疫检测卡用365nm的紫外光发射器照射，如果尼卡巴嗪代谢物时间分辨荧光微球免疫检测卡的C线显色，T线也显色时，结果判定为阳性，且T 线的颜色越深，则样品中的尼卡巴嗪代谢物浓度越高。当尼卡巴嗪代谢物时间分辨荧光微球免疫检测卡的C线显色，T线不显色时，结果判定为阴性，样品中无尼卡巴嗪代谢物。若尼卡巴嗪代谢物时间分辨荧光微球免疫检测卡的C线不显色，则该检测结果无效。
2)定量判定结果的方法
通过免疫层析分析仪测试完成后，仪器将根据检测得到的荧光信号强弱，通过***设定的计算程序计算出样品中尼卡巴嗪代谢物的浓度，并根据预设的阈值给出阴阳性判断。因为每批尼卡巴嗪代谢物时间分辨荧光微球免疫检测卡在前期都会做大量的标准曲线试验，确定本批次的标准曲线，如果采用本批次的尼卡巴嗪代谢物时间分辨荧光微球免疫检测卡去检测实际的新样品，计算检测结果时，直接针对之前拟合的标准曲线进行计算即可，仪器***里的计算芯片进行处理，得到尼卡巴嗪代谢物的浓度。
实施例9尼卡巴嗪代谢物时间分辨荧光定量检测试剂盒各指标确定
1、尼卡巴嗪代谢物时间分辨荧光微球免疫检测卡标准曲线的确定
在实施例8制备的尼卡巴嗪代谢物时间分辨荧光微球免疫检测卡的加样孔中加入不同浓度的尼卡巴嗪代谢物标准品(分别用PBS缓冲液稀释成0ng/mL、0.10ng/mL、0.25ng/mL、0.50ng/mL、0.75 ng/mL、1.00ng/mL和1.25ng/mL)，按照实施例8的使用方法对每个尼卡巴嗪代谢物标准品浓度检测5次，取平均值。以添加的尼卡巴嗪代谢物终浓度为X轴，检测线T荧光信号值与质控线C荧光信号值的比值(T/C)为Y轴，拟合标准曲线，计算IC50值，IC50越低，灵敏度越好。
2、标记抗体和CT用量的确定
(1)标记抗体用量的确定
标记抗体用量对试纸条的影响和抗体用量一样，标记抗体用量过多，导致抗体浪费，T线难以消线并且可能出现假阴性现象，反之，抗体标记用量太少，纸条显色强度太弱，T线信号太低容易误判为假阳性。
本发明将原始浓度为5.71mg/mL的实施例3的尼卡巴嗪代谢物单克隆抗体用0.04mol/L BB缓冲液稀释为0.57mg/mL，分别添加2、4、6和8μL，0.57mg/mL的卡巴嗪代谢物单克隆抗体抗体与荧光微球偶联，得到不同的时间分辨荧光微球标记的尼卡巴嗪代谢物单克隆抗体，再按照实施例8的方法制备尼卡巴嗪代谢物时间分辨荧光微球免疫检测卡，按照实施例9步骤1的方法检测不同浓度的尼卡巴嗪代谢物标准品，其他步骤按照实施例8的方法进行检测。
(2)C/T线包被浓度确定
T线优化的原则是保持试纸条清晰的同时选择较低浓度的包被抗原，T线浓度过高会导致显色信号太强，结合过量的抗体标记，从而使纸条的灵敏度下降；反之，T线浓度过浅，导致T线结合不到抗体标记，容易受背景干扰。C线作为试纸条的质控线，直接决定纸条的有效性，在定量实验中，C 线的浓度会影响T/C的值，即试纸条的灵敏度。
为得到反应稳定、显色清晰的尼卡巴嗪代谢物时间分辨荧光微球免疫检测卡，本发明用不同的抗原浓度包被在CT线上，其中，
T线：1mg/mL实施例2制备的包被原DNC-4C-OVA，C线：0.35mg/mL羊抗鼠IgG；
T线：0.50mg/mL实施例2制备的包被原DNC-4C-OVA，C线：0.35mg/mL羊抗鼠IgG；
T线：0.25mg/mL实施例2制备的包被原DNC-4C-OVA，C线：0.25mg/mL羊抗鼠IgG；
T线：0.15mg/mL实施例2制备的包被原DNC-4C-OVA，C线：0.25mg/mL羊抗鼠IgG。
再按照实施例8的方法制备尼卡巴嗪代谢物时间分辨荧光微球免疫检测卡，按照实施例9步骤1 的方法检测不同浓度的尼卡巴嗪代谢物标准品，其他步骤按照实施例8的方法进行检测。
二、实验结果
(1)标记抗体用量的确定
根据图10显示，随着抗体标记用量的升高尼卡巴嗪代谢物时间分辨荧光微球免疫检测卡的灵敏度开始下降，当抗体用量为2μL时，检测不同浓度的尼卡巴嗪代谢物标准品，纸条显色明亮均匀(图 10A)，读数稳定且灵敏度(图10B)，所以综合显色强度和灵敏度，与20μL时间分辨荧光微球偶联的尼卡巴嗪代谢物单克隆抗体用量为2μL，即时间分辨荧光微球与尼卡巴嗪代谢物单克隆抗体的质量比为1：100。
(2)C/T线包被浓度确定
结果如图11所示，从图11A可看出，当T线：0.50mg/mL DNC-4C-OVA，C线：0.35mg/mL羊抗鼠IgG时，检测不同浓度的尼卡巴嗪代谢物标准品，T线和C线显色强度相当。从图11B可看出，当T线：0.50mg/mL DNC-4C-OVA，C线：0.35mg/mL羊抗鼠IgG时，IC50最低为0.26ng/mL，灵敏度好。因此，选择0.50mg/mL DNC-4C-OVA作为T线的最佳包被原、0.35mg/mL羊抗鼠IgG作为 C线的最佳二抗。
实施例10尼卡巴嗪代谢物时间分辨荧光定量检测试剂盒性能评价
一、实验方法
1、灵敏度
用实例8的尼卡巴嗪代谢物时间分辨荧光定量检测试剂盒检测鸡蛋和鸡肉样品。
2、添加回收实验
将尼卡巴嗪代谢物用0.05mol/L PB溶液(实施例4的样品复溶液)稀释到低、中、高三个浓度，并分别添加到鸡蛋和鸡肉样品中，使得鸡蛋和鸡肉样品中尼卡巴嗪代谢物最终添加浓度为0.1μg/kg、 0.15μg/kg和0.2μg/kg。样品经前处理后进行检测，具体方法与实施例8相同，将所得的T/C值代入标准曲线，算出回收的浓度及相对标准偏差。
3、特异性实验
向样品复溶液中分别添加0.75ng/mL的尼卡巴嗪代谢物、新霉素、盐霉素、地克珠利、硝基咪唑类、庆大霉素和磺胺类药物，震荡混匀，使用实施例8的尼卡巴嗪代谢物时间分辨荧光定量检测试剂盒进行检测。
4、稳定性实验
尼卡巴嗪代谢物时间分辨荧光微球免疫检测卡保存的条件为室温，为了探究试纸条的稳定性，对试纸条进行了加速破坏性实验，分别在室温(25℃)、50℃条件下分别保存1d、4d、8d、16d和 32d分别按照实施例8中所述方法对2g鸡肉阴性样品进行检测荧光信号值。
二、实验结果
1、灵敏度
结果如图12所示，图12A和图12B分别为建立鸡蛋和鸡肉的标准曲线的尼卡巴嗪代谢物时间分辨荧光定量检测试剂盒测试结果，图12C为荧光读数结果经origin 9.0软件拟合后得到的标准曲线。
在鸡蛋标准曲线中，该尼卡巴嗪代谢物时间分辨荧光定量检测试剂盒对尼卡巴嗪代谢物的检测限为0.08μg/kg，IC50为0.25μg/kg，IC20～IC80为0.11～0.60μg/kg；在鸡肉标准曲线中，该尼卡巴嗪代谢物时间分辨荧光定量检测试剂盒对尼卡巴嗪代谢物的检测限为0.10μg/kg，IC50为0.27μg/kg， IC20～IC80为0.15～0.44μg/kg。
2、添加回收实验
表8样本重复性与准确度试验结果
结果如表8所示，鸡蛋样品的平均添加回收率在90.53％～95.23％之间，批内变异系数在1.64％～ 5.91％，批间变异系数3.37％～8.68％之间；鸡蛋样品的平均添加回收率在90.71％～105.45％之间，批内变异系数在1.72％～5.75％，批间变异系数2.78％～6.56％之间；变异系数均小于15％，实施例 8的尼卡巴嗪代谢物时间分辨荧光定量检测试剂盒稳定性良好。
3、特异性实验
结果如图13显示，实施例8的尼卡巴嗪代谢物时间分辨荧光定量检测试剂盒对尼卡巴嗪代谢标识物的交叉反应率为100％，对新霉素、盐霉素、地克珠利、硝基咪唑类、庆大霉素和磺胺类药物等均无交叉反应。
4、稳定性实验
表9荧光信号值结果
结果由表9可知，在室温(25℃)和50℃下密封保存的尼卡巴嗪代谢物时间分辨荧光微球免疫检测卡32d后，试纸条的T/C值均无明显变化，说明尼卡巴嗪代谢物时间分辨荧光微球免疫检测卡在加速实验50℃下最少可稳定保存32d。说明实施例8的尼卡巴嗪代谢物时间分辨荧光定量检测试剂盒稳定性良好，常温(25℃)保存至少1年。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (8)

1.尼卡巴嗪代谢物半抗原在制备尼卡巴嗪代谢物人工抗原中的应用，所述尼卡巴嗪代谢物半抗原的分子结构式如式Ⅱ所示：
Figure FDA0004097700980000011
2.一种尼卡巴嗪代谢物人工抗原，其特征在于，为尼卡巴嗪代谢物半抗原与载体蛋白偶联所得，所述尼卡巴嗪代谢物人工抗原的结构式如式Ⅳ所示：
Figure FDA0004097700980000012
3.权利要求2所述尼卡巴嗪代谢物人工抗原在制备尼卡巴嗪代谢物人工抗体中的应用。
4.一种尼卡巴嗪代谢物人工抗原组合，其特征在于，包括免疫原和包被原，所述免疫原由尼卡巴嗪代谢物半抗原偶联血蓝蛋白或乳铁蛋白得到的，所述包被原由尼卡巴嗪代谢物半抗原偶联卵清蛋白或牛血清白蛋白得到的，所述尼卡巴嗪代谢物半抗原的分子结构式如式Ⅱ所示：
Figure FDA0004097700980000021
5.权利要求4所述尼卡巴嗪代谢物人工抗原组合在制备尼卡巴嗪代谢物检测试剂盒中的应用。
6.一种尼卡巴嗪代谢物检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有权利要求4所述的尼卡巴嗪代谢物人工抗原组合。
7.一种尼卡巴嗪代谢物检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有包被原和抗体，所述包被原为尼卡巴嗪代谢物半抗原与卵清蛋白或牛血清白蛋白偶联所得到的尼卡巴嗪代谢物人工抗原，所述抗体是以尼卡巴嗪代谢物半抗原与血蓝蛋白或乳铁蛋白偶联得到的人工抗原为免疫原免疫动物制备得到，所述尼卡巴嗪代谢物半抗原的分子结构式如式Ⅱ所示：
Figure FDA0004097700980000022
8.根据权利要求7所述的尼卡巴嗪代谢物检测试剂盒，其特征在于，所述尼卡巴嗪代谢物检测试剂盒为尼卡巴嗪代谢物酶联免疫试剂盒、尼卡巴嗪代谢物胶体金检测试剂盒和/或尼卡巴嗪代谢物时间分辨荧光定量检测试剂盒；
所述尼卡巴嗪代谢物酶联免疫试剂盒含有酶标板、权利要求7中所述的抗体和IgG羊抗鼠作为二抗，所述酶标板包被有权利要求7中所述的包被原；
所述尼卡巴嗪代谢物胶体金检测试剂盒含有尼卡巴嗪代谢物胶体金检测卡，所述尼卡巴嗪代谢物胶体金检测卡包括样品吸收垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸水垫、PVC板和结合物释放垫；所述硝酸纤维素膜的检测区包被有权利要求7中所述的包被原，作为T线；所述硝酸纤维素膜的质控区包被有羊抗鼠IgG，作为C线；所述胶体金垫包被有权利要求7中所述的抗体；
所述尼卡巴嗪代谢物时间分辨荧光定量检测试剂盒含有尼卡巴嗪代谢物时间分辨荧光微球免疫检测卡，所述尼卡巴嗪代谢物时间分辨荧光微球免疫检测卡包括在样品吸收垫、结合物释放垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC板；所述硝酸纤维素膜的检测区包被有权利要求7中所述的包被原，作为T线；所述硝酸纤维素膜的质控区包被有羊抗鼠IgG，作为C线；所述结合物释放垫包被有权利要求7中所述的抗体。
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