CN117347530B - 一种维生素b2中塑化剂的检测方法 - Google Patents

一种维生素b2中塑化剂的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种维生素B2中塑化剂的检测方法，该方法利用液相色谱‑质谱（LC‑MS）内标法检测维生素B2中塑化剂，在试样制备步骤为取维生素B2样品，置于容量瓶中，加入水温为95‑100℃的纯净水，沸水浴加热溶解，分离塑化剂后，冷却至室温，定容；随后将溶液转烧瓶，减压旋蒸至干，之后使用甲醇复溶，加入磷酸三苯酯‑乙腈溶液内标工作液混合均匀，微孔滤膜过滤，使用LC‑MS检测分析。本发明首次提出了一种针对维生素B2中塑化剂的检测方法，该方法操作简便、检测成本低、检测结果准确，能够广泛应用于实验室中对维生素B2中塑化剂的快速检测。

Description

一种维生素B2中塑化剂的检测方法
技术领域
本发明属于化学物质检测领域，具体的是一种维生素B2中塑化剂的检测方法。
背景技术
塑化剂广泛的应用于高分子材料中，其能够高效低成本的改善高分子塑料产品的流变加工性能，而塑料制品在生活中无处不在，如农业生产中的塑料薄膜、工业生产过程中的塑料传送件、塑料容器等，塑料制品的广泛使用造成许多农作物和工业产品中残留一定量的塑化剂；塑化剂是一种环境激素，会影响人体的内分泌，并对人类生殖健康造成损害。
维生素B2作为一种重要的食品药品的原料，是人体的代谢环节重要的组分，同时维生素B2的水溶性较强，在人体中难以长期留存，并且维生素B2人体无法合成，因此需要长期通过外源补充。目前维生素B2的生产主要是利用发酵法制备，其碳源主要来源于农作物的玉米和大豆，由于农作和加工过程中会使用大量的塑料用品，而在发酵过程中微生物未将塑化剂进行发酵分解，因此在实际产品中维生素B2产品仍然混杂一定量的塑化剂。
对于塑化剂的检测，国标GB 5009.271—2016食品安全国家标准规定了食品中邻苯二甲酸酯的测定，主要公开了使用两种方法进行检测，第一法采用气相色谱-质谱法同位素内标法，在试样中加入氘代的邻苯二甲酸酯作为内标，各类食品经提取、SPE固相萃取柱净化后经气相色谱-质谱联用仪进行测定。第二法采用气相色谱-质谱法外标法，各类食品提取、净化后采用气相色谱-质谱法测定。采用特征选择离子监测扫描模式(SIM)，以保留时间和定性离子碎片丰度比定性,外标法定量。其中，该标准主要针对的是食品领域中塑化剂的检测，包括了对液态试样 A:液体乳、饮料、酱油、食醋、白酒、蜂蜜等、半固态试样 A:果冻、甜面酱等，固态试样 A:乳粉、米粉、鸡精、味精、干酪、糖果、花粉、肉制品、糕点、方便面、果蔬及其制品等，固态试样 B:黄油等。可以看出，该标准的检测方法主要是针对食品领域中塑化剂的检测，而对于维生素B2这种可应用于食品领域和医药领域的原料的检测方法并不存在；另外由于维生素B2的性能也是显著的区分于上述的食品性能，但是维生素的应用主要是在人体的摄入，因此行业中对维生素B2原料中塑化剂的含量进行测定需求日益显著。
现有技术期刊文献“气相色谱－质谱法测定食品中17种邻苯二甲酸酯类塑化剂的含量”，张国民等，《理化检测-化学分册》，2020年第56卷，第46-54页，公开了使用GS-MS方法测定食品中塑化剂的具体操作和结论分析，其使用的方法参照GB 5009.271—2016中提供的方法，但是从其分析的结论也能看出参照该国标的方法检测方法也会存在操作复杂，测试准确性等问题，因此，其在仪器工作条件考虑到塑化剂的弱极性以及离子源脏污等因素，在进样时选用了硅烷化处理的带玻璃毛超惰性衬管，提高气相进样温度为300-310℃；在样品净化操作上考虑到基质增强效应，部分样品在未经过固相萃取柱萃取回收率会偏高很多，如对于菠菜、芹菜、芒果汁的回收率能达到150%以上，也能反馈出杂质对于回收样品的影响，因此该方案使用了N-丙基乙二胺与硅吸附剂复合填料(PSA/Silica)玻璃固相萃取柱净化，能够将回收率降低到83.2%-135%。另外，该方案还进一步的对提取溶剂、超声时间、温度等都进行了验证和调整，达到一种更加回归准确的检测方法。
从现有技术也能看出，对于国标提出的检测食品中塑化剂方法在实际的操作过程中存在一定的漏洞和缺陷，主要是针对市面在售的产品进行塑化剂检测，同时检测方法中试样的制备方法复杂，对于塑化剂的富集难度大；而目前对于维生素B2这类食品添加原料中塑化剂的检测现有技术中并未公开一个成熟可行的方法，如何对于食品和药品原料维生素B2中塑化剂含量进行准确检测也是行业中必须面临的课题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种维生素B2中塑化剂的检测方法，应用于维生素B2原料，该方法操作简便、检测成本低、检测结果准确，能够广泛应用于实验室中对维生素B2中塑化剂的快速检测，提出了传统检测方法中未存在的针对维生素B2中塑化剂的测定方法。
基于现有技术，本发明的构思在于提供一种维生素B2中塑化剂的检测方法，该方法利用液相色谱-质谱法（LC-MS）内标法检测维生素B2中的塑化剂含量，其中内标物选择为磷酸三苯酯，该内标物在维生素B2原料加工过程中并未添加，且与塑化剂的色谱峰能够区分能够取得较好的内标参照作用。
进一步的，本发明的构思还在于提供一种维生素B2中塑化剂的检测方法，该方法使用更加简单的处理样品，具体的是使用沸水对样品进行加热溶解后通过减压旋蒸至干，再使用溶剂复溶残留物，微孔滤膜过滤。该样品处理方法能够充分的将维生素B2中微量塑化剂富集、纯化。
进一步的，本发明的另一构思还在于提供一种维生素B2中塑化剂的检测方法，该方法使用甲醇作为提取和复溶溶剂，甲醇溶剂能够显著的提高检测的准确性和稳定性。
具体的，本发明提供了一种维生素B2中塑化剂的检测方法，其特征在于，利用液相色谱-质谱（LC-MS）内标法检测维生素B2中塑化剂，包括如下步骤：
（1）溶液配制；
配制内标工作液、塑化剂标准品工作溶液、标准检测溶液。
（2）试样制备
取维生素B2样品，置于容量瓶中，加入纯净水，沸水浴加热，溶解后，冷却至室温，定容，将溶液转置烧瓶，减压旋蒸至干；用甲醇复溶，加入内标工作液混合均匀，微孔滤膜过滤，得到待测液体，待LC-MS检测分析。
（3）LC-MS检测分析
其中，所述的步骤（1）溶液配制包括：
配制内标储备液，内标储备液为磷酸三苯酯-乙腈溶液；
所述的磷酸三苯酯-乙腈溶液的浓度为2mg/mL；
上述磷酸三苯酯-乙腈溶液配制其操作为称取20mg磷酸三苯酯，用乙腈定容至10mL；
所述的内标储备液在-18℃条件下可至少保存3个月。
配制内标工作液，所述的内标工作液为磷酸三苯酯-乙腈溶液；
所述内标工作液磷酸三苯酯-乙腈溶液的浓度为20ug/mL；
上述内标工作液配制操作为吸取100uL 2mg/mL磷酸三苯酯-乙腈溶液，用乙腈定容至10mL，混匀均匀。
配制塑化剂标准品储备液，分别配制塑化剂为邻苯二甲酸二甲酯（Dimethylphthalate DMP）、邻苯二甲酸二乙酯（Diethyl phthalate DEP）、邻苯二甲酸二异丁酯（Diisobutyl phthalate DIBP）、邻苯二甲酸丁基苯酯（benzyl butyl Phthalate BBP）、邻苯二甲酸二丁酯（Dibutyl phthalate DBP）、邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（Di(2-ethylhexyl) phthalateDEHP）、邻苯二甲酸二辛脂（Di-n-octyl phthalate DNOP）、邻苯二甲酸二异壬酯（Diisononyl phthalate DINP）、邻苯二甲酸二异癸酯（Diisodecylphthalate DIDP）的塑化剂标准品储备液；
上述塑化剂标准品储备液的浓度为1000ug/mL；
上述配制塑化剂标准品储备液的操作为取上述塑化剂25mg于25mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至25mL，得到浓度为1000ug/mL的塑化剂标准品储备液。
配制塑化剂中间标准品溶液，所述塑化剂中间标准品溶液的浓度为10ppm；
上述配制塑化剂中间标准品溶液的操作为取前述浓度为1000ug/mL塑化剂标准品储备液0.5mL，用甲醇稀释至50mL摇匀，得到浓度10ppm的塑化剂中间标准品溶液；
上述塑化剂中间标准品溶液可在-18℃条件保存1个月。
配制塑化剂标准品工作溶液，利用塑化剂标准品储备液和中间标准品溶液配制标准品工作溶液；
所述的塑化剂标准品工作溶液浓度为200、100、50、10、5、1ppb；
配制塑化剂标准品工作溶液的操作为，取塑化剂中间标准品溶液2.5mL，用甲醇溶解并稀释至50mL，摇匀，得到500ppb浓度的标准品工作溶液；将此溶液稀释得到200、100、50、10、5、1ppb浓度的塑化剂标准品工作溶液。
配制塑化剂标准品检测溶液，取每个浓度的塑化剂标准品工作溶液1mL依次加入20uL内标工作液混合均匀，0.22um微孔滤膜过滤，得到塑化剂标准品检测溶液；
滤后装入进样瓶进样检测，绘制标准曲线，采用甲醇为空白溶剂。
上述标准检测溶液用以进行（3）LC-MS检测分析，并分析各塑化剂标准曲线。
在一些实施例中，所述的步骤（2）试样制备的操作步骤如下：
2.1取维生素B2样品，置于容量瓶中，加入纯净水，沸水浴加热溶解后，冷却至室温，定容；
2.2将溶液转烧瓶，减压旋蒸至干；
2.3使用甲醇复溶，加入内标工作液混合均匀，微孔滤膜过滤，得到待测液体，待LC-MS检测分析。
其中，所述步骤2.1中加入纯净水为高温水，水温为90-100℃，优选为95-100℃；
所述步骤2.1的的溶解时间为20-40min，优选为30-40min；
所述的步骤2.1的加入纯净水中水的用量为维生素B2与水的质量体积比为1:0.6-0.9，优选的为1:0.7-0.9，更优选的为1:0.8；
所述的步骤2.1中定容为使用纯进水定容至容量瓶刻度。
所述的步骤2.2中减压旋蒸的温度为80-90℃，优选的为85℃。
所述的步骤2.3中所述的甲醇溶解为维生素B2与甲醇的质量体积比为5:0.8-1.2，优选的为5:0.9-1.1；更优选的为5:1；
所述的步骤2.3中加入内标工作液的操作为1mL的样品溶液中加入15-25μL的内标工作液，具体的可以加入20uL 内标工作液。
具体的，所述的步骤2.3中加入内标工作液的操作取样品溶液1mL加入20uL内标工作液混合均匀。
更具体的，所述的步骤（2）试样制备的操作可以按照如下步骤操作：
取维生素B2样品45-55mg于容量瓶中，加入沸水35-40mL，沸水浴加热，冷却至室温，用水稀释至容量瓶刻度。将溶液转移至250mL平底烧瓶，80-90℃下减压旋蒸至干，取出平底烧瓶，用甲醇复溶残留物，并定容，取样品溶液1mL加入20uL内标工作液混合均匀，0.22um微孔滤膜过滤后装入进样瓶进样检测。
更具体的，所述的步骤（2）试样制备的操作步骤如下：
取维生素B2样品约50mg，置于50mL容量瓶中，加入刚煮沸的纯净水约40mL，沸水浴加热30min，冷却至室温，用水稀释至刻度线；将溶液转移至250mL平底烧瓶，85℃下减压旋蒸至干，取出烧瓶，用甲醇复溶残留物，并定容至10mL，取样品溶液1mL加入20uL内标工作液混合均匀，0.22um微孔滤膜过滤后装入进样瓶进样检测。
在另一些实施例中，本发明所述步骤（3）LC-MS检测分析的操作为将待测液体注入液相色谱-质谱联用仪中，由待测液体中邻苯二甲酸酯各组分及其内标峰面积比值进行定量计算；
进一步的，所述的（3）LC-MS检测分析按照如下参数进行测试，
所述的检测设备为：Agilent1260-6465液相色谱三重四级杆质谱联用仪（LC-MSMS）
色谱柱：Agilent EC-C18 2.7um 100*2.1mm + 5*2.1mm guard column
柱温：30℃
流速：0.3mL/min
进样量：5uL
流动相A：称取乙酸胺0.39g，用水溶解并稀释至1000mL，0.22um微孔滤膜过滤后备用；
流动相B：甲醇
流动相A和B照下表进行梯度洗脱
毛细管电压：4000V
气体温度：350℃
鞘气温度：250℃
鞘气流速：11L/min
喷雾器压力：40psi
检测模式MRM
可分段采集片段，如0-7分钟采集DEHP、DIDP、DINP、DNOP的片段，7-11分钟采集BBP、DBP、DIBP的片段，11分钟后采集DEP、DMP的片段，具体时间段的调整根据具体物质的出锋时间可进行适当的调整。
检测离子对、碰撞能量、进样锥电压见下表：
在另一些实施例中，本发明还提供了一种标准曲线的制备方法，
将系列塑化剂标准品检测溶液分别注入液相色谱-质谱联用仪中，以邻苯二甲酸酯各组分及其对内标物的峰面积比值为纵坐标，以系列塑化剂标准品检测溶液中各组分含量(μg/mL)与对应内标物含量 (μg/mL)比值为横坐标，绘制标准曲线。
在另一些实施例中，本发明还提供了一种定量实验的测试标准，计算求出待测品中各邻苯二甲酸酯的含量（ppm）。
具体的，是在步骤（3）中得出试样溶液中各组分含量(μg/mL)与对内标物含量(μg/mL)比值。再根据试样中加入的对内标物含量(μg/mL)计算试样溶液中邻苯二甲酸酯各组分含量(μg/mL)。
进一步的，所述的计算公式如下：
各邻苯二甲酸酯含量（ppm）=
式中：c—由标准曲线求得的待测液中各邻苯二甲酸酯的浓度（ppm）
c0—由标准曲线求得的各空白溶液中各邻苯二甲酸酯的浓度（ppm）
V—待测液的体积（mL）
m—待测液的称量重量（g）。
相对于现有技术对于塑化剂的测试方法而言，本发明创造性的提出了针对维生素B2中塑化剂的测试方法，该方法与现有技术的测试方法不同，使用热水对维生素进行溶解处理，并使用沸水加热，能够充分的将维生素中的塑化剂进行脱离，且保证塑化剂的稳定；同时使用甲醇复溶检测，能够更加充分和准确的监测出维生素B2中的塑化剂，检测方法简单，效率高。
附图说明
图1、总离子流图；
图2、邻苯二甲酸丁基苯酯离子流图；
图3、邻苯二甲酸二异丁酯邻苯二甲酸二丁酯离子流图；
图4、邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯离子流图；
图5、邻苯二甲酸二乙酯离子流图；
图6 、邻苯二甲酸二异癸酯离子流图；
图7 、邻苯二甲酸二异壬酯离子流图；
图8、邻苯二甲酸二甲酯离子流图；
图9 、邻苯二甲酸二辛酯离子流图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明的保护范围。
本实施例方案所提供的一种维生素B2中塑化剂的检测方法，其特征在于，利用液相色谱-质谱（LC-MS）内标法检测维生素B2中塑化剂含量，包括如下步骤：
（1）溶液配制；
（2）试样制备；
（3）LC-MS检测分析。
其中，所述的步骤（1）溶液配制包括
配制内标储备液，内标储备液为磷酸三苯酯-乙腈溶液，所述的磷酸三苯酯-乙腈溶液的浓度为2mg/mL；
上述磷酸三苯酯-乙腈溶液配制其操作为称取20mg磷酸三苯酯，用乙腈定容至10mL；
所述的内标储备液在-18℃条件下可至少保存3个月。
配制内标工作液，所述的内标工作液为磷酸三苯酯-乙腈溶液的浓度为20ug/mL。
上述内标工作液配制其操作为吸取100uL 的2mg/mL磷酸三苯酯乙腈溶液，用乙腈定容至10mL，混匀均匀。
需要说明的是对于具体的配制溶液的操作可以根据实际的实验器材来进行操作。
配制塑化剂标准品储备液，分别配制塑化剂为邻苯二甲酸二甲酯（Dimethylphthalate DMP）、邻苯二甲酸二乙酯（Diethyl phthalate DEP）、邻苯二甲酸二异丁酯（Diisobutylphthalate DIBP）、邻苯二甲酸丁基苯酯（benzyl butyl Phthalate BBP）、邻苯二甲酸二丁酯（Dibutyl phthalate DBP）、邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（Di(2-ethylhexyl)phthalate DEHP）、邻苯二甲酸二辛酯（Di-n-octyl phthalate DNOP）、邻苯二甲酸二异壬酯（Diisononyl phthalate DINP）、邻苯二甲酸二异癸酯（Diisodecylphthalate DIDP）的塑化剂标准品储备液。
上述塑化剂标准品储备溶液的浓度为1000ug/mL；所述的塑化剂标准品溶液根据需要可以进行稀释，另外，所述的塑化剂标准品溶液可于-18℃条件保存3个月。
上述配制塑化剂标准品溶液的操作为取上述塑化剂于25mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至25mL，得到浓度为1000ug/mL的塑化剂标准品储备液。
配制塑化剂中间标准品溶液，所述中间标准品溶液的浓度为10ppm；
上述配制塑化剂中间标准品溶液的操作为取前述浓度为1000ug/mL塑化剂标准品溶液0.5mL，用甲醇稀释至50mL摇匀，得到浓度10ppm的塑化剂中间标准品溶液。
配制塑化剂标准品工作溶液，利用塑化剂标准品储备溶液和中间标准品溶液配制标准品工作溶液，所述的标准品工作溶液浓度为200ppb、100ppb、50ppb、10ppb、5ppb、1ppb；
配制塑化剂标准检测溶液，具体操作为取每个浓度的塑化剂标准品工作液1mL依次加入20uL内标工作液混合均匀，0.22um微孔滤膜过滤。
上述标准检测溶液用以进行（3）LC-MS检测分析，计算各塑化剂的标准曲线。
所述的步骤（2）试样制备的操作步骤如下：
2.1取维生素B2样品，置于容量瓶中，加入纯净水，沸水浴加热溶解后，冷却至室温，定容；
2.2将溶液转烧瓶，减压旋蒸至干；
2.3使用甲醇复溶，加入内标工作液混合均匀，微孔滤膜过滤，得到待测液体，待LC-MS检测分析。
其中，所述步骤2.1的加入的水为高温水，水温为90-100℃，优选为95-100℃；可以为90℃、95℃、98℃、100℃。
本发明的方案使用的高温的溶解方法，虽然维生素B2是一种水溶性的维生素，但是其溶解度在纯水中较低，本发明使用高温条件下进行样品处理，并且用近乎沸水温度处理，处理温度为90-100℃，优选的为95-100℃条件下处理，使得维生素B2的溶解性能提高，同时不引入其他溶剂，避免其他溶剂残留影像测试结果，在本发明的设计的溶解条件能够使得维生素B2发生溶胀或溶解，在该条件处理过程中，分子之间的间隙得到充分的分离，同时维生素B2在水中的溶解性相对较低，此时能够更加有利于塑化剂的析出和分离，使得塑化剂在后续的检测更加准确。
所述步骤2.1的的溶解时间为20-40min，优选为30-40min；可以是30min，35min或40min。
所述的步骤2.1的水加入量为维生素B2与水的质量体积比为1:0.6-0.9，优选的为1:0.8。
本发明定容维生素B2与水的质量比控制在1:0.6-0.9，在此范围内维生素B2并未发生明显的溶解，但是其能够更加有效的促进塑化剂与维生素B2的分离，同时由于水的用量较小，该状态下能够显著的减小溶液中维生素B2的含量，在后期的复溶过程中，减少维生素B2的掺杂，提高检测的准确性。
所述的步骤2.2中减压旋蒸的温度为80-90℃，优选的为85℃；
所述的步骤2.3中所述的甲醇溶解为维生素B2与甲醇的质量体积比为5:0.8-1.2，优选的为5:0.9-1.1；更优选的为5:1。
本发明选择的提取物为甲醇，塑化剂可以快速溶解于甲醇溶液中，保证溶解高效性的同时，确保测试结果的准确。
所述的步骤2.3中加入内标工作液的操作为1mL的样品溶液中加入15-25μL的内标工作液，具体的，可以加入20μL。
具体的，所述的步骤2.3中加入内标工作液的操作取样品溶液1mL加入20uL内标工作液混合均匀。
更具体的，所述的步骤（2）试样制备的操作步骤如下：
取维生素B2样品约50mg，置于50mL容量瓶中，加入刚煮沸的纯净水约40mL，沸水浴加热30min，冷却至室温，用水稀释至刻度线。将溶液转移至250mL平底烧瓶，85℃下减压旋蒸至干，取出烧瓶，用甲醇复溶残留物，并定容至10mL，取样品溶液1mL加入20uL内标工作液混合均匀，0.22um微孔滤膜过滤后装入进样瓶进样检测。
在另一些实施例中，本发明所述步骤（3）LC-MS检测分析的操作为将待测液体注入液相色谱-质谱联用仪中，由待测液体中邻苯二甲酸酯各组分及其内标峰面积比值进行定量计算；
其中，所述的标准曲线的测试和制作操作如下，
将系列塑化剂标准品检测液分别注入液相色谱-质谱联用仪中，以邻苯二甲酸酯各组分及其对内标物的峰面积比值为纵坐标,以系列标准品检测溶液中各组分含量(μg/mL)与对应内标物含量 (μg/mL)比值为横坐标，绘制标准曲线。
在一些实施例中，所述的（3）LC-MS检测分析按照如下参数进行测试，
色谱柱：Agilent EC-C18 2.7um 100*2.1mm + 5*2.1mm guard column
柱温：30℃
流速：0.3mL/min
进样量：5uL
流动相A：称取乙酸胺0.39g，用水溶解并稀释至1000mL，0.22um微孔滤膜过滤后备用。
流动相B：甲醇
流动相A和B照下表进行梯度洗脱
毛细管电压：4000V
气体温度：350℃
鞘气温度：250℃
鞘气流速：11L/min
喷雾器压力：40psi
检测模式MRM
可分段采集片段，如0-7分钟采集DEHP、DIDP、DINP、DNOP的片段，7-11分钟采集BBP、DBP、DIBP的片段，11分钟后采集DEP、DMP的片段，具体时间段的调整根据具体物质的出锋时间可进行适当的调整。
检测离子对、碰撞能量、进样锥电压见下表：
其中，上述实施例中所使用的仪器：Agilent1260-6465液相色谱三重四级杆质谱联用仪、分析天平、Neolab智能氮气发生器（一套）、涡旋混合仪、冰箱、超声波震荡仪。
试剂及试液的配置：除特别注明外，实验中所用试剂为HPLC级或LC-MS级，水为纯净水；
在另一些实施例中，本发明还提供了一种定性实验的测试标准，
其中，试样中目标化合物色谱峰的保留时间与相应标准色谱图的保留时间相比较，变化范围应在±2.5%以内。
每种化合物的质谱定性离子必须出现，至少应包括一个母离子和两个子离子，而且统一检测批次，对同一化合物，样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度与浓度相当的标准品溶液相比，其允许偏差不超过下表规定的范围。
在另一些实施例中，本发明还提供了一种定量实验的测试标准，计算求出待测品中各邻苯二甲酸酯的含量（ppm）
具体的，是在步骤（3）中得出试样溶液中各组分含量(μg/mL)与对内标物含量(μg/mL)比值。再根据试样中加入的对内标物含量(μg/mL)计算试样溶液中邻苯二甲酸酯各组分含量(μg/mL)。
进一步的，所述的计算公式如下：
各邻苯二甲酸酯含量（ppm）=
式中：c—由标准曲线求得的待测液中各邻苯二甲酸酯的浓度（ppm）
c0—由标准曲线求得的各空白溶液中各邻苯二甲酸酯的浓度（ppm）
V—待测液的体积（mL）
m—待测液的称量重量（g）
实施例1 塑化剂标准曲线的制备
配制标准品工作溶液，利用标准储备液和中间标准品溶液配制标准品工作溶液，所述的标准品工作溶液浓度为200ppb、100ppb、50ppb、10ppb、5ppb、1ppb。
将系列塑化剂标准品检测液分别注入液相色谱-质谱联用仪中，以邻苯二甲酸酯各组分及其对内标物的峰面积比值为纵坐标，以系列标准品检测溶液中各组分含量(μg/mL)与对应内标物含量 (μg/mL)比值为横坐标，绘制标准曲线。
测试的标准曲线如下：
表1 各化合物的标准曲线及相关系数
实施例2 试样制备工艺对检测结果的影响
维生素B2待检测物质的试样按照如下步骤操作进行，
取维生素B2样品50mg，置于容量瓶中，加入水，所述的水为纯净水，水浴溶解（水浴温度与加入水的温度相同），冷却至室温，定容；
将溶液转烧瓶，减压旋蒸至干；
使用甲醇复溶，加入内标工作液混合均匀，微孔滤膜过滤，得到待测液体，待LC-MS检测分析。
本组实施例对溶解维生素B2的水的体积、温度进行分析，同时对在复溶过程中，提取溶剂种类和用量对检测结果的影响。
表2 维生素B2试样不同处理工艺（试样制备工艺）
其中，针对实施例2-8选取的LC-MS色谱图，见图1-9，其中图1为总离子流图，图2-图9为不同塑化剂的离子流图。
具体的图2为邻苯二甲酸丁基苯酯离子流图；图3为邻苯二甲酸二异丁酯邻苯二甲酸二丁酯离子流图；图4为邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯离子流图；图5为邻苯二甲酸二乙酯离子流图；图6 为邻苯二甲酸二异癸酯离子流图；图7 为邻苯二甲酸二异壬酯离子流图；图8为邻苯二甲酸二甲酯离子流图；图9为邻苯二甲酸二辛酯离子流图。
进一步的，上述实施例2-1至实施例2-10中所测试出的结果如下：
表3 不同试样制备的测试结果
本发明选取0-7分钟采集DEHP、DIDP、DINP、DNOP的片段中DEHP的片段计算其含量；7-11分钟采集BBP、DBP、DIBP的片段中的DBP的片段计算器含量；11分钟后采集DEP、DMP的片段中的DEP的片段计算器含量。
从实施例2-1至实施例2-10的测试结果来看，本发明实施例2-2与实施例2-6的对比可以看出，使用常温水（实施例2-2,35℃水）进行维生素B2的溶解和使用高温热水（实施例2-6,95℃热水）进行维生素B2的溶解，两者测出的结果来看，热水条件下测出的结果是明显的大于常温水来溶解维生素B2的方案，可以看出高温热水的溶解可以更加充分的将塑化剂与维生素B2进行分离，便于检测出更加准确的数据。
而实施例2-1至实施例2-3的方案来看，在温水的用量增加的情况下，测试结果是增加的，溶解时间的增加同样能在一定程度上增加检测结果；但是温水用量的增加，如从50ml增加到100ml对最终的结果影响不是很明显（实施例2-2和实施例2-3比对），可以看出在较低的热水用量情况下即可以保证塑化剂与维生素B2的分离。
实施例2-2,实施例2-4,实施例2-5,实施例2-6可以看出，在不同温度的热水处理维生素B2和溶解时间的变化，都会影响最终塑化剂的测试结果，同时从结果分析，如实施例2-2和实施例2-4，在减少热水处理时间，但是增加热处理的温度，可以明显的看出高温条件相对而言检测出的增塑剂的含量是更高的，进一步的也能说明温度对于塑化剂的析出，并影响最终检测数值的影响更为明显。在实施例2-2和实施例2-6对比可以看出，在温度达到95℃的条件下，检出率是35℃条件下的两倍，更进一步的说明本发明的热温条件下能够保证分离效率。
另外，从实施例2-6,实施例2-7,实施例2-10来看，使用不同的提取剂对于测试同样存在影响，本发明使用的甲醇能够更好的促进塑化剂的检出。
从实施例2-6,实施例2-8,实施例2-9的测试结果来看，提取剂的用量变化对测试结果的影响，提取剂用量的增加，会导致最终塑化剂的浓度更小，需要仪器有更加精密的检出限，本发明在较低的提取剂用量条件下即可得到更加可信的结果。
虽然本发明在实施例和附图中对发明方案做出了详细的说明，但本发明保护范围并不限于所述具体实施例和附图的展示，基于本领域技术人员可以在不背离本发明构思的情况下在本文中实现各种改变和修改。

Claims (10)

1.一种维生素B2中塑化剂的检测方法，其特征在于，利用液相色谱-质谱（LC-MS）内标法检测维生素B2中塑化剂，包括如下步骤：
（1）溶液配制
配制内标工作液、塑化剂标准品工作溶液和塑化剂标准检测溶液；
（2）试样制备
（3）LC-MS检测分析
其中，所述的步骤（2）试样制备的操作步骤如下：
2.1取维生素B2样品，置于容量瓶中，加入纯净水，沸水浴加热溶解后，冷却至室温，定容；
所述步骤2.1的加入的纯净水的水温为95-100℃；
所述的步骤2.1的加入纯净水中水的用量为维生素B2与水的质量体积比为1:0.7-0.9；
2.2将溶液转烧瓶，减压旋蒸至干；
2.3使用甲醇复溶，加入内标工作液混合均匀，微孔滤膜过滤，得到待测液体，待LC-MS检测分析。
2.如权利要求1所述的维生素B2中塑化剂的检测方法，其特征在于，
所述的步骤（1）溶液配制包括，
配制内标工作液，所述的内标工作液为磷酸三苯酯-乙腈溶液；
所述的内标工作液磷酸三苯酯-乙腈溶液的浓度为20 ug/mL。
3.如权利要求2所述的维生素B2中塑化剂的检测方法，其特征在于，
所述的步骤（1）溶液配制还包括，
配制塑化剂标准品储备溶液，分别配制塑化剂为邻苯二甲酸二甲酯（Dimethylphthalate DMP）、邻苯二甲酸二乙酯（Diethyl phthalate DEP）、邻苯二甲酸二异丁酯（Diisobutyl phthalate DIBP）、邻苯二甲酸丁基苯酯（benzyl butyl Phthalate BBP）、邻苯二甲酸二丁酯（Dibutyl phthalate DBP）、邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（Di(2-ethylhexyl) phthalate DEHP）、邻苯二甲酸二辛酯（Di-n-octyl phthalate DNOP）、邻苯二甲酸二异壬酯（Diisononyl phthalate DINP）、邻苯二甲酸二异癸酯（Diisodecylphthalate DIDP）的塑化剂标准品储备溶液；
上述塑化剂标准品储备溶液的浓度为1000ug/mL。
4.如权利要求3所述的维生素B2中塑化剂的检测方法，其特征在于，
配制塑化剂中间标准品溶液，使用甲醇稀释塑化剂标准品储备溶液制备获得；所述中间标准品溶液的浓度为10ppm。
5.如权利要求4所述的维生素B2中塑化剂的检测方法，其特征在于，
配制塑化剂标准品工作溶液，利用塑化剂标准品储备液和中间标准品溶液配制标准品工作溶液；
所述的塑化剂标准品工作溶液浓度为200ppb、100ppb、50ppb、10ppb、5ppb、1ppb。
6.如权利要求5所述的维生素B2中塑化剂的检测方法，其特征在于，
所述的步骤（1）溶液配制中塑化剂标准检测溶液的配置方法为:
取每个浓度的塑化剂标准品工作溶液1mL依次加入20uL内标工作液混合均匀，0.22um微孔滤膜过滤。
7.如权利要求1所述的维生素B2中塑化剂的检测方法，其特征在于，
所述步骤2.1的的溶解时间为30-40min；
所述的步骤2.2中减压旋蒸的温度为80-90℃。
8.如权利要求7所述的维生素B2中塑化剂的检测方法，其特征在于，所述的步骤2.3中所述的甲醇溶解为维生素B2与甲醇的质量体积比为5:0.9-1.1。
9.如权利要求1所述的维生素B2中塑化剂的检测方法，其特征在于，
所述的步骤2.3中加入内标工作液的操作为1mL的样品溶液中加入15-25μL的内标工作液。
10.如权利要求1-9任一项所述的维生素B2中塑化剂的检测方法，其特征在于，
所述步骤（3）LC-MS检测分析的操作为将待测液体注入液相色谱-质谱联用仪中，由待测液体中邻苯二甲酸酯各组分及其内标峰面积比值进行定量计算；
计算公式如下：
各邻苯二甲酸酯含量/ppm=
式中：c—由标准曲线求得的待测液中各邻苯二甲酸酯的浓度/ppm；
c0—由标准曲线求得的各空白溶液中各邻苯二甲酸酯的浓度/ppm；
V—待测液的体积/mL；
m—待测液的称量重量/g。
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