CN116124905A - 一种小鼠血浆、粪便或组织样本中短链脂肪酸的检测方法 - Google Patents

一种小鼠血浆、粪便或组织样本中短链脂肪酸的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于气相色谱质谱联用快速检测小鼠血浆、粪便及组织样本中短链脂肪酸分析方法，涉及分析化学在临床医学研究中的应用。具体步骤为，取新鲜样本，加入乙腈提取短链脂肪酸，经过离心后进行于气相色谱质谱联用仪器分析。本发明的检测方法简单、快速，准确地测定生物样品中的短链脂肪酸含量情况，排除实验中其他因素对定量结果产生干扰。

Description

一种小鼠血浆、粪便或组织样本中短链脂肪酸的检测方法
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体涉及一种基于气相色谱质谱联用仪检测小鼠血浆、粪便及组织样本中短链脂肪酸分析方法。
背景技术
短链脂肪酸是指碳原子数小于6的有机脂肪酸，包括Acetic acid，Propionicacid，Butyric Acid，Isobutyric acid，Valeric Acid，Isovaleric acid，Hexanoic Acid，3-Methylvaleric acid，4-Methylvaleric acid。它们由肠道内的细菌降解碳水化合物和蛋白质产生，其中95％被结肠细胞吸收，以ATP的形式提供能量或通过基底外侧膜进入体循环，另外5％随粪便排出体外。据报道其能调控能量平衡，保护免疫***、抵抗炎症反应等，在肠道菌群代谢中发挥了重要作用。建立一种快速检测小鼠血浆、粪便及组织样本中短链脂肪酸分析方法，以期为与短链脂肪酸相关的肠道菌群代谢研究提供帮助。
现如今，有很多关于生物样品中短链脂肪酸分析方法的报道。气相色谱质谱联用是检测挥发性有机物最重要的也是最常用的分析技术，因此短链脂肪酸分析多采用气相色谱质谱联用技术。但是前处理需要通过复杂的溶剂体系提取(例如氯化钠溶液及***)，接着采用固相萃取小柱富集，或是采用MTBSTFA试剂衍生，前处理步骤繁琐，可能引入污染或是导致短链脂肪酸损失。液相色谱-质谱不仅具有分辨率高的优势，且线性范围广，能够同时保证定性定量准确性。有报道称利用3-nitrophenylhydrazine衍生，结合液相色谱质谱可以检测粪便中的短链脂肪酸。我们对不同品牌超纯水及甲醇空白进行考察，都有很高的短链脂肪酸检出，如果用此方法，只适合于检测短链脂肪酸含量高的粪便样本，而对含量低的样本会造成很大污染。所以需要建立一种快速检测小鼠血浆、粪便及组织样本中短链脂肪酸分析方法。
发明内容
本发明针对现有检测方法步骤复杂，对短链脂肪酸检测结果容易造成污染或是损失，提出了用乙腈提取、再结合气相色谱-质谱技术，较为准确的检测小鼠血浆、粪便及组织样本中短链脂肪酸。该方法采用气相色谱分离，结合质谱选择离子监测模式，同时检测9种短链脂肪酸。其中，除脾脏组织样本能检测出7种，其余种类的样本都能检测出9种。该方法前处理方法简单，排除样品处理过程带来的损失和对测定的干扰，具有良好的重复性，可以对多类型生物样本中的短链脂肪酸进行准确定量。
本发明的技术方案如下：
(1)吸取25μL血样，加入100μL含内标提取剂乙腈(内标2-Ethylbutyric acid 10μmol/L)，涡旋30s，离心(14000rpm，10min，4℃)，取上清装进样瓶进行气相色谱质谱联用仪分析；
(2)称量粪便样品约20mg，放入研磨球，加入200μL的含内标提取剂乙腈(内标2-Ethylbutyric acid 10μmol/L)，珠打研磨(25Hz，1min×2次)，离心(14000rpm，10min，4℃)，取上清装进样瓶进行气相色谱质谱联用仪分析；
(3)称量约100mg小鼠内脏脂肪样品，放入研磨球，再加入200μL含内标乙腈溶液(内标2-Ethylbutyric acid 10μmol/L)，珠打研磨(25Hz，1min×2次)，离心(14000rpm，10min，4℃)，取上清装进样瓶进行气相色谱质谱联用仪分析；
(4)称量约35mg小鼠脾脏样品，放入研磨球，再加入200μL含内标乙腈溶液(内标2-Ethylbutyric acid 10μmol/L)，珠打研磨(25Hz，1min×2次)，离心(14000rpm，10min，4℃)，取上清装进样瓶进行气相色谱质谱联用仪分析。
气相色谱条件：毛细管柱采用DB-FFAP(30m×0.25mm×0.25μm)，程序升温的起始温度为50℃，保持1min，以10℃/min的速率升至180℃，再继续以30℃/min的速率升至250℃保持2min。线速40cm/sec(He,99.9995％)，进样口温度为270℃，进样量为1μL，不分流。
质谱仪条件：离子源温度230℃，四极杆温度150℃，传输线温度270℃，扫描方式SIM(Acetic acid 43，Propionic acid 74，Butyric Acid 60，Isobutyric acid 43，Valeric Acid 60，Isovaleric acid 60，Hexanoic Acid 60，3-Methylvaleric acid 60，4-Methylvaleric acid 60，2-Ethylbutyric acid 73)。
本方法利用了分析化学的提取技术，结合气相色谱质谱选择离子监测技术，对小鼠血浆、粪便及组织样本中短链脂肪酸进行检测、定量。9种短链脂肪酸的检测限在0.2-7nmol/L，线性范围能达到3-4个数量级，线性相关系数R2>0.999。与现有文献报道方法相比，本方法快速、简单，可对小鼠血浆、粪便及组织样本中短链脂肪酸进行定量检测，为肠道菌群代谢性疾病相关研究提供帮助。
附图说明
图1短链脂肪酸标准样品总离子流图；
图2血浆样本短链脂肪酸总离子流图；
图3粪便样本短链脂肪酸总离子流图；
图4内脏脂肪样本短链脂肪酸总离子流图；
图5脾脏样本短链脂肪酸总离子流图；
表1发明方法的的检测限，定量限，线性范围和相关系数。
具体实施方式
实施例一小鼠血浆样本短链脂肪酸检测
将2只小鼠血浆样本分别吸取25μL血样，各加入100μL含内标提取剂乙腈，内标2-Ethylbutyric acid 10μmol/L，涡旋30s，14000rpm离心10min，温控4℃，取上清装进样瓶等待仪器分析。
气相色谱采用毛细管柱DB-FFAP，色谱柱参数为30m×0.25mm×0.25μm，程序升温，起始温度为50℃，保持1min，以10℃/min的速率升至180℃，再继续以30℃/min的速率升至250℃保持2min。载气为氦气，纯度为99.9995％，线速40cm/sec。进样口温度为270℃，进样量为1μL，不分流。质谱采用选择离子监测模式(各种短链脂肪酸所采用的特征离子见表1)，离子源温度230℃，四极杆温度150℃，传输线温度270℃。
经数据处理，得到血清中各短链脂肪酸峰面积与内标峰面积的比值。各短链脂肪酸相对含量结果如下：Acetic acid 6.9/7.02，Propionic acid 0.17/0.18，Isobutyricacid 0.04/0.04，Butyric Acid 0.13/0.07，Isovaleric acid 0.07/0.06，Valeric Acid0.02/0.02，3-Methylvaleric acid 0.01/0.01，4-Methylvaleric acid 0.0046/0.0046，Hexanoic Acid 0.06/0.05。
代入实施例五的标准曲线，依据上述分析方法检测发现：小鼠血浆中Acetic acid含量最高，1825.82/1857.21μmol/L。其次为Propionic acid，29.15/32.5μmol/L。Isobutyric acid 2.97/2.54μmol/L，Butyric Acid 6.71/3.79μmol/L，Isovaleric acid2.77/2.53μmol/L，Valeric Acid 0.99/0.92μmol/L，3-Methylvaleric acid 0.39/0.34μmol/L，4-Methylvaleric acid 1.09/1.09μmol/L，Hexanoic Acid 2.57/2.2μmol/L。(见图2)。
实施例二小鼠粪便样本短链脂肪酸检测
分别称量2只小鼠粪便样品40mg，放入研磨球，各加入200μL的含内标提取剂乙腈，内标2-Ethylbutyric acid 10μmol/L，珠打研磨，频率为25Hz，时间1min，珠打2次，14000rpm离心10min，温控4℃，取上清装进样瓶进行气相色谱质谱联用仪分析。
经数据处理，得到粪便中各短链脂肪酸相对含量为：Acetic acid 120.55/115.98，Propionic acid 50.40/48.51，Isobutyric acid 5.59/5.28，Butyric Acid84.48/82.58，Isovaleric acid 3.92/3.77，Valeric Acid 10.40/10.42，3-Methylvaleric acid 0.11/0.096，4-Methylvaleric acid 0.064/0.067，Hexanoic Acid0.49/0.45。
代入实施例五的标准曲线，检测结果显示：小鼠粪便中Acetic acid含量最高，39885.44/38374.08μmol/g。其次为Propionic acid，11082.72/10666.99μmol/g。Isobutyric acid 505.55/478.08μmol/g，Butyric Acid 5586.15/5460.62μmol/g，Isovaleric acid 195.84/188.58μmol/g，Valeric Acid 531.95/532.74μmol/g，3-Methylvaleric acid 5.00/4.44μmol/g，4-Methylvaleric acid 18.89/19.59μmol/g，Hexanoic Acid 26.67/24.35μmol/g。(见图3)。
实施例三小鼠内脏脂肪样本短链脂肪酸检测
分别称量2只小鼠内脏脂肪样品100mg，放入研磨球，各加入200μL含内标乙腈，内标2-Ethylbutyric acid 10μmol/L，珠打研磨，频率25Hz，时间1min，珠打2次，14000rpm离心10min，温控4℃，取上清装进样瓶进行气相色谱质谱联用仪分析。相对结果为Aceticacid 2.48/2.20，Propionic acid 0.045/0.046，Isobutyric acid 0.064/0.064，ButyricAcid0.39/0.22，Isovaleric acid 0.08/0.08，Valeric Acid 0.02/0.02，3-Methylvaleric acid 0.002/0.001，4-Methylvaleric acid 0.003/0.002，Hexanoic Acid0.17/0.12。
代入实施例五的标准曲线，检测结果显示：Acetic acid含量为264.25/305.00nmol/g，Propionic acid含量为3.18/4.27nmol/g，Isobutyric acid 1.85/2.43nmol/g，Butyric Acid 8.34/5.99nmol/g，Isovaleric acid 1.22/1.65nmol/g，Valeric Acid 0.30/0.36nmol/g，3-Methylvaleric acid 0.03/0.03nmol/g，4-Methylvaleric acid 0.31/0.20nmol/g，Hexanoic Acid 2.91/2.68nmol/g(见图4)。
实施例四小鼠脾脏样本短链脂肪酸检测
分别称量2只小鼠脾脏样品约35mg，放入研磨球，各加入200μL含内标乙腈，内标2-Ethylbutyric acid 10μmol/L，珠打研磨，频率25Hz，时间1min，珠打2次，14000rpm离心10min，温控4℃，取上清装进样瓶进行气相色谱质谱联用仪分析。相对结果为Acetic acid4.8/4.2，Propionic acid 0.11/0.08，Isobutyric acid 0.05/0.03，Butyric Acid 0.14/0.07，Isovaleric acid 0.06/0.05，Valeric Acid 0.06/0.04，3-Methylvaleric acid0.03/0.02，4-Methylvaleric acid 0.004/0.016，Hexanoic Acid 0.14/0.11。
代入实施例五的标准曲线，检测结果显示：小鼠脾脏组织样本中Acetic acid含量最高，为1478.34/1554.92nmol/g，Propionic acid 22.36/20.00nmol/g，Isobutyricacid4.30/3.24nmol/g，Butyric Acid 8.86/5.15nmol/g，Isovaleric acid 2.92/2.63nmol/g，Valeric Acid 2.70/2.43nmol/g，3-Methylvaleric acid 1.33/0.80nmol/g，4-Methylvaleric acid 1.22/5.25nmol/g，Hexanoic Acid 7.00/6.97nmol/g(见图5)。
实施例五分析方法的评价
准确称量并用乙腈配置短链脂肪酸母液10mg/mL。分别吸取各短链脂肪酸母液配置成400μg/mL混标，并逐级稀释成浓度为浓度点200μg/mL，40μg/mL，20μg/mL，4μg/mL，2μg/mL，0.4μg/mL，0.2μg/mL，0.04μg/mL，0.02μg/mL。将各浓度点吸取25μL，加入200μL含内标10μmol/L2-Ethylbutyric acid乙腈提取剂，涡旋混匀,取上清装进样瓶进行气相色谱质谱联用仪分析，检测所得典型标准样品谱图见附图1。据实际样品含量及仪器灵敏度情况选择线性范围，方法的定量限、检测限、线性相关系数见表1，检测限在0.2-7nmol/mL，定量限在0.5-30nmol/mL，线性范围能达到3-4个数量级，线性相关系数R2>0.999，该方法可对小鼠血浆、粪便及组织样本进行准确定量。
表1
Figure BDA0003351247710000051

Claims (8)

1.一种小鼠血浆、粪便或组织样本中短链脂肪酸的检测方法，其特征在于，包括如下流程步骤：
(1)吸取20-50μL血样，加入80-200μL含内标提取剂乙腈，涡旋，离心，取上清装进样瓶进行气相色谱质谱联用仪分析，经数据处理，得到血清中各短链脂肪酸峰面积与内标峰面积的比值，即相对含量结果；
(2)称量粪便样品10-50mg，放入研磨球，每mg样本中加入5-500μL(优选10μL)的含内标提取剂乙腈，研磨，离心，取上清装进样瓶进行气相色谱质谱联用仪分析，经数据处理，得到粪便中各短链脂肪酸峰面积与内标峰面积的比值，即相对含量结果；
(3)称量组织样品30-100mg，放入研磨球，每mg样本中加入2-10μL(内脏脂肪样本优选2μL，脾脏样品优选6μL)的含内标提取剂乙腈，研磨，离心，取上清装进样瓶进行气相色谱质谱联用仪分析，经数据处理，得到组织中各短链脂肪酸峰面积与内标峰面积的比值，即相对含量结果；
含内标提取剂乙腈中含有1-20μmol/L 2-Ethylbutyric acid。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：
采用的气相色谱条件为：DB-FFAP毛细管柱，规格为30m×0.25mm×0.25μm，程序升温的起始温度为50℃，保持1min，以10℃/min的速率升至180℃，再继续以30℃/min的速率升至250℃保持2min；线速40cm/sec(He,99.9995％)，进样口温度为270℃，进样量为1μL，不分流；
采用的质谱检测条件为：离子源温度230℃，四极杆温度150℃，传输线温度270℃，扫描方式SIM(Acetic acid 43，Propionic acid 74，Butyric Acid 60，Isobutyric acid 43，Valeric Acid 60，Isovaleric acid 60，Hexanoic Acid60，3-Methylvaleric acid 60，4-Methylvaleric acid 60，2-Ethylbutyric acid 73)。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：含内标提取剂乙腈中含有5-10μmol/L2-Ethylbutyric acid。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：提取所用的试剂均为乙腈，气相色谱洗针液也为纯乙腈。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：研磨频率15-20次/s，每次研磨时间1-3min。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所有样本经乙腈提取后，直接装入进样瓶，利用气相色谱质谱联用仪分析。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所有样品采用内标校正，根据线性曲线进行定量；
线性曲线配置方法为：配置浓度为200-1000μg/mL各短链脂肪酸混标，逐级稀释至浓度为0.1-0.01μg/mL中的至少5个以上的不同浓度；吸取各浓度点样品，加入2-6倍体积的含内标提取剂，取上清装进样瓶进行气相色谱质谱联用仪分析,得到各短链脂肪酸峰面积与内标峰面积的比值；
横坐标为各短链脂肪酸峰面积与内标峰面积的比值，纵坐标为配置浓度，制作标准曲线，将得到样本中各短链脂肪酸峰面积与内标峰面积的比值代入线性方程，即可获得各样本中短链脂肪酸绝对定量结果。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述短链脂肪酸包括Acetic acid(乙酸)，Propionic acid(丙酸)，Butyric Acid(丁酸)，Isobutyric acid(异丁酸)，ValericAcid(戊酸)，Isovaleric acid(异丙酸)，Hexanoic Acid(己酸)，3-Methylvaleric acid(3-甲基戊酸)，4-Methylvaleric acid(4-甲基戊酸)中一种或二种以上。
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