WO2023145749A1 - 免疫賦活剤 - Google Patents

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WO2023145749A1
WO2023145749A1 PCT/JP2023/002171 JP2023002171W WO2023145749A1 WO 2023145749 A1 WO2023145749 A1 WO 2023145749A1 JP 2023002171 W JP2023002171 W JP 2023002171W WO 2023145749 A1 WO2023145749 A1 WO 2023145749A1
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WO
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lipid
lipid particles
antigen
immunostimulant
administration
Prior art date
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PCT/JP2023/002171
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English (en)
French (fr)
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靖雄 吉岡
亮 鈴木
理紗 宗像
大樹 小俣
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一般財団法人阪大微生物病研究会
学校法人帝京大学
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Publication date
Application filed by 一般財団法人阪大微生物病研究会, 学校法人帝京大学 filed Critical 一般財団法人阪大微生物病研究会
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to immunostimulators and the like.
  • an immunostimulant such as aluminum hydroxide.
  • aluminum hydroxide has many problems, such as being inflammatory and being unable to induce a Th1-type immune response at all.
  • an adjuvant capable of inducing a Th1-type immune response
  • strong infection is observed. Show defense. In this way, the induction of Th1-type immune responses is becoming essential in the development of vaccines against viral infections.
  • Patent Document 1 describes an immunostimulant using 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (DOTAP)-containing lipid particles.
  • DOTAP 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane
  • An object of the present invention is to provide an immunostimulant containing lipid particles with higher immune response-inducing ability (preferably Th1-type immune response-inducing ability).
  • the present inventor found that the above problems could be solved by an immunostimulator containing lipid particles containing cationic lipids represented by general formula (1). Based on this finding, the inventors have further studied and completed the present invention. That is, the present invention includes the following aspects.
  • R 1 and R 2 are the same or different and represent an unsaturated chain hydrocarbon group.
  • R 3 , R 4 and R 5 are the same or different and represent an alkyl group.
  • p is an integer from 1 to 3;
  • q is an integer from 0 to 3.
  • r represents an integer from 1 to 3;
  • Section 2 wherein the unsaturated chain hydrocarbon group has only one double bond and has 10 to 30 carbon atoms.
  • Section 3. The immunostimulant according to item 1 or 2, wherein the p is 1, the q is 0, and the r is 1.
  • Section 4 Items 1 to 3, wherein the cationic lipid is 1,2-di-O-octadecenyl-3-trimethylammonium propane (DOTMA).
  • DOTMA 1,2-di-O-octadecenyl-3-trimethylammonium propane
  • Item 5 Items 1 to 4, wherein the content of the cationic lipid is 10 to 75 mol% relative to 100 mol% of the lipid constituting the lipid particles.
  • Item 6 Items 1 to 5, wherein the lipid particles contain at least one selected from the group consisting of phospholipids, sterols, and water-soluble polymer-modified lipids.
  • Item 7 Items 1 to 6, wherein the lipid particles contain a phospholipid, a sterol, and a water-soluble polymer-modified lipid.
  • Item 8 Items 1 to 7, which do not contain CpG oligodeoxynucleotides and aluminum compounds.
  • Item A Items 1 to 8, wherein the lipid particles are lipid nanoparticles.
  • Item 9 A pharmaceutical containing the immunostimulant according to any one of Items 1 to 8 and A.
  • Item 10 Item 10. Item 9, which is a vaccine composition.
  • Item 11 Item 9 or 10, further comprising an antigen.
  • Item B Item 12, wherein the antigen comprises at least one selected from the group consisting of influenza vaccine antigens and SARS-CoV-2 vaccine antigens.
  • an immunostimulant containing lipid particles with a higher ability to induce immune responses.
  • FIG. 1 shows the evaluation results of the ability to induce antibody production in Test Example 1.
  • FIG. The vertical axis indicates the ELISA measurement value of the antibody shown above each graph. In the horizontal axis, Cont. indicates the case without drug administration, SV indicates the case of antigen alone administration, and others indicate the case of administration of lipid particles together with antigen. 1 shows the evaluation results of T cell response-inducing ability of Test Example 1.
  • FIG. The vertical axis indicates the concentration value measured by ELISA of the molecule shown above each graph. In the horizontal axis, Cont. indicates the case without drug administration, SV indicates the case of antigen alone administration, and others indicate the case of administration of lipid particles together with antigen. 1 shows the evaluation results of the ability to induce antibody production in Test Example 1.
  • the vertical axis indicates the ELISA measurement value of the antibody shown above each graph.
  • Cont. indicates the case without drug administration
  • SV indicates the case of antigen alone administration
  • others indicate the case of administration of lipid particles together with antigen.
  • 1 shows the evaluation results of T cell response-inducing ability of Test Example 1.
  • FIG. The vertical axis indicates the concentration value measured by ELISA of the molecule shown above each graph.
  • Cont. indicates the case without drug administration
  • SV indicates the case of antigen alone administration
  • others indicate the case of administration of lipid particles together with antigen.
  • 2 shows the evaluation results of the ability to induce antibody production in Test Example 2.
  • FIG. The vertical axis indicates the ELISA measurement value of the antibody shown above each graph.
  • Cont. indicates the case of no drug administration
  • SV indicates the case of antigen alone administration
  • others indicate the case of administration of lipid particles or an existing adjuvant together with the antigen.
  • 2 shows the evaluation results of the ability to induce T cell responses in Test Example 2.
  • FIG. The vertical axis indicates the concentration value measured by ELISA of the molecule shown above each graph.
  • Cont. indicates the case of no drug administration
  • SV indicates the case of antigen alone administration
  • others indicate the case of administration of lipid particles or an existing adjuvant together with the antigen.
  • FIG. 10 shows changes in body weight (upper graph) and measurement results of survival rate (lower graph) in Test Example 2.
  • FIG. 2 shows changes in body weight (upper graph) and measurement results of survival rate (lower graph) when DOTMA-containing LNP was administered in Test Example 2.
  • FIG. The legend indicates the antibody administered.
  • 3 shows the evaluation results of the ability to induce antibody production in Test Example 3.
  • FIG. The vertical axis indicates the ELISA measurement value of the antibody shown above each graph. In the horizontal axis, Cont. indicates the case of no drug administration, S indicates the case of antigen alone administration, and others indicate the case of administration of lipid particles or an existing adjuvant together with the antigen. 3 shows the evaluation results of the ability to induce T cell responses in Test Example 3.
  • FIG. The vertical axis indicates the concentration value measured by ELISA of the molecule shown above each graph.
  • Cont. indicates the case of no drug administration
  • S indicates the case of antigen alone administration
  • others indicate the case of administration of lipid particles or an existing adjuvant together with the antigen.
  • 4 shows the measurement results of spleen weight and body weight ratio of spleen weight in Test Example 4.
  • SV indicates the case of administration of antigen alone, and others indicate the case of administration of lipid particles or an existing adjuvant together with antigen.
  • 4 shows the measurement results of inflammatory cytokines in Test Example 4.
  • SV indicates administration of antigen alone, and others indicate administration of lipid particles or an existing adjuvant together with antigen.
  • the horizontal axis indicates the elapsed time after drug administration. 4 shows the evaluation results of the ability to induce antibody production in Test Example 5.
  • FIG. The vertical axis indicates the ELISA measurement value of the antibody shown above each graph. In the horizontal axis, Cont. indicates the case without drug administration, SV indicates the case of antigen alone administration, and others indicate the case of administration of lipid particles together with antigen. 5 shows the evaluation results of the ability to induce T cell responses in Test Example 5.
  • FIG. The vertical axis indicates the concentration value measured by ELISA of the molecule shown above each graph. In the horizontal axis, Cont.
  • FIG. The vertical axis indicates the ELISA measurement value of the antibody shown above each graph.
  • Cont. indicates the case of no drug administration
  • PspA indicates the case of antigen alone administration
  • others indicate the case of administration of lipid particles or an existing adjuvant together with the antigen.
  • 1 shows the evaluation results of the ability to induce T cell responses in Test Example 6.
  • FIG. The vertical axis indicates the concentration value measured by ELISA of the molecule shown above each graph.
  • Cont. indicates the case of no drug administration
  • PspA indicates the case of antigen alone administration
  • others indicate the case of administration of lipid particles or an existing adjuvant together with the antigen.
  • lipid particle of the present invention a lipid particle containing a cationic lipid represented by general formula (1) (herein also referred to as “the lipid particle of the present invention”) is provided.
  • Contained immunostimulant in this specification, it may be indicated as “immunostimulator of the present invention”. This will be explained below.
  • R 1 and R 2 are the same or different and represent an unsaturated chain hydrocarbon group;
  • R 3 , R 4 and R 5 are the same or different and represent an alkyl group.
  • p is an integer from 1 to 3;
  • q is an integer from 0 to 3.
  • r represents an integer from 1 to 3;
  • the unsaturated chain hydrocarbon group is a monovalent chain hydrocarbon group containing a double bond, and is not particularly limited as long as it is.
  • the unsaturated chain hydrocarbon group includes both straight-chain and branched-chain, and particularly preferably straight-chain.
  • the number of carbon atoms in the unsaturated chain hydrocarbon group is not particularly limited as long as it is capable of forming lipid particles. 22, more preferably 16-20, particularly preferably 17-19, particularly preferably 18.
  • the number of double bonds contained in the unsaturated chain hydrocarbon group is not particularly limited as long as it is the number capable of forming lipid particles, for example 1 to 6, preferably 1 to 4, more preferably 1 to 3, and further Preferably 1 to 2, particularly preferably 1.
  • the unsaturated hydrocarbon group preferably includes a group represented by general formula (2).
  • s is an integer greater than or equal to 0.
  • s is preferably 2 to 26, more preferably 3 to 20, even more preferably 4 to 14, even more preferably 5 to 10, especially preferably 6 to 8, particularly preferably 7.
  • t is an integer greater than or equal to 1.
  • t is preferably 3 to 27, more preferably 4 to 21, even more preferably 5 to 15, even more preferably 6 to 11, especially preferably 7 to 9, particularly preferably 8.
  • the sum of s and t is, for example, 5 to 27, preferably 7 to 27, more preferably 9 to 23, still more preferably 11 to 19, even more preferably 13 to 17, particularly preferably 14 to 16, particularly preferably is 15.
  • p is preferably 1 to 2, particularly preferably 1.
  • q is particularly preferably 0.
  • r is preferably 1 to 2, particularly preferably 1. In a preferred embodiment of the invention, p is 1, q is 0 and r is 1.
  • a preferred embodiment of general formula (1) is general formula (1A).
  • a particularly preferred embodiment of general formula (1) is general formula (1AA).
  • two s may be the same or different, and two t may be the same or different.
  • the cationic lipid represented by general formula (1) is particularly preferably 1,2-di-O-octadecenyl-3-trimethylammonium propane (DOTMA).
  • DOTMA 1,2-di-O-octadecenyl-3-trimethylammonium propane
  • the cationic lipid represented by general formula (1) can also be in the form of a salt.
  • Cationic lipids represented by the general formula (1) include, for example, inorganic acid salts such as hydrochloride, hydrobromide, sulfate, nitrate, and phosphate; acetate, propionate, tartrate, fumaric acid It can be a salt, an organic acid salt such as maleate, malate, citrate, methanesulfonate, paratoluenesulfonate.
  • the cationic lipid represented by general formula (1) may be used alone or in combination of two or more.
  • the lipid particles of the present invention are not particularly limited as long as they contain the cationic lipid represented by general formula (1).
  • the particle size of the lipid particles of the present invention is not particularly limited.
  • the particle size is preferably nano-sized, specifically for example 10-700 nm, 10-400 nm, 10-200 nm, 10-150 nm or less than 100 nm.
  • the lipid particles of the present invention are preferably lipid nanoparticles (LNP: Lipid NanoParticles) having a nano-sized particle size.
  • the lipid particles of the present invention may contain lipids other than the cationic lipid represented by general formula (1) as lipids constituting the particles, or may contain no other lipids. can be.
  • the content of the cationic lipid represented by general formula (1) is not particularly limited as long as lipid particles can be formed. From the viewpoint of the immune response-inducing action of the lipid particles, the content is, for example, 10 to 100 mol%, preferably 10 to 85 mol%, more preferably 100 mol% of the lipid constituting the lipid particles of the present invention. 10 to 75 mol %, more preferably 20 to 70 mol %, even more preferably 30 to 65 mol %, particularly preferably 40 to 60 mol %, particularly preferably 45 to 55 mol %.
  • the content is, for example, 10 mol% or more, preferably 20 mol% or more, more preferably 100 mol% of the lipid constituting the lipid particles of the present invention. It is 30 mol % or more, more preferably 40 mol % or more, and particularly preferably 45 mol % or more. In one aspect of the present invention, the content is preferably 80 mol% or less, more preferably 70 mol% or less, even more preferably 65 mol% or less, still more preferably 60 mol%, from the viewpoint of lipid particle formation. Below, particularly preferably 55 mol % or less, particularly preferably 50 mol % or less.
  • lipids include, but are not particularly limited to, phospholipids, sterols, water-soluble polymer-modified lipids, cationic lipids other than the cationic lipids represented by general formula (1), glycolipids, and the like.
  • the lipid particles of the present invention preferably contain at least one selected from the group consisting of phospholipids, sterols, and water-soluble polymer-modified lipids, all of which (phospholipids, sterols, , and water-soluble polymer-modified lipids).
  • phospholipids include phosphatidylcholines such as dilauroylphosphatidylcholine, dimyristoylphosphatidylcholine, dipalmitoylphosphatidylcholine, distearoylphosphatidylcholine, dioleoylphosphatidylcholine, dilinoleoylphosphatidylcholine, myristoylpalmitoylphosphatidylcholine, myristoylstearoylphosphatidylcholine, palmitoylstearoylphosphatidylcholine; Phosphatidyl such as lauroyl phosphatidylglycerol, dimyristoylphosphatidylglycerol, dipalmitoylphosphatidylglycerol, distearoylphosphatidylglycerol, dioleoylphosphatidylglycerol, dilinoleoylphosphatidylg
  • Phospholipids may be used alone or in combination of two or more.
  • the content is not particularly limited as long as the lipid particles can be formed. %, preferably 10 to 30 mol %, more preferably 15 to 25 mol %, still more preferably 17 to 23 mol %.
  • sterols include cholesterol, cholesteryl hemisuccinate, lanosterol, dihydrolanosterol, desmosterol, dihydrocholesterol, phytosterol, phytosterol, stigmasterol, zymosterol, ergosterol, sitosterol, campesterol, and brassicasterol.
  • the sterol has the effect of stabilizing the lipid particle membrane and adjusting the fluidity of the lipid particle membrane, so it is desirable that the sterol is contained as a constituent lipid of the lipid particle membrane.
  • the sterols may be of one type alone or in combination of two or more types.
  • the content is not particularly limited as long as the lipid particles can be formed. , preferably 20 to 40 mol %, more preferably 25 to 35 mol %, still more preferably 27 to 33 mol %.
  • a water-soluble polymer-modified lipid is a lipid to which a water-soluble polymer has been added, and is not particularly limited as long as it is.
  • water-soluble polymers include, but are not limited to, polyethylene glycol (PEG) chains.
  • the molecular weight of the water-soluble polymer is not particularly limited, but is, for example, 200-10000, preferably 500-7000, more preferably 500-4000, still more preferably 1000-3000, still more preferably 1500-2500.
  • Lipids modified with water-soluble polymers preferably include amphipathic lipids, more preferably phospholipids.
  • the water-soluble polymer-modified lipid may be used singly or in combination of two or more.
  • the content is not particularly limited as long as the lipid particles can be formed. 0 to 10 mol%, preferably 0 to 5 mol%, more preferably 0 to 2 mol%, still more preferably 0 to 1 mol%, even more preferably 0.2 to 1 mol%, particularly preferably 0.3 to 0.7 mol% is.
  • the lipid particles of the present invention may contain other components (other than the solvent) in addition to the lipid.
  • other components include various components known to be incorporated into lipid particles, specifically, for example, membrane stabilizers, charged substances, antioxidants, membrane proteins, polyethylene glycol (PEG), antibodies, peptides. , sugar chains, and the like.
  • Antioxidants can be contained to prevent oxidation of the film, and are used as necessary as a component of the film.
  • Antioxidants used as membrane constituents include, for example, butylated hydroxytoluene, propyl gallate, tocopherols, tocopherol acetate, concentrated mixed tocopherols, vitamin E, ascorbic acid, L-ascorbic stearate, palmitic acid. Examples include ascorbic acid, sodium hydrogen sulfite, sodium sulfite, sodium edetate, erythorbic acid, citric acid and the like.
  • Membrane proteins can be contained for the purpose of adding functions to membranes or stabilizing membrane structures, and are used as necessary as membrane constituents.
  • Membrane proteins include, for example, surface membrane proteins, integral membrane proteins, albumin, recombinant albumin and the like.
  • the content of other components is, for example, 10% by mass or less, preferably 5% by mass or less, more preferably 2% by mass or less, and still more preferably 1% by mass or less, relative to 100% by mass of the lipid particles of the present invention. .
  • the other ingredients may be used singly or in combination of two or more.
  • the lipid particles of the present invention can exhibit a high ability to induce Th1-type immune responses without relying on other adjuvants. Therefore, from the viewpoint of reducing side effects caused by other adjuvants, the lipid particles of the present invention preferably do not contain other adjuvants or their content is less.
  • Other adjuvants include CpG oligodeoxynucleotide (CpG nucleic acid: CpG ODN: e.g. A type, B type, C type, P type etc.), aluminum compounds (e.g. aluminum hydroxide, aluminum phosphate etc.), oil emulsions and the like. mentioned.
  • the content of other adjuvants is, for example, 10% by mass or less, preferably 5% by mass or less, more preferably 2% by mass or less, more preferably 1% by mass or less, with respect to 100% by mass of the lipid particles of the present invention. Preferably it is 0% by mass.
  • the lipid particles may be of one type alone or in combination of two or more types.
  • the lipid particles of the present invention are usually formed in an aqueous solution.
  • aqueous solutions include various buffers (eg, acetate buffer, phosphate buffer, formate buffer, histidine buffer, etc.).
  • the lipid particles of the present invention can be produced according to or according to known methods for lipid particles.
  • the lipid particles of the present invention can be preferably produced by a method including a step of mixing a lipid-containing alcohol solution and an aqueous solution (Step 1).
  • the alcohol that is the solvent for the alcohol solution is not particularly limited as long as it can dissolve lipids.
  • Ethanol is preferably mentioned as the alcohol.
  • the lipid concentration in the alcohol solution is, for example, 0.1-20% by mass, preferably 0.1-10% by mass, more preferably 0.5-3.0% by mass.
  • the mixing ratio of the aqueous solution and the alcohol solution is, for example, 20/1 to 1/1, preferably 4/1 to 2/1.
  • the mode of mixing is not particularly limited as long as it is a mode in which lipid particles can be formed, but it is usually a mode of vigorously stirring with a vortex or the like. Alternatively, when it is performed in a reaction system using a microchannel, mixing occurs within the reaction system.
  • Step 1 is usually performed at room temperature or under heating.
  • the immunostimulant of the present invention may contain other substances besides the lipid particles of the present invention.
  • Other substances include, but are not particularly limited to, adjuvants other than the lipid particles of the present invention.
  • the content of other substances is, for example, 10% by mass or less, preferably 5% by mass or less, more preferably 2% by mass or less, and still more preferably 1% by mass or less with respect to 100% by mass of the immunostimulant of the present invention. be.
  • the other substance may be of one type alone or may be a combination of two or more types.
  • the lipid particles of the present invention can exhibit a high ability to induce Th1-type immune responses without relying on other adjuvants. Therefore, from the viewpoint of reducing side effects caused by other adjuvants, the immunostimulant of the present invention preferably does not contain other adjuvants or contains them in a smaller amount. Other adjuvants are the same as above.
  • the content of other adjuvants is, for example, 10% by mass or less, preferably 5% by mass or less, more preferably 2% by mass or less, more preferably 1% by mass or less, relative to 100% by mass of the immunostimulant of the present invention, Particularly preferably, it is 0% by mass.
  • the immunostimulant of the present invention can be obtained from the lipid particles of the present invention as they are or by adding the above-described components/substances to the particles.
  • the immunostimulant of the present invention can exhibit a higher ability to induce immune responses.
  • the immunostimulant of the present invention is capable of exhibiting higher cell-mediated immunity induction (in particular, Th1-type immune response induction) (for example, IFN- ⁇ induction) and higher antibody induction. can also be demonstrated.
  • the immunostimulant of the present invention can exert the above-mentioned various inducing abilities while suppressing side reactions such as inflammation as compared with other existing adjuvants. Therefore, the immunostimulant of the present invention can be used in various applications utilizing its immunostimulatory action, such as medicines, reagents, etc. Specifically, it can be used for vaccine compositions, antiviral agents, antibacterial agents, and the like.
  • the drug of the present invention is not particularly limited as long as it contains the immunostimulant of the present invention, and may further contain other ingredients as necessary.
  • Other ingredients are not particularly limited as long as they are pharmaceutically acceptable ingredients.
  • Other components include additives as well as components having pharmacological action. Examples of additives include various components known to be blended with immunostimulants, and specific examples include bases, carriers, solvents, dispersants, emulsifiers, buffers, stabilizers, excipients, and binders. , disintegrants, lubricants, thickeners, humectants, coloring agents, fragrances, chelating agents and the like.
  • the lipid particles of the present invention can exhibit a higher ability to induce immune responses without relying on other adjuvants. Therefore, from the viewpoint of reducing side effects caused by other adjuvants, the drug of the present invention preferably does not contain other adjuvants or contains less adjuvants. Other adjuvants are the same as above.
  • the content of other adjuvants is, for example, 10% by mass or less, preferably 5% by mass or less, more preferably 2% by mass or less, still more preferably 1% by mass or less, particularly preferably 1% by mass or less, relative to 100% by mass of the drug of the present invention. is 0% by mass.
  • the agent of the present invention preferably contains an antigen.
  • An antigen is any agent (e.g., protein , peptides, polysaccharides, glycoproteins, glycolipids, nucleic acids or combinations thereof).
  • an antigen-induced immune response may be humoral, cellular, or both.
  • An agent is said to be "antigenic” when it is capable of specifically interacting with an antigen-recognition molecule of the immune system, such as an immunoglobulin (antibody) or T-cell antigen receptor (TCR).
  • one or more antigens are protein-based antigens. In other embodiments, one or more antigens are peptide-based antigens. In various embodiments, the one or more antigens are selected from the group consisting of cancer antigens, viral antigens, bacterial antigens (bacterial antigens, fungal antigens), and pathogen antigens.
  • a "microbial antigen,” as used herein, is an antigen of a microorganism and includes, but is not limited to, infectious viruses, infectious bacteria, infectious parasites, and infectious fungi.
  • Microbial antigens are intact microorganisms as well as natural isolates, fragments or derivatives thereof, as well as the same or similar to naturally occurring microbial antigens, preferably specific to the corresponding microorganism (from which the naturally occurring microbial antigen is derived). It may also be a synthetic compound that induces a potent immune response.
  • the antigen is a cancer antigen.
  • the antigen is a viral antigen.
  • the antigen is a fungal antigen.
  • the antigen is a pathogen antigen.
  • pathogen antigens are synthetic or recombinant antigens.
  • Antigens preferably include viral antigens.
  • Viruses from which antigens are derived are not particularly limited, but examples include influenza viruses (e.g., type A, type B, etc.), rubella virus, Ebola virus, coronavirus, measles virus, varicella-zoster virus, herpes simplex virus, mumps virus, Enveloped viruses such as arbovirus, respiratory syncytial virus, SARS virus, hepatitis virus (e.g., hepatitis B virus, hepatitis C virus, etc.), yellow fever virus, AIDS virus, rabies virus, hantavirus, dengue virus, Nipah virus, lyssa virus viruses); non-enveloped viruses (viruses without envelopes) such as adenovirus, norovirus, rotavirus, human papillomavirus, poliovirus, enterovirus, coxsackievirus, human parvovirus, encephalomyocarditis
  • SARS-CoV-2 SARS coronavirus 2
  • SARS-CoV-2 is not particularly limited, and includes not only known strains such as Wuhan strain, alpha strain, delta strain, lambda strain, and Omicron strain, and their substrains, but also various unknown strains that will be discovered in the future. mentioned.
  • Antigens preferably include bacterial antigens.
  • Bacteria from which antigens are derived are not particularly limited. acnes, faecalis, difficile, pneumococcus, haemophilus influenzae, moraxella, pneumoniae, coynebacterium, hemolytic streptococcus, pseudomonas aeruginosa, staphylococcus, mycoplasma, candida, and aspergillus.
  • the mode of use of the drug of the present invention is not particularly limited, and an appropriate mode of use can be adopted according to its type.
  • the agent of the present invention can be used, for example, in vitro (e.g., added to the culture medium of cultured cells) or in vivo (e.g., administered to an animal), depending on its use. can also
  • the application target of the agent of the present invention is not particularly limited, but examples of mammals include humans, monkeys, mice, rats, dogs, cats, rabbits, pigs, horses, cows, sheep, goats, and deer. Moreover, animal cells etc. are mentioned as a cell.
  • the types of cells are not particularly limited, such as blood cells, hematopoietic stem cells/progenitor cells, gametes (sperm, ovum), fibroblasts, epithelial cells, vascular endothelial cells, nerve cells, hepatocytes, keratinocytes, muscle cells. , epidermal cells, endocrine cells, ES cells, iPS cells, tissue stem cells, cancer cells and the like.
  • the agent of the present invention can be in any dosage form, such as tablets (including orally disintegrating tablets, chewable tablets, effervescent tablets, lozenges, jelly drops, etc.), pills, granules, fine granules, powders, Oral dosage forms such as hard capsules, soft capsules, dry syrups, liquids (including drinks, suspensions, and syrups), jelly, and injection preparations (e.g., drip injections (e.g., intravenous drip preparations, etc.), intravenous injections, intramuscular injections, subcutaneous injections, intradermal injections), external preparations (e.g., ointments, poultices, lotions), suppository inhalers, eye drops, ophthalmic ointments, drops Parenteral formulations such as nose drops, ear drops, and liposomes can be used.
  • tablets including orally disintegrating tablets, chewable tablets, effervescent tablets, lozenges, jelly drops, etc.
  • pills granule
  • the administration route of the agent of the present invention is not particularly limited as long as the desired effect is obtained, and oral administration; enteral administration such as tube feeding and enema administration; intravenous administration, transarterial administration, intramuscular administration, Examples include parenteral administration such as intracardiac administration, subcutaneous administration, intradermal administration, intraperitoneal administration, and nasal administration.
  • the content of the immunostimulant of the present invention in the drug of the present invention depends on the mode of use, the subject of application, the state of the subject of application, etc., and is not limited, but is, for example, 0.0001 to 100% by weight, preferably It can be from 0.001 to 50% by weight.
  • the dosage is not particularly limited as long as it is an effective amount that exhibits efficacy.
  • the above dosage can be adjusted appropriately depending on age, disease state, symptoms and the like.
  • DOTAP 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane
  • DPPC 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
  • NG-DOPE N-glutaryl-L- ⁇ -dioleoylphosphatidylethanolamine
  • DODAP 1,2-dioleoyloxy-3-dimethylaminopropane
  • DOTMA 1,2-di-O-octadecenyl-3-trimethylammonium propane
  • DSPE-PEG-Ome N-(methylpolyoxyethyleneoxycarbonyl)-1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PEG chain molecular weight: 2000)
  • Production example 1 Production of lipid particles 1 An ethanol solution (lipid concentration: 1.0% by mass) containing lipids with the composition and molar ratio shown in Table 1 and 25 mM Sodium Acetate (pH 4.0) were prepared using NanoAssemblr (manufactured by Precision NanoSystems) at a ratio of 1:3 (ethanol solution : 25 mM sodium acetate aqueous solution (pH 4.0, mixing ratio), mixed at 15 mL / min to form lipid nanoparticles, dialyzed (5% glucose aqueous solution), and each lipid particle with the name shown in Table 1 (hereinafter referred to as It is sometimes indicated as “LNP”.) was obtained.
  • the lipid particles of this production example were used in Test Examples 1 to 4 below.
  • Test example 1 Assessment of immunostimulatory capacity1 ⁇ Experimental animals, reagents> - Mice: 6-week-old male C57BL6 mice - Antigen: A split vaccine (SV) derived from H1N1 influenza A virus (strain: A/California/7/2009 (Cal7)) was administered at 0.5 ⁇ g/mouse. - Lipid nanoparticles (LNP): Each LNP listed in Table 1 was administered at 100 ⁇ g/mouse.
  • SV split vaccine
  • H1N1 influenza A virus strain: A/California/7/2009 (Cal7)
  • LNP Lipid nanoparticles
  • mice were immunized subcutaneously on days 0 and 21 after SV alone or SV mixed with various LNPs. On day 28, blood was collected and plasma SV-specific total IgG, IgG1, IgG2b, and IgG2c were evaluated by ELISA.
  • ⁇ Method Evaluation of ability to induce T cell responses: Figures 2 and 4> Immune cells were harvested from the spleens on day 31 and cultured with SV (10 ⁇ g/mL). After 1 or 3 days, the culture supernatant was collected and IL-2, IFN- ⁇ and IL-13 levels were measured by ELISA.
  • Figures 1 and 2 used LNPs created by varying the content of DOTAP, which is used as a cationic lipid.
  • DOTAP LNP using the anionic lipid NG-DOPE was used.
  • the surface charge of the LNP used becomes close to neutral by decreasing the amount of DOTAP, and the negative charge increases by increasing the amount of NG-DOPE.
  • IFN- ⁇ production an indicator of Th1 immunity
  • NG-DOPE an indicator of Th2 immunity
  • DOTAP was used as the cationic lipid
  • LNPs with varying contents of polyethylene glycol (PEG)-modified lipids were used.
  • PEG polyethylene glycol
  • LNPs using DODAP or DOTMA which are cationic lipids, were used.
  • a downward trend was observed for antibody production and T-cell responses with increasing PEG-modified lipid content.
  • DODAP-containing LNPs also tended to induce lower immune responses than DOTAP-containing LNPs.
  • increased antibody production was observed for DOTMA-containing LNPs compared to DOTAP-containing LNPs.
  • Th1 and Th2 immunity were found to be strongly induced by DOTMA-containing LNP.
  • Test example 2 Comparison with existing adjuvants ⁇ laboratory animals, reagents> - Mice: 6-week-old male C57BL6 mice - Antigen: A split vaccine (SV) derived from H1N1 influenza A virus (strain: A/California/7/2009 (Cal7)) was administered at 0.5 ⁇ g/mouse.
  • Adjuvant Aluminum hydroxide (alum) was administered at 50 ⁇ g/mouse, or B-type CpG nucleic acid (CpG K3) was administered at 50 ⁇ g/mouse.
  • mice were immunized subcutaneously on days 0 and 21 after SV alone or mixed with alum, CpG K3, DOTAP-containing LNPs or DOTMA-containing LNPs. On day 28, blood was collected and plasma SV-specific total IgG, IgG1, IgG2b, and IgG2c were evaluated by ELISA.
  • ⁇ Method (Evaluation of ability to induce T cell response: Fig. 6)> Immune cells were harvested from the spleens on day 31 and cultured with SV (10 ⁇ g/mL). After 1 or 3 days, the culture supernatant was collected and IL-2, IFN- ⁇ and IL-13 levels were measured by ELISA.
  • mice were nasally infected with H1N1 influenza A virus (strain: A/Puerto Rico/8/1934 (PR8)) different from the vaccine strain, and body weight changes and survival rates were measured over the course of the day.
  • H1N1 influenza A virus strain: A/Puerto Rico/8/1934 (PR8)
  • ⁇ Method body weight change, survival rate: Fig. 8>
  • Anti-IFN- ⁇ antibody or isotype control antibody was administered intraperitoneally on day 30 (one day before infection). After that, on the 31st day, they were infected nasally with H1N1 influenza A virus (strain: A/Puerto Rico/8/34 (PR8)) different from the vaccine strain, and body weight changes and survival rate were measured over time. .
  • Test example 3 Evaluation of immunostimulatory ability when using SARS-CoV-2 antigen ⁇ laboratory animal, reagent> ⁇ Mice: 6-week-old male BALB/c mice ⁇ Antigen: Recombinant S protein derived from SARS-CoV-2 was produced in mammalian cells. S protein was administered at 1 ⁇ g/mouse.
  • Adjuvant Aluminum hydroxide (alum) was administered at 50 ⁇ g/mouse, or B-type CpG nucleic acid (CpG K3) was administered at 50 ⁇ g/mouse.
  • mice were immunized subcutaneously on days 0 and 21 after S protein alone or mixed with alum, CpG K3, DOTAP-containing LNPs or DOTMA-containing LNPs. Blood was collected on day 28, and SV-specific total IgG, IgG1, IgG2a, and IgG2b in plasma were evaluated by ELISA.
  • ⁇ Method Evaluation of ability to induce T cell response: Fig. 10.
  • Immune cells were harvested from the spleen on day 31 and cultured with S protein (10 ⁇ g/mL). One day later, the culture supernatant was collected and the IFN- ⁇ level was measured by ELISA.
  • Test example 4 Evaluation of side reactions ⁇ laboratory animals, reagents> - Mice: 6-week-old male C57BL6 mice - Antigen: A split vaccine (SV) derived from H1N1 influenza A virus (strain: A/California/7/2009 (Cal7)) was administered at 0.5 ⁇ g/mouse. • Adjuvant: B-type CpG nucleic acid (CpG K3) was administered at 50 ⁇ g/mouse. - Lipid nanoparticles (LNP): DOTMA-containing LNP was administered at 100 ⁇ g/mouse.
  • SV split vaccine
  • CpG K3 B-type CpG nucleic acid
  • LNP Lipid nanoparticles
  • mice After mixing SV with CpG K3 or DOTMA-containing LNPs, mice were immunized subcutaneously twice every two days. Spleen weights were assessed 6 days after the first dose.
  • ⁇ Method (measurement of inflammatory cytokine: FIG. 12)> Mice were immunized subcutaneously with SV alone or after SV was mixed with CpG K3 or DOTMA-containing LNPs. Blood inflammatory cytokine level (IL-12 p40 level) was measured daily by ELISA.
  • Production example 2 Production of lipid particles 2 An ethanol solution (lipid concentration 1.0% by mass) containing lipids in the composition and molar ratio shown in Table 2 and 25 mM Sodium Acetate (pH 4.0) were prepared using NanoAssemblr (manufactured by Precision NanoSystems) at a ratio of 1:3 (ethanol solution: 25 mM sodium acetate aqueous solution (pH 4.0, mixing ratio), mixed at 15 mL/min to form lipid nanoparticles, and dialyzed (5% glucose aqueous solution) to obtain each lipid particle with the name shown in Table 2.
  • DOTMA50 in Table 2 has the same composition as DOTMA in Table 1.
  • the lipid particles of this production example were used in Test Examples 5 and 6 below.
  • Test example 5 Evaluation of immunostimulatory capacity 2 ⁇ Experimental animals, reagents> - Mice: 6-week-old male C57BL6 mice - Antigen: A split vaccine (SV) derived from H1N1 influenza A virus (strain: A/California/7/2009 (Cal7)) was administered at 0.5 ⁇ g/mouse. - Lipid nanoparticles (LNP): DOTMA-containing LNP was administered at 100 ⁇ g/mouse.
  • SV split vaccine
  • H1N1 influenza A virus strain: A/California/7/2009 (Cal7)
  • LNP Lipid nanoparticles
  • mice were immunized subcutaneously on days 0 and 21 after SV alone or SV mixed with DOTMA-containing LNPs. On day 28, blood was collected and plasma SV-specific total IgG, IgG1, IgG2b, and IgG2c were evaluated by ELISA.
  • ⁇ Method Evaluation of ability to induce T cell response: Fig. 14> Immune cells were harvested from the spleens on day 31 and cultured with SV (10 ⁇ g/mL). After 1 or 3 days, the culture supernatant was collected and IL-2, IFN- ⁇ and IL-13 levels were measured by ELISA.
  • DOTMA50 had the highest antibody titers.
  • IgG2b and IgG2c were remarkable.
  • Test example 6 Evaluation of immunostimulatory ability when using pneumococcal antigen ⁇ laboratory animal, reagent> ⁇ Mouse: 6-week-old male C57BL6 mouse ⁇ Antigen: Recombinant PspA protein derived from Streptococcus pneumoniae was produced in Escherichia coli. PspA protein was administered at 1 ⁇ g/mouse. ⁇ Adjuvant: Aluminum hydroxide (alum) was administered at 50 ⁇ g/mouse, and B-type CpG nucleic acid (CpG K3) was administered at 50 ⁇ g/mouse. - Lipid nanoparticles (LNP): DOTMA-containing LNP was administered at 100 ⁇ g/mouse.
  • alum Aluminum hydroxide
  • CpG K3 B-type CpG nucleic acid
  • LNP Lipid nanoparticles
  • mice were immunized subcutaneously on days 0 and 21 after PspA protein alone or mixed with LNP containing alum, CpG K3 and DOTMA. Blood was collected on the 28th day, and PspA-specific total IgG in plasma was evaluated by ELISA.
  • Fig. 16 ⁇ Method (Evaluation of ability to induce T cell response: Fig. 16)> Immune cells were harvested from the spleens on day 31 and cultured with PspA protein (10 ⁇ g/mL). One day later, the culture supernatant was collected and the IFN- ⁇ level was measured by ELISA.

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Abstract

免疫応答誘導能（好ましくはTh1型免疫応答誘導能）がより高い脂質粒子を含有する免疫賦活剤を提供すること。一般式（1）で表されるカチオン性脂質を含有する脂質粒子を含有する、免疫賦活剤。

Description

免疫賦活剤
　本発明は、免疫賦活剤等に関する。
　感染症に対するワクチン開発において、水酸化アルミニウムなどの免疫賦活剤（以下、アジュバントともいう）の併用が必須のワクチンも存在する。しかし、水酸化アルミニウムは起炎性があると共に、Th1型免疫応答を全く誘導できないなど、課題も山積みとなっている。例えば、インフルエンザスプリットワクチンに水酸化アルミニウムを併用しても、亜型の異なるインフルエンザウイルスに対する防御能は一切観察されない一方で、Th1型免疫応答を誘導可能なアジュバントを併用した場合には、強力な感染防御を示す。このように、ウイルス感染症に対するワクチン開発において、Th1型免疫応答の誘導は必要不可欠となりつつある。
特開2020－090445号公報
　特許文献１には、1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム－プロパン（DOTAP）含有脂質粒子を用いた免疫賦活剤について記載されている。本発明者は研究を進める中で、脂質粒子のTh1型免疫応答誘導能をさらに改善することに着目した。
　本発明は、免疫応答誘導能（好ましくはTh1型免疫応答誘導能）がより高い脂質粒子を含有する免疫賦活剤を提供することを課題とする。
　本発明者は鋭意研究を進めた結果、一般式（1）で表されるカチオン性脂質を含有する脂質粒子を含有する、免疫賦活剤、であれば、上記課題を解決できることを見出した。本発明者はこの知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明を完成させた。即ち、本発明は、下記の態様を包含する。
　項１．　一般式（1）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
［式中：R1及びR2は同一又は異なって、不飽和鎖式炭化水素基を示す。R3、R4及びR5は同一又は異なって、アルキル基を示す。pは1～3の整数を示す。qは0～3の整数を示す。rは1～3の整数を示す。］
で表されるカチオン性脂質を含有する脂質粒子を含有する、免疫賦活剤。
　項２．　前記不飽和鎖式炭化水素基が、二重結合を1つのみ有し且つ炭素数10～30の不飽和鎖式炭化水素基である、項１に記載の免疫賦活剤。
　項３．　前記pが1であり、前記qが0であり、且つ前記rが1である、項１又は２に記載の免疫賦活剤。
　項４．　前記カチオン性脂質が1,2－ジ－O－オクタデセニル－3－トリメチルアンモニウムプロパン（DOTMA）である、項１～３のいずれかに記載の免疫賦活剤。
　項５．　前記カチオン性脂質の含有量が、前記脂質粒子を構成する脂質100モル％に対して10～75モル％である、項１～４のいずれかに記載の免疫賦活剤。
　項６．　前記脂質粒子がリン脂質、ステロール、及び水溶性高分子修飾脂質からなる群より選択される少なくとも1種を含有する、項１～５のいずれかに記載の免疫賦活剤。
　項７．　前記脂質粒子がリン脂質、ステロール、及び水溶性高分子修飾脂質を含有する、項１～６のいずれかに記載の免疫賦活剤。
　項８．　CpGオリゴデオキシヌクレオチド及びアルミニウム化合物を含有しない、項１～７のいずれかに記載の免疫賦活剤。
　項Ａ．　前記脂質粒子が脂質ナノ粒子である、項１～８のいずれかに記載の免疫賦活剤。
　項９．　項１～８及び項Ａのいずれかに記載の免疫賦活剤を含有する、医薬。
　項１０．　ワクチン組成物である、項９に記載の医薬。
　項１１．　さらに抗原を含有する、項９又は１０に記載の医薬。
　項１２．　抗ウイルス用又は抗菌用である、項９～１１のいずれかに記載の医薬。
　項Ｂ．　前記抗原がインフルエンザワクチン抗原及びSARS-CoV-2ワクチン抗原からなる群より選択される少なくとも1種を含む、項１１に記載の医薬。
　本発明によれば、免疫応答誘導能がより高い脂質粒子を含有する免疫賦活剤を提供することができる。
試験例1の抗体産生誘導能の評価結果を示す。縦軸は、各グラフ上方に示される抗体のELISA測定値を示す。横軸中、Cont.は薬剤投与無しの場合を示し、SVは抗原単独投与の場合を示し、その他は抗原と共に脂質粒子を投与した場合を示す。 試験例1のT細胞応答誘導能の評価結果を示す。縦軸は、各グラフ上方に示される分子の、ELISAで測定された濃度値を示す。横軸中、Cont.は薬剤投与無しの場合を示し、SVは抗原単独投与の場合を示し、その他は抗原と共に脂質粒子を投与した場合を示す。 試験例1の抗体産生誘導能の評価結果を示す。縦軸は、各グラフ上方に示される抗体のELISA測定値を示す。横軸中、Cont.は薬剤投与無しの場合を示し、SVは抗原単独投与の場合を示し、その他は抗原と共に脂質粒子を投与した場合を示す。 試験例1のT細胞応答誘導能の評価結果を示す。縦軸は、各グラフ上方に示される分子の、ELISAで測定された濃度値を示す。横軸中、Cont.は薬剤投与無しの場合を示し、SVは抗原単独投与の場合を示し、その他は抗原と共に脂質粒子を投与した場合を示す。 試験例2の抗体産生誘導能の評価結果を示す。縦軸は、各グラフ上方に示される抗体のELISA測定値を示す。横軸中、Cont.は薬剤投与無しの場合を示し、SVは抗原単独投与の場合を示し、その他は抗原と共に脂質粒子又は既存のアジュバントを投与した場合を示す。 試験例2のT細胞応答誘導能の評価結果を示す。縦軸は、各グラフ上方に示される分子の、ELISAで測定された濃度値を示す。横軸中、Cont.は薬剤投与無しの場合を示し、SVは抗原単独投与の場合を示し、その他は抗原と共に脂質粒子又は既存のアジュバントを投与した場合を示す。 試験例2の体重推移（上方のグラフ）及び生存率（下方のグラフ）測定結果を示す。凡例中、Cont.は薬剤投与無しの場合を示し、SVは抗原単独投与の場合を示し、その他は抗原と共に脂質粒子又は既存のアジュバントを投与した場合を示す。 試験例2の、DOTMA含有LNPを投与した場合の体重推移（上方のグラフ）及び生存率（下方のグラフ）測定結果を示す。凡例に、投与した抗体を示す。 試験例3の抗体産生誘導能の評価結果を示す。縦軸は、各グラフ上方に示される抗体のELISA測定値を示す。横軸中、Cont.は薬剤投与無しの場合を示し、Sは抗原単独投与の場合を示し、その他は抗原と共に脂質粒子又は既存のアジュバントを投与した場合を示す。 試験例3のT細胞応答誘導能の評価結果を示す。縦軸は、各グラフ上方に示される分子の、ELISAで測定された濃度値を示す。横軸中、Cont.は薬剤投与無しの場合を示し、Sは抗原単独投与の場合を示し、その他は抗原と共に脂質粒子又は既存のアジュバントを投与した場合を示す。 試験例4の脾臓重量及び脾臓重量の体重比の測定結果を示す。横軸中、SVは抗原単独投与の場合を示し、その他は抗原と共に脂質粒子又は既存のアジュバントを投与した場合を示す。 試験例4の炎症性サイトカインの測定結果を示す。凡例中、SVは抗原単独投与の場合を示し、その他は抗原と共に脂質粒子又は既存のアジュバントを投与した場合を示す。横軸は薬剤投与後の経過時間を示す。 試験例5の抗体産生誘導能の評価結果を示す。縦軸は、各グラフ上方に示される抗体のELISA測定値を示す。横軸中、Cont.は薬剤投与無しの場合を示し、SVは抗原単独投与の場合を示し、その他は抗原と共に脂質粒子を投与した場合を示す。 試験例5のT細胞応答誘導能の評価結果を示す。縦軸は、各グラフ上方に示される分子の、ELISAで測定された濃度値を示す。横軸中、Cont.は薬剤投与無しの場合を示し、SVは抗原単独投与の場合を示し、その他は抗原と共に脂質粒子を投与した場合を示す。 試験例6の抗体産生誘導能の評価結果を示す。縦軸は、各グラフ上方に示される抗体のELISA測定値を示す。横軸中、Cont.は薬剤投与無しの場合を示し、PspAは抗原単独投与の場合を示し、その他は抗原と共に脂質粒子又は既存のアジュバントを投与した場合を示す。 試験例6のT細胞応答誘導能の評価結果を示す。縦軸は、各グラフ上方に示される分子の、ELISAで測定された濃度値を示す。横軸中、Cont.は薬剤投与無しの場合を示し、PspAは抗原単独投与の場合を示し、その他は抗原と共に脂質粒子又は既存のアジュバントを投与した場合を示す。
　本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
　1．免疫賦活剤
　本発明は、その一態様において、一般式（1）で表されるカチオン性脂質を含有する脂質粒子（本明細書において、「本発明の脂質粒子」と示すこともある。）を含有する、免疫賦活剤（本明細書において、「本発明の免疫賦活剤」と示すこともある。）に係る。以下に、これについて説明する。
　一般式（1）は、以下に示す式である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　式中：R1及びR2は同一又は異なって、不飽和鎖式炭化水素基を示す。R3、R4及びR5は同一又は異なって、アルキル基を示す。pは1～3の整数を示す。qは0～3の整数を示す。rは1～3の整数を示す。
　不飽和鎖式炭化水素基は、一価であり且つ二重結合を含む鎖式炭化水素基であり、その限りにおいて特に制限されない。不飽和鎖式炭化水素基は、直鎖状及び分岐鎖状のいずれも包含するが、特に好ましくは直鎖状である。不飽和鎖式炭化水素基の炭素数は、脂質粒子を形成可能な数である限り特に制限されないが、例えば8～30、好ましくは10～30、より好ましくは12～26、さらに好ましくは14～22、よりさらに好ましくは16～20、とりわけ好ましくは17～19、特に好ましくは18である。不飽和鎖式炭化水素基が含む二重結合の数は、脂質粒子を形成可能な数である限り特に制限されないが、例えば1～6、好ましくは1～4、より好ましくは1～3、さらに好ましくは1～2、特に好ましくは1である。
　不飽和炭化水素基としては、好ましくは、一般式（2）で表される基が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　sは0以上の整数である。sは、好ましくは2～26、より好ましくは3～20、さらに好ましくは4～14、よりさらに好ましくは5～10、とりわけ好ましくは6～8、特に好ましくは7である。
　tは1以上の整数である。tは、好ましくは3～27、より好ましくは4～21、さらに好ましくは5～15、よりさらに好ましくは6～11、とりわけ好ましくは7～9、特に好ましくは8である。
　sとtの和は、例えば5～27、好ましくは7～27、より好ましくは9～23、さらに好ましくは11～19、よりさらに好ましくは13～17、とりわけ好ましくは14～16、特に好ましくは15である。
　pは、好ましくは1～2、特に好ましくは1である。qは、特に好ましくは0である。rは、好ましくは1～2、特に好ましくは1である。本発明の好ましい態様においては、pが1であり、qが0であり、且つrが1である。
　一般式（1）の好ましい態様は、一般式（1A）である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　一般式（1）の特に好ましい態様は、一般式（1AA）である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　一般式（1AA）において、2つのsは同一であってもよいし異なっていてもよく、また2つのtは同一であってもよいし異なっていてもよい。
　一般式（1）で表されるカチオン性脂質は、特に好ましくは1,2－ジ－O－オクタデセニル－3－トリメチルアンモニウムプロパン（DOTMA）である。
　一般式（1）で表されるカチオン性脂質は、塩の形態であることもできる。一般式（1）で表されるカチオン性脂質は、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；　酢酸塩、プロピオン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩等の有機酸塩であることができる。
　一般式（1）で表されるカチオン性脂質は、1種単独であってもよいし、2種以上の組合せであってもよい。
　本発明の脂質粒子は、一般式（1）で表されるカチオン性脂質を含有する脂質粒子である限り特に制限されない。本発明の脂質粒子の粒径は、特に制限されない。該粒径は、好ましくはナノサイズであり、具体的には例えば10～700nm、10～400nm、10～200nm、10～150nm、又は100nm未満である。本発明の脂質粒子は、粒径がナノサイズである脂質ナノ粒子（LNP：Lipid　NanoParticle）であることが好ましい。
　本発明の脂質粒子は、粒子を構成する脂質として、一般式（1）で表されるカチオン性脂質以外の他の脂質を含有するものであることができ、また他の脂質を含有しないものであることができる。一般式（1）で表されるカチオン性脂質の含有量は、脂質粒子を形成できる限り特に制限されない。当該含有量は、脂質粒子の免疫応答誘導作用の観点から、本発明の脂質粒子を構成する脂質100モル％に対して、例えば10～100モル％、好ましくは10～85モル％、より好ましくは10～75モル％、さらに好ましくは20～70モル％、よりさらに好ましくは30～65モル％、とりわけ好ましくは40～60モル％、特に好ましくは45～55モル％である。また、当該含有量は、脂質粒子の免疫応答誘導作用の観点から、本発明の脂質粒子を構成する脂質100モル％に対して、例えば10モル％以上、好ましくは20モル％以上、より好ましくは30モル％以上、さらに好ましくは40モル％以上、特に好ましくは45モル％以上である。本発明の一態様において、当該含有量は、脂質粒子形成性の観点から、好ましくは80モル％以下、より好ましくは70モル％以下、さらに好ましくは65モル％以下、よりさらに好ましくは60モル％以下、とりわけ好ましくは55モル％以下、特に好ましくは50モル％以下である。
　他の脂質としては、特に制限されないが、リン脂質、ステロール、水溶性高分子修飾脂質、一般式（1）で表されるカチオン性脂質以外のカチオン性脂質、糖脂質等が挙げられる。本発明の好ましい態様において、本発明の脂質粒子は、リン脂質、ステロール、及び水溶性高分子修飾脂質からなる群より選択される少なくとも1種を含有することが好ましく、これら全て（リン脂質、ステロール、及び水溶性高分子修飾脂質）を含有することが特に好ましい。
　リン脂質の具体例としては、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン、ミリストイルパルミトイルホスファチジルコリン、ミリストイルステアロイルホスファチジルコリン、パルミトイルステアロイルホスファチジルコリン等のホスファチジルコリン；ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジリノレオイルホスファチジルグリセロール、ミリストイルパルミトイルホスファチジルグリセロール、ミリストイルステアロイルホスファチジルグリセロール、パルミトイルステアロイルホスファチジルグリセロール等のホスファチジルグリセロール；ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジリノレオイルホスファチジルエタノールアミン、ミリストイルパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ミリストイルステアロイルホスファチジルエタノールアミン、パルミトイルステアロイルホスファチジルエタノールアミン等のホスファチジルエタノールアミン；ホスファチジルセリン；ホスファチジン酸；ホスファチジルイノシトール；スフィンゴミエリン；カルジオリピン；卵黄レシチン；大豆レシチン；及びこれらの水素添加物等が例示される。
　リン脂質は、1種単独であってもよいし、2種以上の組合せであってもよい。
　本発明の脂質粒子がリン脂質を含有する場合、その含有量は、脂質粒子を形成できる限り特に制限されないが、本発明の脂質粒子を構成する脂質100モル％に対して、例えば5～50モル％、好ましくは10～30モル％、より好ましくは15～25モル％、さらに好ましくは17～23モル％である。
　ステロールの具体例としては、コレステロール、コレステリルヘミスクシネート、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、デスモステロール、ジヒドロコレステロール、フィトステロール、フィトステロール、スチグマステロール、チモステロール、エルゴステロール、シトステロール、カンペステロール、ブラシカステロール等が例示される。特に、当該ステロールには、脂質粒子膜を安定化させたり、脂質粒子膜の流動性を調節したりする作用があるため、脂質粒子膜の構成脂質として含まれていることが望ましい。
　ステロールは、1種単独であってもよいし、2種以上の組合せであってもよい。
　本発明の脂質粒子がステロールを含有する場合、その含有量は、脂質粒子を形成できる限り特に制限されないが、本発明の脂質粒子を構成する脂質100モル％に対して、例えば15～60モル％、好ましくは20～40モル％、より好ましくは25～35モル％、さらに好ましくは27～33モル％である。
　水溶性高分子修飾脂質は、水溶性高分子が付加された脂質であり、その限りにおいて特に制限されない。水溶性高分子としては、特に制限されないが、例えばポリエチレングリコール（PEG）鎖が挙げられる。水溶性高分子の分子量は、特に制限されないが、例えば200～10000、好ましくは500～7000、より好ましくは500～4000、さらに好ましくは1000～3000、よりさらに好ましくは1500～2500である。水溶性高分子で修飾される脂質としては、好ましくは両親媒性脂質が挙げられ、より好ましくはリン脂質が挙げられる。
　水溶性高分子修飾脂質は、1種単独であってもよいし、2種以上の組合せであってもよい。
　本発明の脂質粒子が水溶性高分子修飾脂質を含有する場合、その含有量は、脂質粒子を形成できる限り特に制限されないが、本発明の脂質粒子を構成する脂質100モル％に対して、例えば0～10モル％、好ましくは0～5モル％、より好ましくは0～2モル％、さらに好ましくは0～1モル％、よりさらに好ましくは0.2～1モル％、特に好ましくは0.3～0.7モル％である。
　本発明の脂質粒子は、脂質以外にも他の成分（溶媒以外）を含んでいてもよい。他の成分としては、脂質粒子に配合することが公知の各種成分が挙げられ、具体的には例えば膜安定化剤、荷電物質、抗酸化剤、膜タンパク質、ポリエチレングリコール（PEG）、抗体、ペプチド、糖鎖等が挙げられる。
　抗酸化剤は、膜の酸化防止のために含有させることができ、膜の構成成分として必要に応じて使用される。膜の構成成分として使用される抗酸化剤としては、例えば、ブチル化ヒドロキシトルエン、没食子酸プロピル、トコフェロール、酢酸トコフェロール、濃縮混合トコフェロール、ビタミンE、アスコルビン酸、L-アスコルビン酸ステアリン酸エステル、パルミチン酸アスコルビン酸、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、エリソルビン酸、クエン酸等が例示される。
　膜タンパク質は、膜への機能付加又は膜の構造安定化を目的として含有させることができ、膜構成成分として必要に応じて使用される。膜タンパク質としては、例えば、膜表在性タンパク質、膜内在性タンパク質、アルブミン、組換えアルブミン等が挙げられる。
　他の成分の含有量は、本発明の脂質粒子100質量％に対して、例えば10質量％以下、好ましくは5質量％以下、より好ましくは2質量％以下、さらに好ましくは1質量％以下である。
　他の成分は、1種単独であってもよいし、2種以上の組合せであってもよい。
　本発明の脂質粒子は、他のアジュバントに依らずに、高いTh1型免疫応答誘導能を発揮することができる。このため、本発明の脂質粒子は、他のアジュバントによる副作用を低減するという観点から、他のアジュバントを含有しない或いはその含有量がより少ないことが好ましい。他のアジュバントとしては、CpGオリゴデオキシヌクレオチド（CpG核酸：CpG ODN:例えばAタイプ、Bタイプ、Cタイプ、Pタイプ等）、アルミニウム化合物（例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム等）、オイルエマルジョン等が挙げられる。他のアジュバントの含有量は、本発明の脂質粒子100質量％に対して、例えば10質量％以下、好ましくは5質量％以下、より好ましくは2質量％以下、さらに好ましくは1質量％以下、特に好ましくは0質量％である。
　脂質粒子は、1種単独であってもよいし、2種以上の組合せであってもよい。
　本発明の脂質粒子は、通常、水系溶液中で形成されている。水系溶液としては、例えば各種緩衝液（例えば、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、ギ酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液等）が挙げられる。
　本発明の脂質粒子は、脂質粒子の公知の方法に従って又は準じて製造することができる。本発明の脂質粒子は、好適には、脂質を含有するアルコール溶液と、水系溶液とを混合する工程（工程1）を含む方法によって、製造することができる。
　アルコール溶液の溶媒であるアルコールとしては、脂質を溶解可能なアルコールである限り特に制限されない。アルコールとしては、エタノールが好ましく挙げられる。
　アルコール溶液中の脂質濃度は、例えば0.1～20質量％、好ましくは0.1～10質量％、より好ましくは0.5～3.0質量％である。
　水系溶液とアルコール溶液との混合比（水系溶液／アルコール溶液、v/v）は、例えば20/1～1/1、好ましくは4/1～2/1である。
　混合態様は、脂質粒子の形成が可能な態様である限り特に制限されないが、通常は、ボルテックス等で激しく撹拌する態様である。或いは、マイクロ流路を用いた反応系で行う場合は、反応系内で混合される。
　工程1は、通常、室温下又は加温下で実行される。
　本発明の免疫賦活剤は、本発明の脂質粒子以外にも、さらに他の物質を含み得る。他の物質としては、特に制限されないが、例えば本発明の脂質粒子以外のアジュバントが挙げられる。
　他の物質の含有量は、本発明の免疫賦活剤100質量％に対して、例えば10質量％以下、好ましくは5質量％以下、より好ましくは2質量％以下、さらに好ましくは1質量％以下である。
　他の物質は、1種単独であってもよいし、2種以上の組合せであってもよい。
　本発明の脂質粒子は、他のアジュバントに依らずに、高いTh1型免疫応答誘導能を発揮することができる。このため、本発明の免疫賦活剤は、他のアジュバントによる副作用を低減するという観点から、他のアジュバントを含有しない或いはその含有量がより少ないことが好ましい。他のアジュバントについては、上記と同様である。他のアジュバントの含有量は、本発明の免疫賦活剤100質量％に対して、例えば10質量％以下、好ましくは5質量％以下、より好ましくは2質量％以下、さらに好ましくは1質量％以下、特に好ましくは0質量％である。
　本発明の免疫賦活剤は、本発明の脂質粒子をそのまま、或いは該粒子に上記した成分／物質を添加することにより、得ることができる。
　2．用途
　本発明の免疫賦活剤は、より高い免疫応答誘導能を発揮することができる。本発明の免疫賦活剤は、より高い細胞性免疫の誘導能（特に、Th1型免疫応答誘導能）（例えばIFN－γ誘導作用）を発揮することが可能であり、またより高い抗体誘導能をも発揮することが可能である。また、本発明の免疫賦活剤は、既存の他のアジュバントに比べて、炎症などの副反応を抑えつつ、上記各種誘導能を発揮することができる。このため、本発明の免疫賦活剤は、その免疫賦活作用を利用した種々の用途、例えば医薬、試薬等（本明細書において、「本発明の薬剤」と示すこともある。）に、より具体的には、ワクチン組成物、抗ウイルス用薬剤、抗菌剤等に利用が可能である。
　本発明の薬剤は、本発明の免疫賦活剤を含有する限りにおいて特に制限されず、必要に応じてさらに他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、薬学的に許容される成分であれば特に限定されるものではない。他の成分としては、薬理作用を有する成分のほか、添加剤も含まれる。添加剤としては、免疫賦活剤に配合することが公知の各種成分が挙げられ、具体的には例えば基剤、担体、溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、増粘剤、保湿剤、着色料、香料、キレート剤等が挙げられる。
　本発明の脂質粒子は、他のアジュバントに依らずに、より高い免疫応答誘導能を発揮することができる。このため、本発明の薬剤は、他のアジュバントによる副作用を低減するという観点から、他のアジュバントを含有しない或いはその含有量がより少ないことが好ましい。他のアジュバントについては、上記と同様である。他のアジュバントの含有量は、本発明の薬剤100質量％に対して、例えば10質量％以下、好ましくは5質量％以下、より好ましくは2質量％以下、さらに好ましくは1質量％以下、特に好ましくは0質量％である。
　本発明の薬剤は、好適には抗原を含有する。抗原は、免疫系を有する哺乳動物に（直接あるいは、たとえばDNAワクチンなどでの発現時に）導入されると、この哺乳動物の免疫系によって認識され、免疫応答を誘発できるあらゆる作用剤（たとえば、タンパク質、ペプチド、多糖、糖タンパク質、糖脂質、核酸またはそれらの組み合わせ）をいう。本明細書で定義する場合、抗原誘発免疫応答は、液性であっても細胞性であってもよいし、両方であってもよい。作用剤は、免疫グロブリン（抗体）またはT細胞抗原受容体（TCR）などの免疫系の抗原認識分子と特異的に相互作用できるときに、「抗原性」であるとされる。
　いくつかの実施形態では、1種類以上の抗原は、タンパク質に基づく抗原である。他の実施形態では、1種類以上の抗原は、ペプチドに基づく抗原である。さまざまな実施形態において、1種類以上の抗原は、がん抗原、ウイルス抗原、菌抗原（細菌抗原、真菌抗原）、および病原体抗原からなる群から選択される。「微生物抗原」とは、本明細書で使用する場合、微生物の抗原であり、感染性ウイルス、感染性細菌、感染性寄生虫、感染性真菌を含むが、これらに限定されるものではない。微生物抗原は、インタクトな微生物ならびにその天然単離物、断片または誘導体のほか、天然に生じる微生物抗原と同一または類似であり、好ましくは、（天然に生じる微生物抗原が由来する）対応の微生物に特異的な免疫応答を誘導する合成化合物であってもよい。一実施形態では、抗原は、がん抗原である。一実施形態では、抗原は、ウイルス抗原である。もうひとつの実施形態では、抗原は、菌抗原である。さまざまな実施形態において、抗原は、病原体抗原である。いくつかの実施形態では、病原体抗原は、合成抗原または組換え抗原である。
　抗原としては、好ましくはウイルス抗原が挙げられる。抗原の由来ウイルスとしては、特に制限されないが、例えばインフルエンザウイルス（例えばA型、B型等）、風疹ウイルス、エボラウイルス、コロナウイルス、麻疹ウイルス、水痘・帯状疱疹ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ムンプスウイルス、アルボウイルス、RSウイルス、SARSウイルス、肝炎ウイルス（例えば、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス等）、黄熱ウイルス、エイズウイルス、狂犬病ウイルス、ハンタウイルス、デングウイルス、ニパウイルス、リッサウイルス等のエンベロープウイルス（エンベロープを有するウイルス）；　アデノウイルス、ノロウイルス、ロタウイルス、ヒトパピローマウイルス、ポリオウイルス、エンテロウイルス、コクサッキーウイルス、ヒトパルボウイルス、脳心筋炎ウイルス、ライノウイルス等の非エンベロープウイルス（エンベロープを有さないウイルス）等が挙げられる。これらの中でも、好ましくはエンベロープウイルスが挙げられ、より好ましくはインフルエンザウイルス、コロナウイルス等が挙げられる。
　最近では、SARSコロナウイルス2（SARS-CoV-2）の世界的な流行が起こり、治療技術が確立されていないことから、医療、経済等の多方面に亘って甚大な被害が続いている。本発明の免疫賦活剤はSARS-CoV-2に対しても有効である。SARS-CoV-2としては、特に制限されず、武漢株、アルファ株、デルタ株、ラムダ株、オミクロン株等の既知の株及びそれらの亜系統のみならず、将来発見される未知の各種株が挙げられる。
　抗原としては、好ましくは菌抗原が挙げられる。抗原の由来菌としては、特に制限されないが、例えば百日咳菌、破傷風菌、ジフテリア菌、サルモネラ菌、ピロリ菌、ウエルシュ菌、ボツリヌス菌、カンピロバクター、大腸菌、黄色ブドウ球菌、レンサ球菌、セレウス菌、腸炎ビブリオ、アクネ菌、フェカーリス菌、ディフィシル菌、肺炎球菌、インフルエンザ桿菌、モラキセラ菌、肺炎桿菌、コイネバクテリウム、溶連菌、緑膿菌、ブドウ球菌、マイコプラズマ、カンジダ菌、アスペルギルス菌等が挙げられる。
　本発明の薬剤の使用態様は、特に制限されず、その種類に応じて適切な使用態様を採ることができる。本発明の薬剤は、その用途に応じて、例えばin vitroで使用する（例えば、培養細胞の培地に添加する。）こともできるし、in vivoで使用する（例えば、動物に投与する。）こともできる。
　本発明の薬剤の適用対象は特に限定されないが、哺乳動物では、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、シカ等が挙げられる。また、細胞としては、動物細胞等が挙げられる。細胞の種類も特に制限されず、例えば血液細胞、造血幹細胞・前駆細胞、配偶子（***、卵子）、線維芽細胞、上皮細胞、血管内皮細胞、神経細胞、肝細胞、ケラチン生成細胞、筋細胞、表皮細胞、内分泌細胞、ES細胞、iPS細胞、組織幹細胞、がん細胞等が挙げられる。
　本発明の薬剤は、任意の剤形、例えば錠剤（口腔内側崩壊錠、咀嚼可能錠、発泡錠、トローチ剤、ゼリー状ドロップ剤などを含む）、丸剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、ドライシロップ剤、液剤（ドリンク剤、懸濁剤、シロップ剤を含む）、ゼリー剤などの経口製剤形態や、注射用製剤（例えば、点滴注射剤（例えば点滴静注用製剤等）、静脈注射剤、筋肉注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤）、外用剤（例えば、軟膏剤、パップ剤、ローション剤）、坐剤吸入剤、点眼剤、眼軟膏剤、点鼻剤、点耳剤、リポソーム剤等の非経口製剤形態を採ることができる。
　本発明の薬剤の投与経路としては、所望の効果が得られる限り特に制限されず、経口投与；　経管栄養、注腸投与等の経腸投与；　経静脈投与、経動脈投与、筋肉内投与、心臓内投与、皮下投与、皮内投与、腹腔内投与、経鼻投与等の非経口投与等が挙げられる。
　本発明の薬剤中の本発明の免疫賦活剤の含有量は、使用態様、適用対象、適用対象の状態等に左右されるものであり、限定はされないが、例えば0.0001～100重量％、好ましくは0.001～50重量％とすることができる。
　本発明の薬剤を動物に投与する場合の投与量は、薬効を発現する有効量であれば特に限定されず、通常は、本発明の免疫賦活剤の重量として、一般に経口投与の場合には一日あたり0.1～1000 mg/kg体重、好ましくは一日あたり0.5～500 mg/kg体重であり、非経口投与の場合には一日あたり0.01～100 mg/kg体重、好ましくは0.05～50 mg/kg体重である。上記投与量は、年齢、病態、症状等により適宜増減することもできる。
　以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
　略称
　実施例で使用される略称とその正式名称を以下に示す。
DOTAP： 1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム－プロパン
DPPC： 1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン
NG-DOPE： N-グルタリル-L- α- ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン
DODAP： 1,2-ジオレオイルオキシ-3-ジメチルアミノプロパン
DOTMA： 1,2-ジ-O-オクタデセニル-3-トリメチルアンモニウムプロパン
DSPE-PEG-Ome： N-(メチルポリオキシエチレンオキシカルボニル)-1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン（PEG鎖分子量：2000）
　製造例1．脂質粒子の製造1
　表１に示す構成及びモル比で脂質を含有するエタノール溶液（脂質濃度1.0質量％）と25mM Sodium Acetate(pH4.0)とを、NanoAssemblr（Precision NanoSystems社製）を用いて1：3（エタノール溶液：25 mM 酢酸ナトリウム水溶液（pH 4.0）、混合比）、15 mL/minで混合して脂質ナノ粒子化し、透析（5%グルコース水溶液）を行い、表１に示す名称の各脂質粒子（以下、「LNP」と示すこともある。）を得た。本製造例の脂質粒子は、以下の試験例1～4で使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　試験例1．免疫賦活能の評価1
　＜実験動物、試薬＞
・マウス：6週齢雄のC57BL6マウス
・抗原：H1N1 influenza A virus (株: A/California/7/2009 (Cal7))由来のスプリットワクチン（SV）を0.5 μg/マウスで投与した。
・脂質ナノ粒子（LNP）：表１に記載したLNPを各々100 μg/マウスで投与した。
　＜手法（抗体産生誘導能の評価：図１及び３）＞
　SV単独もしくは、SVを各種LNPと混合した後、0日および21日目に、マウスに皮下免疫した。28日目に、血液を回収し、血漿中のSV特異的total IgG、IgG1、IgG2b、IgG2cをELISAで評価した。
　＜手法（T細胞応答誘導能の評価：図２及び４）＞
　31日目に脾臓から免疫細胞を回収し、SV（10 μg/mL）と共に培養した。1または3日後に培養上清を回収し、IL-2、IFN-γ、IL-13量をELISAで測定した。
　＜結果＞
　結果を図１～４に示す。
　図１～２では、カチオン性脂質として使用しているDOTAPの含有量を変化させて作成したLNPを使用した。また、DOTAPの代わりに、アニオン性脂質のNG-DOPEを用いたLNPを使用した。なお、使用したLNPの表面電荷が、DOTAPの量を低下させることで中性に近くなり、NG-DOPEの量を増加させることで負電荷が増大することを明らかとしている。その結果、SVを抗原に用いた場合には、DOTAPの含有量が多い方が抗体産生能が高いことが判明した。T細胞応答については、Th1免疫の指標であるIFN-γ産生は、DOTAPおよびNG-DOPEを用いたLNPの一部で観察された。Th2免疫の指標であるIL-13産生は、NG-DOPEを用いたLNPで観察された。
　図３～４では、カチオン性脂質としてDOTAPを用い、ポリエチレングリコール（PEG）修飾脂質の含有量を変化させたLNPを用いた。また、DOTAPの代わりに、カチオン性脂質であるDODAP又はDOTMAを用いたLNPを使用した。抗体産生およびT細胞応答について、PEG修飾脂質の含有量が増加するにつれ低下する傾向が観察された。また、DODAP含有LNPについても、DOTAP含有LNPと比較して、免疫応答は低い傾向が認められた。一方で、DOTMA含有LNPについて、DOTAP含有LNPと比較して、抗体産生（特にIgG2c）の増加が観察された。さらに、Th1免疫、Th2免疫ともに、DOTMA含有LNPでは強力に誘導されることが判明した。以上の結果から、DOTMA含有LNPで、抗体産生と共にT細胞応答を強力に誘導し得ることが判明した。
　試験例2．既存のアジュバントとの比較
　＜実験動物、試薬＞
・マウス：6週齢雄のC57BL6マウス
・抗原：H1N1 influenza A virus (株: A/California/7/2009 (Cal7))由来のスプリットワクチン（SV）を0.5 μg/マウスで投与した。
・アジュバント：水酸化アルミニウム（alum）を50 μg/マウスで投与し、又はBタイプCpG核酸（CpG K3）を50 μg/マウスで投与した。
・脂質ナノ粒子（LNP）：DOTAP含有LNPを100 μg/マウスで投与し、又はDOTMA含有LNPを100 μg/マウスで投与した。
　＜手法（抗体産生誘導能の評価：図５）＞
　SV単独もしくは、SVをalum、CpG K3、DOTAP含有LNPもしくはDOTMA含有LNPと混合した後、0日および21日目に、マウスに皮下免疫した。28日目に、血液を回収し、血漿中のSV特異的total IgG、IgG1、IgG2b、IgG2cをELISAで評価した。
　＜手法（T細胞応答誘導能の評価：図６）＞
　31日目に脾臓から免疫細胞を回収し、SV（10 μg/mL）と共に培養した。1または3日後に培養上清を回収し、IL-2、IFN-γ、IL-13量をELISAで測定した。
　＜手法（体重推移、生存率：図７）＞
　31日目に、ワクチン株とは異なるH1N1 influenza A virus (株: A/Puerto Rico/8/1934 (PR8))を経鼻より感染させ、経日的に体重推移、生存率を測定した。
　＜手法（体重推移、生存率：図８）＞
　DOTMA含有LNP併用群について、Th1免疫の感染防御における役割を検証した。 30日目（感染1日前）に、抗IFN-γ抗体もしくはアイソタイプコントロール抗体を腹腔内投与した。その後、31日目に、ワクチン株とは異なる H1N1 influenza A virus (株: A/Puerto Rico/8/34 (PR8))を経鼻より感染させ、経日的に体重推移、生存率を測定した。
　＜結果＞
　結果を図５～８に示す。
　図５では、LNPとして汎用されるDOTAP含有LNPと共に、独自に見出したDOTMA含有LNPの免疫誘導効果を検証した。alum、CpG K3、DOTAP含有LNP、DOTMA含有LNPのいずれにおいても、SVと併用することで抗体価の向上が観察された。alumでは特にIgG1が、CpG核酸ではIgG2cの向上が認められた。DOTMA含有LNPでは、IgG1、IgG2b、IgG2cのいずれについても高い抗体価が観察された。
　図６においてT細胞応答を評価したところ、DOTMA含有LNP群においてCpG K3群よりも強力に、Th1免疫の指標であるIFN-γの産生が観察された。alumではTh2免疫の指標であるIL-13の産生が認められた。
　図７においてワクチン後にヘテロ株を感染させたところ、SV単独、alum併用群、DOTAP含有LNP併用群では、顕著な体重減少および生存率の低下が観察された。一方で、CpG K3併用群およびDOTMA含有LNP併用群においては、体重減少は観察されず、全マウスで生存が観察された。 
　図８において、抗IFN-γ抗体群において、アイソタイプコントロール抗体群と比較して、体重減少および生存率の減少が観察された。即ち、図７で観察された、DOTMA含有LNP群における強力なTh1免疫誘導が、ヘテロ株に対する感染防御に重要であることが示された。
　試験例3．SARS-CoV-2抗原を使用した場合の免疫賦活能の評価
　＜実験動物、試薬＞
・マウス：6週齢雄のBALB/cマウス
・抗原：SARS-CoV-2由来の組換えS蛋白質を哺乳類細胞で作製した。S蛋白質を1 μg/マウスで投与した。
・アジュバント：水酸化アルミニウム（alum）を50 μg/マウスで投与し、又はBタイプCpG核酸（CpG K3）を50 μg/マウスで投与した。
・脂質ナノ粒子（LNP）：DOTAP含有LNPを100 μg/マウスで投与し、又はDOTMA含有LNPを100 μg/マウスで投与した。
　＜手法（抗体産生誘導能の評価：図９）＞
　S蛋白質単独もしくは、S蛋白質をalum、CpG K3、DOTAP含有LNPもしくはDOTMA含有LNPと混合した後、0日および21日目に、マウスに皮下免疫した。28日目に血液を回収し、血漿中のSV特異的total IgG、IgG1、IgG2a、IgG2bをELISAで評価した。
　＜手法（T細胞応答誘導能の評価：図１０）＞
　31日目に脾臓から免疫細胞を回収し、S蛋白質（10 μg/mL）と共に培養した。1日後に培養上清を回収し、IFN-γ量をELISAで測定した。
　＜結果＞
　結果を図９～１０に示す。
　図９において、alum、CpG K3、DOTAP含有LNP、DOTMA含有LNPのいずれにおいても、抗体価の向上が観察された。
　図１０において、T細胞応答を評価したところ、DOTMA含有LNP群においてCpG K3群よりも強力に、Th1免疫の指標であるIFN-γの産生が観察された。即ちDOTMA含有LNPは、SVのみならずS蛋白質においても、Th1免疫を強力に誘導し得ることが判明した。
　試験例4．副反応の評価
　＜実験動物、試薬＞
・マウス：6週齢雄のC57BL6マウス
・抗原：H1N1 influenza A virus (株: A/California/7/2009 (Cal7))由来のスプリットワクチン（SV）を0.5 μg/マウスで投与した。
・アジュバント：BタイプCpG核酸（CpG K3）を50 μg/マウスで投与した。
・脂質ナノ粒子（LNP）：DOTMA含有LNPを100 μg/マウスで投与した。
　＜手法（脾臓重量の測定：図１１）＞
　SVをCpG K3もしくはDOTMA含有LNPと混合した後、2日おきに2回、マウスに皮下免疫した。初回投与の6日後に、脾臓重量を評価した。
　＜手法（炎症性サイトカインの測定：図１２）＞
　SV単独もしくは、SVをCpG K3もしくはDOTMA含有LNPと混合した後、マウスに皮下免疫した。経日的に、血中の炎症性サイトカイン量（IL-12 p40量）をELISAで測定した。
　＜結果＞
　結果を図１１～１２に示す。
　図１１においいて、CpG K3の併用群では、脾臓重量の有意な増加が観察された一方で、DOTMA含有LNP併用群では観察されなかった。
　図１２において、CpG K3の併用群で、投与72時間、120時間後に、IL-12 p40の有意な上昇が観察された一方で、DOTMA含有LNP併用群では観察されなかった。
　以上の結果から、本投与量においてCpG K3では全身性の副反応が誘発される可能性が示された一方で、DOTMA含有LNPでは安全に使用可能なことが示された。
　製造例2．脂質粒子の製造2
　表２に示す構成及びモル比で脂質を含有するエタノール溶液（脂質濃度1.0質量％）と25mM Sodium Acetate（pH 4.0）とを、NanoAssemblr（Precision NanoSystems社製）を用いて1：3（エタノール溶液：25 mM 酢酸ナトリウム水溶液（pH 4.0）、混合比）、15 mL/minで混合して脂質ナノ粒子化し、透析（5%グルコース水溶液）を行い、表２に示す名称の各脂質粒子を得た。なお、表２のDOTMA50は表１のDOTMAと同じ組成である。本製造例の脂質粒子は、以下の試験例5～6で使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　試験例5．免疫賦活能の評価2
　＜実験動物、試薬＞
・マウス：6週齢雄のC57BL6マウス
・抗原：H1N1 influenza A virus (株: A/California/7/2009 (Cal7))由来のスプリットワクチン（SV）を0.5 μg/マウスで投与した。
・脂質ナノ粒子（LNP）：DOTMA含有LNPを100 μg/マウスで投与した。
　＜手法（抗体産生誘導能の評価：図１３）＞
　SV単独もしくは、SVをDOTMA含有LNPと混合した後、0日および21日目に、マウスに皮下免疫した。28日目に、血液を回収し、血漿中のSV特異的total IgG、IgG1、IgG2b、IgG2cをELISAで評価した。
　＜手法（T細胞応答誘導能の評価：図１４）＞
　31日目に脾臓から免疫細胞を回収し、SV（10 μg/mL）と共に培養した。1または3日後に培養上清を回収し、IL-2、IFN-γ、IL-13量をELISAで測定した。
　＜結果＞
　結果を図１３～１４に示す。
　図１３において、いずれの抗体価もDOTMA50で最も高いことが明らかとなった。特に、IgG2b、IgG2cでは顕著であった。
　図１４において、T細胞応答を評価したところ、いずれのサイトカインもDOTMA50で最も高く、DOTMA含有量が低下するにつれ、サイトカイン産生も低下した。特にIFN-γの産生について、DOTMA50が最も高く、DOTMAがTh1免疫応答に必須であることが示された。
　試験例6．肺炎球菌抗原を使用した場合の免疫賦活能の評価
　＜実験動物、試薬＞
・マウス：6週齢雄のC57BL6マウス
・抗原：肺炎球菌由来の組換えPspA蛋白質を大腸菌で作製した。PspA蛋白質を1 μg/マウスで投与した。
・アジュバント：水酸化アルミニウム（alum）を50 μg/マウスで投与、BタイプCpG核酸（CpG K3）を50 μg/マウスで投与した。
・脂質ナノ粒子（LNP）：DOTMA含有LNPを100 μg/マウスで投与した。
　＜手法（抗体産生誘導能の評価：図１５）＞
　PspA蛋白質単独もしくは、 PspA蛋白質をalum、CpG K3、DOTMA含有LNPと混合した後、0日および21日目に、マウスに皮下免疫した。28日目に血液を回収し、血漿中のPspA特異的total IgGをELISAで評価した。
　＜手法（T細胞応答誘導能の評価：図１６）＞
　31日目に脾臓から免疫細胞を回収し、 PspA蛋白質（10 μg/mL）と共に培養した。1日後に培養上清を回収し、IFN-γ量をELISAで測定した。
　＜結果＞
　結果を図１５～１６に示す。
　図１５において、alum、CpG K3、DOTMA含有LNPのいずれにおいても、抗体価の向上が観察された。特にDOTMA含有LNPにおいて強い抗体価が観察された。
　図１６において、T細胞応答を評価したところ、DOTMA含有LNP群においてCpG K3群よりも強力に、Th1免疫の指標であるIFN-γの産生が観察された。即ちDOTMA含有LNPは、SVやS蛋白質のみならずPspA蛋白質においても、Th1免疫を強力に誘導し得ることが判明した。

Claims (12)

  1. 一般式（1）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式中：R1及びR2は同一又は異なって、不飽和鎖式炭化水素基を示す。R3、R4及びR5は同一又は異なって、アルキル基を示す。pは1～3の整数を示す。qは0～3の整数を示す。rは1～3の整数を示す。］
    で表されるカチオン性脂質を含有する脂質粒子を含有する、免疫賦活剤。
  2. 前記不飽和鎖式炭化水素基が、二重結合を1つのみ有し且つ炭素数10～30の不飽和鎖式炭化水素基である、請求項１に記載の免疫賦活剤。
  3. 前記pが1であり、前記qが0であり、且つ前記rが1である、請求項１又は２に記載の免疫賦活剤。
  4. 前記カチオン性脂質が1,2－ジ－O－オクタデセニル－3－トリメチルアンモニウムプロパン（DOTMA）である、請求項１～３のいずれかに記載の免疫賦活剤。
  5. 前記カチオン性脂質の含有量が、前記脂質粒子を構成する脂質100モル％に対して10～75モル％である、請求項１～４のいずれかに記載の免疫賦活剤。
  6. 前記脂質粒子がリン脂質、ステロール、及び水溶性高分子修飾脂質からなる群より選択される少なくとも1種を含有する、請求項１～５のいずれかに記載の免疫賦活剤。
  7. 前記脂質粒子がリン脂質、ステロール、及び水溶性高分子修飾脂質を含有する、請求項１～６のいずれかに記載の免疫賦活剤。
  8. CpGオリゴデオキシヌクレオチド及びアルミニウム化合物を含有しない、請求項１～７のいずれかに記載の免疫賦活剤。
  9. 請求項１～８のいずれかに記載の免疫賦活剤を含有する、医薬。
  10. ワクチン組成物である、請求項９に記載の医薬。
  11. さらに抗原を含有する、請求項９又は１０に記載の医薬。
  12. 抗ウイルス用又は抗菌用である、請求項９～１１のいずれかに記載の医薬。
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