CN117305458A - TKTmRNA检测试剂在制备多发性骨髓瘤筛查试剂盒中的用途及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物科学领域，具体涉及一种TKTmRNA检测试剂在制备多发性骨髓瘤筛查试剂盒中的用途及试剂盒。本发明首次发现多发性骨髓瘤患者骨髓浆细胞中TKTmRNA的水平显著高于意义未明的单克隆免疫球蛋白病（MGUS）患者和健康对照。本发明将检测TKTmRNA水平的试剂用于制备多发性骨髓瘤筛查试剂盒，能够实现多发性骨髓瘤的有效筛查。
Description
技术领域
本发明属于医药科学领域，具体涉及TKTmRNA检测试剂在制备多发性骨髓瘤筛查试剂盒中的用途及试剂盒。
背景技术
多发性骨髓瘤（MM）是一种恶性浆细胞病，特征是骨髓中的浆细胞异常增殖。增殖的浆细胞产生单克隆免疫球蛋白，导致靶器官的损害，出现贫血、骨痛、骨质破坏、肾功能受损等不良状态，给患者家庭和社会带来了沉重的负担。我国MM发病率约为十万分之一，占所有癌肿的1% 左右。
多发性骨髓瘤与意义未明的单克隆免疫球蛋白病（MGUS）在临床上的区分不明显，尤其是在疾病的早期阶段。同时，由于骨髓瘤的高度异质性，诊断也变得相当复杂，给患者及其家庭带来巨大的经济负担。因此，开发一种新型、有效的骨髓瘤诊断方法对于早期诊断疾病、提高治疗效果和改善患者生活质量具有极其重要的意义。
TKT基因，其具体功能并没有被完全研究清楚，TKTmRNA是指TKT基因的信使RNA（mRNA），它是从TKT基因转录而来，并携带着编码TKT蛋白的信息。目前有关TKT诊治帕金森病的相关报道。
目前尚未见TKTmRNA与多发性骨髓瘤相关的现有技术。
发明内容
本发明的目的在于提供TKTmRNA检测试剂在制备多发性骨髓瘤筛查试剂盒中的用途及试剂盒。
本发明提供了一种检测TKTmRNA水平的试剂在制备多发性骨髓瘤筛查试剂盒中的用途。
进一步地，所述检测TKTmRNA水平的试剂包括实时定量PCR检测试剂、NorthernBlot检测试剂、高通量测序试剂、基因芯片试剂或核酸印迹检测试剂。
进一步地，所述检测TKTmRNA水平的试剂为实时定量PCR检测试剂，所述实时定量PCR检测试剂包含引物序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
进一步地，所述检测TKTmRNA水平的试剂为Northern Blot检测试剂。
进一步地，所述检测TKTmRNA水平的试剂是检测人骨髓中浆细胞中TKT mRNA的试剂。
本发明还提供了一种多发性骨髓瘤筛查试剂盒，它包括用于检测TKTmRNA的试剂。
进一步地，所述检测TKTmRNA水平的试剂包括实时定量PCR检测试剂、NorthernBlot检测试剂、高通量测序试剂、基因芯片试剂或核酸印迹检测试剂。
进一步地，所述检测TKTmRNA水平的试剂为实时定量PCR检测试剂，所述实时定量PCR检测试剂包含引物序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
进一步地，所述检测TKTmRNA水平的试剂为Northern Blot检测试剂。
进一步地，所述检测TKTmRNA水平的试剂是检测人骨髓中浆细胞中TKTmRNA水平的试剂。
本发明有益效果：本发明的试剂盒可以通过检测骨髓中TKTmRNA的水平，可以筛查待检人群患多发性骨髓瘤的风险程度：若TKTmRNA水平低，则患有多发性骨髓瘤的风险低，若TKTmRNA水平高，则患有多发性骨髓瘤的风险高。本发明将检测TKTmRNA的试剂用于制备多发性骨髓瘤筛查试剂盒，该试剂盒具有高特异性和高敏感性，能够实现多发性骨髓瘤的有效筛查。本发明为患者采取相关的治疗措施或者决策提供有效的依据，临床应用前景良好。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1 为多发性骨髓瘤患者和意义未明的单克隆免疫球蛋白病(MGUS)的TKTmRNA表达水平结果图。
图2 为GSE6477数据库中健康对照（NC）、意义未明的单克隆免疫球蛋白病(MGUS)和多发性骨髓瘤（MM）之间TKTmRNA的表达水平图。
图3 GSE6477数据库中健康对照（NC）为对照的ROC曲线图。
图4 GSE6477数据库中意义未明的单克隆免疫球蛋白病(MGUS)为对照的ROC曲线图。
具体实施方式
本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
MGUS是指意义未明的单克隆免疫球蛋白病（Monoclonal Gammopathy ofUndetermined Significance）。这是一种良性的浆细胞瘤，其特点是在血液中存在低水平的M蛋白，但不会引起明显的体征或症状。MGUS有可能会发展为多发性骨髓瘤。
实施例1、实时定量PCR（qPCR）检测骨髓浆细胞中TKTmRNA水平与多发性骨髓瘤的关系
一、实验方法
（一）样本采集和处理
1、样本采集
研究对象为收集7名意义未明的单克隆免疫球蛋白病（MGUS）患者，12名多发性骨髓瘤患者的骨髓样本。MGUS和多发性骨髓瘤的诊断按照国际骨髓瘤工作组（IMWG）指南（2014年版）和中国多发性骨髓瘤诊治指南（2022年修订）的诊断标准进行诊断和确认，上述MGUS和多发性骨髓瘤患者均招募自四川省人民医院。受试者的基础信息见表1：
表1受试者的基础信息
| 基本信息 | MGUS | 多发性骨髓瘤 |
| 人数（n） | 7 | 12 |
| 平均年龄（Y） | 43 | 67 |
| 男性比例（%） | 57.1 | 75 |
2、实验处理
2.1骨髓样本采集
常规无菌条件下行骨髓穿刺采集患者骨髓1-2ml于EDTA抗凝的紫头采血管中，颠倒混匀。
2.2骨髓浆细胞分离
向EDTA抗凝骨髓样本中加入20μL CD138+磁珠试剂（美天旎生物科技公司）对浆细胞进行标记，置于4℃冰箱15min。
将磁珠分选柱安装在分选器上，加3ml PBS缓冲液于磁珠分选柱，待PBS完全通过分选柱后加入孵育好的样本进行分选。重复加入两次PBS缓冲液3ml过柱。
取下分选柱加入3ml PBS缓冲液，快推分选柱活塞芯杆进行洗脱，重复洗脱3次，洗脱液装入10ml离心管离心（3000r/min，10min）。离心后保留200μl上清液与沉淀，混合装入1.5ml EP管，所得样本为骨髓中分离的浆细胞。
（二）mRNA核酸提取和扩增
使用TRIzol提取上步中分离的骨髓浆细胞的mRNA，并测定mRNA浓度和纯度。
对浓度和纯度符合要求的mRNA使用逆转录试剂盒将mRNA合成cDNA。
使用qPCR试剂盒对合成的cDNA进行定量扩增分析。
使用2-ΔΔCq方法计算相对表达量。
TKT的引物序列如下：
TKT正向5'-3'（SEQ ID NO.1）：ACTTCGACAAGGCCAGCTAC；
TKT反向5'-3'（SEQ ID NO.2）：GCTGTGTCCATCCACGATGA。
二、实验结果
多发性骨髓瘤患者和意义未明的单克隆免疫球蛋白病(MGUS)的TKTmRNA水平实验结果如图1。可以看出，多发性骨髓瘤患者分离浆细胞（CD138+）检测TKTmRNA的水平，明显高于意义未明的单克隆免疫球蛋白病(MGUS) 患者分离浆细胞（CD138+）检测TKTmRNA的水平。
实验结果表明，本发明通过实验检测患者分离的浆细胞中TKTmRNA的水平，证实了TKTmRNA可以作为多发性骨髓瘤的标志物，可以为患者采取相关治疗措施或决策提供有效的依据。
实施例2、TKTmRNA在GSE6477（数据库）中表达
一、实验方法
通过选取数据库中骨髓瘤研究数据，分析骨髓瘤患者中TKTmRNA水平情况。数据来源于NCBI的GEO（Gene Expression Omnibus）数据库的数据GSE6477。研究分析健康对照（NC）、意义未明的单克隆免疫球蛋白病(MGUS)和多发性骨髓瘤（MM）之间TKTmRNA的表达差异。
二、实验结果
利用GSE6477数据库分析TKT mRNA水平结果如图2。GSE6477数据库中健康对照组（NC）12人，MGUS组共22人，多发性骨髓瘤组49人。
多发性骨髓瘤患者骨髓浆细胞中的TKT mRNA的平均水平为11.15，健康对照（NC）骨髓中TKT mRNA的平均水平为9.75。多发性骨髓瘤组与健康对照组 (p<0.0001)相比有统计学意义。多发性骨髓瘤组与健康对照组的 ROC 分析结果特异性为91.67%，敏感性为97.96%，表明TKT mRNA可特异地区分多发性骨髓瘤与健康对照，如图3。
MGUS患者骨髓中的TKTmRNA的平均水平为9.40。多发性骨髓瘤组与MGUS组 (p<0.0001)相比有统计学意义。多发性骨髓瘤组与健康对照组的 ROC 分析结果特异性为95.83%，敏感性为97.96%，表明TKTmRNA可特异地区分多发性骨髓瘤与MGUS，如图4。
实验结果表明，TKTmRNA可用于临床多发性骨髓瘤的辅助诊断。本发明并通实验和数据库分析，证实多发性骨髓瘤患者骨髓浆细胞中TKTmRNA水平明显高于正常人和MGUS患者，TKTmRNA可以作为多发性骨髓瘤的标志物，为患者采取相关的治疗措施或者决策提供有效的依据。
综上所述，本发明的试剂盒可以通过检测骨髓中TKTmRNA的水平，可以筛查待检人群患多发性骨髓瘤的风险程度：若TKTmRNA水平低，则患有多发性骨髓瘤的风险低，若TKT mRNA水平高，则患有多发性骨髓瘤的风险高。本发明将检测TKTmRNA的试剂用于制备多发性骨髓瘤筛查试剂盒，该试剂盒具有高特异性和高敏感性，能够实现多发性骨髓瘤的有效筛查。本发明为患者采取相关的治疗措施或者决策提供有效的依据，临床应用前景良好。
Claims (10)
1.检测TKT mRNA水平的试剂在制备多发性骨髓瘤筛查试剂盒中的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述检测TKTmRNA水平的试剂包括实时定量PCR检测试剂、Northern Blot检测试剂、高通量测序试剂、基因芯片试剂或核酸印迹检测试剂。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述检测TKTmRNA水平的试剂为实时定量PCR检测试剂，所述实时定量PCR检测试剂包含引物序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述检测TKTmRNA水平的试剂为NorthernBlot检测试剂。
5.如权利要求1~4任一所述的用途，其特征在于，所述检测TKTmRNA水平的试剂是检测人骨髓中浆细胞中TKT mRNA的试剂。
6.一种多发性骨髓瘤筛查试剂盒，其特征在于，它包括用于检测TKTmRNA的试剂。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述检测TKTmRNA水平的试剂包括实时定量PCR检测试剂、Northern Blot检测试剂、高通量测序试剂、基因芯片试剂或核酸印迹检测试剂。
8.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述检测TKTmRNA水平的试剂为实时定量PCR检测试剂，所述实时定量PCR检测试剂包含引物序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
9.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述检测TKTmRNA水平的试剂为NorthernBlot检测试剂。
10.如权利要求5~8任一所述的试剂盒，其特征在于，所述检测TKTmRNA水平的试剂是检测人骨髓中浆细胞中TKTmRNA水平的试剂。
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