CN115261476A - 筛选血清外泌体LncRNA HULC作为肝癌早期标记物的方法及其制备试剂盒的用途 - Google Patents

筛选血清外泌体LncRNA HULC作为肝癌早期标记物的方法及其制备试剂盒的用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种筛选血清外泌体LncRNA HULC作为肝癌早期标记物的方法及其制备试剂盒的用途。该筛选方法是通过定量RT‑PCR从基因水平的联合检测血清外泌体LncRNA HULC在早期肝癌患者血清中的变化，实现肝癌的早期标记物的优选和确定。该血清外泌体LncRNA HULC为肝癌早期标记物可以用于制备试剂盒。该试剂盒是包含HULC引物对的PCR试剂盒。本发明通过研究血清外泌体LncRNA HULC作为肝癌早期诊断标记物的价值，研发了肝癌早期诊断试剂盒，其作为体外诊断试剂，使用简便、快速、敏感性与特异性强，能够用于实现肝癌的早期诊断，提高肝癌患者的生存率，并且易于推广应用。

Description

筛选血清外泌体LncRNA HULC作为肝癌早期标记物的方法及 其制备试剂盒的用途
技术领域
本发明涉及一种生物医学领域的用于肝癌早期诊断的标记物及其制备试剂盒的方法与用途，具体地，涉及一种筛选血清外泌体LncRNA HULC作为肝癌早期标记物的方法及其制备试剂盒的用途。
背景技术
肝癌的恶性程度极高，被称为“癌中之王”。肝癌的早期症状很不典型，往往很容易被忽视，等出现明显的症状已是中晚期。目前临床肝癌诊疗中存在着早期诊断难、治疗缺乏针对性等问题。因此，对早期肝癌及肝癌标记物的研究和确定，特别是利用其制备灵敏有效的试剂盒，就尤为重要和迫切。
目前，国内外临床上常用的肝癌诊断标记物为甲胎蛋白(AFP)，但AFP诊断肝癌的敏感度和特异度并不十分理想。γ-谷氨酰转肽酶同工酶Ⅱ(GGTⅡ)在肝癌患者血清中明显升高，而在健康人体内几乎检测不到，曾被认为是HCC(肝细胞癌，hepatocellularcarcinoma)的特异性标志物，但用于诊断HCC的敏感性仅为43.8％，后续研究证实GGTⅡ在不同肝脏疾病中均有表达，特异性不强，限制了其临床应用。超声检查通常难以发现、确认小于3cm的肿块，且超声医师个体诊断水平的差异对诊断结果有很大影响。CT诊断费用较高，产生的辐射对患者具有一定影响，难以作为定期筛查方式推广应用。而MRI的诊断费用更高，目前也没有成为常规定期筛查方式。
因此，寻找诊断肝癌特别是早期肝癌的分子标记物，成为目前研究的重点和难点。早期诊断对肝癌患者的治疗、预后意义重大。在肝癌进展的不同阶段，肿瘤标志物的种类、数量和含量均发生变化，随着相关研究的深入，新的肝癌标志物不断被发现，而寻找灵敏、准确的肝癌标志物，制备使用方便的试剂盒，对于早期肝癌进行定性定量检测是十分必要的。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于肝癌早期诊断的标记物及其制备试剂盒的方法与用途，可以解决现有技术中存在的问题，得到简便、快速、敏感性与特异性强的标记物和试剂盒，能够用于肝癌早期诊断，提高肝癌患者的生存率，并且易于推广应用。
为了达到上述目的，本发明提供了一种筛选出血清外泌体LncRNA HULC作为肝癌早期标记物的方法，其中，该方法包含：步骤1，分离正常人及肝癌患者血清外泌体，并分别检测正常人血清和早期肝癌患者血清外泌体LncRNA的表达；步骤2，对正常人血清和早期肝癌患者血清外泌体LncRNA中差异表达的基因进行聚类分析，找到在肝癌患者血清外泌体LnCRNA中差异表达非常明显的基因，作为新的肝癌标志物的候选LncRNA；步骤3，对肝癌标志物的候选LncRNA在基因水平上进行鉴定，找到若干特异性和敏感性强的诊断基因，包括HULC；步骤4，对正常人群和肝癌患者血清进行检测，观察外泌体LnCRNA作为肝癌早期标记物的敏感性和特异性；步骤5，确定血清外泌体LncRNA HULC为肝癌早期标记物。
上述的筛选出血清外泌体LncRNA HULC作为肝癌早期标记物的方法，其中，所述的步骤1中，利用超高速离心分离正常人及肝癌患者血清外泌体。
上述的筛选出血清外泌体LncRNA HULC作为肝癌早期标记物的方法，其中，所述的步骤3中，利用荧光实时定量qRT-PCR和原位杂交，对肝癌标志物的候选LncRNA在基因水平上进行鉴定。
上述的筛选出血清外泌体LncRNA HULC作为肝癌早期标记物的方法，其中，所述的步骤4中，利用荧光实时定量qRT-PCR，对正常人群和肝癌患者血清进行检测。
本发明还提供了一种上述的血清外泌体LncRNA HULC作为肝癌早期标记物的用途，其中，所述的标记物用于制备试剂盒。
本发明也提供了一种利用上述的血清外泌体LncRNA HULC作为肝癌早期标记物制备的试剂盒，其中，所述的试剂盒是包含HULC引物对的PCR试剂盒。
上述的利用血清外泌体LncRNA HULC作为肝癌早期标记物制备的试剂盒，其中，所述的HULC引物对包括上游引物和下游引物；上游引物序列为：5’-GGGGTGGAACTCATGATGGAATTGG-3’；下游引物序列为：5’-GCCAGGAAACTTCTTGCTTGATGC-3’。
上述的利用血清外泌体LncRNA HULC作为肝癌早期标记物制备的试剂盒，其中，所述的试剂盒，在进行荧光实时定量PCR反应扩增时，PCR反应体系为：50℃，2min；95℃，15s，60℃，1min；35个循环；95℃，10min。
本发明提供的筛选血清外泌体LncRNA HULC作为肝癌早期标记物的方法及其制备试剂盒的用途具有以下优点：
本发明研究了血清外泌体LncRNA HULC作为肝癌早期诊断标记物的价值，并研发了肝癌早期诊断试剂盒。通过定量RT-PCR从基因水平的联合检测血清外泌体LncRNA HULC在早期肝癌患者血清中的变化，探讨血清外泌体LncRNA HULC波动规律与早期肝癌分期、分级的相关性，实现肝癌的早期标记物的优选和确定，利用其制备试剂盒，能够实现肝癌的早期有效诊断，并为临床实践提供依据。
使用本发明提供的试剂盒，在检测时只需抽取1毫升血，即可在数小时内得出结果，利于连续动态检测和人群的大规模筛查；要求简单、成本低，易于推广应用。特别是该试剂盒可用于诊断早期肝癌，利于早诊早治，提高肝癌患者的生存率。
附图说明
图1为本发明提供的利用该血清外泌体LncRNA HULC作为肝癌早期标记物制备的试剂盒的使用示意图。
图2为本发明实施例3中的差异表达非常明显的基因以及特异性和敏感性强的诊断基因筛选图。
图3为本发明实施例3中的血清外泌体HULC的相对CT值分布情况统计图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的具体实施方式作进一步地说明。
本发明提供的一种筛选出血清外泌体LncRNA HULC作为肝癌早期标记物的方法，其包含：
步骤1，分离正常人及肝癌患者血清外泌体，并分别检测正常人血清和早期肝癌患者血清外泌体LncRNA(Long non-coding RNA，长链非编码RNA)的表达。
长链非编码RNA是长度大于200个核苷酸的非编码RNA，其在剂量补偿效应(Dosagecompensationeffect)、表观遗传调控、细胞周期调控和细胞分化调控等众多生命活动中发挥重要作用，成为遗传学研究热点。
步骤2，对正常人血清和早期肝癌患者血清外泌体LncRNA中差异表达的基因进行聚类分析，找到在肝癌患者血清外泌体LnCRNA中差异表达非常明显的基因，作为新的肝癌标志物的候选LncRNA。
步骤3，对肝癌标志物的候选LncRNA在基因水平上进行鉴定，找到若干特异性和敏感性强的诊断基因，包括HULC。
HULC(highly up-regulated in liver cancer)，是一种在肝癌中呈异常上调表达的长链非编码RNA，因在肝癌中特异性高表达而被命名，并被认为其参与调控了肝癌细胞增殖、抗凋亡、侵袭及上皮间质化等诸多肿瘤恶性生物学行为。
步骤4，对正常人群和肝癌患者血清进行检测，观察外泌体LnCRNA作为肝癌早期标记物的敏感性和特异性。
步骤5，确定血清外泌体LncRNA HULC为肝癌早期标记物。
优选地，步骤1中利用超高速离心分离正常人及肝癌患者血清外泌体。
步骤3中利用荧光实时定量qRT-PCR(real-time quantitative PCR)和原位杂交，对肝癌标志物的候选LncRNA在基因水平上进行鉴定。
步骤4中利用荧光实时定量qRT-PCR，对正常人群和肝癌患者血清进行检测。
本发明还提供了该血清外泌体LncRNA HULC作为肝癌早期标记物的用途，该标记物用于制备试剂盒。
本发明也提供了利用该血清外泌体LncRNA HULC作为肝癌早期标记物制备的试剂盒，该试剂盒是包含HULC引物对的PCR试剂盒。
该HULC引物对包括上游引物和下游引物；上游引物序列为(F)：5’-GGGGTGGAACTCATGATGGAATTGG-3’(SEQ ID NO.1)；下游引物序列为(R)：5’-GCCAGGAAACTTCTTGCTTGATGC-3’(SEQ ID NO.2)。
该试剂盒在进行荧光实时定量PCR反应扩增时，PCR反应体系为：50℃，2min；95℃，15s，60℃，1min；35个循环；95℃，10min。
下面结合实施例对本发明提供的筛选血清外泌体LncRNA HULC作为肝癌早期标记物的方法及其制备试剂盒的用途做更进一步描述。
需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，均按照常规实验条件，或按照制造厂商说明书建议的条件。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
除非特殊说明，本发明所用术语具有本发明所属领域中的一般含义。
实施例1
一种筛选出血清外泌体LncRNA HULC作为肝癌早期标记物的方法，其包含：
步骤1，利用超高速离心分离正常人及肝癌患者血清外泌体，并分别检测正常人血清和早期肝癌患者血清外泌体的LncRNA的表达。
步骤2，对正常人血清和早期肝癌患者血清外泌体LncRNA中差异表达的基因进行聚类分析，找到在肝癌患者血清外泌体LnCRNA中差异表达非常明显的基因，作为新的肝癌标志物的候选LncRNA。
步骤3，利用荧光实时定量qRT-PCR和原位杂交，对肝癌标志物的候选LncRNA在基因水平上进行鉴定，找到若干特异性和敏感性强的诊断基因，包括HULC。
步骤4，利用荧光实时定量qRT-PCR，对正常人群和肝癌患者血清进行检测，观察外泌体LnCRNA作为肝癌早期标记物的敏感性和特异性。
步骤5，确定血清外泌体LncRNA HULC为肝癌早期标记物。
本实施例还提供了该血清外泌体LncRNA HULC作为肝癌早期标记物的用途，该标记物用于制备试剂盒。
实施例2
一种利用血清外泌体LncRNA HULC作为肝癌早期标记物制备的试剂盒，该试剂盒是包含HULC引物对的PCR试剂盒。
该试剂盒中还包含设有96个PCR加样孔1的PCR板2，使用时参见图1所示。
该HULC引物对是根据Genebank中的HULC LncRNA(AY914050.1)全序列，设计的HULC基因特异引物。包括上游引物和下游引物；上游引物序列为(F)：5’-GGGGTGGAACTCATGATGGAATTGG-3’(SEQ ID NO.1)；下游引物序列为(R)：5’-GCCAGGAAACTTCTTGCTTGATGC-3’(SEQ ID NO.2)。
该试剂盒在进行荧光实时定量PCR反应扩增时，PCR反应体系为：50℃，2min；95℃，15s，60℃，1min；35个循环；95℃，10min。
实施例3
一、研究对象。
选取55例早期肝癌患者为研究对象。
纳入标准：经手术病理、影像学证实，满足早期肝癌诊疗规范相关标准。
排除标准：并发肾病综合征、心力衰竭、结核等可引起血清肿瘤标志物升高者、妊娠、生殖***胚胎源性肿瘤、其他恶性肿瘤患者。
患者未进行放化疗治疗。
对照组：选取健康体检者67例。
两组性别、年龄等临床资料差异无统计学意义标本采集经医院伦理委员会审查批准，患者知情同意。
二、利用超高速离心技术分离正常人及肝癌患者血清外泌体，利用基因表达谱芯片技术检测正常人血清和早期肝癌患者血清外泌体。
1.每个试验对象取5ml外周血，300g，10min离心，吸取上层血浆至一新的离心管中。
2.加入5mlPBS，3000g离心10min；细胞培养液提取外泌体时，不加PBS，直接按此参数离心，此步骤是去除大颗粒物质和细胞碎片。
3.取上清至新管，4℃，9000g，30min离心，弃沉淀，去掉小颗粒物质。
4.上清液经0.22μm滤膜过滤，去沉淀，此步骤非常关键！可以去掉大分子蛋白，使外泌体的蛋白测定结果更准确。
5.超速离心，100,000g，150min，4℃离心，沉淀即为外泌体，加入150μlPBS重悬。
6.分别取10μl外泌体溶液按照BCA实验步骤测定蛋白浓度，粒径大小，流式测定表面抗原，透射电镜测定外泌体大小及形态。
三.利用生物信息学的方法对这些差异表达的基因进行聚类分析，找到一些新的在肝癌患者血清外泌体LnCRNA中差异表达非常明显的基因。通过荧光实时定量qRT-PCR、原位杂交等技术对新的肝癌的标志物在基因水平进行鉴定，找到几种新的特异性和敏感性强的诊断基因。把HULC作为新的肝癌诊断标志物的候选LncRNA。参见图2所示。
四、利用荧光实时定量qRT-PCR的方法对正常人群和肝癌患者血清进行检测，观察外泌体LnCRNA诊断肝癌敏感性和特异性。
1.将收集的外泌体加入0.5mlTrizol提取总RNA，检测总RNA的浓度和纯度，然后反转录成cDNA。
2.设计HULC引物对。
上游引物F：GGGGTGGAACTCATGATGGAATTGG，下游引物R：GCCAGGAAACTTCTTGCTTGATGC。
按PCR试剂盒的使用方式依次加样，然后上机进行Real-time PCR反应扩增反应。PCR反应体系：50℃，2min；95℃，10min；(95℃，15s，60℃，1min。35个循环)。
3.收集数据整理分析CT值，以CT值小于30为阳性诊断。
如图3所示，两组研究对象血清外泌体HULC的相对CT值分布情况(图1)，正常人血清外泌体HULC的相对CT值为42.13±4.69，而早期肝癌组外泌体HULC的相对CT值21.27±5.22，两组间差异具有统计学意义。其中53例早期肝癌患者血清外泌体HULC的相对CT值小于30，只要2例早期肝癌患者血清外泌体HULC的相对CT值大于30，阳性率96.3％左右。
在此基础上，还可以对外泌体LnCRNA的检测方法进行优化，得出简便、快速、敏感性与特异性强的肝癌早期诊断实验条件。
本发明的筛选血清外泌体LncRNA HULC作为肝癌早期标记物的方法及其制备试剂盒的用途，提供了一种体外诊断试剂，设计特异性引物，利用定量RT-PCR的方法来检测患者血清外泌体LncRNA HULC的相对表达量实现肝癌的早期诊断，适用于最一般的PCR仪。本发明所得的试剂盒，可以从基因层次提早诊断出未出现实体瘤的肝癌，比影像学等常见的肝癌诊断方法提前1～3年；对于早期肝癌诊断准确率提高，效果优于一般的血清学指标检查；只需抽取1mL血即可在数小时内得出结果，创伤性小，人力物力消耗小，利于连续动态检测和人群的大规模筛查。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

Claims (8)

1.一种筛选出血清外泌体LncRNA HULC作为肝癌早期标记物的方法，其特征在于，该方法包含：
步骤1，分离正常人及肝癌患者血清外泌体，并分别检测正常人血清和早期肝癌患者血清外泌体LncRNA的表达；
步骤2，对正常人血清和早期肝癌患者血清外泌体LncRNA中差异表达的基因进行聚类分析，找到在肝癌患者血清外泌体LnCRNA中差异表达明显的基因，作为新的肝癌标志物的候选LncRNA；
步骤3，对肝癌标志物的候选LncRNA在基因水平上进行鉴定，找到若干特异性和敏感性强的诊断基因，包括HULC；
步骤4，对正常人群和肝癌患者血清进行检测，观察外泌体LnCRNA作为肝癌早期标记物的敏感性和特异性；
步骤5，确定血清外泌体LncRNA HULC为肝癌早期标记物。
2.如权利要求1所述的筛选出血清外泌体LncRNA HULC作为肝癌早期标记物的方法，其特征在于，所述的步骤1中，利用超高速离心分离正常人及肝癌患者血清外泌体。
3.如权利要求1所述的筛选出血清外泌体LncRNA HULC作为肝癌早期标记物的方法，其特征在于，所述的步骤3中，利用荧光实时定量qRT-PCR和原位杂交，对肝癌标志物的候选LncRNA在基因水平上进行鉴定。
4.如权利要求1所述的筛选出血清外泌体LncRNA HULC作为肝癌早期标记物的方法，其特征在于，所述的步骤4中，利用荧光实时定量qRT-PCR，对正常人群和肝癌患者血清进行检测。
5.一种如权利要求1所述的血清外泌体LncRNA HULC作为肝癌早期标记物的用途，其特征在于，所述的标记物用于制备试剂盒。
6.一种利用如权利要求1所述的血清外泌体LncRNA HULC作为肝癌早期标记物制备的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒是包含HULC引物对的PCR试剂盒。
7.如权利要求6所述的利用血清外泌体LncRNA HULC作为肝癌早期标记物制备的试剂盒，其特征在于，所述的HULC引物对包括上游引物和下游引物；上游引物序列为：5’-GGGGTGGAACTCATGATGGAATTGG-3’；下游引物序列为：5’-GCCAGGAAACTTCTTGCTTGATGC-3’。
8.如权利要求6所述的利用血清外泌体LncRNA HULC作为肝癌早期标记物制备的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒，在进行荧光实时定量PCR反应扩增时，PCR反应体系为：50℃，2min；95℃，15s，60℃，1min；35个循环；95℃，10min。
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