CN117304247A

CN117304247A - 一种三萜类化合物及其制备方法与应用

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Publication number: CN117304247A
Application number: CN202311255868.1A
Authority: CN
Inventors: 王知斌; 杨德强; 闫梦麒; 吴丽红; 付新; 杨春娟
Original assignee: Heilongjiang University of Chinese Medicine
Current assignee: Heilongjiang University of Chinese Medicine
Priority date: 2023-09-27
Filing date: 2023-09-27
Publication date: 2023-12-29

Abstract

本发明公开了一种三萜类化合物，结构为(3β,6α,10α,12α,16β,24E)‑4‑methylol‑6,12‑bis(acetyloxy)‑3,10,16‑trihydroxy‑9,19‑cyclo‑9,10‑secolanosta‑9(11),24‑dien‑26‑ylβ‑D‑glucopyranoside。本发明通过对膜荚黄芪叶中单体成分进行分离及活性筛选，获得了具有抗癌活性的新的单体化合物，为膜荚黄芪叶的成分及药用活性的进一步深入研究提供了理论基础，同时也拓展了抗癌药物的天然植物资源。

Description

一种三萜类化合物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及天然药化领域，具体涉及一种新的三萜类化合物。

背景技术

结肠癌是一种常见的胃肠道恶性肿瘤，以结肠的储存、发酵、吸收、分泌和运动为特征，主要发生在直肠和乙状结肠交界处。到目前为止，结肠癌的治疗方法主要依赖于手术、化疗、放疗，以及生物与靶向治疗等手段。近年来，研发具有抗癌活性的中药化学成分成为开发有效治疗略的新途径，因其副作用小，多靶点，且不易产生耐药性而广受关注。选择天然、毒副作用小、使用安全的中草药防治癌症极具吸引力，将为防治日趋严重的结肠癌疾病的研究提供新途径和新方法。

中药膜荚黄芪为豆科植物膜荚黄芪Astragalus membranaceus(Fish.)Bge.的干燥根，具有补气升阳，益卫固表，利水消肿，托疮生肌等作用，在我国有大面积的种植和培养。其中含有的三萜皂苷和黄酮类成分，为普遍认可的中药膜荚黄芪中有效成分。目前对黄芪叶化学成分和药理作用研究较少，现有研究表明，黄芪叶中的皂苷成分与根中相似，总皂苷的含量是根的5.6倍，黄芪叶具有抗炎、保肝、抗衰老等作用。

但现有活性研究多针对多针对三萜皂苷总提取物的活性，鲜少有对单体化合物的活性研究。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的缺陷，通过对膜荚黄芪中的单体成分研究，拓展具有抗癌活性药物的范围。

为了达到上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一种三萜类化合物，结构式如下：

本发明还提供了上述三萜类化合物的制备方法，通过从膜荚黄芪叶中提取分离得到所述三萜类化合物。

进一步的，在部分实施例中，作为优选的，本发明三萜类化合物的制备方法包括以下步骤：取膜荚黄芪叶以纯甲醇加热回流提取，过滤，取提取液减压浓缩后得到浸膏；将浸膏用水混悬溶解，依次用石油醚、水饱和正丁醇萃取，取正丁醇萃取液减压浓缩获得正丁醇层；正丁醇层加水饱和正丁醇溶解，用0.1％NaOH水溶液调节PH为12，等体积萃取，将正丁醇层减压浓缩后得到浸膏，获得正丁醇碱层；取正丁醇碱层经正相硅胶柱层析，以二氯甲烷-甲醇溶剂体系进行梯度洗脱，经薄层色谱TLC和HPLC分析，合并相同馏分；再经反相ODS柱进行分离，以甲醇-水***梯度洗脱，反复经制备型HPLC色谱柱分离，以甲醇-水以54:46洗脱，即得所述三萜类化合物。

本发明还提供了上述三萜类化合物在制备治疗癌症药物方面的应用。

在部分实施例中，作为优选的，上述三萜类化合物在制备治疗结肠癌药物方面的应用。

本发明相比现有技术具有以下优点：

本发明通过对膜荚黄芪叶中单体成分的分离及活性筛选，获得了具有抗癌活性的新的单体化合物，为膜荚黄芪的成分及药用活性的进一步深入研究提供了理论基础，同时也拓展了抗癌药物的天然植物资源。

附图说明

图1为本发明三萜类化合物的结构式；

图2为本发明三萜类化合物的质谱图；

图3为本发明三萜类化合物的氢谱图；

图4为本发明三萜类化合物的碳谱图；

图5为本发明三萜类化合物的HSQC谱图；

图6为本发明三萜类化合物的HMBC谱图；

图7为本发明三萜类化合物的¹H-¹H COSY谱图；

图8为本发明三萜类化合物的NOESY谱图；

图9为化合物huangqiyenin G的结构式。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

本发明三萜类化合物的制备

取膜荚黄芪叶5.00kg，用适量纯甲醇加热回流提取3次，每次2h，纱布过滤，合并所有提取液，减压浓缩后得到浸膏(500.00g)。将浸膏用10L水混悬溶解，依次用石油醚、水饱和正丁醇萃取，分别减压浓缩后得到石油醚层(171.57g)，正丁醇层(296.35g)。正丁醇层加4L水饱和正丁醇溶解，用0.1％NaOH水溶液调节PH为12，等体积萃取3次，分别合并水层和正丁醇层，将正丁醇层减压浓缩后得到浸膏(105.00g)，命名为正丁醇碱层；将合并后的水层使用2％的HCL水溶液调节PH为2～3，水饱和正丁醇等体积萃取3次，正丁醇层减压浓缩后得到浸膏(153.00g)，命名为正丁醇酸层。取正丁醇碱层86.00g经正相硅胶柱层析，以二氯甲烷-甲醇(20:1-10:1-5:1-3:1-2:1-1:1-0:1)溶剂体系梯度洗脱，经薄层色谱TLC和HPLC分析，合并相同馏分得到Fr.1～Fr.11，共11个组分。Fr.7(12.40g)经反相ODS柱进行分离，以甲醇-水***洗脱(40％-50％-60％-70％-85％)，反复进制备型HPLC色谱柱，使用甲醇-水(54:46)洗脱，得到化合物astramembraoside J(15.00mg)，呈白色无定型粉末状，即为本发明三萜类化合物。

实施例2

化合物结构鉴定

对实施例1制备获得的化合物进行结构鉴定，谱图数据如下：

Tab.1 ¹H-NMR和¹³C-NMR data(δin ppm)of astramembraoside J(C₅D₅N)

结合图2至图7，HRESIMS m/z 813.6094[M+HCOO]^-,(calcd for 813.4273)，表明化合物中具有9个不饱和度。IR显示该化合物中存在羟基(3423cm^-1)、羰基(1709cm^-1)和双键(1640cm^-1)。从氢谱中可以观察到个7个甲基信号δ_H 1.03(3H,d,J＝6.7Hz,H-21),1.30(3H,s,H-18),1.37(3H,s,H-30),1.79(3H,s,H-28),1.80(3H,s,H-27),2.06(3H,s,6-CH₃CO)和2.17(3H,s,12-CH₃CO)；2个烯氢质子信号5.37(1H,br.s,H-11)和5.73(m,H-24)。在碳谱中观察到40个碳信号，包括7个甲基δ_C 12.2，14.0，14.6，18.8，22.1，22.2，28.7；10个亚甲基δ_C 26.2，29.5，33.1，37.3，43.5，47.4，63.2，71.0，75.6；15个次甲基δ_C 30.6，44.3，57.0，58.3，71.0，72.1，75.6，77.3，77.5，77.7，78.8，78.9，103.8，126.1，129.8；8个季碳δ_C41.5，49.2，50.3，72.8，132.2，140.8，170.7，171.1。没有观察到环丙烷上的H原子信号，这些数据表明该化合物为一个四环三萜。从碳谱中还可以看到一个葡萄糖端基H质子信号H-1'(δ_H 4.89,d,J＝7.7Hz)，从耦合常数可以确定葡萄糖为β构型。从H-19_α(δ_H 2.17-2.27,1H,m)到C-8(δ_C 44.3)，C-5(δ_C 58.3)和C-10(δ_C 72.8)的HMBC相关性表明，CH₂-19基团位于C-9和C-10之间。这些数据表明，该化合物是一种新的环芳烃型三萜，其环庚烷环是由环芳烃的9,10键断裂而产生的。从HMBC谱中还可以看到H-1'(δ_H 4.89,1H,d,J＝7.7Hz)和C-26(δ_C 75.6)相关，说明葡萄糖和C-26相连。该化合物和化合物huangqiyenin G(该化合物的结构式如图9所示)相比基本相似，不同点在于，C-4位上的CH₃被CH₂OH所取代，因此C-29(δ_C71.0)的化学位移像低场移动。从HMBC谱中可以看到12-CH₃CO(δ_H 2.17)和12-CH₃ CO(δ_C171.1)相关，11-H(δ_H 5.37)和12-CH₃ CO(δ_C 171.1)相关，可以推测出-CH₃COO和C-12相连，6-CH₃CO(δ_H 2.06)和6-CH₃ CO(δ_C 170.7)，C-6(δ_C 77.3)相关，可以推测出-CH₃COO和C-6相连。

同时将本发明化合物的NOESY谱和与huangqiyenin G的NMR数据比较，¹³C-NMR数据基本相同，表明该化合物和huangqiyenin G具有完全相同的侧链，这意味着C(24)＝C(25)键为E键，根据H-C(3)在δ_H 3.67(dd,J＝10.3,3.9)处的耦合常数，OH-在C-3的构型可以被赋值为β，从NOESY谱中可以观察到H-C(3)/Me(28)，H-C(3)/H-C(29)，H-C(29)/H-C(5),Me(30)/H-C(16),H-C(16)/H-C(17)，H-C(17)/H-C(12)，H-C(17)/Me-21,Me(18)/H-C(20),H-C(8)/Me(18),H-C(8)/H-C(6)，H-C(6)/H_β-C(19)，H-C(30)/H_β-C(19)说明H-C(3),CH₂OH-29,H-C(5),H-C(12),Me(28),H-C(16),H-C(17),Me(21)为α构型，Me(30)，H-C(6),H-C(8),Me(18)为β构型。此外，由于H-C(30)/H_β-C(19)，因此可以推断出CH₂-19位于A环的β位，所以OH-C(10)为α构型。该化合物的结构为(3β,6α,10α,12α,16β,24E)-4-methylol-6,12-bis(acetyloxy)-3,10,16-trihydroxy-9,19-cyclo-9,10-secolanosta-9(11),24-dien-26-ylβ-D-glucopyranoside，如图1所示，命名为astramembraoside J。

实施例3

药效活性

一、试验方法

1.细胞铺板：

①将细胞培养瓶从孵箱中取出，于显微镜下观察状态。

②将细胞放入超净台，3MLPBS洗涤，共洗两次。

③加入1.5mL胰酶，消化细胞，于显微镜下观察，等到细胞不成梭形且有少量悬浮时，用10％有双抗培养液停止消化，将细胞吹打20次，置入15mL离心管中。

④1000rpm离心5min，弃去上清液，加入10％有双抗培养液2mL吹打混匀，混合所有混匀后培养液，加至10mL，混匀。

⑤取10μL培养液，加至细胞计数板上，计数。

⑥铺板，每孔约为3000个细胞，在周围一圈每孔加200μLPBS。

2.细胞给药：

①配置药品母液，用培养基稀释成需要的浓度。

②吸出96孔板内液体，加300μLPBS洗2次。

③C组：每孔加200μL10％无双抗细胞培养液；

给药组，每孔加200μL不同梯度的药液。

④在周围一圈每孔加200μLPBS。

3.MTT实验：

①取MTT粉末4.8mg，配置MTT5mg/mL溶液0.96mL，，过滤膜，避光保存。②PBS300μL洗3次。

③每孔分别加180μLDMEM，20μLMTT溶液。

④在周围一圈每孔加200μLPBS。

⑤孵箱孵育4h。

⑥4h后吸出所有液体，加150μLDMSO复溶。

⑦避光状态下用摇床摇10min。

⑧用酶标仪562nm测吸光度。

二、试验结论

1、活性数据如下表：

表2

本发明三萜类化合物astramembraoside J对人结肠癌RKO细胞和HT-29细胞的抑制作用，和阳性药5-FU相比，化合物astramembraoside J对人结肠癌RKO细胞显示出较好的抑制作用，对HT-29细胞显示出中等的抑制作用，其IC₅₀值分别为73.8和87.5μmol/L。有望成为防治结肠癌的药物或保健产品，为充分利用黄芪叶丰富的天然植物资源提供重要的科学依据。

Claims

1.一种三萜类化合物，结构式如下：

2.权利要求1所述三萜类化合物的制备方法，通过从膜荚黄芪叶中提取分离得到所述三萜类化合物。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：取膜荚黄芪叶以纯甲醇加热回流提取，过滤，取提液减压浓缩后得到浸膏；将浸膏用水混悬溶解，依次用石油醚、水饱和正丁醇萃取，取正丁醇萃取液减压浓缩获得正丁醇层；正丁醇层加水饱和正丁醇溶解，用0.1％NaOH水溶液调节PH为12，等体积萃取，将正丁醇层减压浓缩后得到浸膏，获得正丁醇碱层；取正丁醇碱层经正相硅胶柱层析，以二氯甲烷-甲醇溶剂体系进行梯度洗脱，经薄层色谱TLC和HPLC分析，合并相同馏分；再经反相ODS柱进行分离，以甲醇-水***梯度洗脱，反复经制备型HPLC色谱柱分离，以甲醇-水以54:46洗脱，即得所述三萜类化合物。

4.权利要求1所述三萜类化合物在制备治疗癌症药物方面的应用。

5.权利要求1所述三萜类化合物在制备治疗结肠癌药物方面的应用。