CN117286080B - 一种改善***活力的益生菌及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种改善***活力的益生菌及应用，属于微生物技术领域，具体涉及以高、低***活力的公鸡为研究对象，通过16S rRNA测序技术分析肠道菌群差异与公鸡***品质的相关性；在公鸡回肠内容物中分离、筛选及鉴定，获得7种乳酸菌，分别为戊糖片球菌、约氏乳杆菌、卷曲乳杆菌、唾液乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、乳酸片球菌和屎肠球菌，其中唾液乳杆菌（保藏编号为CGMCC No.28410）为16S rRNA测序发现的差异益生菌。然后用不同益生菌对低***活力的24周龄公鸡和低***活力模型小鼠进行试验验证，结果表明，本发明获得的唾液乳杆菌能够有效改善***活力。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，特别涉及一种改善***活力的益生菌及应用。
背景技术
目前，人工授精技术在畜牧业的发展中发挥着十分重要的作用。雄性动物的繁殖力取决于***的产量和品质。其中***活力作为衡量***品质的关键指标，可影响***受精能力，对评估雄性动物繁殖能力具有重要意义。在种公鸡养殖过程中，采用人工授精技术可提高种公鸡的利用率及种蛋受精率，从而降低养殖成本并加快育种进程，因此对授精时的***品质要求更高。然而，在调查数据中发现大多数受精率较低的公鸡，其***活力也较低。如何提高公鸡***品质一直是困扰我国养鸡业的一项重大难题，因此提高***活力是当前的研究重点。
目前有研究表明，在种公鸡的饲粮中添加益生菌（主要成分为芽孢杆菌、乳酸菌和酵母菌）可提高***活力，对提高种公鸡的繁殖能力有一定的改善作用；鼠李糖乳杆菌和长双歧杆菌的联合服用可改善弱***男性的***活力；芽孢杆菌益生菌补充剂对公鸡***活力的提高也有一定的效果。但提高***活力的高效手段还有待开发，虽然已有部分研究证明益生菌有提高***活力的潜质，但仍缺少明显改善***活力的益生菌产品。现有技术CN116144536A虽然公开了一种复合菌，将其用于中药组合物的发酵，其发酵液能有效改善男性***活力，但并未对复合菌本身对***活力的功能进行验证；现有技术CN113975301A和CN115478029A分别公开小克里斯滕森氏菌和罗伊氏乳杆菌LRB5在***活力提升中的潜力，但是对于其他益生菌以及复合益生菌是否能够发挥功能仍未探究。因此，开发益生菌用于提高***活力具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明的目的是为了改善***活力，提供了一种益生菌。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供一种唾液乳杆菌，该菌株于2023年09月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，分类命名为唾液乳杆菌，Lactobacillus Salivarius，保藏编号为CGMCC No.28410。
本发明一方面提供包含上述唾液乳杆菌(Lactobacillus Salivarius)的菌剂。
所述菌剂为液体菌剂或固体菌剂，采用常规技术手段、加入微生物制剂领域允许的辅料制备得到。
本发明一方面提供一种改善***活力的益生菌，包含唾液乳杆菌，该菌株于2023年09月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，分类命名为唾液乳杆菌Lactobacillus Salivarius，保藏编号为CGMCC No.28410；其中活菌数不低于1×109CFU/mL，处理时间在4周以上。
本发明一方面提供一种益生菌组合物，其特征在于，包含唾液乳杆菌或唾液乳杆菌菌剂，以及其他的益生菌共同作用，用于改善***活力；其中唾液乳杆菌的活菌数不低于1×109CFU/mL，处理时间在4周以上。
本发明一方面是提供一种菌剂、一种改善***活力的益生菌、一种益生菌组合物的应用，包含在产品中改善***活力的应用。
本发明一方面利用高***活力公鸡回肠内容物，经过分离、筛选及鉴定，获得7种乳酸菌，分别为戊糖片球菌、约氏乳杆菌、卷曲乳杆菌、唾液乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、乳酸片球菌和屎肠球菌。
其中唾液乳杆菌（保藏编号为CGMCC No.28410）为16S rRNA测序分析肠道菌群差异与公鸡***品质相关性时发现的差异益生菌。
本发明一方面用不同益生菌对低***活力的24周龄公鸡和低***活力模型小鼠进行试验，验证获得的唾液乳杆菌能够有效改善***活力，其中唾液乳杆菌CGMCCNo.28410提高***活力的效果最显著。
本发明还提供一种益生菌组合物在制备改善***活力产品中的应用，其中包含前述益生菌。
本发明相比现有技术的有益效果为：
（1）本发明筛选获得一株益生菌，经鉴定为唾液乳杆菌，保藏编号为CGMCCNo.28410，于2023年09月08日保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心。
（2）本发明发现采用109CFU/mL唾液乳杆菌CGMCC No.28410和罗伊氏乳杆菌对低***活力的24周龄公鸡进行4周处理试验，结果显示益生菌对公鸡***活力提升具有显著效果，其中唾液乳杆菌CGMCC No.28410提高***活力的效果最显著，比对照组提高了55%。
（3）进一步通过实验证明，唾液乳杆菌CGMCC No.28410和罗伊氏乳杆菌对低***模型小鼠具有提升***活力的能力。
附图说明
图1 不同菌株对公鸡***活力的影响。CRT为对照，Poc为戊糖片球菌组，Lac为唾液乳杆菌组，Lrt为罗伊氏乳杆菌组，Pac为乳酸片球菌组。表示统计学意义上差异极其显著（P＜0.001）。/>表示统计学意义上差异极显著（P＜0.01）。#表示统计学意义上差异显著（P＜0.05）。
图2 不同菌株对棉酚处理后小鼠***活力的治疗效果。CRT为对照，Gy为棉酚处理组，Gy+Poc为棉酚和戊糖片球菌组，Gy+Lac为棉酚和唾液乳杆菌组，Gy+Lrt为棉酚和罗伊氏乳杆菌组，Gy+Pac为棉酚＋乳酸片球菌组。表示统计学意义上差异极其显著（P＜0.001）。/>表示统计学意义上差异极显著（P＜0.01）。/>表示统计学意义上差异显著（P＜0.05）。
具体实施方式
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。应当能够理解的是，以下实施例仅用于示例性地进一步详细解释和说明本发明的内容，而不用于限制本发明。
以下实施例中，致病性大肠杆菌源自实验室保藏菌；16S rRNA测序工作由上海派森诺生物科技股份有限公司完成；16S DNA测序由吉林省库美生物技术科技有限公司完成；MRS培养基来自北京酷来搏科技有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒来自天根生化科技有限公司；扩增聚合酶（NEB），琼脂糖，生理盐水以及其他化学试剂等均购自正规供应商。
实施例1、公鸡***活力测定与分组
在正式试验开始的前2周对公鸡进行***训练，采用腹背联合按摩法收集公鸡***。正式试验时收集的***样品于30 min内送到实验室，对所有试验公鸡的***活力进行试验。即用移液器吸取10 µL新鲜***于1.5 mL试管中，沿试管壁缓慢加入等温的生理盐水，稀释***至500 µL，然后轻轻转动，混匀，使之成为50倍稀释***。取稀释好的中层***10 µL于载玻片上，盖片后，在高倍显微镜下检测，记录视野中呈直线前进运动的***数即为***活力。
选出30只公鸡并按照***活力将其分为高***活力组（IH组）和低***活力组（IL组），每组各15只。其中高***活力公鸡的平均***活力为66.67±1.60%，低***活力公鸡的平均***活力为31.33±2.56%。结果如表1表示，髙***活力组的有效***数极显著高于低***活力组（P<0.01）。
表1 不同***活力公鸡的***品质指标
注：数字表示为平均值±标准误，同行中大写字母不同代表差异极显著（P<0.01）。
实施例2、不同***活力组肠道菌群的差异
以实施例1筛选出的高、低***活力公鸡为研究对象，收集高、低***活力公鸡回肠及盲肠内容物，并通过16S rRNA测序对两组公鸡回肠和盲肠的菌群结构进行研究，分析高、低***活力公鸡肠道菌群的物种组成并筛选出差异益生菌。
具体过程为：随机屠宰高***活力公鸡和低***活力公鸡各6只，收集其回肠及盲肠内容物于无菌冻存管中，液氮速冻后置于-80℃保存备用。将采集的回肠及盲肠内容物样本送至上海派森诺生物科技股份有限公司，经过微生物总DNA提取、PCR扩增，并利用Illumina平台对DNA片段进行双端测序。原始数据经过去引物、质量过滤及嵌合体检查等步骤后进行生物信息学分析，包括序列处理分析、Alpha多样分析、Beta多样分析、物种差异分析及物种组成分析等。分析结果显示，1）高、低***活力公鸡回肠及盲肠的菌群多样性均无差异；回肠的菌群结构组成在两组间差异性较大，而盲肠菌群结构组成差异性较小；2）在回肠门水平中，高***活力公鸡厚壁菌门的相对丰度显著高于低***活力公鸡；在属水平上，乳杆菌属作为高***活力公鸡的优势菌属，其相对丰度极显著高于低***活力组，且乳杆菌属与***活力呈正相关；在种水平上，瑞士乳杆菌、唾液乳杆菌的相对丰度在低***活力组中极显著降低，***乳杆菌相对丰度显著降低；3）在盲肠门水平中，两组公鸡的厚壁菌门无显著差异；属水平上，高***活力公鸡乳杆菌属的相对丰度极显著高于低***活力公鸡，其与***活力呈正相关；种水平上，***乳杆菌的相对丰度在低***活力组中极显著降低，盲肠肠球菌显著升高。
其中乳杆菌属（Lactobacillus）、肠球菌属（Enterococcaceae_Enterococcus）、螺杆菌属（Helicobacter）和志贺氏菌属（Shigella）是IH组的主要优势菌属，这四种菌属的相对丰度在IH组回肠内容物中的占比总和高达85.66%，其中乳杆菌属占69.60%、肠球菌属占7.44%、螺杆菌属占4.39%、志贺氏菌属占4.23%。
实施例3、益生菌的分离、筛选及鉴定
以高***活力公鸡的回肠内容物为研究对象，采用MRS培养基分离肠道内容物中的细菌，通过抑菌试验进行筛选，并利用16s rDNA进行菌种鉴定，为后续的益生菌饲喂改善公鸡***品质提供试验材料。
首先，试验过程中随机屠宰6只高***活力公鸡，使用酒精对动物体表进行消毒，用无菌手术剪刀剪开动物腹腔并取出回肠，用镊子无菌收集回肠内容物于含有生理盐水的10 mL离心管中。使用旋涡振荡器将内容物与生理盐水充分混匀，制备菌液。
然后，使用接种环沾取混合均匀的菌液并在MRS固体培养基上均匀划线，放入37℃的恒温培养箱中倒置培养18-24 h。在培养基上挑取形态不一样的单个菌落至含有MRS液体培养基的5 mL离心管中，使用振荡器混合均匀后放入恒温振荡器中培养18-24 h。混匀后用接种环沾取纯化后的菌液在MRS固体培养基上均匀划线并在37℃的恒温培养箱中倒置培养18-24 h，此过程重复三次。
将获得的细菌进行抑菌试验，即将冻存的致病性大肠杆菌在室温下自然解冻，用振荡器混合均匀后加到LB液体培养基中，再次混匀后于恒温振荡器中培养18-24 h，即为病原菌液；采用牛津杯法检测分离纯化的细菌对致病性大肠杆菌的抑制能力。在LB固体培养基上加入100 µL病原菌液并用三角玻璃棒涂抹均匀，再用镊子夹取3个牛津杯均匀放在培养基上，吸取240 µL纯化好的菌液加至牛津杯中，做好标记后放入37℃恒温培养箱培养18-24 h。培养完后使用游标卡尺测量抑菌圈直径。
上述试验结果显示，从6只高***活力公鸡回肠内容物中分离纯化出133株细菌。通过测量抑菌圈直径观察抑菌效果，其中直径≥ 20mm代表极度抑菌，20mm>直径≥ 15mm代表高度抑菌，15mm>直径≥ 10mm代表中度抑菌，直径<10mm代表没有抑菌效果。结果见表2，有9株细菌极度抑菌，21株细菌高度抑菌，46株细菌中度抑菌，57株细菌没有抑菌效果。
表2 菌株对大肠杆菌的抑菌效果
根据抑菌试验挑选出40株抑菌效果较好细菌提取细菌基因组DNA并进行PCR扩增，使用16s通用引物27F和1492R进行扩增。通过吉林省库美生物科技有限公司进行PCR产物测序，与NCBI中的BLAST进行对比分析。通过菌种鉴定确定39株菌均为乳酸菌，共有3种菌属，其中片球菌属12株，乳杆菌属26株，肠球菌属1株。具体鉴定结果见表3。根据鉴定结果可知，回肠内容物中乳酸菌种类较为丰富，且以乳杆菌为主。其中唾液乳杆菌与实施例2中16SrRNA测序发现的差异益生菌一致。经鉴定为唾液乳杆菌，保藏编号为CGMCC No.28410，于2023年09月08日保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心。
表3 回肠内容物细菌鉴定结果
实施例4、益生菌对公鸡***活力的影响
筛选低***活力的24周龄公鸡100只（随机分成5组，对照组，戊糖片球菌组，唾液乳杆菌组，罗伊氏乳杆菌组，乳酸片球菌组。每组20只鸡），分别饲喂四周后检测***活力。处理组采用灌注的方式，浓度为1×109CFU/Kg×body。
图1结果显示，与对照组相比，唾液乳杆菌组和罗伊氏乳杆菌组可以显著提高***活力，但二者之间存在显著差异。戊糖片球菌和乳酸片球菌组并没有显著差异。唾液乳杆菌饲喂后***活力由43.14%提高至66.95%，罗伊氏乳杆菌饲喂后***活力由43.14%提高至57.5%。综上，唾液乳杆菌提高***活力的效果最显著，比对照组提高了55%。
实施例5、益生菌对小鼠***活力的影响
将60只6周龄小鼠随机分为6组，每组10只，对照组饲喂标准饮食，处理组棉酚饲喂一个月，构建低***活力模型。棉酚处理采取灌胃的方式，每两天一次，灌胃浓度为15 mg/kg。
实验过程中共分6组，分别为正常饮食组；棉酚组；棉酚＋戊糖片球菌组；棉酚＋唾液乳杆菌组；棉酚＋罗伊氏乳杆菌组；棉酚＋乳酸片球菌组。益生菌灌胃浓度为4×109CFU/mL，每只小鼠灌胃0.25 mL，连续灌胃四周。灌胃四周后，采集小鼠***，取出小鼠的双侧附睾转移到含有２mL生理盐水的离心管中，用组织剪剪碎，在37℃恒温水浴锅中孵育15 min，取10 μL***悬液于***计数板上，用自动***分析仪检测***活力及运动学参数。结果如图2，棉酚处理构建低***模型后，唾液乳杆菌组与罗伊氏乳杆菌组具有显著的治疗作用，戊糖片球菌和乳酸片球菌并没有显著差异。唾液乳杆菌治疗后***活力由25.3%提高至45%，罗伊氏乳杆菌治疗后由25.3%提高至37.5%。与之前结果一致，唾液乳杆菌治疗效果最好，与对照组相比活力提高了77%。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种唾液乳杆菌，其特征在于，该菌株于2023年09月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，分类命名为唾液乳杆菌Lactobacillus Salivarius，保藏编号为CGMCC No.28410。
2.包含权利要求1所述的唾液乳杆菌的菌剂。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂为液体菌剂或固体菌剂，采用常规技术手段、加入微生物制剂领域允许的辅料制备得到。
4.一种改善***活力的益生菌，其特征在于，包含权利要求1的唾液乳杆菌，该菌株于2023年09月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，分类命名为唾液乳杆菌Lactobacillus Salivarius，保藏编号为CGMCC No.28410。
5.根据权利要求4所述的益生菌，其特征在于，活菌数不低于1×109 CFU/mL，处理时间在4周以上。
6.一种益生菌组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的唾液乳杆菌，或权利要求2所述的菌剂。
7.根据权利要求6所述的益生菌组合物，其特征在于，活菌数不低于1×109 CFU/mL，处理时间在4周以上。
8.权利要求6或7所述的益生菌组合物在制备改善***活力产品中的应用。
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