CN115181711A - 人乳杆菌lhm11及菌剂和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明是涉及微生物领域，具体涉及人乳杆菌LHM11及菌剂和应用。本发明的人乳杆菌(Lactobacillus hominis)M11能改善动物机体代谢，增加有益的代谢产物，从而增加睾丸有益代谢产物如视磺酸（调控***发生的起始），从而提高雄性动物的***质量和繁殖力；能在动物体内定植，并对人工胆盐、人工胃酸、人工肠液耐受能力强。
Description
技术领域
本发明是涉及微生物领域，具体涉及人乳杆菌LHM11及菌剂和应用。
背景技术
目前，雄性动物的雄性***不育率大幅度提高，主要是因为雄性生殖***更容易受环境因素的影响。然而现在还没有良好的方法改善***品质从而治疗雄性***不育。近年来研究发现肠道菌群与人及其他动物的健康息息相关，然而肠道菌群与雄性生殖轴的关系还没有确认，虽然已经有研究发现肠道菌群混合物可以改变雄性动物的***品质，有益的肠道有益菌群可以改善动物的***品质，但是还没有报道具体是哪种有益菌可以起到改善动物***品质，提高雄性动物繁殖力，也没有任何文献公开哪种具体的肠道菌可以提高雄性繁殖力。
发明内容
本发明的目的是提供一种人乳杆菌(Lactobacillus hominis) M11。
本发明的另一目的是提供包含上述人乳杆菌(Lactobacillus hominis) M11的菌剂。
本发明的另一目的是提供上述人乳杆菌(Lactobacillus hominis) M11的应用。
本发明的人乳杆菌M11，该菌株于2022年 7月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为人乳杆菌Lactobacillus hominis，保藏编号为CGMCC No.25327。
本发明提供含有人乳杆菌(Lactobacillus hominis) M11的菌剂，所述菌剂可以是液体菌剂或固体菌剂，采用常规技术手段、加入微生物制剂领域允许的辅料制备得到。
本发明提供了人乳杆菌(Lactobacillus hominis) M11用于制备以下用途的制剂的用途，
（1）改善肠道健康；
（2）改善血液及睾丸代谢组；
（3）增加雄性动物***浓度；
（4）增加雄性动物***活力；
（5）提高雄性动物交配成功率及交配的雌性动物怀孕率；和/或
（6）提高雄性动物交配的雌性动物产活仔数。
本发明的目的是提供一种人乳杆菌(Lactobacillus hominis) M11，该菌能改善动物机体代谢，增加有益的代谢产物，从而增加睾丸有益代谢产物如视磺酸（调控***发生的起始），从而提高雄性动物的***质量和繁殖力；而且人乳杆菌(Lactobacillus hominis) M11能在动物体内定植，并对人工胆盐、人工胃酸、人工肠液耐受能力强。
附图说明
图1为本发明的人乳杆菌(Lactobacillus hominis) M11的生长曲线(MRS培养基)；
图2显示本发明实施例2中试验小鼠在试验周期35天体重变化情况；
图3显示本发明实施例2中试验小鼠的***浓度；
图4显示本发明实施例2中试验小鼠的***活力；
图5显示本发明实施例2中试验小鼠的***顶体完整性；
图6显示本发明实施例2中试验小鼠的***的畸形率；
图7显示本发明实施例2中试验小鼠的怀孕率；
图8显示本发明实施例2中试验小鼠的产活仔数；
图9显示本发明实施例3中试验公猪的***量；
图10显示本发明实施例3中试验公猪***的浓度；
图11显示本发明实施例3中试验公猪***的活力；
图12显示本发明实施例3中试验公猪***的顶体完整性；
图13显示本发明实施例3中试验公猪***的畸形率；
图14显示本发明实施例4中试验公牛***的浓度；
图15显示本发明实施例4中试验公牛***的活力；
图16显示本发明实施例4中试验公牛***的顶体完整性；
图17显示本发明实施例4中试验公牛***的畸形率。
本发明的人乳杆菌M11，分类命名为人乳杆菌Lactobacillus hominis，该菌株于2022年 7月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.25327。
具体实施方式
本发明验证了人乳杆菌(Lactobacillus hominis) M11（以下实施例缩写为LHM11）对雄性动物繁殖力的有益作用，以白消安（Busulfan）建立小鼠弱精、少精症模型，发现该菌株能够提高***浓度、活力、顶体完整性，降低***畸形率，提高雄鼠与正常雌鼠交配的成功率，交配后母鼠的怀孕率、产活仔数。夏季高温高湿会导致公猪、公羊***品质下降，从而导致母猪、母羊怀孕率和产活仔数减少，LHM11可以提高夏季高温高湿状态下公猪和公羊的***浓度和活力、顶体完整性，降低***畸形率。
实施例1人乳杆菌(Lactobacillus hominis) M11的分离
1、菌株分离：人乳杆菌Lactobacillus hominis分离自肠道内容物。取肠道内容物，用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释，吸取合适稀释度的稀释液0.1mL在MRS琼脂上均匀涂布，37°C培养48h后， 将生长出的菌落通过平板划线接种到新的MRS固体培养基进行纯化培养48h。
2、菌株富集：将纯化培养后的菌株，在无菌操作台上用接种环逐一接种到无菌MRS肉汤培养基中，置于摇床中，37°C培养48h后进行16S rRNA鉴定，并将剩余部分与含有25%甘油的生理盐水混合，保存至-80°C冰箱。
3、16S rRNA鉴定：将富集后的菌液，使用细菌通用引物进行菌落PCR扩增后,进行16S rDNA测序鉴定，在NCBI上将各个菌株的16S rDNA序列与数据库中所有已测定细菌的16S rDNA序列进行比对，其中发现有5株与人乳杆菌属的Lactobacillus hominis JCM18988的16S rDNA 序列的同源相似性最高，相似度大于或等于99.8%，确定这5株菌种类别为人乳杆菌 (Lactobacillus hominis)。
实施例2人乳杆菌(Lactobacillus hominis) M11的特性检测
1、人乳球菌LHM11的微生物学特性如下:
（1）菌落形态：圆形单菌落，直径大约1~2mm，乳白色，不透明，菌落表面光滑有微微的凸起，边缘是规则的。
（2）染色后细菌形态呈现短杆状，无鞭毛，不能运动。
（3）生长特性：在MRS液体培养基中，置于37°C摇床培养，5小时后开始进入对数生长期，14h进入平台期，最大活菌数为3.09×108CFU/mL （图1）。
2、耐胆盐检测
将已活化并且菌液浓度在1×108CFU/mL的菌液，分别取1ml接种到9ml含猪胆盐浓度为0.3g/100mL的无菌生理盐水中，1h后采用平板涂布法测定活菌数。
结果显示（表1），在0.3g/100mL的胆盐浓度下，与其它4株人乳杆菌比较，人乳杆菌(Lactobacillus hominis)M11具有最好的耐胆盐能力，存活率在21.33%左右。
表1人乳杆菌在强胆盐0.3%浓度下的存活率%
3、耐人工胃液检测
将已活化并且菌液浓度在1×108CFU/mL的菌液，分别取1ml接种到9ml PH=1.5的人工胃液中，1h后采用平板涂布法测定活菌数。
结果显示（表2），在pH=1.5的人工胃液1h后，与其它4株人乳杆菌比较，LHM11具有最好的耐人工胃液能力，存活率在 20.15%左右。
表2人乳杆菌在pH=1.5的人工胃液中的存活率%
4、耐人工肠液检测
将已活化并且菌液浓度在1×108CFU/mL的菌液，分别取1ml接种到9ml pH=6.8的人工胃液中，4h后采用平板涂布法测定活菌数。
结果显示（表3），在人工肠液4h后，与其它4株人乳杆菌比较，LHM11具有最好的耐人工肠液能力，存活率在22.12%左右。
表3人乳杆菌在人工肠液的存活率%
实施例3人乳杆菌(Lactobacillus hominis) M11对白消安模型雄性小鼠繁殖力的影响
在确定人乳杆菌LHM11菌株具有最好的益生特性，保留人乳杆菌LHM11菌株用于后续实验。
一、实验方法
1、选取100只21日龄的ICR雄性小鼠，饲养于中国农业科学院动物科学研究所动物中心。试验过程中，将鼠房的温度控制在22±2℃，光照/黑暗时间为12小时，并自由取食和饮水。
2、将所有小鼠随机分为5组（每组20只小鼠）：对照组（Con组），白消安组（B组），B+LHM11(10^6)组，B+LHM11(10^8)组，B+LHM11(10^10)组。Con组：在试验过程中，每天灌胃一次0.1ml的生理盐水，为期14天；B组：在试验过程中，每天灌胃一次0.1ml的生理盐水，为期14天；B+LHM11(10^6)组：在试验过程中，每天灌胃一次0.1ml浓度为1×106CFU/mL的菌液，为期14天；B+LHM11(10^8)组：在试验过程中，每天灌胃一次0.1ml浓度为1×108CFU/mL的菌液，为期14天；B+LHM11(10^10)组：在试验过程中，每天灌胃一次0.1ml浓度为1×1010CFU/mL的菌液，为期14天。然后所有小鼠正常饲养21天（3周），不做任何处理，试验过程中，每天测量小鼠体重，观察并记录小鼠的状态，存活情况，有无临床异常症状等。总计35天后（14天+21天），第36天，每组随机选取10只小鼠，收集样品进行分析。每组剩余的10只小鼠与正常母鼠交配，每只公鼠与2只母鼠交配，交配4天。交配4天后母鼠单笼饲养，公鼠收样检测分析。交配21天后统计母鼠怀孕率，产活仔数。
二、检测指标
1、试验期间，每2天统计小鼠体重一次。
2、测量公鼠***浓度、活力、顶体完整性、畸形率。
3、交配21天后统计母鼠的怀孕率、产活仔数。
4、并检测公鼠的血液指标和睾丸代谢物。
三、实验结果
1、生长情况：整个试验中小鼠生长变化情况如图2所示，白消安导致小鼠体重增长变慢，从处理的第5天白消安组（B）的体重要低于对照组，而且一直到实验结束，白消安组体重显著低于对照组，而白消安处理后饲喂LHM11的3个组的体重要高于白消安组。
2、***浓度：如图3所示，白消安模型组小鼠的***浓度远远低于对照组，白消安处理后饲喂LHM11的3个组的***浓度远远高于百消安组，几乎达到对照组的水平。
3、***活力：如图4所示，白消安模型组小鼠的***活力远远低于对照组，白消安处理后饲喂LHM11的3个组的***活力远远高于百消安组，几乎达到对照组的水平。
4、***顶体完整性：如图5所示，白消安模型组小鼠的***顶体完整性变差，远远低于对照组，白消安处理后饲喂LHM11的3个组的***顶体完整性远远高于白消安组，几乎达到对照组的水平。
5、***畸形率：如图6所示，白消安模型组小鼠的***畸形率远远高于对照组，白消安处理后饲喂LHM11的3个组的***畸形率远远低于白消安组，与对照组的水平相当。
6、怀孕率：如图7所示，白消安模型组小鼠与正常母鼠交配后的怀孕率远远低于对照组，白消安处理后饲喂LHM11的3个组的小鼠与正常母鼠交配后的怀孕率远远高于白消安组，几乎达到对照组的水平。
7、产活仔数：如图8所示，白消安模型组小鼠与正常母鼠交配后，母鼠产活仔数远远少于对照组，白消安处理后饲喂LHM11的3个组的小鼠与正常母鼠交配后，母鼠产活仔数远远多于百消安组，几乎达到对照组的水平。
8、另外，对处理后的公鼠的血液和睾丸代谢物分析发现，白消安增加了血液及睾丸中有害代谢物，减少有益代谢物。而白消安处理后饲喂LHM11增加血液及睾丸有益代谢物如谷胱甘肽、视磺酸及总还原能力等。
实施例4人乳杆菌(Lactobacillus hominis) M11对公猪***品质的影响
一、实验方法
选用公猪站里健康公猪40头（2 ~ 3岁），体重大约300公斤（kg）。所有公猪分别被圈养在封闭的猪舍内，并提供商品饲料和自由饮水。猪圈环境保持清洁、通风，并定期消毒。实验在夏季的7，8月份。
所有公猪被随机分为4个组：对照组（Con）；LHM11(10^9)组；LHM11(10^12)组；LHM11(10^15)组；每组10头公猪。Con组：饲喂商用饲料；LHM11(10^9)组：饲喂商用饲料+109CFU/头/天乳杆菌LHM11；LHM11(10^12)组：饲喂商用饲料+1012CFU/头/天乳杆菌LHM11；LHM11(10^15)组：饲喂商用饲料+1015CFU/头/天乳杆菌LHM11；LHM11饲喂两周（14天），然后所有组饲喂商用饲料56天（总实验周期70天），每天饲喂2次，定量饲喂。试验过程中，观察并记录公猪的状态。70天后收取公猪***，并测试分析。
二、检测指标
1、试验期间，每天统计公猪的体征。
2、第71天开始检测公猪的***品质。
三、实验结果
1、***量：如图9所示，饲喂LHM11的3个组的***量多于对照组。
2、***浓度：如图10所示，饲喂LHM11的3个组的***浓度高于对照组。
3、***活力：如图11所示，饲喂LHM11的3个组的***活力高于对照组。
4、***顶体完整性：如图12所示，饲喂LHM11的3个组的***顶体完整性高于对照组。
5、***畸形率：如图13所示，饲喂LHM11的3个组的***畸形率低于对照组。
实施例5人乳杆菌(Lactobacillus hominis) M11对公牛***品质的影响
一、实验方法
选用健康公牛40只（2 ~ 3岁），体重大约1000公斤（kg）。所有公牛分别被圈养在封闭的牛舍内，并提供常规饲料（精料和草料）和自由饮水。牛圈环境保持清洁、通风，并定期消毒。实验在夏季的7，8月份。
所有公牛被随机分为4个组：对照组（Con）；LHM11(3×10^9)组；LHM11(3×10^12)组；LHM11(3×10^15)组；每组10只公牛。Con组：饲喂常规饲料；LHM11(3×10^8)组：饲喂常规饲料+3×109CFU/头/天乳杆菌LHM11；LHM11(3×10^12)组：饲喂常规饲料+3×1012CFU/头/天乳杆菌LHM11；LHM11(3×10^15)组：饲喂商用饲料+3×1015CFU/头/天乳杆菌LHM11；LHM11饲喂两周（14天），然后所有组饲喂商用饲料56天（总实验周期70天），定量饲喂。试验过程中，观察并记录公牛的状态。70天后收取公牛***，并测试分析。
二、检测指标
1、试验期间，每天统计公牛的体征。
2、第71天开始检测公牛的***品质。
三、实验结果
1、***浓度：如图14所示，饲喂LHM11的3个组的***浓度高于对照组；
2、***活力：如图15所示，饲喂LHM11的3个组的***活力高于对照组；
3、***顶体完整性：如图16所示，饲喂LHM11的3个组的***顶体完整性高于对照组；
4、***畸形率：如图17所示，饲喂LHM11的3个组的***畸形率低于对照组。
与同属种的人乳杆菌相比，LHM11最大的优势是具有提高雄性动物繁殖性能的特性。而且在人工胆盐、人工胃酸、人工肠液耐受能力强。
以上实施例仅用于解释本申请的技术方案，不限定本申请的保护范围。
Claims (4)
1.人乳杆菌(Lactobacillus hominis) M11，其特征在于，所述人乳杆菌(Lactobacillus hominis) M11的保藏编号为CGMCC No.25327。
2.包含权利要求1所述的人乳杆菌(Lactobacillus hominis) M11的菌剂。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂为液体菌剂或固体菌剂。
4.权利要求1所述的人乳杆菌(Lactobacillus hominis) M11用于制备以下用途的制剂的应用，
（1）改善肠道健康的制剂；
（2）改善血液及睾丸代谢组的制剂；
（3）增加雄性动物***浓度的制剂；
（4）增加雄性动物***活力的制剂；
（5）提高雄性动物交配成功率及交配的雌性动物怀孕率的制剂；和/或
（6）提高雄性动物交配的雌性动物产活仔数的制剂。
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