CN117187189B - 一种用于检测乌司奴单抗的杂交瘤细胞株组合和抗体组合及其应用 - Google Patents
一种用于检测乌司奴单抗的杂交瘤细胞株组合和抗体组合及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测乌司奴单抗的杂交瘤细胞株组合和抗体组合及其应用。本发明制备乌司奴（Fab）2片段免疫原，对小鼠进行免疫，筛选抗乌司奴（Fab）2片段独特型抗体，最后发现以抗体Ust‑B‑1为包被抗体，以Ust‑G‑10为检测抗体的配对方式具备更高的信噪比，即更好的灵敏度，采用该配对建立乌司奴单抗游离血液浓度的检测方法，同多种其他常用抗体药物均无交叉反应，特异性高，精确度高。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测乌司奴单抗的杂交瘤细胞株组合和抗体组合及其应用。
背景技术
乌司奴单克隆抗体（Ustekinumab），简称乌司奴单抗，是一种人源化单克隆抗体，针对白介素12和白介素23，调节免疫***和免疫介导的炎症性疾病的发生。在两个针对中重度牛皮癣的III期临床试验中显示Ustekinumab是安全有效的，最长时间为76周。Ustekinumab同样适用于治疗中度到重度斑块型银屑病、活动性银屑病和克罗恩病，通常需要更高的注射剂量。
临床疗效通常与治疗性抗体的浓度水平相关，监测治疗性抗体的浓度可为实现最优的治疗方案提供参考依据。然而，国内临床实践针对乌司奴单抗的血药浓度开展的监测方案很少，这与乌司奴单抗的血药浓度检测方法繁琐、人们缺乏血药浓度监测的意识等有关。乌司奴单抗的检测分析主要有ELISA法和LC-MS法，但LC-MS法分析时间较长，操作复杂，难以满足临床检验对高效能的要求，ELSIA法自动化程度低，测试时间长，满足不了临床高通量、快速准确的检测需求。
发明内容
本发明的目的在于弥补现有技术的不足，提供能简单快速的检测乌司奴单抗杂交瘤细胞株组合和抗体组合，以此提高乌司奴单抗检测的灵敏性、特异性和精密度。
为了实现上述目的，本发明提供了一种用于检测乌司奴单抗的杂交瘤细胞株组合，所述杂交瘤细胞株组合包括杂交瘤细胞株Ust-B-1和杂交瘤细胞株Ust-G-10；
所述杂交瘤细胞株Ust-B-1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45641；
所述杂交瘤细胞株Ust-G-10保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45640。
本发明还提供了一种检测乌司奴单抗的抗体组合，所述抗体组合包括包被抗体和检测抗体；
所述包被抗体包括杂交瘤细胞株Ust-B-1产生的抗体；所述杂交瘤细胞株Ust-B-1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45641；
所述检测抗体包括杂交瘤细胞株Ust-G-10产生的抗体；所述杂交瘤细胞株Ust-G-10保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45640。
本发明还提供了上述技术方案所述的杂交瘤细胞株组合或抗体组合在制备检测乌司奴单抗的产品中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述的杂交瘤细胞株组合或抗体组合在制备监测乌司奴单抗的血药浓度水平的产品中的应用。
本发明还提供了一种检测乌司奴单抗的试剂盒，所述试剂盒包括磁微粒工作液、抗体工作液和指示液；
所述磁微粒工作液包括包被抗体偶联磁微粒和磁珠缓冲液；所述包被抗体包括杂交瘤细胞株Ust-B-1产生的抗体；所述杂交瘤细胞株Ust-B-1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45641；
所述抗体工作液包括示踪物标记的检测抗体和抗体稀释液；所述检测抗体包括杂交瘤细胞株Ust-G-10产生的抗体；所述杂交瘤细胞株Ust-G-10保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45640。
优选的，所述磁微粒工作液中包被抗体偶联磁微粒的浓度为0.2~0.6mg/mL；
所述抗体工作液中示踪物标记的检测抗体的浓度为0.1~2μg/mL。
优选的，所述包被抗体偶联磁微粒中磁珠和包被抗体的质量比为（50~500）：1。
优选的，所述示踪物标记的检测抗体包括示踪物、检测抗体和偶联剂；
所述示踪物、检测抗体和偶联剂的质量比为1：（0.2~1）：（0.2~1）。
优选的，所述磁珠缓冲液包括TBST缓冲液；
所述抗体稀释液包括50mM 2-吗啉乙磺酸、5mg/mL牛血清白蛋白、0.9mg/mL氯化钠和1mM MgCl2；所述抗体稀释液的pH为6.7，溶剂为水；
所述指示液包括发光液；
所述示踪物包括碱性磷酸酶。
本发明还提供了一种非诊断和治疗目的的乌司奴单抗游离血液浓度的检测方法，包括如下步骤：
将待检测样品和不同浓度的标准品分别和磁微粒工作液混合，37℃孵育5min，去除上清，得到包被磁珠；将所述包被磁珠和抗体工作液混合，37℃孵育5min，去除上清，得到检测磁珠；将所述检测磁珠和发光液混合，统计发光值；
利用不同浓度的标准品测定的发光值建立标准曲线，将待检测样品的发光值带入所述标准曲线，即为所述待检测样品中乌司奴单抗游离血液浓度；
所述磁微粒工作液为上述技术方案所述试剂盒中的磁微粒工作液；
所述抗体工作液为上述技术方案所述试剂盒中的抗体工作液。
有益效果：
本发明提供了一种用于检测乌司奴单抗的杂交瘤细胞株组合，包括杂交瘤细胞株Ust-B-1和杂交瘤细胞株Ust-G-10；所述杂交瘤细胞株Ust-B-1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45641；所述杂交瘤细胞株Ust-G-10保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45640。利用本发明所述杂交瘤细胞株组合产生的抗体能够特异性检测乌司奴单抗，监测乌司奴单抗的血药浓度水平，实施例结果表明，利用所述杂交瘤细胞株组合产生的抗体进行检测时具备更高的信噪比（26），灵敏度高，并且在检测乌司奴单抗的过程中，同多种其他常用抗体药物均无交叉反应，特异性高，精确度高。
生物保藏信息
杂交瘤细胞株Ust-B-1，分类命名为杂交瘤细胞，于2023年07月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：中国，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号为CGMCC No.45641；
杂交瘤细胞株Ust-G-10，分类命名为杂交瘤细胞，于2023年07月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：中国，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号为CGMCC No.45640。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为乌司奴（Fab）2片段SDS-PAGE电泳图；
图2为磁微粒发光法检测乌司奴抗体游离血药浓度是的标准曲线。
具体实施方式
本发明提供了一种用于检测乌司奴单抗的杂交瘤细胞株组合，所述杂交瘤细胞株组合包括杂交瘤细胞株Ust-B-1和杂交瘤细胞株Ust-G-10；
所述杂交瘤细胞株Ust-B-1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45641；
所述杂交瘤细胞株Ust-G-10保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45640。
本发明还提供了一种检测乌司奴单抗的抗体组合，所述抗体组合包括包被抗体和检测抗体；
所述包被抗体包括杂交瘤细胞株Ust-B-1产生的抗体；所述杂交瘤细胞株Ust-B-1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45641；
所述检测抗体包括杂交瘤细胞株Ust-G-10产生的抗体；所述杂交瘤细胞株Ust-G-10保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45640。
本发明利用杂交瘤细胞株Ust-B-1产生的抗体作为包被抗体，以杂交瘤细胞株Ust-G-10产生的抗体为检测抗体特异性检测乌司奴单抗，具备更高的信噪比，即更好的灵敏度，在检测乌司奴单抗的过程中，同多种其他临床常用抗体药物均无交叉反应，特异性高。
根据本发明杂交瘤细胞株组合和抗体组合的优势，所述杂交瘤细胞株组合或抗体组合在制备检测乌司奴单抗的产品和/或监测乌司奴单抗的血药浓度水平的产品中的应用同样属于本发明的保护范围。在本发明中，所述产品优选包括试剂盒，进一步优选包括磁微粒化学发光检测试剂盒。
本发明还提供了一种检测乌司奴单抗的试剂盒，所述试剂盒包括磁微粒工作液、抗体工作液和指示液；
所述磁微粒工作液包括包被抗体偶联磁微粒和磁珠缓冲液；所述包被抗体包括杂交瘤细胞株Ust-B-1产生的抗体；所述杂交瘤细胞株Ust-B-1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45641；
所述抗体工作液包括示踪物标记的检测抗体和抗体稀释液；所述检测抗体包括杂交瘤细胞株Ust-G-10产生的抗体；所述杂交瘤细胞株Ust-G-10保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45640。
在本发明中，所述磁微粒工作液中包被抗体偶联磁微粒的浓度优选为0.2~0.6mg/mL，进一步优选为0.4mg/mL；所述包被抗体偶联磁微粒中磁珠和包被抗体的质量比优选为（50~500）：1，进一步优选为（50~100）：1，更优选为50：1。本发明所述磁珠优选包括Dynalbeads M280 Tosyl磁珠，购买自赛默飞生物制药（杭州）有限公司。本发明所述磁微粒缓冲液优选包括TBST缓冲液。
在本发明中，所述包被抗体偶联磁微粒的制备方法优选包括：将50mM pH 8.0的硼酸盐缓冲液和磁珠混合，得到磁珠缓冲液后和所述包被抗体混合，37℃震荡反应8h，磁吸去除上清，得到所述包被抗体偶联磁微粒。
在本发明中，所述抗体工作液中示踪物标记的检测抗体的浓度优选为0.1~2μg/mL，进一步优选为0.5~1.5μg/mL，最优选为1μg/mL。
在本发明中，所述示踪物标记的检测抗体优选包括示踪物、检测抗体和偶联剂；所述示踪物、检测抗体和偶联剂的质量比优选为1：（0.2~1）：（0.2~1），进一步优选为1：0.5：0.5。本发明所述示踪物优选包括碱性磷酸酶；所述偶联剂优选包括戊二醛。本发明优选将所述示踪物、检测抗体和偶联剂混合，室温混匀2h，得到所述示踪物标记的检测抗体。
在本发明中，所述抗体稀释液优选包括50mM MES、5mg/mL牛血清白蛋白、0.9mg/mL氯化钠和1mM MgCl2；所述抗体稀释液的pH优选为6.7，溶剂优选为水，进一步优选为超纯水。本发明所述指示液优选包括发光液，进一步优选为AMPPD发光液。
本发明还提供了一种非诊断和治疗目的的乌司奴单抗游离血液浓度的检测方法，包括如下步骤：
将待检测样品和不同浓度的标准品分别和磁微粒工作液混合，37℃孵育5min，后去除上清，得到包被磁珠；将所述包被磁珠和抗体工作液混合，37℃孵育5min，去除上清，得到检测磁珠；将所述检测磁珠和发光液混合，统计发光值；
利用不同浓度的标准品测定的发光值建立标准曲线，将待检测样品的发光值带入所述标准曲线，即为所述待检测样品中乌司奴单抗游离血液浓度；
所述磁微粒工作液为上述技术方案所述试剂盒中的磁微粒工作液；
所述抗体工作液为上述技术方案所述试剂盒中的抗体工作液。
本发明优选将检测样品和磁微粒工作液混合，37℃孵育5min，后去除上清，得到包被磁珠；将所述包被磁珠和抗体工作液混合，37℃孵育5min，去除上清，得到检测磁珠；将所述检测磁珠和发光液混合，统计发光值。
本发明优选将不同浓度的标准品分别和磁微粒工作液混合，37℃孵育5min，后去除上清，得到包被磁珠；将所述包被磁珠和抗体工作液混合，37℃孵育5min，去除上清，得到检测磁珠；将所述检测磁珠和发光液混合，统计发光值。
本发明利用不同浓度的标准品测量的发光值以及对应的浓度建立标准曲线，将所述待检测样品的发光值带入所述标准曲线，即为所述待检测样品中乌司奴单抗游离血液浓度。
本发明利用所述磁微粒工作液孵育待检测样品，磁微粒工作液中的包被抗体Ust-B-1能够包被待检测样品中的乌司奴单抗，后续利用抗体工作液中的检测抗体Ust-G-10与包被抗体Ust-B-1配对，通过检测发光值，实现乌司奴单抗游离血液浓度的检测。
基于本发明提供的试剂盒和检测方法能够特异性检测乌司奴单抗，实施例结果表明，在检测乌司奴单抗的同时，同多种其他临床常用抗体药物均无交叉反应，特异性高，并且精密度高。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种用于检测乌司奴单抗的杂交瘤细胞株组合和抗体组合及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
以乌司奴单抗的抗原结合片段（（Fab）2片段，即轻链Fab+重链Fab片段）为免疫原，其中（Fab）2片段免疫原的制备，由如下步骤组成：
（1）将20mg乌司奴抗体用20mM 磷酸盐缓冲液（PB，pH7.4）稀释到5mg/mL，总体积4mL，加入2mg IdeZ蛋白酶（购买自北京德奥平生物技术有限公司），37℃孵育30min，得到孵育产物；
（2）利用ProteinA柱吸附步骤（1）所得孵育产物中未反应的全长抗体和切割下的Fc段，得到第一产物；利用Ni亲和层析去除第一产物中的IdeZ酶，收集流穿液，采用OD280测定浓度，-20℃冷冻保存；
以乌司奴抗体（记为抗体）、IdeZ蛋白酶（记为IdeZ）和流穿液（记为酶切产物）为样品，进行SDS-PAGE鉴定，结果如图1所示。
根据图1可以看出，对全长的乌司奴抗体切割后所得酶切产物中，含有乌司奴（Fab）2片段。在SDS-PAGE上可以看到轻链Fab和重链Fab。
实施例2
抗乌司奴（Fab）2片段独特型抗体的制备
抗乌司奴独特型单克隆抗体的制备采用杂交瘤细胞融合技术，具体步骤为：
收集实施例1酶切产物中的乌司奴（Fab）2片段，用PBS缓冲液将乌司奴（Fab）2片段稀释到1mg/mL，加入等体积的弗氏完全佐剂，乳化完全，对小鼠按照0.1mg乌司奴（Fab）2片段/只的剂量进行首次免疫；间隔4周后，取1mg/mL的乌司奴（Fab）2片段稀释液，同弗式不完全佐剂等体积混合乳化后，对一免后的小鼠按照0.1mg乌司奴（Fab）2片段/只的剂量进行第二次免疫；
3天后，取第二次免疫脾细胞同Sp2/0细胞融合，获得多株杂交瘤细胞并进行编号；采用乌司奴单抗（2μg/mL）包被ELISA 96孔板，对杂交瘤细胞的培养上清，进行效价测定，对效价检测阳性的克隆再进行竞争性筛选：
竞争性筛选采用乌司奴抗体药物（2μg/mL）包被ELISA 96孔板，每孔50μL，加入5μg/mL IL-23蛋白和5μg/mL IL-12蛋白，以及杂交瘤细胞的培养上清，采用常规ELISA方法，测定OD450值。选取细胞效价测定强阳性，同时竞争性筛选弱阳性或阴性的克隆，最终筛选到9个产生竞争性抗乌司奴独特型抗体的杂交瘤细胞，具体信息如表1所示。
表1 抗乌司奴（Fab）2片段独特型抗体效价检测
注：OD450＞1为强阳性，OD450≤0.3为弱阳性或阴性。
实施例3
配对抗体的筛选；
以实施例2得到的抗体为样品，分别作为包被抗体或检测抗体，采用棋盘法筛选配对抗体，共计9*8=72个配对方式；其中检测抗体和HRP（辣根过氧化物酶）偶联，得到乌司奴独特型抗体-HRP偶联物：
采用包被抗体（2μg/mL）包被ELISA 96孔板，加入5μg/mL的乌司奴单抗，每孔50μL，反应30min后，用PBST清洗3次，加入2μg/mL抗乌司奴独特型抗体-HRP偶联物，每孔50μL，反应30min后，用PBST清洗3次，加入TMB显色液，采用酶标仪读取OD450值，结果记为S5；同时设置不添加乌司奴药物的处理方式作为对照，酶标仪读取OD450值，结果记为S0，计算信噪比（S/N）。本次筛选有且仅有2种配对方式实现有效配对，具体信息如表2。
表2 配对抗体的筛选结果
根据表2可以看出，以抗体Ust-B-1为包被抗体，以Ust-G-10为检测抗体的配对方式具备更高的信噪比，即更好的灵敏度，后续采用该配对进行乌司奴单抗游离血液浓度检测方法的建立，将产生抗体Ust-B-1的杂交瘤细胞Ust-B-1，以及产生抗体Ust-G-10的杂交瘤细胞Ust-G-10分别进行保藏。
实施例4
一种乌司奴抗体的游离血液浓度的检测方法的建立（微粒发光法）
1.磁微粒工作液的配制
将50mg Dynal beads M280 Tosyl磁珠，稀释在2mL 50mM pH8.0的硼酸盐缓冲液中，加入1mg实施例3中杂交瘤细胞Ust-B-1产生的抗乌司奴Ust-B-1抗体，混匀后，37℃震荡反应8h；磁吸去除上清，加入TBST（50mM Tris、0.9wt% NaCl、0.1wt% TW20和余量的超纯水，pH7.4），37℃反应12h；磁吸去除上清，加入TBST，稀释到0.4mg/mL，得到磁微粒工作液，2~8℃保存待用。
2.抗体工作液的配制
1mg碱性磷酸酶（ALP）溶解在1mL PBS中，加入0.5mg实施例3中杂交瘤细胞Ust-G-10产生的抗乌司奴的抗体Ust-G-10，混合均匀，加入10μL 50wt.%的戊二醛溶液，室温混匀2h，透析到PBS中，用抗体稀释液（50mM MES、0.9wt.% NaCl、5mg/mL BSA、1mM MgCl2和余量的超纯水，pH 6.7）稀释到1μg/mL，得到抗体工作液。
3.标准曲线的绘制
利用未经过乌司奴单抗治疗的人血清基质稀释乌司奴单抗，配置不同浓度的乌司奴校准品（乌司奴单抗的浓度依次为0、0.5、2、5、20和50μg/mL）；
利用PBS对校准品进行10倍稀释，取10μL稀释后的校准品和50μL步骤1得到的磁微粒工作液混合5min后清洗，去除上清，再加入50μL步骤2得到的抗体工作液，37℃孵育反应5min，清洗，去除上清，加入AMPPD发光液显色，统计发光值，绘制标准曲线，结果如表3和图2所示。
表3 微粒发光法乌司奴单抗游离血药浓度标准曲线数据
根据表3和图2，磁微粒发光法得到的标准曲线为：四参数方程式：Y = (A - D) /[1 + (X/C)B] + D；其中：A=12980.69043；B=0.97545528；C=104691.0234；D=21257211904；相关系数R2：0.999。
4.精密度检测：利用未经过乌司奴单抗治疗的人血清基质稀释乌司奴单抗，配制高和低两个浓度的乌司奴单抗溶液，按照步骤3的方式，检测两个浓度高和低两个浓度的乌司奴单抗溶液的发光值，在一次实验中每个浓度点测10孔（依次编号1~10），并按照SD/Mean计算批内变异系数（CV），其中高浓度乌司奴单抗溶液中乌司奴单抗的浓度为10.0μg/mL；低浓度乌司奴单抗溶液中乌司奴单抗的浓度为2.0μg/mL；
取10μL待检测样品和50μL步骤1得到的磁微粒工作液混合5min后清洗，去除上清，再加入50μL步骤2得到的抗体工作液，37℃孵育反应5min，清洗，去除上清，加入AMPPD发光液显色，统计发光值，代入步骤3标准曲线，计算乌司奴单抗浓度，结果如表4所示。
表4 精密度检测结果
根据表4可以看出，采用Ust-B-1/Ust-G-10配对抗体制备的磁微粒发光法对乌司奴单抗浓度进行测定时精密度高，可以用于乌司奴单抗的含量测定。
5.交叉反应检测
选择5种交叉反应物（人IgG1蛋白、依那西普蛋白、阿达木单抗、戈利木单抗和英夫利昔单抗），利用未经过乌司奴单抗治疗的人血清基质稀释乌司奴单抗，配制高和低两个浓度的乌司奴单抗溶液，其中高浓度乌司奴单抗溶液中乌司奴单抗的浓度为30μg/mL；低浓度乌司奴单抗溶液中乌司奴单抗的浓度为8μg/mL；在高和低浓度的乌司奴单抗溶液中分别添加上述交叉反应物中的任意一种，使交叉反应物的终浓度为50μg/mL，作为待检测样品，计算交叉反应率；
取10μL待检测样品和50μL步骤1得到的磁微粒工作液混合5min后清洗，去除上清，再加入50μL步骤2得到的抗体工作液，37℃孵育反应5min，清洗，去除上清，加入AMPPD发光液显色，统计发光值，代入步骤3标准曲线，计算乌司奴单抗浓度，按照下述公式计算交叉反应率，结果如表5所示；
交叉反应率=（实测浓度-理论浓度）/交叉反应物浓度×100%；
其中，实测浓度为测量所得待检测样品中乌司奴单抗的浓度；理论浓度为制备待测检测样品时添加的乌司奴单抗的浓度，即8μg/mL或30μg/mL；交叉反应物浓度浓度为制备待测检测样品时添加的交叉反应物的浓度，即50μg/mL。
表5 交叉反应结果
根据表5可以看出，本发明采用Ust-B-1/Ust-G-10配对抗体建立的磁微粒发光法检测乌司奴单抗浓度时，同多种其他临床常用抗体药物均无交叉反应，特异性高。
根据上述内容可以看出，本发明采用Ust-B-1/Ust-G-10配对抗体对乌司奴单抗进行检测时具有较高的灵敏度、特异性和精密度，能够满足乌司奴单抗的检测要求。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.一种用于检测乌司奴单抗的杂交瘤细胞株组合，其特征在于，所述杂交瘤细胞株组合包括杂交瘤细胞株Ust-B-1和杂交瘤细胞株Ust-G-10；
所述杂交瘤细胞株Ust-B-1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45641；
所述杂交瘤细胞株Ust-G-10保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45640。
2.一种检测乌司奴单抗的抗体组合，其特征在于，所述抗体组合包括包被抗体和检测抗体；
所述包被抗体为杂交瘤细胞株Ust-B-1产生的抗体；所述杂交瘤细胞株Ust-B-1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45641；
所述检测抗体为杂交瘤细胞株Ust-G-10产生的抗体；所述杂交瘤细胞株Ust-G-10保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45640。
3.权利要求1所述的杂交瘤细胞株组合或权利要求2所述的抗体组合在制备检测乌司奴单抗的产品中的应用。
4.权利要求1所述的杂交瘤细胞株组合或权利要求2所述的抗体组合在制备监测乌司奴单抗的血药浓度水平的产品中的应用。
5.一种检测乌司奴单抗的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括磁微粒工作液、抗体工作液和指示液；
所述磁微粒工作液包括包被抗体偶联磁微粒和磁珠缓冲液；所述包被抗体为杂交瘤细胞株Ust-B-1产生的抗体；所述杂交瘤细胞株Ust-B-1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45641；
所述抗体工作液包括示踪物标记的检测抗体和抗体稀释液；所述检测抗体为杂交瘤细胞株Ust-G-10产生的抗体；所述杂交瘤细胞株Ust-G-10保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45640。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述磁微粒工作液中包被抗体偶联磁微粒的浓度为0.2~0.6mg/mL；
所述抗体工作液中示踪物标记的检测抗体的浓度为0.1~2μg/mL。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述包被抗体偶联磁微粒中磁珠和包被抗体的质量比为（50~500）：1。
8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述示踪物标记的检测抗体包括示踪物、检测抗体和偶联剂；
所述示踪物、检测抗体和偶联剂的质量比为1：（0.2~1）：（0.2~1）。
9.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述磁珠缓冲液包括TBST缓冲液；
所述抗体稀释液包括50mM 2-吗啉乙磺酸、5mg/mL牛血清白蛋白、0.9mg/mL氯化钠和1mM MgCl2；所述抗体稀释液的pH为6.7，溶剂为水；
所述指示液包括发光液；
所述示踪物包括碱性磷酸酶。
10.一种非诊断和治疗目的的乌司奴单抗游离血液浓度的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
将待检测样品和不同浓度的标准品分别和磁微粒工作液混合，37℃孵育5min，去除上清，得到包被磁珠；将所述包被磁珠和抗体工作液混合，37℃孵育5min，去除上清，得到检测磁珠；将所述检测磁珠和发光液混合，统计发光值；
利用不同浓度的标准品测定的发光值建立标准曲线，将待检测样品的发光值带入所述标准曲线，即得所述待检测样品中乌司奴单抗游离血液浓度；
所述磁微粒工作液为权利要求5~9任一项所述试剂盒中的磁微粒工作液；
所述抗体工作液为权利要求5~9任一项所述试剂盒中的抗体工作液。
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013055404A1 (en) * | 2011-10-10 | 2013-04-18 | City Of Hope | Meditopes and meditope-binding antibodies and uses thereof |
| CN112852743A (zh) * | 2021-01-25 | 2021-05-28 | 江苏荃信生物医药有限公司 | 用于生产乌司奴单抗的生物类似药的细胞株及生产方法 |
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| CN114874160A (zh) * | 2022-07-11 | 2022-08-09 | 北京丹大生物技术有限公司 | 多西紫杉醇衍生物、多西紫杉醇人工抗原、杂交瘤细胞株、多西紫杉醇单克隆抗体及应用 |
-
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013055404A1 (en) * | 2011-10-10 | 2013-04-18 | City Of Hope | Meditopes and meditope-binding antibodies and uses thereof |
| CN112852743A (zh) * | 2021-01-25 | 2021-05-28 | 江苏荃信生物医药有限公司 | 用于生产乌司奴单抗的生物类似药的细胞株及生产方法 |
| CN114264827A (zh) * | 2021-12-30 | 2022-04-01 | 苏州和锐生物科技有限公司 | 一种白介素生物制剂的抗体检测试剂盒及制备方法 |
| CN114874160A (zh) * | 2022-07-11 | 2022-08-09 | 北京丹大生物技术有限公司 | 多西紫杉醇衍生物、多西紫杉醇人工抗原、杂交瘤细胞株、多西紫杉醇单克隆抗体及应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Mining human antibody repertoires;Beerli, Roger R.等;《MABS》;20100701;第2卷(第4期);第365-378页 * |
| 单克隆抗体药物概述;李雅婷等;《生物学教学》;20230808;第48卷(第8期);第2-4页 * |
Also Published As
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