CN117177999B - 一种靶向IL-18Rβ的抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种针对IL‑18Rβ的抗体或其抗原结合片段、其制备方法及其应用。具体地，本发明还提供了编码上述抗体或其抗原结合片段的核酸分子、相应的表达载体和能够表达该抗体或其抗原结合片段的宿主细胞，以及本发明抗体或其抗原结合片段的生产方法及应用。本发明的针对IL‑18Rβ的抗体或其抗原结合片段能够特异性结合人IL‑18Rβ，且亲和力远远高出野生型抗体，同时具有良好的IL‑18/IL‑18R阻断活性。本发明抗体或其抗原结合片段为与IL‑18受体异常表达有关或与IL‑18信号通路高活性有关疾病的预防/诊断/治疗提供了新的技术手段。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种特异性靶向IL-18Rβ的抗体及其抗原结合片段、其制备方法和应用。
背景技术
白细胞介素18(Interleukin-18，IL-18)，也称为干扰素-γ诱导因子，调控多种类型免疫细胞介导的炎症反应。IL-18不仅激活Thl细胞和NK细胞促进IFN-γ释放，而且调控Th2，Th17和巨噬细胞的激活，是一个重要的炎症促进因子。
多项研究发现，IL-18与多种自身免疫疾病密切相关，如噬血细胞性淋巴组织增生症(Hemophagocytic lymphohistiocytosis，HLH)、巨噬细胞活化综合征、特应性皮炎、特发性肺纤维化、硬皮症、全身型幼年特发性关节炎(Systemic juvenile idiopathicarthritis，sJIA)、***性红白狼疮(Systemic lupus erythematosus，SLE)、和炎症性肠炎等。
IL-18受体是异源二聚体跨膜蛋白，其由结合配体的IL-18R alpha(IL-18Rα)亚基和对功能性信号传导至关重要的IL-18R beta(IL-18Rβ)亚基组成。
IL-18经蛋白酶Caspas-1水解成活性形式后，作用于细胞表面的IL-18受体，激活下游促炎信号通路。IL-18先以较低亲和力与IL-18Rα结合形成二聚体，但并不能传递信号，只有该二聚体和IL-18Rβ结合形成高亲和力受体复合物才能向下游传递促炎信号。阻断IL-18及其受体三元复合物的形成，有效抑制IL-18下游致炎性信号通路，是目前治疗自身免疫疾病和炎症疾病一个很有前途的方法。
IL-18Rα广泛表达，且还能和炎症抑制因子IL-37结合，在炎症调控作用中比较复杂。IL-18Rβ特异表达于免疫细胞，且是IL-18传递信号必须的受体，因此靶向IL-18Rβ抗体能够特异且有效的抑制IL-18信号。由于体内天然存在IL-18高亲和力decoy receptor IL-18BP，以及膜结合形式IL-18的存在，靶向IL-18本身受多方面影响，作用机制比较复杂。综合而言，靶向IL-18Rβ抗体相对于IL-18信号通路其他成分，在特异性、有效性和安全性方面具有优势。
因此，本领域迫切需要开发一种特异性靶向IL-18Rβ的抗体，用以治疗自身免疫疾病和炎症疾病等。
发明内容
本发明的目的在于提供一种自身免疫疾病和炎症疾病等的新型治疗手段。
本发明的又一目的在于提供一种针对IL-18Rβ的抗体及其应用。
在本发明的第一方面，提供了一种针对IL-18Rβ的抗体或其抗原结合片段。
在另一优选例中，所述抗体或其抗原结合片段能够特异性结合IL-18Rβ。
在另一优选例中，所述抗体或其抗原结合片段基于SEQ ID NO：18所示的野生型重链可变区和/或基于SEQ ID NO：20所示的野生型轻链可变区可包括选自下组的有益突变：F27L、F27I、F27V、S99A、S31F、A34D、A34E，或其组合。
在另一优选例中，所述抗体或其抗原结合片段还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个(如1-4个)氨基酸残基，并能保留与IL-18Rβ特异性结合能力的抗体或其抗原结合片段。
在另一优选例中，所述抗体或其抗原结合片段基于SEQ ID NO：18所示的野生型重链可变区可包括选自下组的有益突变：F27L、F27I、F27V、S99A，或其组合。
在另一优选例中，所述抗体或其抗原结合片段基于SEQ ID NO：20所示的野生型轻链可变区可包括选自下组的有益突变：S31F、A34D、A34E，或其组合。
在另一优选例中，所述抗体或其抗原结合片段基于SEQ ID NO：18所示的野生型重链可变区和/或基于SEQ ID NO：20所示的野生型轻链可变区具有选自下组的有益突变，或其组合：
S31F、A34E、F27L；
S31F、A34E、F27I、S99A；
A34D、F27I、S99A；
S31F、A34D、F27L；
A34E、F27I；
A34D、F27I；
A34E、F27L；
S31F、A34D、F27V、S99A；
A34E、F27L、S99A；或
S31F、A34E、F27L。
在另一个优选例中，所述抗体或其抗原结合片段基于SEQ ID NO：18所示的野生型重链可变区具有选自下组的有益突变：F27I、S99A，或其组合；和/或基于SEQ ID NO：20所示的野生型轻链可变区具有选自下组的有益突变：S31F、A34E，或其组合。
在另一个优选例中，所述抗体或其抗原结合片段基于SEQ ID NO：18所示的野生型重链可变区具有选自下组的有益突变：F27L；和/或基于SEQ ID NO：20所示的野生型轻链可变区具有选自下组的有益突变：S31F、A34D，或其组合。
在另一个优选例中，所述抗体或其抗原结合片段基于SEQ ID NO：18所示的野生型重链可变区具有选自下组的有益突变：F27I；和/或基于SEQ ID NO：20所示的野生型轻链可变区具有选自下组的有益突变：A34D。
在另一优选例中，所述抗体或其抗原结合片段包括：
(a)重链互补决定区CDRH1、CDRH2、CDRH3，所述CDRH1、CDRH2、CDRH3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：2、3和4所示，或者分别如SEQ ID NO：10、3和11所示，或者分别如SEQ IDNO：2、3和11所示；和
(b)轻链互补决定区CDRL1、CDRL2、CDRL3，所述CDRL1、CDRL2、CDRL3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：6、7和8所示，或者分别如SEQ ID NO：13、7和8所示，或者分别如SEQ IDNO：16、7和8所示，或者分别如SEQ ID NO：22、7和8所示。
在另一优选例中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个(如1-4个)氨基酸残基并能保留与IL-18Rβ特异性结合能力的衍生序列。
在另一优选例中，所述抗体或其抗原结合片段具有表1中A034、A035、A037、A038、或A039抗体的6个CDR(CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2、CDRL3)。
在另一优选例中，所述的经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留与IL-18Rβ特异性结合能力的衍生序列为同源性或序列相同性为至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述的CDR1、CDR2和CDR3由框架区FR1、FR2、FR3和FR4所隔开。
在另一优选例中，所述抗体或其抗原结合片段还包括框架区FR。
在另一优选例中，所述抗体或其抗原结合片段具有如SEQ ID NO：1、9或14所示的重链可变区，和具有如SEQ ID NO：5、12、15或17所示的轻链可变区。
在另一优选例中，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：5所示，或者分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：5所示，或者分别如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：12所示，或者分别如SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：17所示，或者分别如SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15所示。
在另一优选例中，所述抗体或其抗原结合片段具有如SEQ ID NO：24、26、28、30、32或34所示的重链序列，和具有如SEQ ID NO：25、27、29、31、33或35所示的轻链序列。
在另一优选例中，所述抗体或其抗原结合片段具有：
如SEQ ID NO：24所示的重链序列和SEQ ID NO：25所示的轻链序列；或
如SEQ ID NO：26所示的重链序列和SEQ ID NO：27所示的轻链序列；或
如SEQ ID NO：28所示的重链序列和SEQ ID NO：29所示的轻链序列；或
如SEQ ID NO：30所示的重链序列和SEQ ID NO：31所示的轻链序列；或
如SEQ ID NO：32所示的重链序列和SEQ ID NO：33所示的轻链序列；或
如SEQ ID NO：34所示的重链序列和SEQ ID NO：35所示的轻链序列。
在另一优选例中，所述抗体或其抗原结合片段的重链恒定区选自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区，优选地为IgG1或IgG4。
在另一优选例中，所述抗体或其抗原结合片段为鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体。
在另一优选例中，所述抗体或其抗原结合片段可包括单体、二价抗体、和/或多价抗体。
在另一优选例中，所述二价抗体还可以是双特异性抗体。
在另一优选例中，所述多价抗体还可以是多特异性抗体。
在另一优选例中，所述抗原结合片段选自scFv、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、二硫键连接的Fv(dsFv)，或sdAb。
在本发明的第二方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：
(i)如本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段；和
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
在另一优选例中，所述的标签序列包括Fc标签、HA标签、GGGS序列、FLAG标签、Myc标签、6His标签，或其组合。
在另一优选例中，所述的重组蛋白特异性结合IL-18Rβ。
在另一优选例中，所述的重组蛋白(或多肽)包括融合蛋白。
在另一优选例中，所述的重组蛋白为单体、二聚体，或多聚体。
在本发明的第三方面，提供一种核苷酸分子，所述多核苷酸编码选自下组的蛋白质：如本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段，或本发明第二方面所述的重组蛋白。
在另一优选例中，本发明的核酸可为RNA、DNA或cDNA。
在另一优选例中，所述核苷酸分子包括重链核苷酸序列和轻链核苷酸序列。
在另一优选例中，所述重链核苷酸序列选自SEQ ID NO：36、38、40、42、44、46，或其组合。
在另一优选例中，所述轻链核苷酸序列选自SEQ ID NO：37、39、41、43、45、47，或其组合。
在另一优选例中，所述核苷酸分子包括：如SEQ ID NO：36所示的重链核苷酸序列和如SEQ ID NO：37所示的轻链核苷酸序列；或如SEQ ID NO：38所示的重链核苷酸序列和如SEQ ID NO：39所示的轻链核苷酸序列；或如SEQ ID NO：40所示的重链核苷酸序列和如SEQID NO：41所示的轻链核苷酸序列；或如SEQ ID NO：42所示的重链核苷酸序列和如SEQ IDNO：43所示的轻链核苷酸序列；或如SEQ ID NO：44所示的重链核苷酸序列和如SEQ ID NO：45所示的轻链核苷酸序列；或如SEQ ID NO：46所示的重链核苷酸序列和如SEQ ID NO：47所示的轻链核苷酸序列。
在本发明的第四方面，提供一种表达载体，所述表达载体含有本发明的第三方面所述的核苷酸分子。
在另一优选例中，所述的表达载体选自下组：DNA、RNA、病毒载体、质粒、转座子、其他基因转移***、或其组合。优选地，所述表达载体包括病毒载体，如慢病毒、腺病毒、AAV病毒、逆转录病毒、或其组合。
在另一优选例中，所述的表达载体选自下组：pTomo慢病毒载体、plenti、pLVTH、pLJM1、pHCMV、pLBS.CAG、pHR、pLV等。
在另一优选例中，所述的表达载体中还包括选自下组的：启动子、转录增强元件WPRE、长末端重复序列LTR等。
在本发明的第五方面，提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明的第四方面所述的表达载体，或其基因组中整合有本发明的第三方面所述的核苷酸分子。
在另一优选例中，所述的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。
在另一优选例中，所述的宿主细胞选自下组：大肠杆菌、酵母细胞、哺乳动物细胞。
在本发明的第六方面，提供一种嵌合抗原受体CAR，所述CAR的抗原结合区scFv段为特异性结合于IL-18Rβ的结合区，并且，所述scFv的重链可变区包括：
重链互补决定区CDRH1、CDRH2、CDRH3，所述CDRH1、CDRH2、CDRH3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：2、3和4所示，或者分别如SEQ ID NO：10、3和11所示，或者分别如SEQ ID NO：2、3和11所示；和/或
所述scFv的轻链可变区包括：
轻链互补决定区CDRL1、CDRL2、CDRL3，所述CDRL1、CDRL2、CDRL3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：6、7和8所示，或者分别如SEQ ID NO：13、7和8所示，或者分别如SEQ ID NO：16、7和8所示，或者分别如SEQ ID NO：22、7和8所示。
在另一优选例中，所述CAR还包括信号肽。
在另一优选例中，所述CAR还包括其他的外源蛋白。
在另一优选例中，所述的CAR具有式Ia所示结构：
L-scFv-H-TM-C-CD3ζ (Ia)
式中，
L为无或信号肽序列；
scFv是特异性结合IL-18Rβ的结构域；
H为无或铰链区；
TM为跨膜结构域；
C为共刺激信号结构域；
CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列(包括野生型、或其突变体/修饰体)；
所述“-”连接肽或肽键。
在另一优选例中，所述L分别选自下组蛋白的信号肽：CD8、GM-CSF、CD4、CD28、CD137，或其突变/修饰体，或其组合。
在另一优选例中，所述scFv靶向IL-18Rβ。
在另一优选例中，所述scFv为IL-18Rβ抗体或其抗原结合片段。
在另一优选例中，所述H选自下组蛋白的铰链区：CD8、CD28、CD137、IgG，或其组合。
在另一优选例中，所述TM选自下组蛋白的跨膜区：CD28、CD3epsilon、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、CD278、CD152、CD279、CD233，或其突变/修饰体，或其组合。
在另一优选例中，所述C选自下组蛋白的共刺激结构域：OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD70、CD134、4-1BB(CD137)、PD-1、Dap10、LIGHT、NKG2C、B7-H3、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、NKG2D、GITR、OX40L、2B4、TLR，或其突变/修饰体，或其组合。
在本发明的第七方面，提供一种工程化免疫细胞，所述工程化免疫细胞表达外源的如本发明的第六方面所述的CAR。
在另一优选例中，所述工程化免疫细胞选自下组：
(i)嵌合抗原受体αβT细胞(CAR-T细胞)；
(ii)嵌合抗原受体γδT细胞(CAR-T细胞)；
(iii)嵌合抗原受体NKT细胞(CAR-NKT细胞)；
(iv)嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK细胞)。
在另一优选例中，所述工程化免疫细胞包括自体或异体的αβT细胞、γδT细胞、NKT细胞、NK细胞，或其组合。
在另一优选例中，所述工程化免疫细胞为CAR-T细胞。
在本发明的第八方面，提供一种产生针对IL-18Rβ的抗体或其抗原结合片段的方法，包括步骤：
(a)在适合的条件下，培养如本发明的第五方面所述的宿主细胞，从而获得含IL-18Rβ的抗体或其抗原结合片段的培养物；
(b)从所述培养物中分离和/或回收所述的针对IL-18Rβ的抗体或其抗原结合片段；和
(c)任选地，对步骤(b)获得的针对IL-18Rβ的抗体或其抗原结合片段进行纯化和/或修饰。
在本发明的第九方面，提供一种免疫偶联物，所述免疫偶联物含有：
(a)抗体部分，所述抗体部分包括如本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段；和
(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、金纳米颗粒/纳米棒、纳米磁粒、病毒外壳蛋白或VLP，或其组合。
在另一优选例中，所述的(a)部分与所述的偶联部分通过化学键或接头进行偶联。
在另一优选例中，所述的放射性核素包括：
(i)诊断用同位素，所述的诊断用同位素选自下组：Tc-99m、Ga-68、F-18、I-123、I-125、I-131、In-111、Ga-67、Cu-64、Zr-89、C-11、Lu-177、Re-188，或其组合；和/或
(ii)治疗用同位素，所述的治疗用同位素选自下组：Lu-177、Y-90、Ac-225、As-211、Bi-212、Bi-213、Cs-137、Cr-51、Co-60、Dy-165、Er-169、Fm-255、Au-198、Ho-166、I-125、I-131、Ir-192、Fe-59、Pb-212、Mo-99、Pd-103、P-32、K-42、Re-186、Re-188、Sm-153、Ra223、Ru-106、Na24、Sr89、Tb-149、Th-227、Xe-133、Yb-169、Yb-177，或其组合。
在另一优选例中，所述偶联部分为药物或毒素。
在另一优选例中，所述的药物为靶向治疗IL-18相关疾病的药物。
在另一优选例中，所述IL-18相关疾病包括IL-18高表达的疾病、与IL-18受体异常表达有关或与IL-18信号通路高活性有关的疾病、IL-18Rβ介导的疾病。
在另一优选例中，所述IL-18相关疾病为自身免疫疾病或炎性疾病。
在另一优选例中，所述IL-18相关疾病选自：肿瘤、白血病、糖尿病肾病、阿尔茨海默症、帕金森病、关节炎、类风湿性关节炎、多发性硬化症、银屑病、银屑病性关节炎、克罗恩病、炎性肠病、溃疡性结肠炎、狼疮、***性红斑狼疮、青少年类风湿性关节炎、青少年特发性关节炎、格雷夫氏病、桥本甲状腺炎、艾迪生病、乳糜泻、皮肌炎、多发性硬化症、重症肌无力、恶性贫血、干燥综合征、I型糖尿病、II型糖尿病、脉管炎、葡萄膜炎、脓毒症、动脉粥样硬化、强直性脊柱炎、噬血细胞性淋巴组织细胞增多症、巨噬细胞活化综合征、***性红斑狼疮、化脓性关节炎、坏疽性脓皮病、特应性皮炎、特发性肺纤维化、硬皮症、全身型幼年特发性关节炎(sJIA)、炎症性肠炎(IBD)、成人斯蒂尔病(Adult-onset Still′s disease，AOSD)、慢性阻塞性肺病(COPD)或肺结节，或其组合。
在另一优选例中，所述肿瘤选自：膀胱癌、肝癌、结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌、白血病、淋巴瘤、胰腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、尿道癌、头颈癌、胃肠道癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、肾癌、黑色素瘤、***癌、甲状腺癌，或其组合。
在另一优选例中，所述的药物为细胞毒性药物。
在另一优选例中，所述的细胞毒性药物选自下组：抗微管蛋白药物、DNA小沟结合试剂、DNA复制抑制剂、烷化试剂、抗生素、叶酸拮抗物、抗代谢药物、化疗增敏剂、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱，或其组合。
特别有用的细胞毒性药物类的例子包括，例如，DNA小沟结合试剂、DNA烷基化试剂、和微管蛋白抑制剂、典型的细胞毒性药物包括、例如奥瑞他汀(Auristatins)、喜树碱(Camptothecins)、多卡霉素/倍癌霉素(Duocarmycins)、依托泊甙(Etoposides)、美登木素(Maytansines)和美登素类化合物(Maytansinoids)(例如DM1和DM4)、紫杉烷(Taxanes)、苯二氮卓类(Benzodiazepines)或者含有苯二氮卓的药物(Benzodiazepine containingdrugs)(例如吡咯并[1，4]苯二氮卓类(PBDs)，吲哚啉苯并二氮卓类(Indolinobenzodiazepines)和噁唑烷并苯并二氮卓类(Oxazolidinobenzodiazepines))、长春花生物碱(Vinca alkaloids)，或其组合。
在另一优选例中，所述的毒素选自下组：耳他汀类(例如，耳他汀E、耳他汀F、MMAE和MMAF)、金霉素、类美坦西醇、篦麻毒素、篦麻毒素A-链、考布他汀、多卡米星、多拉司他汀、阿霉素、柔红霉素、紫杉醇、顺铂、cc1065、溴化乙锭、丝裂霉素、依托泊甙、替诺泊甙(Tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙素、二羟基炭疽菌素二酮、放线菌素、白喉毒素、假单胞菌外毒素(PE)A、PE40、相思豆毒素、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-八叠球菌、白树毒素、迈托毒素(Mitogellin)、局限曲菌素(Retstrictocin)、酚霉素、依诺霉素、麻疯树毒蛋白(Curicin)、巴豆毒素、卡奇霉素、肥皂草(Sapaonaria officinalis)抑制剂、糖皮质激素，或其组合。
在另一优选例中，所述偶联部分为可检测标记物。
在另一优选例中，所述偶联部分选自下组：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂，或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如IL-2等)、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))或任何形式的纳米颗粒。
在另一优选例中，所述免疫偶联物含有：多价(如二价)的如本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段。
在另一优选例中，所述多价是指在所述免疫偶联物的氨基酸序列中包含多个重复的相同或不同的如本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段。
在本发明的第十方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有：
(i)活性成分，所述活性成分选自下组：如本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段，或如本发明第二方面所述的重组蛋白，或如本发明第七方面所述的工程化免疫细胞，或如本发明第九方面所述的免疫偶联物，或其组合；和
(ii)药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在另一优选例中，所述药物组合物的剂型选自下组：注射剂、冻干剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物包括0.01～99.99％的如本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段，或如本发明第二方面所述的重组蛋白，或如本发明第七方面所述的工程化免疫细胞，或如本发明第九方面所述的免疫偶联物，或其组合和0.01～99.99％的药用载体，所述百分比为占所述药物组合物的质量百分比。
在另一优选例中，所述活性成分中所述工程化的免疫细胞的浓度为1×103-1×108个细胞/mL，较佳地1×104-1×107个细胞/mL。
在本发明的第十一方面，提供一种活性成分的用途，所述活性成分选自下组：如本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段，或如本发明第二方面所述的重组蛋白，或如本发明第七方面所述的工程化免疫细胞，或如本发明第九方面所述的免疫偶联物，或其组合，所述活性成分被用于制备：
(a)预防和/或治疗IL-18相关疾病的药物；
(b)检测IL-18相关疾病的试剂。
在另一优选例中，所示试剂为诊断试剂，较佳地，所述的诊断试剂为检测片或检测板。
在另一优选例中，所述诊断试剂用于：检测样品中的IL-18Rβ蛋白或其片段。
在另一优选例中，所述IL-18相关疾病包括IL-18高表达的疾病、与IL-18受体异常表达有关或与IL-18信号通路高活性有关的疾病、IL-18Rβ介导的疾病。
在另一优选例中，所述IL-18相关疾病为自身免疫疾病或炎性疾病。
在另一优选例中，所述IL-18高表达的疾病选自：肿瘤、白血病、糖尿病肾病、阿尔茨海默症、帕金森病、关节炎、类风湿性关节炎、多发性硬化症、银屑病、银屑病性关节炎、克罗恩病、炎性肠病、溃疡性结肠炎、狼疮、***性红斑狼疮、青少年类风湿性关节炎、青少年特发性关节炎、格雷夫氏病、桥本甲状腺炎、艾迪生病、乳糜泻、皮肌炎、多发性硬化症、重症肌无力、恶性贫血、干燥综合征、I型糖尿病、II型糖尿病、脉管炎、葡萄膜炎、脓毒症、动脉粥样硬化、强直性脊柱炎、噬血细胞性淋巴组织细胞增多症、巨噬细胞活化综合征、***性红斑狼疮、化脓性关节炎、坏疽性脓皮病、特应性皮炎、特发性肺纤维化、硬皮症、全身型幼年特发性关节炎(sJIA)、炎症性肠炎(IBD)、成人斯蒂尔病(Adult-onset Still′s disease，AOSD)、慢性阻塞性肺病(COPD)或肺结节，或其组合。
在另一优选例中，所述肿瘤选自：膀胱癌、肝癌、结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌、白血病、淋巴瘤、胰腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、尿道癌、头颈癌、胃肠道癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、肾癌、黑色素瘤、***癌、甲状腺癌，或其组合。
在本发明的第十二方面，提供了一种体外检测样品中IL-18Rβ蛋白或其片段的方法，所述方法包括步骤：
(1)在体外，将所述样品与如本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段接触；
(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在IL-18Rβ蛋白或其片段的对应靶点。
在另一优选例中，所述的检测包括诊断性的或非诊断性的。
本发明的第十三方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒中包括：
(1)第一容器，所述第一容器中含有如本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段，或如本发明第二方面所述的重组蛋白，或如本发明第七方面所述的工程化免疫细胞，或如本发明第九方面所述的免疫偶联物，或如本发明第十方面所述的药物组合物，或其组合；和/或
(2)第二容器，所述第二容器中含有抗所述第一容器内容物的二抗；
或者，
所述试剂盒含有一检测板，所述检测板包括：基片(支撑板)和测试条，所述的测试条含有如本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段，或如本发明第二方面所述的重组蛋白，或如本发明第七方面所述的工程化免疫细胞，或如本发明第九方面所述的免疫偶联物，或如本发明第十方面所述的药物组合物，或其组合。
在另一优选例中，所述试剂盒中还含有一说明书，根据所述的说明书记载，所述的试剂盒用于非侵入性地检测待测对象的IL-18Rβ的表达。
在另一优选例中，所述的试剂盒用于IL-18相关疾病的检测。
在另一优选例中，所述IL-18相关疾病包括IL-18高表达的疾病、与IL-18受体异常表达有关或与IL-18信号通路高活性有关的疾病、IL-18Rβ介导的疾病。
在另一优选例中，所述IL-18相关疾病选自：肿瘤、白血病、糖尿病肾病、阿尔茨海默症、帕金森病、关节炎、类风湿性关节炎、多发性硬化症、银屑病、银屑病性关节炎、克罗恩病、炎性肠病、溃疡性结肠炎、狼疮、***性红斑狼疮、青少年类风湿性关节炎、青少年特发性关节炎、格雷夫氏病、桥本甲状腺炎、艾迪生病、乳糜泻、皮肌炎、多发性硬化症、重症肌无力、恶性贫血、干燥综合征、I型糖尿病、II型糖尿病、脉管炎、葡萄膜炎、脓毒症、动脉粥样硬化、强直性脊柱炎、噬血细胞性淋巴组织细胞增多症、巨噬细胞活化综合征、***性红斑狼疮、化脓性关节炎、坏疽性脓皮病、特应性皮炎、特发性肺纤维化、硬皮症、全身型幼年特发性关节炎(sJIA)、炎症性肠炎(IBD)、成人斯蒂尔病(Adult-onset Still′s disease，AOSD)、慢性阻塞性肺病(COPD)或肺结节，或其组合。
在另一优选例中，所述肿瘤选自：膀胱癌、肝癌、结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌、白血病、淋巴瘤、胰腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、尿道癌、头颈癌、胃肠道癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、肾癌、黑色素瘤、***癌、甲状腺癌，或其组合。
在本发明的第十四方面，提供了一种预防和/或治疗IL-18相关疾病的方法，所述方法包括：给需要的对象施用如本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段，或如本发明第二方面所述的重组蛋白，或如本发明第七方面所述的工程化免疫细胞，或如本发明第九方面所述的免疫偶联物，或如本发明第十方面所述的药物组合物，或其组合。
在另一优选例中，所述对象包括哺乳动物，如人。
在另一优选例中，所述IL-18相关疾病包括IL-18高表达的疾病、与IL-18受体异常表达有关或与IL-18信号通路高活性有关的疾病、IL-18Rβ介导的疾病。
在另一优选例中，所述IL-18相关疾病为自身免疫疾病或炎性疾病。
在另一优选例中，所述IL-18相关疾病选自：肿瘤、白血病、糖尿病肾病、阿尔茨海默症、帕金森病、关节炎、类风湿性关节炎、多发性硬化症、银屑病、银屑病性关节炎、克罗恩病、炎性肠病、溃疡性结肠炎、狼疮、***性红斑狼疮、青少年类风湿性关节炎、青少年特发性关节炎、格雷夫氏病、桥本甲状腺炎、艾迪生病、乳糜泻、皮肌炎、多发性硬化症、重症肌无力、恶性贫血、干燥综合征、I型糖尿病、II型糖尿病、脉管炎、葡萄膜炎、脓毒症、动脉粥样硬化、强直性脊柱炎、噬血细胞性淋巴组织细胞增多症、巨噬细胞活化综合征、***性红斑狼疮、化脓性关节炎、坏疽性脓皮病、特应性皮炎、特发性肺纤维化、硬皮症、全身型幼年特发性关节炎(sJIA)、炎症性肠炎(IBD)、成人斯蒂尔病(Adult-onset Still′s disease，AOSD)、慢性阻塞性肺病(COPD)或肺结节或其组合，或其组合。
在另一优选例中，所述肿瘤选自：膀胱癌、肝癌、结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌、白血病、淋巴瘤、胰腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、尿道癌、头颈癌、胃肠道癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、肾癌、黑色素瘤、***癌、甲状腺癌，或其组合。
在另一优选例中，所述的工程化免疫细胞或药物组合物中所包含的CAR免疫细胞是来源于所述对象的细胞(自体细胞)。
在另一优选例中，所述的工程化免疫细胞或药物组合物中所包含的CAR免疫细胞是来源于健康个体的细胞(异体细胞)。
在另一优选例中，所述的方法可与其他治疗方法联合使用。
在另一优选例中，所述的其他治疗方法包括化疗、放疗、靶向治疗等方法。
在本发明的第十五方面，提供了一种针对IL-18相关疾病的诊断方法，包括步骤：
(i)从诊断对象获取一样品，将所述的样品与如本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段，或如本发明第二方面所述的重组蛋白，或如本发明第七方面所述的工程化免疫细胞，或如本发明第九方面所述的免疫偶联物，或如本发明第十方面所述的药物组合物接触；和
(ii)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示所述的对象为IL-18相关疾病的确诊患者。
在另一优选例中，所述的样品为血液样品或咽拭子样品，或其他组织器官中的样品。
在另一优选例中，所述IL-18相关疾病包括IL-18高表达的疾病、与IL-18受体异常表达有关或与IL-18信号通路高活性有关的疾病、IL-18Rβ介导的疾病。
在另一优选例中，所述IL-18相关疾病为自身免疫疾病或炎性疾病。
在另一优选例中，所述IL-18相关疾病选自：肿瘤、白血病、糖尿病肾病、阿尔茨海默症、帕金森病、关节炎、类风湿性关节炎、多发性硬化症、银屑病、银屑病性关节炎、克罗恩病、炎性肠病、溃疡性结肠炎、狼疮、***性红斑狼疮、青少年类风湿性关节炎、青少年特发性关节炎、格雷夫氏病、桥本甲状腺炎、艾迪生病、乳糜泻、皮肌炎、多发性硬化症、重症肌无力、恶性贫血、干燥综合征、I型糖尿病、II型糖尿病、脉管炎、葡萄膜炎、脓毒症、动脉粥样硬化、强直性脊柱炎、噬血细胞性淋巴组织细胞增多症、巨噬细胞活化综合征、***性红斑狼疮、化脓性关节炎、坏疽性脓皮病、特应性皮炎、特发性肺纤维化、硬皮症、全身型幼年特发性关节炎(sJIA)、炎症性肠炎(IBD)、成人斯蒂尔病(Adult-onset Still′s disease，AOSD)、慢性阻塞性肺病(COPD)或肺结节，或其组合。
在另一优选例中，所述肿瘤选自：膀胱癌、肝癌、结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌、白血病、淋巴瘤、胰腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、尿道癌、头颈癌、胃肠道癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、肾癌、黑色素瘤、***癌、甲状腺癌，或其组合。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了IL-18RβWT抗体的序列信息。
图2显示了抗IL-18Rβ抗体(IgG1)在KG-1细胞中抑制IFN-γ的24h浓度-反应曲线。
图3显示了抗IL-18Rβ抗体(IgG4)在KG-1细胞中抑制IFN-γ的24h浓度-反应曲线。
图4显示了抗IL-18Rβ抗体(IgG1)在KG-1细胞中抑制IFN-γ的24h浓度-反应曲线(平行试验)。
图5显示了抗IL-18Rβ抗体(IgG1)在人PBMC细胞中抑制IFN-γ的48h浓度-反应曲线。
图6显示了抗IL-18Rβ抗体(IgG4)在人PBMC细胞中抑制IFN-γ的72h浓度-反应曲线。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，经过大量的筛选，首次开发了一种高亲和力的靶向IL-18Rβ的抗体及其抗原结合片段。具体地，本发明利用IL-18Rβ的WT抗体作为改善亲和力的起始材料构建精确突变文库，将饱和突变引入WT抗体六个CDR区的全部73个残基。进一步筛选后，通过表面等离子体共振测定的解离速率常数对所选突变体进行排序，用有益突变的随机组合构建组合文库，从而获得了结合亲和力提高的本发明的IL-18Rβ的抗体及其抗原结合片段。本发明开发的靶向IL-18Rβ的抗体及其抗原结合片段可以作为靶向治疗与IL-18受体异常表达有关或与IL-18信号通路高活性有关疾病的新型治疗手段。
术语
如本文所用，术语“本发明抗体”、“本发明的抗体”、“本发明的针对IL-18Rβ的抗体”、“针对IL-18Rβ的抗体”、“IL-18Rβ的抗体”、“IL-18Rβ抗体”具有相同的含义，可互换使用，均指特异性识别和结合于IL-18Rβ蛋白(包括人IL-18Rβ蛋白)的抗体。
优选地，本发明的抗体编号以及对应的序列编号如下表1所示。
表1
| 抗体编号 | VH | CDRH1 | CDRH2 | CDRH3 | VL | CDRL1 | CDRL2 | CDRL3 |
| A034 | 9 | 10 | 3 | 11 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| A035 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| A037 | 9 | 10 | 3 | 11 | 12 | 13 | 7 | 8 |
| A038 | 14 | 2 | 3 | 11 | 17 | 22 | 7 | 8 |
| A039 | 14 | 2 | 3 | 11 | 15 | 16 | 7 | 8 |
| C056-WT | 18 | 19 | 3 | 11 | 20 | 21 | 7 | 8 |
注：表中各个数值表示序列编号，即“1”表示“SEQ ID NO：1”，表中显示的VH、CDRH1、CDRH2、CDRH3、VL、CDRL1、CDRL2、CDRL3的序列编号为其氨基酸序列的编号。
优选地，本发明的A035抗体、A037抗体、A039抗体分别具有IgG1和IgG4两种类型，其中：
A035抗体(IgG4)具有如SEQ ID NO：24所示的重链序列和SEQ ID NO：25所示的轻链序列；A037抗体(IgG4)具有如SEQ ID NO：26所示的重链序列和SEQ ID NO：27所示的轻链序列；A039抗体(IgG4)具有如SEQ ID NO：28所示的重链序列和SEQ ID NO：29所示的轻链序列；
A035抗体(IgG1)具有如SEQ ID NO：30所示的重链序列和SEQ ID NO：31所示的轻链序列；A037抗体(IgG1)具有如SEQ ID NO：32所示的重链序列和SEQ ID NO：33所示的轻链序列；A039抗体(IgG1)如SEQ ID NO：34所示的重链序列和SEQ ID NO：35所示的轻链序列。
本文中的术语“抗体”意在包括全长抗体及其任何抗原结合片段(即，抗原结合部分)或单链。全长抗体是包含至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，重链和轻链由二硫键连接。各重链由重链可变区(简称VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域构成，即CH1、CH2和CH3。各轻链由轻链可变区(简称VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。VH和VL区还可以划分为称作互补决定区(CDR)的高变区，其由较为保守的框架区(FR)区分隔开。各VH和VL由三个CDR以及四个FR构成，从氨基端到羧基端以FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4的顺序排布。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括多种免疫***细胞(例如，效应细胞)和传统补体***的第一组分(C1q)。
本文中的术语，抗体的“抗原结合片段”(或抗原结合部分)，是指抗体的保持有特异结合抗原(例如，IL-18Rβ蛋白)能力的一个或多个片段。已证实，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来实施。包含在抗体的“抗原结合部分”中的结合片段的例子包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1构成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，包含铰链区二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1构成的Fd片段；(iv)由抗体单臂VL和VH构成的Fv片段；(v)由VH构成的dAb片段；(vi)分离的互补决定区(CDR)；以及(vii)纳米抗体，一种包含单可变结构域和两个恒定结构域的重链可变区。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由不同的基因编码，它们可以通过重组法经由使两者成为单蛋白链的合成接头而连接，其中VL和VH区配对形成单价分子)(称为单链Fc(scFv))。这些单链抗体也意在包括在术语涵义中。这些抗体片段可以通过本领域技术人员已知的常用技术而得到，且片段可以通过与完整抗体相同的方式进行功能筛选。
如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分b折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等，NIH Publ.No.91-3242，卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
本领域技术人员可使用多种已知编号方案中的任一者来定义CDR的氨基酸序列边界，该等编号方案包括以下文献中所阐述的彼等：Kabat等人，上文文献(“Kabat”编号方案)；Al-Lazikani等人，1997，J.Mol.Biol.，273：927-948(“Chothia”编号方案)；Lefranc等人，Dev.Comp.Immunol.，2003，27：55-77(“IMGT”编号方案)。
如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子(Cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与本发明的抗体或其片段结合而形成的偶联物。本发明还包括与所述的针对IL-18Rβ的抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。
如本文所用，术语“重链可变区”与“VH”可互换使用。
如本文所用，术语“轻链可变区”与“VL”可互换使用。
如本文所用，术语“可变区”与“互补决定区(Complementarity determiningregion，CDR)”可互换使用。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链可变区包括三个互补决定区CDRH1、CDRH2、和CDRH3。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链包括上述重链可变区和重链恒定区。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的轻链可变区包括三个互补决定区CDRL1、CDRL2、和CDRL3。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的轻链包括上述轻链可变区和轻链恒定区。
在本发明中，术语“本发明抗体”、“本发明蛋白”、或“本发明多肽”可互换使用，都指特异性结合IL-18Rβ蛋白的多肽，例如具有重链可变区的蛋白或多肽。它们可含有或不含起始甲硫氨酸。
本发明还提供了具有本发明抗体的其他蛋白质或融合表达产物。具体地，本发明包括具有含可变区的重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该可变区与本发明抗体的重链可变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。
一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链可变区的3个特定的区域来描述，称为可变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。
本发明抗体的重链的可变区特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的抗体重链可变区的分子，只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90％以上(较佳地95％以上，最佳地98％以上)的同源性。
本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
本发明抗体指具有IL-18Rβ蛋白结合活性的、包括上述CDR区的多肽。该术语还包括具有与本发明抗体相同功能的、包含上述CDR区的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、***和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明抗体的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。
本发明还提供了其他多肽，如包含抗体或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了本发明抗体的片段。通常，该片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
在本发明中，“本发明抗体的保守性变异体”指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表2进行氨基酸替换而产生。
表2
本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明的抗体可以单独使用，也可与可检测标记物(为诊断目的)、治疗剂、PK(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。
用于诊断目的可检测标记物包括但不限于：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。
可与本发明抗体结合或偶联的治疗剂包括但不限于：1.放射性核素；2.生物毒素；3.细胞因子如IL-2等；4.金纳米颗粒/纳米棒；5.病毒颗粒；6.脂质体；7.纳米磁粒；8.前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))等。
IL-18、IL-18R与IL-18Rβ
白介素-18(IL18，也称为干扰素-γ诱导因子)是一种蛋白，其在人中由IL-18基因编码。该基因编码的蛋白质是促炎细胞因子。造血细胞和非造血细胞等许多细胞类型都有产生IL-18的潜力。
IL-18受体由可诱导成分IL-18Rα(该成分以低亲和力结合成熟的IL-18)和组成型表达的共受体IL-18Rβ组成。IL-18与配体受体IL-18Rα结合，诱导IL-18Rβ募集形成高亲和力复合物，该复合物通过toll/interleukin-1受体(TIR)域发出信号。该信号结构域可激活促炎程序和NF-κB途径的MyD88衔接蛋白。IL-18Rβ特异表达于免疫细胞，且是IL-18传递信号必须的受体，因此靶向IL-18Rβ抗体能够特异且有效的抑制IL-18信号。有效抑制IL-18下游致炎性信号通路，是目前治疗自身免疫疾病和炎症疾病一个很有前途的方法。
药物组合物
本发明还提供了一种组合物。优选地，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：腹膜内、静脉内、或局部给药。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％，较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约10微克/千克体重至约50毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重至约10毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
针对IL-18Rβ的抗体或其抗原结合片段
在本发明中，所述针对IL-18Rβ的抗体或其抗原结合片段包括单体、二价体(二价抗体)、四价体(四价抗体)、和/或多价体(多价抗体)，可以是鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体。
典型地，本发明的抗体或其抗原结合片段基于SEQ ID NO：18所示的重链可变区和/或基于SEQ ID NO：20所示的轻链可变区包括选自下组的有益突变：F27L、F27I、F27V、S99A、S31F、A34D、A34E；所述抗体或其抗原结合片段还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个(如1-4个)氨基酸并能保留与IL-18Rβ特异性结合能力的抗体或其抗原结合片段。
在本发明的一个优选例中，所述抗体或其抗原结合片段具有如SEQ ID NO：1、9或14所示的重链可变区，和具有如SEQ ID NO：5、12、15或17所示的轻链可变区。
在本发明的一个优选例中，所述针对IL-18Rβ的抗体或其抗原结合片段包括一条或多条具有如SEQ ID NO：24、26、28、30、32或34所示的重链，和具有如SEQ ID NO：25、27、29、31、33或35所示的轻链。
标记的抗体
在本发明的一个优选例中，所述抗体带有可检测标记物。更佳地，所述的标记物选自下组：同位素、胶体金标记物、有色标记物或荧光标记物。
胶体金标记可采用本领域技术人员已知的方法进行。在本发明的一个优选的方案中，针对IL-18Rβ蛋白的抗体用胶体金标记，得到胶体金标记的抗体。
本发明的针对IL-18Rβ的抗体能够有效结合IL-18Rβ蛋白。
检测方法
本发明还涉及检测IL-18Rβ蛋白或其片段的方法。该方法步骤大致如下：获得细胞和/或组织样本；将样本溶解在介质中；检测在所述溶解的样本中IL-18Rβ蛋白的水平。
在本发明的检测方法中，所使用的样本没有特别限制，代表性的例子是存在于细胞保存液中的含细胞的样本。
试剂盒
本发明还提供了一种含有本发明的抗体(或其片段)或检测板的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。
本发明还提供了用于检测IL-18Rβ蛋白水平的检测试剂盒，该试剂盒包括识别IL-18Rβ蛋白的抗体，用于溶解样本的裂解介质，检测所需的通用试剂和缓冲液，如各种缓冲液、检测标记、检测底物等。该检测试剂盒可以是体外诊断装置。
应用
如上所述，本发明的抗体有广泛生物应用价值和临床应用价值，其应用涉及到与IL-18相关疾病的治疗，兼顾IL-18高表达的诊断、基础医学研究、生物学研究等多个领域。一个优选的应用是用于针对IL-18Rβ蛋白的临床预防和治疗。
本发明也提供了刺激靶向哺乳动物肿瘤细胞群或组织的T细胞所介导的免疫应答的方法，其包括以下步骤：给哺乳动物施用本发明的CAR-T细胞。
在一个实施方式中，本发明包括一类细胞疗法，分离病人自体T细胞(或者异源供体)，激活并进行基因改造产生CAR-T细胞，随后注入同一病人体内。这种方式使移植物抗宿主反应的发生概率极低，抗原被T细胞以无MHC限制方式识别。此外，一种CAR-T就可以治疗表达该抗原的所有癌症。不像抗体疗法，CAR-T细胞能够体内复制，产生可导致持续控制肿瘤的长期持久性。
在一个实施方式中，本发明的CAR-T细胞可经历稳定的体内扩增并可持续数月至数年的时间。另外，CAR介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中，CAR-T细胞可诱导对CAR抗原结合结构域所识别的抗原的高表达肿瘤细胞的特异性免疫应答。例如，本发明的CAR-T细胞引起针对IL-18Rβ高表达的肿瘤细胞的特异性免疫应答。
可治疗的癌症包括没有被血管化或基本上还没有被血管化的肿瘤，以及血管化的肿瘤。用本发明的CAR治疗的癌症类型包括但不限于：胃癌、肺癌、肝癌、骨肉瘤、乳腺癌、胰腺癌、淋巴瘤等。
通常地，如本文所述活化和扩增的细胞可用于治疗和预防肿瘤等疾病。因此，本发明提供了治疗癌症的方法，其包括给予给需要其的对象治疗有效量的本发明的CAR-T细胞。
本发明的CAR-T细胞可被单独给予或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如IL-2、IL-17或其他细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。
本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度等因素确定，或可由临床试验确定。
当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。包括本文描述的T细胞的药物组合物可以以104至109个细胞/kg体重的剂量，优选105至107个细胞/kg体重的剂量(包括范围内的所有整数值)施用。T细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如Rosenberg等，NewEng.J.of Med.319：1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可由医学领域技术人员通过监测患者的疾病迹象容易地确定，并以此调整治疗。
对象组合物的给予可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方式中，本发明的T细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方式中，本发明的T细胞组合物优选通过静脉内注射施用。T细胞的组合物可被直接注入肿瘤，***或感染位置。
在本发明的某些实施方式中，利用本文描述的方法或本领域已知的其他将T细胞扩展至治疗性水平的方法活化和扩展的细胞，与任何数量的有关治疗形式结合(例如，之前、同时或之后)施用给患者，所述治疗形式包括但不限于用以下试剂进行治疗：所述试剂诸如抗病毒疗法、西多福韦和白细胞介素-2、阿糖胞苷(也已知为ARA-C)或对MS患者的那他珠单抗治疗或对牛皮癣患者的厄法珠单抗治疗或对PML患者的其他治疗。在进一步的实施方式中，本发明的T细胞可与以下结合使用：化疗、辐射、免疫抑制剂，诸如，环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯和FK506，抗体或其他免疫治疗剂。在进一步的实施方式中，本发明的细胞组合物与骨髓移植、利用化疗剂诸如氟达拉滨、外部光束放射疗法(XRT)、环磷酰胺结合(例如，之前、同时或之后)而施用给患者。例如，在一个实施方式中，对象可经历高剂量化疗的标准治疗，之后进行外周血干细胞移植。在一些实施方式中，在移植后，对象接受本发明的扩展的免疫细胞的注入。在一个额外的实施方式中，扩展的细胞在外科手术前或外科手术后施用。
施用给患者的以上治疗的剂量将随着治疗病症的精确属性和治疗的接受者而变化。人施用的剂量比例可根据本领域接受的实践实施。通常，每次治疗或每个疗程，可将1×105个至1×1010个本发明经修饰的T细胞，通过例如静脉回输的方式，施用于患者。
本发明的主要优点包括：
1.本发明的IL-18Rβ的抗体或其抗原结合片段能够特异性结合IL-18Rβ，并且具有高亲和力，相比WT的亲和力提高了十倍以上，最高提高了22倍。
2.本发明的IL-18Rβ的抗体或其抗原结合片段具有良好的IL-18/IL-18R阻断活性，能有效抑制IL-18下游致炎性信号通路。
3.本发明的IL-18Rβ的抗体或其抗原结合片段相对于IL-18信号通路其他成分，在特异性、有效性和安全性方面具有优势。
4.本发明的IL-18Rβ的抗体或其抗原结合片段能高效阻断IL-18刺激的KG-1细胞内IFN-γ的释放，活性效力达到了WT的20倍。
5.本发明的IL-18Rβ的抗体或其抗原结合片段能高效阻断IL-18刺激的人外周血单个核细胞IFN-γ释放，活性效力比WT明显高出。
6.本发明的IL-18Rβ的抗体或其抗原结合片段在对IL-18相关疾病(包括但不限于IL-18高表达的疾病、与IL-18受体异常表达有关或与IL-18信号通路高活性有关的疾病、IL-18Rβ介导的疾病)的预防/诊断/治疗方面做出贡献，提供了新的方法与技术手段。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
氨基酸序列
SEQ ID NO：1 A035抗体重链可变区
SEQ ID NO：2 A035、A039、A038抗体重链互补决定区CDRH1
SEQ ID NO：3 A035、A037、A034、A039、A038、C056-WT抗体重链互补决定区CDRH2
SEQ ID NO：4 A035抗体重链互补决定区CDRH3
SEQ ID NO：5 A035、A034抗体轻链可变区
SEQ ID NO：6 A035、A034抗体轻链互补决定区CDRL1
SEQ ID NO：7 A035、A037、A034、A039、A038、C056-WT抗体轻链互补决定区CDRL2
SEQ ID NO：8 A035、A037、A034、A039、A038、C056-WT抗体轻链互补决定区CDRL3
SEQ ID NO：9 A037、A034抗体重链可变区
SEQ ID NO：10 A037、A034抗体重链互补决定区CDRH1
SEQ ID NO：11 A037、A034、A039、A038、C056-WT抗体重链互补决定区CDRH3
SEQ ID NO：12 A037抗体轻链可变区
SEQ ID NO：13 A037抗体轻链互补决定区CDRL1
SEQ ID NO：14 A039、A038抗体重链可变区
SEQ ID NO：15 A039抗体轻链可变区
SEQ ID NO：16 A039抗体轻链互补决定区CDRL1
SEQ ID NO：17 A038抗体轻链可变区
SEQ ID NO：18 C056-WT抗体重链可变区
SEQ ID NO：19 C056-WT抗体重链互补决定区CDRH1
SEQ ID NO：20 C056-WT抗体轻链可变区
SEQ ID NO：21 C056-WT抗体轻链互补决定区CDRL1
SEQ ID NO：22 A038抗体轻链互补决定区CDRL1
SEQ ID NO：23 IL-18Rβ抗原序列
SEQ ID NO：24 A035抗体(IgG4)重链
SEQ ID NO：25 A035抗体(IgG4)轻链
SEQ ID NO：26 A037抗体(IgG4)重链
SEQ ID NO：27 A037抗体(IgG4)轻链
SEQ ID NO：28 A039抗体(IgG4)重链
SEQ ID NO：29 A039抗体(IgG4)轻链
SEQ ID NO：30 A035抗体(IgG1)重链
SEQ ID NO：31 A035抗体(IgG1)轻链
SEQ ID NO：32 A037抗体(IgG1)重链
SEQ ID NO：33 A037抗体(IgG1)轻链
SEQ ID NO：34 A039抗体(IgG1)重链
SEQ ID NO：35 A039抗体(IgG1)轻链
SEQ ID NO：36 A035抗体(IgG4)重链核苷酸序列
SEQ ID NO：37 A035抗体(IgG4)轻链核苷酸序列
SEQ ID NO：38 A037抗体(IgG4)重链核苷酸序列
SEQ ID NO：39 A037抗体(IgG4)轻链核苷酸序列
SEQ ID NO：40 A039抗体(IgG4)重链核苷酸序列
SEQ ID NO：41 A039抗体(IgG4)轻链核苷酸序列
SEQ ID NO：42 A035抗体(IgG1)重链核苷酸序列
SEQ ID NO：43 A035抗体(IgG1)轻链核苷酸序列
SEQ ID NO：44 A037抗体(IgG1)重链核苷酸序列
SEQ ID NO：45 A037抗体(IgG1)轻链核苷酸序列
SEQ ID NO：46 A039抗体(IgG1)重链核苷酸序列
SEQ ID NO：47 A039抗体(IgG1)轻链核苷酸序列
实施例1.抗IL-18Rβ高亲和力抗体的制备
如图1所示，发明人使用IL-18Rβ的WT抗体(即野生型抗体，表1中的C056-WT)作为改善亲和力的起始材料。构建精确突变文库，来将饱和突变引入WT抗体六个CDR区的全部73个残基。进一步筛选后，通过表面等离子体共振(Surface plasmon resonance，SPR)测定的解离速率常数(Dissociation rate constant)对所选突变体进行排序。随后用有益突变的随机组合构建一个组合文库。通过SPR排序也确定了先导Fab克隆。所有SPR筛选均在Biacore 8K上进行。运行缓冲液为HBS-EP(10mM HEPES，500mM NaCl，3mM EDTA，0.05％吐温20，pH 6.0)。将一分泌的Fab吸附到SASA生物传感器上。平衡后，注射抗原120秒(结合期)，然后注射运行缓冲液360秒(解离期)。在注射其他选定的克隆之前，再生传感器表面。使用Biacore 8K评估软件将实验数据局部拟合到1∶1交互模型，从而获得Fab克隆的off-rate。最后，在HEK293细胞中表达来自先导克隆的全长IgG，并在结合试验和功能试验中进行评估。
如表3所示，通过SPR分析了44个hit，并确定了有7种有益突变体表现出更佳的结合亲和力(即＞WT抗体亲和力的2倍，如表4所示)。
表5中列出了结合亲和力提高的前10个组合突变(＞WT抗体亲和力的10倍)。选择5个先导克隆(A034、A035、A037、A038和A039)进行全长抗体生产。序列提供如下。
表3 44个hit突变体的IL-18Rβ的亲和力及动力学
表4通过饱和诱变筛选鉴定的有益突变体
表5前10个亲和力增强的有益突变体组合
| 序号 | 克隆编号 | ka(1/Ms) | kd(1/s) | KD(M) | 比值(kd) | 序列分析 |
| 1 | A034 | 1.31E+05 | 4.24E-05 | 3.22E-10 | 28.07 | VL-S31F/VL-A34E/VH-F27L |
| 2 | A035 | 1.43E+05 | 3.19E-05 | 2.24E-10 | 37.30 | VL-S31F/VL-A34E/VH-F27I/VH-S99A |
| 3 | A036 | 1.07E+05 | 6.91E-05 | 6.48E-10 | 17.22 | VL-A34D/VH-F27I/VH-S99A |
| 4 | A037 | 1.18E+05 | 1.00E-06 | 8.47E-12 | 1190.00 | VL-S31F/VL-A34D/VH-F27L |
| 5 | A038 | 7.82E+04 | 5.67E-05 | 7.25E-10 | 20.99 | VL-A34E/VH-F27I |
| 6 | A039 | 1.15E+05 | 3.00E-05 | 2.60E-10 | 39.67 | VL-A34D/VH-F27I |
| 7 | A040 | 7.70E+04 | 8.00E-05 | 1.04E-09 | 14.88 | VL-A34E/VH-F27L |
| 8 | A041 | 1.53E+05 | 6.35E-05 | 4.15E-10 | 18.74 | VL-S31F/VL-A34D/VH-F27V/VH-S99A |
| 9 | A042 | 7.90E+04 | 1.06E-04 | 1.34E-09 | 11.23 | VL-A34E/VH-F27L/VH-S99A |
| 10 | A043 | 1.28E+05 | 6.29E-05 | 4.91E-10 | 18.92 | VL-S31F/VL-A34E/VH-F27L |
| 11 | C056-WT | 6.66E+04 | 1.19E-03 | 1.78E-08 | 1.00 |
实施例2.抗IL-18Rβ抗体的亲和力评价
使用表面等离子体共振生物传感器Biacore 8K(GE Healthcare)测定抗IL-18Rβ抗体与人IL-18Rβ蛋白的亲和力。测量在25℃下进行，运行缓冲液为HBS-EP+。将抗体作为捕获物注入到Series S传感器芯片蛋白A上。之后将稀释的IL-18Rβ(400，200，100，50，25，12.5，6.25nM)作为结合相注入流动细胞1和2的表面。结合时间为120秒。将缓冲液流维持420秒以进行分离。通过注射10mM甘氨酸-HCl pH 1.5 30秒使表面再生。使用Biacore评估软件获得解离(kd)速率常数和结合(ka)速率常数的数据。平衡解离常数(KD)由kd比ka的比值计算得出。
表6总结了抗IL-18Rβ抗体的结合动力学数据。A035、A037和A039的结合亲和力在0.72～0.98nm范围内，与亲本抗体WT(15.8nm)相比提高了16-22倍。
表6抗IL-18Rβ抗体的结合动力学
实施例3.抗IL-18Rβ抗体对阻断IL-18刺激的KG-1细胞内IFN-γ释放的活性
将3×105KG-1细胞(ATCC，#CCL-246)接种到96孔板的每个孔中。在用10ng/mL IL-18刺激1h之前，将实施例1中制备的抗体的系列稀释液添加到孔中。24小时孵育后，通过离心将细胞沉淀，并根据制造商的说明书，使用ELISA试剂盒(R&D Systems，#VAL104C)从上清中测量IFN-γ。对上述抗IL-18Rβ抗体(包括IgG1和IgG4两种类型)至少进行了3次重复实验，表7和表8中总结了每种抗体的IC50。
表7抗IL-18Rβ抗体在KG-1试验中的IC50(24小时)
| 抗体 | IC50(nM) |
| WT | 8.14 |
| A035(IgG1) | 0.26 |
| A037(IgG1) | 0.27 |
| A039(IgG1) | 0.59 |
表8抗IL-18Rβ抗体在KG-1试验中的IC50(24小时)
| 抗体 | IC50(nM) |
| WT | 1.01 |
| A035(IgG4) | 0.12 |
| A037(IgG4) | 0.11 |
| A039(IgG4) | 0.24 |
相应数据的结果绘图如图2和图3所示，A035、A037和A039抗体的效力约为WT抗体的20倍。
在稍后的另一组重复试验中，同样证明了抗体A035、A037和A039具有与上述试验相当的优异的细胞抑制活性，结果见表9和图4。
表9抗IL-18Rβ抗体在KG-1重复试验中的IC50(24小时)
实施例4.抗IL-18Rβ抗体阻断IL-18刺激的人外周血单个核细胞IFN-γ释放的活
性
人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)(TPCS，#PB025C-W)以1×105个细胞/孔的浓度接种在96孔板中。然后将细胞与不同浓度的抗IL-18Rβ抗体在50ng/mL IL-18和5ng/mL IL-12条件下在37℃和5％CO2中分别孵育48小时(IgG1抗体)和72小时(IgG4抗体)。根据制造商的说明书，使用人ELISA试剂盒(R&D Systems，#VAL104C)测量IFN-γ的产生量。
结果如图5和图6所示，IgG1和IgG4抗体对应的IC50值分别如表10和表11所示，以上结果均表明A035、A037和A039抗体显示出比WT抗体更高的效力。
表10抗IL-18Rβ抗体在人外周血单个核细胞试验中的IC50(48小时)
| 抗体 | IC50(nM) |
| WT | 194.58 |
| A035(1gG1) | 7.56 |
| A037(IgG1) | 5.42 |
| A039(IgG1) | 7.21 |
表11抗IL-18Rβ抗体在人外周血单个核细胞试验中的IC50(72小时)
| 抗体 | IC50(nM) |
| WT | 32.56 |
| A035(IgG4) | 1.00 |
| A037(IgG4) | 0.76 |
| A039(IgG4) | 1.36 |
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (42)
1.一种IL-18Rβ抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段包含选自下组的重链互补决定区和轻链互补决定区：
(1) 所述重链互补决定区包含：如SEQ ID NO: 2、3和4所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3；所述轻链互补决定区包含：如SEQ ID NO: 6、7和8所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3；或
(2) 所述重链互补决定区包含：如SEQ ID NO: 10、3和11所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3；所述轻链互补决定区包含：如SEQ ID NO: 13、7和8所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3；或
(3) 所述重链互补决定区包含：如SEQ ID NO: 2、3和11所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3；所述轻链互补决定区包含：如SEQ ID NO: 16、7和8所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3；或
(4) 所述重链互补决定区包含：如SEQ ID NO: 10、3和11所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3；所述轻链互补决定区包含：如SEQ ID NO: 6、7和8所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3；或
(5) 所述重链互补决定区包含：如SEQ ID NO: 2、3和11所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3；所述轻链互补决定区包含：如SEQ ID NO: 22、7和8所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3。
2. 如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段基于SEQ ID NO: 18所示的重链可变区进行以下有益突变：F27I和S99A；和基于SEQ IDNO: 20所示的轻链可变区进行以下有益突变：S31F和A34E。
3. 如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段基于SEQ ID NO: 18所示的重链可变区进行以下有益突变：F27L；和基于SEQ ID NO:20所示的轻链可变区进行以下有益突变：S31F和A34D。
4. 如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段基于SEQ ID NO: 18所示的重链可变区进行以下有益突变：F27I；和基于SEQ ID NO:20所示的轻链可变区进行以下有益突变：A34D。
5. 如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段基于SEQ ID NO: 18所示的重链可变区进行以下有益突变：F27L；和基于SEQ ID NO:20所示的轻链可变区进行以下有益突变：S31F和A34E。
6. 如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段基于SEQ ID NO: 18所示的重链可变区进行以下有益突变：F27I；和基于SEQ ID NO:20所示的轻链可变区进行以下有益突变：A34E。
7. 如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段具有：
如SEQ ID NO: 9所示的重链可变区和SEQ ID NO: 5所示的轻链可变区；或
如SEQ ID NO: 1所示的重链可变区和SEQ ID NO: 5所示的轻链可变区；或
如SEQ ID NO: 9所示的重链可变区和SEQ ID NO: 12所示的轻链可变区；或
如SEQ ID NO: 14所示的重链可变区和SEQ ID NO: 17所示的轻链可变区；或
如SEQ ID NO: 14所示的重链可变区和SEQ ID NO: 15所示的轻链可变区。
8. 如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段具有：
如SEQ ID NO: 24所示的重链序列和SEQ ID NO: 25所示的轻链序列；或
如SEQ ID NO: 26所示的重链序列和SEQ ID NO: 27所示的轻链序列；或
如SEQ ID NO: 28所示的重链序列和SEQ ID NO: 29所示的轻链序列；或
如SEQ ID NO: 30所示的重链序列和SEQ ID NO: 31所示的轻链序列；或
如SEQ ID NO: 32所示的重链序列和SEQ ID NO: 33所示的轻链序列；或
如SEQ ID NO: 34所示的重链序列和SEQ ID NO: 35所示的轻链序列。
9.如权利要求1-8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段为鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体。
10.如权利要求1-8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗原结合片段选自scFv、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、二硫键连接的Fv(dsFv)，或sdAb。
11.如权利要求1-8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段的重链恒定区选自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区。
12.如权利要求1-8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段的重链恒定区选自人IgG1或IgG4的重链恒定区。
13.如权利要求1-8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段包括单体、二价抗体和/或多价抗体。
14.如权利要求13所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述二价抗体是双特异性抗体。
15.如权利要求13所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述多价抗体是多特异性抗体。
16. 一种重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白由以下部分组成：
(i) 如权利要求1-15中任一项所述的抗体或其抗原结合片段；和
(ii) 协助表达和/或纯化的标签序列。
17.如权利要求16所述的重组蛋白，其特征在于，所述的标签序列包括：Fc标签、HA标签、GGGS序列、FLAG标签、Myc标签、6His标签，或其组合。
18.如权利要求16所述的重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白包括融合蛋白。
19.如权利要求16所述的重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白为单体、二聚体，或多聚体。
20.一种核苷酸分子，其特征在于，所述核苷酸分子编码如权利要求1-15中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或如权利要求16-19中任一项所述的重组蛋白。
21.如权利要求20所述的核苷酸分子，其特征在于，所述核苷酸分子为RNA或DNA。
22.如权利要求21所述的核苷酸分子，其特征在于，所述DNA为cDNA。
23. 如权利要求20所述的核苷酸分子，其特征在于，所述核苷酸分子包括：
如SEQ ID NO: 36所示的重链核苷酸序列和如SEQ ID NO: 37所示的轻链核苷酸序列；或
如SEQ ID NO: 38所示的重链核苷酸序列和如SEQ ID NO: 39所示的轻链核苷酸序列；或
如SEQ ID NO: 40所示的重链核苷酸序列和如SEQ ID NO: 41所示的轻链核苷酸序列；或
如SEQ ID NO: 42所示的重链核苷酸序列和如SEQ ID NO: 43所示的轻链核苷酸序列；或
如SEQ ID NO: 44所示的重链核苷酸序列和如SEQ ID NO: 45所示的轻链核苷酸序列；或
如SEQ ID NO: 46所示的重链核苷酸序列和如SEQ ID NO: 47所示的轻链核苷酸序列。
24.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求20-23中任一项所述的核苷酸分子。
25.如权利要求24所述的表达载体，其特征在于，所述的表达载体选自下组：DNA、RNA，或其组合。
26.如权利要求24所述的表达载体，其特征在于，所述的表达载体选自下组：病毒载体、质粒、转座子，或其组合。
27.如权利要求24所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为病毒载体，所述病毒载体选自下组：慢病毒、腺病毒、AAV病毒、逆转录病毒，或其组合。
28.如权利要求24所述的表达载体，其特征在于，所述的表达载体选自下组：pTomo慢病毒载体、plenti、pLVTH、pLJM1、pHCMV、pLBS.CAG、pHR、pLV。
29.如权利要求24所述的表达载体，其特征在于，所述的表达载体中还包括选自下组的元件：启动子、转录增强元件WPRE、长末端重复序列LTR。
30.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求24-29中任一项所述的表达载体，或其基因组中整合有权利要求20-23中任一项所述的核苷酸分子。
31.如权利要求30所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。
32.如权利要求30所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞选自下组：大肠杆菌、酵母细胞、哺乳动物细胞。
33. 一种嵌合抗原受体CAR，其特征在于，所述CAR的抗原结合区scFv段为特异性结合于IL-18Rβ的结合区，并且，所述scFv的重链可变区和轻链可变区包括选自下组的重链互补决定区和轻链互补决定区：
(1) 所述重链互补决定区包含：如SEQ ID NO: 2、3和4所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3；所述轻链互补决定区包含：如SEQ ID NO: 6、7和8所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3；或
(2) 所述重链互补决定区包含：如SEQ ID NO: 10、3和11所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3；所述轻链互补决定区包含：如SEQ ID NO: 13、7和8所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3；或
(3) 所述重链互补决定区包含：如SEQ ID NO: 2、3和11所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3；所述轻链互补决定区包含：如SEQ ID NO: 16、7和8所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3；或
(4) 所述重链互补决定区包含：如SEQ ID NO: 10、3和11所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3；所述轻链互补决定区包含：如SEQ ID NO: 6、7和8所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3；或
(5) 所述重链互补决定区包含：如SEQ ID NO: 2、3和11所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3；所述轻链互补决定区包含：如SEQ ID NO: 22、7和8所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3。
34.一种产生针对IL-18Rβ的抗体或其抗原结合片段的方法，其特征在于，包括步骤：
(a) 在适合的条件下，培养如权利要求30-32中任一项所述的宿主细胞，从而获得含IL-18Rβ的抗体或其抗原结合片段的培养物；
(b) 从所述培养物中分离和/或回收所述的针对IL-18Rβ的抗体或其抗原结合片段；和
(c) 任选地，对步骤(b)获得的针对IL-18Rβ的抗体或其抗原结合片段进行纯化和/或修饰。
35. 一种免疫偶联物，其特征在于，所述免疫偶联物含有：
(a) 抗体部分，所述抗体部分包括如权利要求1-15中任一项所述的抗体或其抗原结合片段；和
(b) 选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、金纳米颗粒或纳米棒、纳米磁粒、病毒外壳蛋白或VLP，或其组合。
36. 一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有：
(i) 活性成分，所述活性成分选自下组：如权利要求1-15中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或如权利要求16-19中任一项所述的重组蛋白，或如权利要求20-23中任一项所述的核苷酸分子，或如权利要求24-29中任一项所述的表达载体，或如权利要求30-32中任一项所述的宿主细胞，或如权利要求35所述的免疫偶联物，或其组合；和
(ii) 药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
37.一种活性成分的用途，所述活性成分选自下组：如权利要求1-15中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或如权利要求16-19中任一项所述的重组蛋白，或如权利要求20-23中任一项所述的核苷酸分子，或如权利要求24-29中任一项所述的表达载体，或如权利要求30-32中任一项所述的宿主细胞，或如权利要求35所述的免疫偶联物，或如权利要求36所述的药物组合物，或其组合，其特征在于，所述活性成分被用于制备：
(a) 预防和/或治疗IL-18相关疾病的药物；
(b) 检测IL-18相关疾病的试剂；
所述IL-18相关疾病选自：关节炎、多发性硬化症、克罗恩病、重症肌无力、炎症性肠炎(IBD)、成人斯蒂尔病(Adult-onset Still's disease, AOSD)、慢性阻塞性肺病(COPD)或肺结节、噬血细胞性淋巴组织增生症(Hemophagocytic lymphohistiocytosis, HLH)、特应性皮炎、特发性肺纤维化、硬皮症、***性红白狼疮(Systemic lupus erythematosus,SLE)，或其组合。
38.如权利要求37所述的用途，其特征在于，所述试剂为诊断试剂。
39.如权利要求38所述的用途，其特征在于，所述的诊断试剂为检测片或检测板。
40. 如权利要求37所述的用途，其特征在于，所述IL-18相关疾病选自：类风湿性关节炎、全身型幼年特发性关节炎(Systemic juvenile idiopathic arthritis, sJIA)，或其组合。
41.一种非诊断性的体外检测样品中IL-18Rβ蛋白或其片段的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(1) 在体外，将所述样品与如权利要求1-15中任一项所述的抗体或其抗原结合片段接触；
(2) 检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在IL-18Rβ蛋白或其片段的对应靶点。
42. 一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：
(1) 第一容器，所述第一容器中含有如权利要求1-15中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或如权利要求16-19中任一项所述的重组蛋白，或如权利要求35所述的免疫偶联物，或如权利要求36所述的药物组合物，或其组合；和/或
(2) 第二容器，所述第二容器中含有抗所述第一容器内容物的二抗；
或者，
所述试剂盒含有一检测板，所述检测板包括：基片和测试条，所述的测试条含有如权利要求1-15中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或如权利要求16-19中任一项所述的重组蛋白，或如权利要求35所述的免疫偶联物，或如权利要求36所述的药物组合物，或其组合。
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