CN117106697A - Palbociclib在制备CHO细胞无血清培养基中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及无血清培养基技术领域。本发明提供了Palbociclib在制备CHO细胞无血清培养基中的应用。通过添加Palbociclib制备一种CHO细胞无血清培养基，所述Palbociclib在该CHO细胞无血清培养基中的终浓度为2‑50μM。本发明CHO细胞无血清培养基中还包括维生素C，与Palbociclib搭配使用，能够更好的提高目的蛋白在CHO细胞中的表达水平，增加细胞特异性生产力，促进CHO细胞生长、提高细胞活率和产量，同时达到降低生产成本的目的。

Description

Palbociclib在制备CHO细胞无血清培养基中的应用

技术领域

本发明涉及无血清培养基技术领域，尤其涉及Palbociclib在制备CHO细胞无血清培养基中的应用。

背景技术

近年来，生物治疗学和诊断学在医药市场上快速增长。二十多年以来，已有300多种生物制药获得美国食品和药物管理局(FDA)的批准，这一数字还在持续增长，越来越多的生物制品(蛋白质、核酸、糖及复合体)进入诊断和治疗领域。作为生物药物的重要部分，单抗等重组蛋白药物具有巨大的科研价值和商业价值。CHO细胞是生产重组蛋白和单克隆抗体的重要平台之一，超过80％的经批准的单抗是在CHO细胞中生产的。培养基对细胞的生长和生产力起着至关重要的作用。常规的细胞培养需要添加血清，但血清的成分复杂、批次不一，存在如外源病毒因子和致病因子污染、血清残留导致的过敏反应，以及细胞培养的标准化和最终产品纯化难度大等缺点，难以用于重组蛋白药物的生产。无血清培养基组成成分明确，可避免血清的不同批次或不明组分对细胞培养的影响，能在很大程度上避免或改善含血清培养基所带来的上述缺陷，目前广泛用于重组蛋白药物生产过程中CHO细胞的培养。

近年来，为了满足对单克隆抗体日益增长的需求，在工业化CHO细胞重组蛋白药物生产过程中，会采取一系列措施提高重组蛋白表达量以降低生产成本。早期提高CHO细胞重组蛋白表达量的重点是通过优化表达载体，改造宿主细胞、培养基组成，流加策略来提高细胞培养时间跨度内的整合活细胞密度(IVCD)和细胞比生产率(Qp)，后期发现通过优化培养工艺(如低温，高渗透压环境)，添加小分子试剂可以提高蛋白的比生产率。其中，通过添加小分子添加剂优化无血清培养基已成为促进CHO细胞蛋白表达的有效策略。如CN116478913A公开的应用于CHO细胞的无血清培养基。因此研究开发出配方简单，成本低，应用于CHO细胞培养能够更好的提高重组蛋白表达量，成为了目前需要解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的在于提供Palbociclib在制备CHO细胞无血清培养基中的应用，通过添加Palbociclib，并与维生素C搭配使用，更好的提高了目的蛋白在CHO细胞中的表达水平，增加细胞特异性生产力，促进CHO细胞生长、提高细胞活率和产量。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了Palbociclib在制备CHO细胞无血清培养基中的应用。

作为优选，所述CHO细胞包括CHO-K1、CHO-S或CHO-DG44细胞。

本发明还提供了一种CHO细胞无血清培养基，包括基础无血清培养基和Palbociclib。

作为优选，所述Palbociclib的终浓度为2-50μM。

作为优选，所述Palbociclib的终浓度为20-45μM。

作为优选，所述CHO细胞无血清培养基中还包括维生素C。

作为优选，所述CHO细胞无血清培养基中Palbociclib和维生素C的浓度比例为(2-50)μM:15μM。

通过采用上述技术方案，本发明具有如下有益效果：

本发明技术方案通过在CHO细胞无血清培养基中添加Palbociclib在一定程度上可提高目的蛋白在CHO细胞中的表达水平。而将Palbociclib和维生素C按合理的浓度关系联合使用，可以更好的提高目的蛋白在CHO细胞中的表达水平，增加细胞特异性生产力，促进CHO细胞生长、提高细胞活率和产量，达到协同增效的目的。同时，采用本发明技术方案还能够降低生物制品生产工艺中的能耗和需求，降低生物制品的生产成本。

附图说明

图1为不同处理组Western blot检测结果(图1中的A为不同处理组的Westernblot条带，图1中的B为不同处理组HSA相对表达量)；

图2为不同处理组活细胞数及细胞活率(图2中的A为不同处理组的活细胞数，图2中的B为不同处理组的细胞活率)。

具体实施方式

本发明提供了一种Palbociclib在制备CHO细胞无血清培养基中的应用。

在本发明中，所述CHO细胞包括CHO-K1、CHO-S或CHO-DG44细胞。

本发明还提供了一种CHO细胞无血清培养基，包括基础无血清培养基和Palbociclib。

在本发明中，所述基础无血清培养基购自于河南普诺易生物制品研究院有限公司，优选的包括DC1004a培养基。

在本发明中，所述Palbociclib购自于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。本发明所述Palbociclib的终浓度优选为2-50μM，进一步的优选为20-45μM，更进一步的优选为40μM。

在本发明中，所述CHO细胞无血清培养基中还包括维生素C。

在本发明中，所述CHO细胞无血清培养基中Palbociclib和维生素C的浓度比例优选为(2-50)μM:15μM，进一步的优选为(25-45)μM:15μM，更进一步的优选为40μM:15μM。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

(一)配制CHO细胞无血清培养基

称取27.5g无血清培养基干粉DC1004a，加入注射用水，充分溶解后调节pH至7.2，然后用0.1μm孔径滤膜过滤除菌，获得基础无血清培养基。称量Palbociclib粉末17.9mg，添加到上述获得的基础无血清培养基中，即获得含40μM Palbociclib无血清培养基。称量维生素C粉末2.6mg，添加到上述获得的基础无血清培养基中，即获得含15μM维生素C的无血清培养基。称量维生素C粉末2.6mg和Palbociclib粉末17.9mg，添加到上述获得的基础无血清培养基中，即获得含40μM Palbociclib和15μM维生素C的无血清培养基。然后用含15μM维生素C的无血清培养基对含40μM Palbociclib和15μM维生素C无血清培养基进行稀释，依次配制2μM Palbociclib和15μM维生素C、5μM Palbociclib和15μM维生素C、10μM Palbociclib和15μM维生素C、20μM Palbociclib和15μM维生素C的无血清培养基。

(二)对CHO细胞重组蛋白HSA表达的影响

为研究Palbociclib和/或维生素C的添加对细胞影响，设置不同的处理组。

对照组1：基础无血清培养基

对照组2：含15μM维生素C的无血清培养基

对照组3：含40μM Palbociclib的无血清培养基

实验组1：含2μM Palbociclib和15μM维生素C的无血清培养基

实验组2：含5μM Palbociclib和15μM维生素C的无血清培养基

实验组3：含10μM Palbociclib和15μM维生素C的无血清培养基

实验组4：含20μM Palbociclib和15μM维生素C的无血清培养基

实验组5：含40μM Palbociclib和15μM维生素C的无血清培养基

1.细胞复苏。将人血清白蛋白CHO细胞(购自美国Life Technologies，货号A11557-01)接种于24孔板，24h后细胞密度达95％，用脂质体2000转染细胞，在37℃、5％CO₂培养箱中培养；48h后用含15μg/mLBSD的培养基换液，10天后空白细胞全部死完，然后浓度减半继续处理4周得到稳定转染的细胞池。用有限稀释法以获得单克隆，细胞在添加10％FBS的培养基中稀释至10个/mL，将细胞稀释液均匀铺在96孔板中，5d后鉴定出单个克隆，细胞密度达到60％后可将细胞放大培养，获得的HSA单克隆细胞株，冻存，备用。

取出冻存的HSA单克隆细胞株，37℃水浴锅中快速融化，在超净台中用移液枪吸出细胞于1.5EP管中，1000rpm离心5min弃上清，加入DMEM/F12完全培养基(河南普诺易生物制品研究院有限公司)，均匀吹打细胞成单细胞悬液，将细胞悬液加入到细胞培养瓶中，补加2mL完全培养基，吹打均匀，放入37℃、5％CO₂细胞培养箱内培养。

2.细胞传代。从培养箱中取出细胞培养瓶，在超净工作台中弃去旧培养基，加入PBS冲洗。加入1mL胰蛋白酶消化至细胞变圆但不脱落，吸除消化液。加入6mL新鲜的完全培养基终止消化，吹打均匀后将细胞悬液按4000cells/cm²接种到另一细胞培养瓶中并补加新鲜完全培养基继续培养。

3.细胞悬浮。取贴壁培养细胞，显微镜下观察细胞状态。PBS清洗细胞后，用1mL胰蛋白酶消化至细胞变圆但不脱落，吸除消化液，加入6mL新鲜的完全培养基终止消化。1000rpm离心5min收集细胞沉淀，分别加入对照组1-3和实验组1-5所述的无血清培养基进行重悬。将细胞以4×10⁵/mL的密度接种于六孔的细胞培养板中，并放置摇床上，调整转速为120rpm，于37℃、5％CO₂细胞培养箱中悬浮培养。细胞接种的当天为悬浮培养的第0天，持续培养7d，悬浮培养第7d，1000rpm离心，收集上清进行Westernblot测试，并用Image J对Westernblot条带进行灰度值分析得到的HSA相对表达量。

结果如图1所示，含Palbociclib的无血清培养基均可提高CHO细胞中重组HSA的表达，而同时添加Palbociclib和维生素C的无血清培养基对CHO细胞中重组HSA表达的提高效果更显著，即表明了Palbociclib和维生素C具有协同增效的作用，其中，40μM为Palbociclib最佳浓度，实验组5的HSA相对表达水平最高。

(三)对CHO细胞生长的影响

采用同上述一样的对照组1-3以及实验组1-5的无血清培养基，进行悬浮培养，培养7d。每天取样，采用台盼蓝染色，对细胞进行计数，记录活细胞数及细胞活率。

结果如图2所示，含Palbociclib和维生素C的无血清培养基细胞生长缓慢，且随着Palbociclib浓度的增加生长速度逐渐降低，细胞活率无显著差异。但蛋白表量提高可能是由于促进了细胞周期阻滞。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.Palbociclib在制备CHO细胞无血清培养基中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述CHO细胞包括CHO-K1、CHO-S或CHO-DG44细胞。

3.一种CHO细胞无血清培养基，其特征在于，包括基础无血清培养基和Palbociclib。

4.根据权利要求3所述的CHO细胞无血清培养基，其特征在于，所述Palbociclib的终浓度为2-50μM。

5.根据权利要求3所述的CHO细胞无血清培养基，其特征在于，所述Palbociclib的终浓度为20-45μM。

6.根据权利要求3所述的CHO细胞无血清培养基，其特征在于，所述CHO细胞无血清培养基中还包括维生素C。

7.根据权利要求6所述的CHO细胞无血清培养基，其特征在于，所述CHO细胞无血清培养基中Palbociclib和维生素C的浓度比例为(2-50)μM:15μM。