CN107674858B - 骨髓内皮祖细胞的分离培养基和分离方法 - Google Patents

骨髓内皮祖细胞的分离培养基和分离方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及骨髓内皮祖细胞的分离培养和分离方法。通过本发明中提供的培养基配合本发明提供的方法来培养EPC，可以使EPC快速的生长增殖，5～10ml的骨髓，在20天左右便可得到5×107个细胞。

Description

骨髓内皮祖细胞的分离培养基和分离方法
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及骨髓内皮祖细胞的分离培养基和分离方法。
背景技术
EPCs是血管内皮细胞的前体细胞，即能分化为成熟血管内皮细胞的祖细胞，又称血管母细胞或血管内皮干细胞，来源于骨髓的原始细胞，与人类胚胎时期的成血管细胞)和HUVEC相似，在一定条件下可诱导分化成为成熟的ECs。1997年，Asahara等首次分离并证实成年人外周血中存在着能分化为血管内皮细胞的内皮祖细胞，并在体内证实了其生成血管的能力，人们开始了对内皮祖细胞各方面的研究。目前，内皮祖细胞先后从脐血、脂肪、骨髓和胎肝中被分离出来，并且内皮祖细胞的功能应用研究也取得一定成果，为临床应用奠定了基础。
骨髓中含有丰富细胞，如间充质干细胞、造血干细胞、内皮祖细胞等，骨髓中的血管内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells，EPCs)可以游走到创伤组织参加新血管形成，并能分化为内皮细胞，促进局部血管生成和血管新生。目前已有研究者将EPCs用于治疗缺血性疾病，并取得了良好的治疗效果，具有再生和分化能力的EPCs已逐渐成为治疗血管***疾病的理想细胞材料。因此EPCs已成为近年来生命科学研究的热点。
目前，传统的EPC分离和培养的方法如下：
1.用传统的Ficoll密度梯度离心法分离出骨髓中单个核细胞(BM-MNCs)。
2.用人CD34+抗体包被的免疫磁珠采取磁珠分选法在BM-MNCs中分离出MNC CD34+。然后将MNC 34+单独接种于培养皿中进行培养。
3.MNC CD34+的培养：培养基的配方为DMEM或M-199+20％胎牛血清+牛脑提取物+抗生素，或DMEM或M-199+20％胎牛血清+VEGF+FGF-2+EGF+IGF-1+抗坏血酸。培养皿采用人纤维连接蛋白或明胶包被。
传统的培养方法较为繁琐，在用CD34+抗体包被的免疫磁珠分选MNC的过程中不可避免会有MNC CD34+的损失加上磁珠本身对细胞的损伤，会大大降低细胞的获得率，同时免疫磁珠分离的方法所需费用昂贵，不利于经济效益，特别随着George等提出了CD34-的概念后，证明EPC上的表型表达率均不一致，所以这种方法已经逐渐不被采用。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供骨髓内皮祖细胞的分离培养基和分离方法，本发明提供的分离方法简便，细胞得率高且活率高。
本发明提供的培养基由基础培养基、人血清、bFGF、VEGF、IGF、EGF、氢化可的松、谷氨酰胺和双抗组成。
基础培养基中包含细胞生长、繁殖所需要的基本营养物质，在本发明中，基础培养基时用于配置本发明所述培养基的基础，其为液态或固体粉末。基础培养基为液态则各物质以液体培养基定容至适宜浓度，基础培养基为液态，则各物质以水定容至适宜浓度。本发明中，所述基础培养基为M199培养基。优选的，所述基础培养基为M199液体培养基。
本发明中培养基中，所述人血清的体积分数为20％。
本发明采用的人血清来自自体外周血。制备方法为，自体外周血经400g离心10min后，取上层血清。
本发明中培养基中，所述bFGF的浓度为8ng/mL～12ng/mL；
所述VEGF的浓度为15ng/mL 25ng/mL；
所述IGF的浓度为15ng/mL～25ng/mL；
所述EGF的浓度为8ng/mL～12ng/mL；
所述氢化可的松的浓度为80ng/mL～120ng/mL；
所述谷氨酰胺的浓度为2.5mmol/L～3.5mmol/L。
一些实施例中，本发明提供培养基中，
所述bFGF的浓度为10ng/mL；
所述VEGF的浓度为20ng/mL；
所述IGF的浓度为20ng/mL；
所述EGF的浓度为10ng/mL；
所述氢化可的松的浓度为100ng/mL；
所述谷氨酰胺的浓度为3mmol/L。
bFGF为碱性成纤维细胞生长因子，又称为FGF-B，本发明采用的是hFGF-B。VEGF是血管内皮生长因子。IGF是***，本发明采用的是R3-IGF-1，又称人长链R3***。EGF是表皮生长因子，本发明采用的是hEGF，即人体表皮生长因子。
本发明培养基中，双抗包括青霉素和链霉素。本发明采用的是商业化100×青链霉素混合液，在培养基中的稀释倍数为1×。
本发明所述的培养基在分离骨髓内皮祖细胞中的应用。
本发明提供的培养基中，添加了适宜的生长因子和血清，能够通过差速贴壁的方式，从骨髓组织中分离出杂细胞(培养24小时贴壁的细胞)，并能够通过进一步的体外培养，诱导分化MNC(单个核细胞)得到内皮祖细胞。实验表明，以本发明提供的培养基分离骨髓内皮祖细胞分离的细胞量大，活率也较高。
本发明还提供了一种内皮祖细胞的分离方法包括：
步骤1：将骨髓与等体积高糖DMEM基础培养基混合后，与Ficoll液混合，经离心获得单个核细胞；
步骤2：所述单个核细胞经洗涤后，以本发明所述的培养基重悬，接种于包被人纤维连接蛋白的培养容器，培养1天后，取培养液离心，获得细胞沉淀；
步骤3：所述细胞沉淀以本发明所述的培养基重悬，接种于新的包被人纤维连接蛋白的培养容器，每2～3天补充培养基一次，培养一周后所得贴壁细胞为内皮祖细胞。
本发明中，所述Ficoll液与骨髓的体积比为1：1。
本发明中，步骤1所述离心的转速为700g，时间为30min；步骤2所述离心的转速为500g，时间为10min。
本发明中，所述洗涤采用含体积分数为0.2％的人血清的生理盐水。
本发明中，包被人纤维连接蛋白的培养容器优选为T25培养瓶。用于包被的纤维连接蛋白的浓度为2～20ng/mL。优选的，用于包被的纤维连接蛋白的浓度为10ng/mL。包被的条件为37℃，二氧化碳培养箱，30～60min。或者4℃包被10～14h。
本发明中，所述接种的密度为1×105cell/cm2～2×106cell/cm2。
本发明采用密度梯度离心法分离骨髓中的单个核细胞，通过差速贴壁的方法，在特定的培养基诱导下，实现体外分离培养EPC，本发明至少存在以下有益效果：
采用密度梯度离心的方法，对细胞的损伤小，还能够分离出特异的单个核细胞，并且此方法的花费较少，经济适用，更为EPC的大规模分离培养奠定了基础。
采用高糖DMEM基础培养基稀释骨髓，可以更好的保护骨髓中的细胞不受伤害而破损、死亡，并且离心后分层更加清晰，有助于单个核细胞的吸取。
采用24个小时差速贴壁的方法分离EPC细胞，可以将更快贴壁的骨髓间充质干细胞以及巨噬细胞与目的细胞EPC分离出来，得到较纯的EPC细胞。
采用自体外周血来制备血清，既可以使培养出的EPCs细胞可用于以后的临床实验，避免了外源动物血清的污染以及一些潜在风险，也可是使细胞更好的生长。
通过本发明中的特定培养基来培养EPC，可以使EPC快速的生长增殖，5～10ml的骨髓，在20天左右便可得到5×107个细胞。
附图说明
图1示实施例2培养的细胞7天形态；
图2示实施例2培养的细胞15天形态。
具体实施方式
本发明提供了骨髓内皮祖细胞的分离培养基和分离方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
1.抽取人骨髓5mL；
2.加入等体积高糖DMEM基础培养基，混匀；
3.缓慢加入到已装有Ficoll液的离心管中，700g离心30min；
4.将10ng/ml的FN加入T25中，放入二氧化碳培养箱37℃包被60min；
5.吸取中间单个核细胞层；
6.加入10ml含0.2％人血清的生理盐水，500g离心10min，重复一次；
7.弃上清液，用培养基1重悬，取50μL细胞悬液台盼蓝染色，细胞计数；
8.根据计数结果，按1×105/cm2的密度将细胞接种于已包被人纤维连接蛋白的T25培养瓶中；
9.24h后，取上清液，500g离心10min，将细胞沉淀重新接种于1个新的已包被人纤维连接蛋白的T25培养瓶中；
10.每2～3天补液一次，培养一周后换液，所得贴壁细胞即为EPC；
所述培养基1的配方为：M199+20vol％人血清+10ng/mL hFGF-B+20ng/mL VEGF+20ng/mL R3-IGF-1+10ng/mL hEGF+100ng/mL氢化可的松+3mmol/L-谷氨酰胺+1×双抗
实施例2
1.抽取人骨髓10mL；
2.加入等体积高糖DMEM基础培养基，混匀；
3.缓慢加入到已装有Ficoll液的离心管中，700g离心30min；
4.将10ng/ml的FN加入T25中，放入二氧化碳培养箱包被30～60min；
5.吸取中间单个核细胞层；
6.加入10ml含0.2％人血清的生理盐水，500g离心10min，重复一次；
7.弃上清液，用培养基1重悬，取50μL细胞悬液台盼蓝染色，细胞计数；
8.根据计数结果，按2×106cell/cm2的密度将细胞接种于已包被人纤维连接蛋白的T25培养瓶中；
9.24h后，取上清液，500g离心10min，将细胞沉淀重新接种于1个新的已包被人纤维连接蛋白的T25培养瓶中；
10.每2～3天补液一次，培养一周后换液，所得贴壁细胞即为EPC；
所述培养基1的配方为：M199+20vol％人血清+10ng/mL hFGF-B+20ng/mL VEGF+20ng/mL R3-IGF-1+10ng/mL hEGF+100ng/mL氢化可的松+3mmol/L-谷氨酰胺+1×双抗
对比例1
1.抽取人骨髓5mL；
2.加入等体积高糖DMEM基础培养基，混匀；
3.缓慢加入到已装有Ficoll液的离心管中，700g离心30min；
4.将10ng/ml的FN加入T25中，放入二氧化碳培养箱37℃包被60min；
5.吸取中间单个核细胞层；
6.加入10ml含0.2％人血清的生理盐水，500g离心10min，重复一次；
7.弃上清液，用培养基1重悬，取50μL细胞悬液台盼蓝染色，细胞计数；
8.根据计数结果，按1×105/cm2的密度将细胞接种于未包被人纤维连接蛋白的T25培养瓶中；
9.每2～3天补液一次，培养一周后换液；
所述培养基1的配方为：IMDM+20vol％人血清+10ng/mL hFGF-B+20ng/mL VEGF+20ng/mL R3-IGF-1+10ng/mL hEGF+100ng/mL氢化可的松+3mmol/L-谷氨酰胺+1×双抗
对比例2
1.抽取人骨髓5mL；
2.加入等体积高糖DMEM基础培养基，混匀；
3.缓慢加入到已装有Ficoll液的离心管中，700g离心30min；
4.将10ng/ml的FN加入T25中，放入二氧化碳培养箱37℃包被60min；
5.吸取中间单个核细胞层；
6.加入10ml含0.2％人血清的生理盐水，500g离心10min，重复一次；
7.弃上清液，用培养基1重悬，取50μL细胞悬液台盼蓝染色，细胞计数；
8.根据计数结果，按1×105/cm2的密度将细胞接种于已包被人纤维连接蛋白的T25培养瓶中；
9.每2～3天补液一次，培养一周后换液；
所述培养基1的配方为：M199+20vol％人血清+20ng/mL hFGF-B+2ng/mL VEGF+40ng/mL R3-IGF-1+10ng/mL hEGF+200ng/mL氢化可的松+抗坏血酸1.0μg/ml+青霉素0.1mg/ml+链霉素0.1mg/ml+两性霉素B 50ng/ml+肝素100U/ml+酚红0.62ng/ml。
对比例3
1.抽取人骨髓5mL；
2.加入等体积高糖DMEM基础培养基，混匀；
3.缓慢加入到已装有Ficoll液的离心管中，700g离心30min；
4.将10ng/ml的FN加入T25中，放入二氧化碳培养箱37℃包被60min；
5.吸取中间单个核细胞层；
6.加入10ml含0.2％人血清的生理盐水，500g离心10min，重复一次；
7.弃上清液，用培养基1重悬，取50μL细胞悬液台盼蓝染色，细胞计数；
8.根据计数结果，按1×104/cm2的密度将细胞接种于已包被人纤维连接蛋白的T25培养瓶中；
9.24h后，取上清液，500g离心10min，将细胞沉淀重新接种于1个新的已包被人纤维连接蛋白的T25培养瓶中；
10.每2～3天补液一次，培养一周后换液；
所述培养基1的配方为：M199+10vol％人血清+10ng/mL hFGF-B+20ng/mL VEGF+20ng/mL R3-IGF-1+10ng/mL hEGF+100ng/mL氢化可的松+3mmol/L-谷氨酰胺。
效果检测
对实施例1～对比例3分离细胞的效果进行检测，结果如表1：
表1分离效果
Figure BDA0001471962640000071
实施例2培养的细胞7天形态如图1；15天形态如图2。说明本发明提供的培养基和培养方法配合，能够有效分离得到骨髓内皮祖细胞。而各对比例的效果不论在细胞活率还是细胞量方面都显著低于实施例1～2，p<0.05。其中，实施例2所得细胞数量与实施例1相比存在显著性差异，p<0.05。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种培养基，其特征在于，由基础培养基、人血清、bFGF、VEGF、IGF、EGF、氢化可的松、谷氨酰胺和双抗组成；
所述基础培养基为M199培养基；
所述人血清的体积分数为20％；
所述bFGF的浓度为10ng/mL；
所述VEGF的浓度为20ng/mL；
所述IGF的浓度为20ng/mL；
所述EGF的浓度为10ng/mL；
所述氢化可的松的浓度为100ng/mL；
所述谷氨酰胺的浓度为3mmol/L；
所述双抗包括青霉素和链霉素，在培养基中的稀释倍数为1×。
2.权利要求1所述的培养基在分离人骨髓内皮祖细胞中的应用。
3.一种人骨髓内皮祖细胞的分离方法，其特征在于，包括：
步骤1：将人骨髓与等体积高糖DMEM基础培养基混合后，与Ficoll液混合，经离心获得单个核细胞；
步骤2：所述单个核细胞经洗涤后，以权利要求1所述的培养基重悬，接种于包被人纤维连接蛋白的培养容器，培养1天后，取培养液离心，获得细胞沉淀；
步骤3：所述细胞沉淀以权利要求1所述的培养基重悬，接种于新的包被人纤维连接蛋白的培养容器，每2～3天补充培养基一次，培养一周后所得贴壁细胞为内皮祖细胞。
4.根据权利要求3所述的分离方法，其特征在于，所述洗涤采用含体积分数为0.2％的人血清的生理盐水。
5.根据权利要求3所述的分离方法，其特征在于，所述接种的密度为1×105cell/cm2～2×106cell/cm2。
6.根据权利要求3所述的分离方法，其特征在于，
步骤1所述离心的转速为700g，时间为30min；
步骤2所述离心的转速为500g，时间为10min。
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