CN117069853B - 一种靶向曲妥珠单抗的抗体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了一种靶向曲妥珠单抗的抗体及其用途。本申请还提供了编码所述抗体的核酸、包含所述核酸的表达载体、包含所述核酸或所述表达载体的宿主细胞、检测曲妥珠单抗的检测试剂或试剂盒等。本申请制备的特异性结合曲妥珠单抗的抗体不但可以为血液中药物浓度监测提供技术支持,而且还可以作为ADA检测的阳性参照。
Description
技术领域
本申请通常涉及抗体领域。更具体地,本申请涉及一种靶向曲妥珠单抗的抗体的制备和用途。
背景技术
表皮生长因子受体家族 (epidermal growth factor receptor family, ErbBfamily) 包括erbB1(EGFR,HER1),erbB2(HER2),erbB3(HER3)和erbB4 (HER4)四个家族成员。HER2蛋白具有酪氨酸蛋白激酶活性,与EGFR家族其它成员异源二聚化发挥信号传导功能。HER2过表达导致受体胞质内酪氨酸残基自磷酸化,启动信号通路,导致细胞异常增殖,在乳腺癌、胃癌、结肠直肠癌和肺癌等肿瘤的发生发展过程发挥重要作用,HER2因而成为理想的肿瘤治疗靶点。
曲妥珠单抗是1990年开发的第一个抗HER2单克隆抗体,通过抑制受体二聚化、受体内化和降解、抑制 PI3K-AKT信号通路等多种机制干扰HER2信号传导通路。临床试验证实化疗联合曲妥珠单抗可提高 HER2阳性转移性乳腺癌女性的总生存期,因此曲妥珠单抗成为转移性和早期HER2阳性乳腺癌的一线治疗药物。
随着曲妥珠单抗在临床肿瘤应用范畴的不断扩大,需要检测血液中抗体的含量,进行药物的药代动力学分析;监测抗药抗体(Anti-drug antibody,ADA)的产生情况,指导临床合理用药,因此制备出能够抗曲妥珠单抗的抗体非常有必要。抗曲妥珠单抗的抗体识别曲妥珠单抗的可变区,并产生特异性结合的抗体。抗曲妥珠单抗的抗体可以分为竞争型(抗原阻断型)和非竞争型(抗原非阻断型)两种。
发明内容
为满足临床患者曲妥珠单抗的检测需求,本文中提供一种靶向曲妥珠单抗的独特型抗体。具体而言,本申请提供了以下技术方案。
在第一方面,本申请提供了特异性结合曲妥珠单抗的抗体或其抗原结合部分,其包含重链可变区和轻链可变区,所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3,其中按照Kabat编号***,所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和 LCDR3,其中所述HCDR1的氨基酸序列如SEQID NO:1所示,所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示,所述HCDR3的氨基酸序列如SEQID NO:3所示,所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示,所述LCDR2的氨基酸序列如SEQID NO:5所示,并且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示;或者按照IMGT编号***,所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示,所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示,所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示,所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示,所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示,并且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQID NO:13所示。
在第二方面,本申请提供了核酸分子,其编码第一方面所述的抗体或其抗原结合部分。
在第三方面,本申请提供了表达载体,其包含第二方面所述的核酸分子。
在第四方面,本申请提供了宿主细胞,其包含第二方面所述的核酸分子或第三方面所述的表达载体。
在第五方面,本申请提供了制备第一方面所述的抗体或其抗原结合部分的方法,其包括:
a) 培养第四方面所述的宿主细胞;和
b) 从所述宿主细胞中或所述宿主细胞的培养物上清中回收所述抗体或其抗原结合部分。
在第六方面,本申请提供了检测试剂或试剂盒,其包含第一方面所述的抗体或其抗原结合部分。
在第七方面,本申请提供了第一方面所述的抗体或其抗原结合部分用于检测受试者的生物样品中的曲妥珠单抗的用途。
在第八方面,本申请提供了第一方面所述的抗体或其抗原结合部分用于测定施用了曲妥珠单抗的患者的生物样品中的曲妥珠单抗的含量的用途。
本申请制备的特异性结合曲妥珠单抗的抗体不但可以为血液中药物浓度监测提供技术支持,而且还可以作为ADA检测的阳性参照。
附图说明
图1显示了曲妥珠单抗经Ide S酶切前后的SDS-PAGE电泳图,其中M: 蛋白Marker;1,2:非还原条件和还原条件下的曲妥珠单抗;3,4:非还原条件和还原条件下的曲妥珠单抗F(ab’)2片段;
图2显示了本申请制备的抗曲妥珠单抗的抗体9G6影响Her2阳性乳腺癌细胞SKBR3与曲妥珠单抗结合的流式细胞术检测结果,其中曲妥珠单抗与SKBR3细胞结合,峰图右移,加入免疫小鼠的血清阳性对照后峰图左移,9G6克隆抗体的结果与免疫血清相似,峰图左移;
图3显示了采用HEK293细胞表达的抗曲妥珠单抗的抗体9G6的SDS-PAGE电泳图和亲和力测定。A:抗曲妥珠单抗的抗体9G6的SDS-PAGE电泳结果,其中M:蛋白Marker;1: 非还原条件;2: 还原条件;B:抗曲妥珠单抗的抗体9G6与曲妥珠单抗F(ab’)2片段的Fortebio检测的结合及解离曲线;
图4显示了抗曲妥珠单抗的抗体9G6与曲妥珠单抗结合的拟合曲线;
图5显示了抗曲妥珠单抗的抗体的9G6竞争曲妥珠单抗与SKBR3细胞结合的拟合曲线。
发明的详细描述
提供以下定义和方法以更好地界定本申请以及在本申请实践中指导本领域普通技术人员。除非另作说明,本申请的术语按照相关领域普通技术人员的常规用法理解。
定义
本文使用的术语“约”指所记载的数字的±10%,例如约1%指的0.9%至1.1%的范围。
本文所用的术语“抗体”是指能显示期望的生物活性的任何形式的抗体或其片段。因此,它以最广义的含义使用,具体覆盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段,只要它们能显示期望的生物活性。
本文所用的术语“特异性结合”是本领域熟知的术语,并且测定抗体与抗原此类特异性结合的方法也为本领域所熟知。例如,在一些实施方案中,“特异性结合”是指抗体与预期的靶标结合,但不与其他靶标显著结合。相比与其他表位的结合,抗体以明显增加的亲和力和/或以更长的持续时间结合预期的靶表位。
本文所用的术语“抗原结合部分”包括抗体的基本上保留其结合活性的片段或衍生物。因此,术语“抗原结合部分”指全长抗体的一部分,通常是其抗原结合区或可变区。抗原结合部分的实例包括但不限于:Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2 片段、Fv片段、双体、单链抗体分子如sc-Fv以及从抗体片段形成的多特异性抗体。还认为,抗原结合部分可包括不会实质上改变其结合活性的保守氨基酸置换。
本文所用的术语“Fab片段”包含一条轻链以及一条重链的CH1和可变区。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。
本文所用的术语“Fab’片段”含有一条轻链以及一条重链的部分或片段,所述部分或片段含有VH结构域和CH1结构域以及在CH1和CH2结构域之间的区域,使得在2个Fab’片段的两条重链之间可以形成链间二硫键,以形成F(ab’)2 分子。
本文所用的术语“F(ab’)2 片段”含有两条轻链和两条重链,所述重链含有在CH1和CH2结构域之间的恒定区的一部分,使得在两条重链之间形成链间二硫键。F(ab’)2 片段因而由两个Fab’片段组成,而两个Fab’片段通过两条重链之间的二硫键连接在一起。
本文所用的术语“Fv片段”包含来自重链和轻链的可变区,但是缺少恒定区。
本文所用的术语“单链Fv”或“scFv”,是指包含抗体的VH结构域和VL结构域的抗体片段,其中这些结构域以单一多肽链形式存在。通常,Fv多肽还包含VH 结构域和VL结构域之间的多肽接头,所述接头使scFv能够形成期望的结构以进行抗原结合。
本文所用的术语“双体”指具有两个抗原结合位点的小抗体片段,所述片段在同一多肽链中包含重链可变结构域(VH)和与之连接的轻链可变结构域(VL)(VH-VL 或VL-VH)。通过使用短得不能让同一链上的两个结构域之间发生配对的接头,各结构域被迫与另一条链的互补结构域发生配对,从而产生两个抗原结合位点。
本文所用的术语“超变区”指抗体的负责抗原结合的氨基酸残基。超变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如轻链可变结构域中的残基24-34(LCDR-1)、50-56(LCDR-2)和89-97(LCDR-3)和重链可变结构域中的残基31-35(HCDR-1)、50-65(HCDR-2)和95-102(HCDR-3);Kabat 等人,(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest, 第5 版, Public Health Service, National Institutes of Health,Bethesda, Md.,和/或来自“超可变环”的氨基酸残基(即轻链可变结构域中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)和重链可变结构域中的残基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3);Chothia 和Lesk, (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917。“框架区”或“FR”残基,是指本文定义为CDR残基的超变区残基之外的那些可变结构域残基。
本文所用的术语“CDR”可由本领域公知的方式加以标注和定义,包括但不限于Kabat编号***、Chothia编号***或IMGT编号***,使用的工具网站包括但不限于AbRSA网站(http://cao.labshare.cn/AbRSA/cdrs.php)、abYsis网站(www.abysis.org/abysis/sequence_input/key_annotation/key_annotation.cgi)和IMGT网站(http://www.imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/DomainGapAlign.cgi#results)。本文所用的“CDR”是按照Kabat编号***或IMGT编号***进行编号的。
本文所用的术语“单克隆抗体”指由基本同质的抗体群体获得的抗体,即,除了可能在少量个体中存在自然发生的突变以外,组成群体的各个抗体是相同的。
本文所用的术语“EC50”是指半数最大效应浓度(concentration for 50% ofmaximal effect, EC50),指能引起50%最大效应的浓度。
本文所用的术语“亲和力”是指分子之间的结合力,其本质是一种非共价作用力。其体现了分子之间(例如抗体和抗原之间,受体和配体之间)结合的能力,测定分子之间的亲和力的方法是本领域内公知的,包括但不限于生物膜干涉技术(BLI)、固相放射免疫法(SP-RIA)、平衡透析法、结合抗原沉淀法、放射免疫法(RIA)、酶联免疫吸附实验(ELISA法)、表面等离子共振法(SPR)等。亲和力的大小可以用亲和力常数KD表示,亲和力常数KD越高,则两者结合的能力越强。
具体实施方式
随着曲妥珠单抗在临床肿瘤应用范畴的不断扩大,需要检测血液中抗体的含量,进行药物的药代动力学分析;监测抗药抗体的产生情况,指导临床合理用药,因此制备出能够抗曲妥珠单抗的抗体非常有必要。本申请的发明人通过利用曲妥珠单抗的一部分来免疫小鼠制备出抗曲妥珠单抗的抗体,经测试,其能够以高亲和力结合曲妥珠单抗,从而为精确检测血液中曲妥珠单抗的含量,进行药物的药代动力学分析提供了支持。
EGFR(epidermal growth factor receptor,简称为EGFR、ErbB-1或HER1)是表皮生长因子受体(HER)家族成员之一。该家族包括HER1(erbB1,EGFR)、HER2(erbB2,NEU)、HER3(erbB3)及HER4(erbB4)。HER家族在细胞生理过程中发挥重要的调节作用。EGFR广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面,EGFR信号通路对细胞的生长、增殖和分化等生理过程发挥重要的作用。EGFR分为三区:胞外配体结合区,跨膜区和胞内激酶区。
具体地,本申请提供了如下技术方案:
在第一方面,本申请提供了特异性结合曲妥珠单抗的抗体或其抗原结合部分,其包含重链可变区,所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3中的任意一项或多项,其中按照Kabat编号***,所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示,所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示,所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示;或者按照IMGT编号***,所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示,所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示,所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。
在优选的实施方案中,其中按照Kabat编号***,所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3,其中所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示,所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示,所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示;或者按照IMGT编号***,所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示,所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示,所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。
在一些实施方案中,所述抗体或其抗原结合部分还包含轻链可变区,所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3中的任意一项或多项,其中按照Kabat编号***,其中所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示,所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示,所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示;或者按照IMGT编号***,所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示,所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示,并且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。
在优选的实施方案中,所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3,其中按照Kabat编号***,所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示,所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO:5所示,所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示;或者按照IMGT编号***,所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示,所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示,并且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。
在优选的实施方案中,所述抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区,所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3,并且所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3,其中按照Kabat编号***,所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示,所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示,所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示,所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示,所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示,所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示;或者按照IMGT编号***,所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示,所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示,所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示,所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示,所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示,并且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。
在具体的实施方案中,所述抗原结合部分选自:Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fv片段、scFv片段、Fd片段或单域抗体。
在一些实施方案中,所述抗体为鼠源抗体。
在一些实施方案中,所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示,和/或所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
在一些实施方案中,所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示,并且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
在第二方面,本申请提供了核酸分子,其编码第一方面所述的抗体或其抗原结合部分。
在优选的实施方案中,本文所述的核酸可以是适合在宿主细胞中表达的密码子优化的核酸。例如根据密码子的简并性,其仍然编码同样的蛋白质。根据所用宿主细胞进行密码子优化的方法是本领域技术人员公知的。
在第三方面,本申请提供了表达载体,其包含第二方面所述的核酸分子。
可以使用任何合适的表达载体。例如,原核克隆载体包括来自大肠杆菌的质粒,如colEl、pCRl、pBR322、pMB9、pUC、pKSM和RP4。原核载体还包括噬菌体DNA如M13和其它丝状单链DNA噬菌体的衍生物。可用于酵母的载体的实例是2μ质粒。用于在哺乳动物细胞中表达的合适载体包括以下众所周知的衍生物:SV-40、腺病毒、逆转录病毒衍生的DNA序列以及衍生自功能性哺乳动物载体(如上述那些)和功能性质粒和噬菌体DNA的组合的穿梭载体。
另外的真核表达载体为本领域已知的(例如,P J. Southern&P. Berg, J. Mol.Appl. Genet, 1:327-341 (1982);Subramani等人, Mol. Cell. Biol, 1: 854-864(1981);Kaufinann&Sharp, "Amplification And Expression of SequencesCotransfected with a Modular Dihydrofolate Reductase Complementary DNA Gene,"J. Mol. Biol, 159:601-621 (1982);Kaufhiann&Sharp, Mol. Cell. Biol, 159:601-664 (1982);Scahill等人, "Expression And Characterization Of The Product Of AHuman Immune Interferon DNA Gene In Chinese Hamster Ovary Cells," Proc. Nat'lAcad. Sci USA, 80:4654-4659 (1983);Urlaub&Chasin, Proc. Nat'l Acad. Sci USA,77:4216-4220, (1980),将其全部通过引用并入本文)。
可用于本申请的表达载体含有至少一个表达控制序列,其与待表达的DNA序列或片段可操作连接。将控制序列***载体中以控制和调节克隆的DNA序列的表达。有用的表达控制序列的实例是lac***,trp***,tac***,trc***,噬菌体λ的主要操纵子和启动子区,fd外壳蛋白的控制区,酵母的糖酵解启动子,例如3-磷酸甘油酸激酶的启动子,酵母酸性磷酸酶的启动子,例如Pho5,酵母α-交配因子的启动子,以及来源于多瘤病毒、腺病毒、逆转录病毒和猿猴病毒的启动子,例如SV40的早期和晚期启动子和已知控制原核或真核细胞及其病毒或其组合的基因表达的其它序列。
在第四方面,本申请提供了宿主细胞,其包含第二方面所述的核酸分子或第三方面所述的表达载体。
在一些实施方案中,本文所述的宿主细胞为哺乳动物细胞。哺乳动物细胞可以包括但不限于CHO细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞、COS细胞和PER.C6细胞。本领域技术人员能够根据需要选择适合的宿主细胞。
在第五方面,本申请提供了制备第一方面所述的抗体或其抗原结合部分的方法,其包括:
a) 培养第四方面所述的宿主细胞;和
b) 从所述宿主细胞中或所述宿主细胞的培养物上清中回收所述抗体或其抗原结合部分。
本文公开的抗曲妥珠单抗单克隆抗体的制备方法可包括:在表达条件下培养宿主细胞,从而表达抗曲妥珠单抗单克隆抗体;分离和纯化表达的抗曲妥珠单抗单克隆抗体。利用上述方法,可以获得粗抗曲妥珠单抗单克隆抗体。然后通过纯化方法,包括基于曲妥珠单抗的亲和纯化、非变性凝胶纯化、HPLC或RP-HPLC、分子排阻、在蛋白A柱上纯化、或这些技术的任何组合,将抗曲妥珠单抗单克隆抗体纯化为基本均一的物质,例如在SDS-PAGE电泳上为单一条带。
在第六方面,本申请提供了检测试剂或试剂盒,其包含第一方面所述的抗体或其抗原结合部分。
在一些实施方案中,所述试剂盒还包含如何进行所述检测的说明书。
本文所述的抗体或其抗原结合部分可与可检测部分结合。示例性的可检测部分包括但不限于放射性同位素例如碘 125、碘-131、铯- 137、铱192和钴60、辣根过氧化物酶、异硫氰酸荧光素、生物素、碱性磷酸酶、化学发光剂如鲁米诺类等。本领域技术人员可以根据需要选择适合的可检测部分与本申请的抗体或其抗原结合部分结合,从而实现不同的检测目的。
在第七方面,本申请提供了第一方面所述的抗体或其抗原结合部分用于检测受试者的生物样品中的曲妥珠单抗的用途。
本文使用的术语“受试者”是指哺乳动物,包括但不限于灵长类动物、牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫以及诸如大鼠和小鼠的啮齿类动物。优选地,哺乳动物为非人类的灵长类或者人类。特别优选的哺乳动物是人。本文使用的“患者”和“受试者”可以互换使用。
在第八方面,本申请提供了第一方面所述的抗体或其抗原结合部分用于测定施用了曲妥珠单抗的患者的生物样品中的曲妥珠单抗的含量的用途。
在第七方面和第八方面的一些实施方案中,“生物样品”是指取自受试者(例如,人(或其它动物),例如患有癌症的人,或怀疑患有癌症的人,并且含有曲妥珠单抗的任何样品。生物样品可以是体液,例如血液,血浆,血清,尿液,***液,来自阴囊(例如睾丸的腹水)的液体,***冲洗液,胸腔液,腹水,脑脊液,唾液,汗液,泪液,痰液,支气管肺泡灌洗液,来自***的排出液体,来自身体的不同部分(例如,甲状腺,***)的吸出液体,眼内液体(例如房水)等。
本说明书和权利要求书中,词语“包括”、“包含”和“含有”意指“包括但不限于”,且并非意图排除其他部分、添加物、组分、或步骤。
应该理解,在本申请的特定方面、实施方案或实施例中描述的特征、特性、组分或步骤,可适用于本文所描述的任何其他的方面、实施方案或实施例,除非与之矛盾。
上述公开内容总体上描述了本申请,实施例是对本申请作进一步的说明,不应理解为对本申请的限制。实施例不包括对传统方法的详细描述,如那些用于构建载体和质粒的方法,将编码蛋白的基因***到载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法。这样的方法对于本领域具有普通技术的人员是众所周知的,并且在许多出版物中都有所描述,例如参见Sambrook, J., Fritsch, EF. and Maniais,T.(1989) Molecular Cloning:ALaboratory Manual,第二版,Cold spring Harbor Laboratory Press。
实施例1:曲妥珠单抗F(ab’)2片段的制备
将1 mg曲妥珠单抗(购自Roche)和1000 U Ide S蛋白酶(购自Acro)加入消化缓冲液(10mM磷酸钠,10mM NaCl,pH6.5), 混匀后于37℃下孵育60 分钟。 酶切产物用ProteinA 亲和层析结合Fc片段,收集流穿,再经镍柱去除Ide S蛋白酶,收集流穿,获得曲妥珠单抗F(ab')2片段。收获的蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳显示非还原状态分子量为100kD,还原后分子量为25kD,符合预期, 结果见图1。
实施例2:抗曲妥珠单抗的抗体的制备
2.1 曲妥珠单抗F(ab’)2 抗原免疫Balb/C小鼠
选择6-8周龄健康雌性Balb/C小鼠作为免疫对象。将400 mg曲妥珠单抗F(ab’)2蛋白,用生理盐水调整体积到0.5 ml,与0.5 ml 完全弗氏免疫佐剂(Sigma)混合,置于2 ml预冷注射器中,置于冰上的组织高速分散器乳化20 min,溶液变成乳白色。取适量乳化液滴于冰水中,静置10 min,液滴不散开,表明乳化完全,蛋白与免疫佐剂形成油包水状态;在Balb/C小鼠皮下的3个点注射乳化的抗原,每点100 ml。两周免疫一次,总共进行3次皮下免疫,后续两次皮下免疫佐剂调整为不完全弗氏佐剂(Sigma)。腹腔强化注射抗原50mg,每天一次,共注射3次。
2.2 免疫小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合
免疫小鼠脱颈处死后,75% 酒精浸泡消毒,打开腹腔,摘取脾脏置于培养皿中,加入3 ml PRIM1640 基础培养液,将小鼠脾脏置于70mm滤网上,用10ml注射器的针芯轻轻研磨小鼠脾脏,收集脾脏单细胞悬液。脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0用PEG 1500 (Roche,Cat.10783641001)进行细胞融合。融合后的细胞于300g 下离心5分钟,用100 ml HAT培养液重悬,加入10块铺有饲养层细胞的96孔板,于细胞培养箱中培养10-15天。
2.3 杂交瘤分泌抗体的ELISA检测
杂交瘤融合后第7天在孔板中可见克隆生长,取杂交瘤上清50 ml,用于ELISA检测。用浓度为1mg/ml的曲妥珠单抗F(ab’)2包被ELISA板,并在其中加入50 ml杂交瘤上清。设置免疫血清作为阳性对照,培养液空白对照。二抗选择HRP标记羊抗鼠IgG(博奥博奥龙生物科技有限公司,1:5000)。孵育完成后在酶标仪中以450 nm波长检测光密度。更换HAT培养液2天后再次进行ELISA筛选,两次均阳性的克隆进入流式细胞术(FACS)检测。
实施例3:抗曲妥珠单抗的抗体的鉴定
3.1 流式细胞术检测杂交瘤抗体与细胞结合活性
将复苏并至少传代培养3代以上的SKBR3细胞(ATCC编号:HTB-30)吹打均匀并收集细胞,250 g/min离心5min,重悬计数,调整细胞密度为2.5×106个细胞/mL。组别设为空白组,APC标记的大鼠抗人IgG Fc (BioLegend,克隆号:M1310G05)二抗组,曲妥珠单抗组,免疫血清阳性对照组和实验组(曲妥珠单抗+杂交瘤上清 50 μl)。实验组的管中加入50 μl杂交瘤上清,10μl曲妥珠单抗(终浓度为1 μg/ml) , 混匀后室温孵育10 min, 然后加入40μl的SKBR3细胞悬液, 室温孵育30 min,用3 mL 含有2% FBS的PBS缓冲液清洗,250 g/min离心5min,以50 μl的含有2% FBS的PBS缓冲液重悬;空白组加入0.5 μl的水;曲妥珠单抗组加入0.5μl的APC标记的大鼠抗人IgG Fc (BioLegend,克隆号:M1310G05),实验组和阳性对照组均加入0.5μl的APC标记的大鼠抗人IgG Fc 抗体;混匀后于室温避光孵育30 min。孵育完成后以含有2% FBS的PBS缓冲液清洗各组的试管,250 g/min离心5min,以100 μl含有2%FBS的PBS缓冲液重悬,上流式细胞仪(艾森,仪器型号:NovoCyte)检测。杂交瘤抗体为竞争型(抗原阻断型)抗体,FACS结果表现为APC通道相较于曲妥珠单抗组峰图左移,具体参见图2,从中选择出分泌抗曲妥珠单抗的抗体的杂交瘤细胞,编号为9G6克隆。
3.2. 杂交瘤抗体的制备
将杂交瘤细胞9G6克隆培养于含10% 低IgG血清的RPIM 1640 培养液中,收获培养好的细胞培养物于3000×g离心20 min,收集上清并用0.45 μm过滤器过滤。用20 mM PB和150 mM NaCl的混合缓冲液(pH 7.4)平衡5 mL Protein A (Thermo Scientific)亲和层析柱,流速5 mL/min,体积大于5CV。将过滤后的样品液以5 mL/min流速上样。上样完成后,用20 mM PB和150 mM NaCl的混合缓冲液(pH 7.4)洗涤Protein A亲和层析柱,流速5 mL/min。用50 mM柠檬酸(pH 3.0)缓冲液进行洗脱,流速5 mL/min,收集完整洗脱峰,同时用1MTris HCl (pH 9.0)缓冲液调节收集到的洗脱液的pH至7.0左右。Nanodrop微量分光光度计测定蛋白浓度,所得抗体命名为9G6。
3.3抗体可变区基因测序
将纯化后的抗体经小鼠单抗Ig类/亚类鉴定用ELISA试剂盒(博奥龙,BF06001)检测后确定抗抗体亚型为IgG1,轻链为k亚型。杂交瘤细胞9G6经TRIZOL提取总RNA,按照5’-RACE 试剂盒(生工生物,B605102-0010)说明书,反转录并经巢氏PCR方法扩增所得抗体的重链和轻链。PCR产物800bp左右,DNA片段割胶回收后克隆进入pClone007载体(擎科生物,pClone007 Vector Kit)。将所得的载体转化TSC-C01感受态细胞(擎科生物),挑选5个克隆测序,抗体轻链和重链可变区的氨基酸序列结果见SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10。
实施例4:抗曲妥珠单抗的抗体的表达及鉴定
4.1 抗体的表达
合成如上获得的重链和轻链核酸序列(江苏赛索飞生物科技有限公司),利用同源重组技术,将重链序列克隆进入小鼠IgG1骨架真核表达载体重链载体pQKXM13(北京免疫方舟医药科技有限公司,编号:pQKXM13),获得重链表达载体pQK9G6-H;将轻链序列克隆进入小鼠IgG1骨架真核表达载体κ轻链载体pQKXM16(北京免疫方舟医药科技有限公司,编号:pQKXM16),获得轻链表达载体pQK9G6-L。将重链表达载体pQK9G6-H和轻链表达载体pQK9G6-L共同转染HEK293细胞 (ATCC,编号:CRL-1573)进行表达。HEK293细胞的培养条件为 OPM-293 CD05无血清培养基(奥浦迈,Cat:81075-001),36.5℃,7.5%CO2,120 rpm悬浮培养。转染时,将重组质粒pQK9G6-H和pQK9G6-L按照1:1的重量比(DNA总量为100 mg)于10 mL OPM-293 CD05培养基中混合,随后加入100 mL PEI (浓度为3 mg/mL),迅速涡旋混匀,室温静止孵育15分钟。然后将该混合物加入至上述细胞培养物中。细胞在36.5℃,7.5% CO2,120rpm/min条件下继续培养7天收获表达的抗体。
4.2 抗体的纯化
将收获的细胞培养物于3000×g离心20 min,收集上清并用0.45 μm过滤器过滤。用5 mL Protein A亲和层析柱(GE)抗体,用50 mM柠檬酸(pH 3.0)缓冲液进行洗脱,流速5mL/min,收集完整洗脱峰,同时用1M Tris HCl (pH 9.0)缓冲液调节收集到的洗脱液的pH至7.0左右。将所获蛋白用SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色检测(图3A)。
4.3 抗体的鉴定
4.3.1 Fortebio测定抗体亲和力
将纯化后的抗体使用分子互作仪Fortebio Octet QK(Molecular Devices公司)测定其亲和力常数KD。通过Protein A的传感器(sensor)固定鼠源抗体,固定浓度为0.25 μM。曲妥珠单抗F(ab’)2片段按照600 nM,300 nM,150 nM和75 nM的浓度上样。所得到的抗体与曲妥珠单抗几乎不解离(图3B)。亲和力常数测定结果KD值小于<1.0E-12。
4.3.2 ELISA检测抗曲妥珠单抗的抗体与曲妥珠单抗的结合
酶标板包被曲妥珠单抗F(ab')2,蛋白浓度为1 g/ml,抗体9G6初始浓度为40μg/ml,倍比稀释,加入到ELISA板中,每孔100μl,PBS溶液作为空白对照。二抗选择HRP标记羊抗鼠IgG(博奥博奥龙生物科技有限公司,1:5000),在酶标仪中以450 nm波长检测光密度,结果如图4所示,GraphPad Prims 软件计算其 EC50为0.0613μg/ml。
4.3.3 流式细胞术检测抗曲妥珠单抗的抗体与曲妥珠单抗的结合
将胰酶消化后的SKBR3细胞吹打均匀并收集细胞,250 g/min离心5min,重悬计数,调整细胞密度为2.0×106个细胞/mL。组别设为空白组,二抗组,曲妥珠单抗组和实验组(曲妥珠单抗+抗体9G6)。实验组的管中加入曲妥珠单抗10 μg/ml,9G6抗体浓度从100 μg/ml依次倍比稀释9个浓度,混匀后室温孵育10 min, 然后加入80 μl的SKBR3细胞悬液, 室温孵育30 min,用3 mL 含有2% FBS的PBS缓冲液清洗,250 g/min离心5min,以50 μl的含有2%FBS的PBS缓冲液重悬;曲妥珠单抗组和实验组加入APC标记的大鼠抗人IgG Fc(BioLegend,克隆号:M1310G05) 0.5μl,混匀后于室温避光孵育30 min。孵育完成后以含有2% FBS的PBS缓冲液清洗,以100 μl含有2% FBS的PBS缓冲液重悬,上流式细胞仪(艾森,仪器型号:NovoCyte)检测,结果如图5所示。可见随着抗体9G6浓度的增加,曲妥珠单抗的荧光强度逐渐下降。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本申请的技术方案作了详尽的描述,但在这些技术方案的基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本申请精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本申请要求保护的范围。
序列表
SEQ ID NO:1 (9G6抗体按照Kabat编号***的HCDR1的氨基酸序列)
DYYIY
SEQ ID NO:2 (9G6抗体按照Kabat编号***的HCDR2的氨基酸序列)
RINPYNGATNYNQNFKD
SEQ ID NO:3 (9G6抗体按照Kabat编号***的HCDR3的氨基酸序列)
GGTGAWFAY
SEQ ID NO:4 (9G6抗体按照Kabat编号***的LCDR1的氨基酸序列)
SASSSVSYMH
SEQ ID NO:5 (9G6抗体按照Kabat编号***的LCDR2的氨基酸序列)
DTSKLAS
SEQ ID NO:6 (9G6抗体按照Kabat编号***的LCDR3的氨基酸序列)
QQWSSNPPT
SEQ ID NO:7 (9G6抗体的VH的氨基酸序列)
EVQLLESGPEL VKPGASVKIS CKASTYSFTD YYIYWVKQSH VKSLEWIGRI NPYNGATNYNQNFKDKAYLT VDKASSTAYM VLHSLTSEDS AVYYCSRGGT GAWFAYWGQG TLVTVSA
SEQ ID NO:8 (9G6抗体的VL的氨基酸序列)
QIVLTQS PAIMSASPGE KVTMTCSASS SVSYMHWYQQ KSGTSPKRWI YDTSKLASGVPARFSGSGSG TSYSLTISSM EAEDAATYYC QQWSSNPPTF GGGTKLEIK
SEQ ID NO:9 (9G6抗体按照IMGT编号***的HCDR1的氨基酸序列)
TYSFTDYY
SEQ ID NO:10 (9G6抗体按照IMGT编号***的HCDR2的氨基酸序列)
INPYNGAT
SEQ ID NO:11 (9G6抗体按照IMGT编号***的HCDR3的氨基酸序列)
SRGGTGAWFAY
SEQ ID NO:12 (9G6抗体按照IMGT编号***的LCDR1的氨基酸序列)
SSVSY
SEQ ID NO:13 (9G6抗体按照IMGT编号***的LCDR3的氨基酸序列)
QQWSSNPPT
SEQ ID NO:14(9G6抗体按照IMGT编号***的LCDR2的氨基酸序列)
DT。
Claims (10)
1.特异性结合曲妥珠单抗的抗体或其抗原结合部分,其包含重链可变区和轻链可变区,所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3,所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3,其中按照Kabat编号***,所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示,所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示,所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示,所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示,所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示,并且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示;或者按照IMGT编号***,所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示,所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示,所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示,所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示,所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示,并且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。
2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分,其中所述抗原结合部分选自:Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fv片段、scFv片段或Fd片段。
3. 如权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合部分,其中所述抗体为鼠源抗体,并且所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示,和/或所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
4.核酸分子,其编码权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合部分。
5.表达载体,其包含权利要求4所述的核酸分子。
6.宿主细胞,其包含权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述的表达载体。
7. 制备权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合部分的方法,其包括:
a) 培养权利要求6所述的宿主细胞;和
b) 从所述宿主细胞中或所述宿主细胞的培养物上清中回收所述抗体或其抗原结合部分。
8.检测试剂或试剂盒,其包含权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合部分。
9.权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合部分用于检测受试者的生物样品中的曲妥珠单抗的用途。
10.权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合部分用于测定施用了曲妥珠单抗的患者的生物样品中的曲妥珠单抗的含量的用途。
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