CN117069834A - 细粒棘球绦虫EgM123蛋白单克隆抗体的制备方法 - Google Patents

细粒棘球绦虫EgM123蛋白单克隆抗体的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了细粒棘球绦虫EgM123蛋白单克隆抗体的制备方法，涉及生物工程技术领域，包括：构建EgM123基因原核表达载体：pET28a‑EgM123，通过双酶切与基因测序验证，构建成功质粒转化BL21感受态细胞，I PTG诱导pET28a‑EgM123基因表达，SDS‑PAGE电泳分析蛋白大小及表达，并优化出最佳表达条件，将复性浓缩后的蛋白使用Western b l ot和ELI SA检测其反应原性，为制备EgM123蛋白单克隆抗体提供免疫蛋白。本发明制备的EgM123蛋白单克隆抗体可直接用于检测感染动物脏器组织抗原定位，节省检测诊断时间，实现高效定性诊断；同时，也可用于犬粪便虫体抗原的检测，实现对细粒棘球绦虫感染犬更为高效、便捷的诊断，利于对包虫病的净化，实现从感染源头到易感群体形成综合性的防控体系。

Description

细粒棘球绦虫EgM123蛋白单克隆抗体的制备方法
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及细粒棘球绦虫EgM123蛋白单克隆抗体的制备方法。
背景技术
细粒棘球绦虫，又称包生绦虫，主要分为两性，即囊形包虫和泡型包虫。成虫寄生于犬科类食肉动物的体内，幼虫称棘球蚴寄生于人和多种动物的内脏，导致多脏器内形成细粒棘球蚴包囊，引起一种严重的人畜共患慢性寄生虫疾病(又称棘球蚴病或包虫病)。犬是细粒棘球绦虫的终末宿主，因此，针对携带细粒棘球绦虫感染犬的诊断与筛查，对于牧区牛、羊受细粒棘球绦虫感染的威胁和疫区细粒棘球蚴病的净化至关重要。
细粒棘球绦虫的许多蛋白被证明在绦虫感染的过程中是具有抗原性的，它们可以作为制备防治包虫病的疫苗候选分子。这些蛋白主要包括耐热脂蛋白AgB、脂蛋白Ag5、P21、Eg6、Eg14、脂肪酸连接蛋白EgA31、以及Eg95、EgM家族等。研究发现EgM家族基因EgM4、EgM9和EgM123对细粒棘球绦虫病终末宿主具有较好的免疫原性。其中EgM123基因ORF为594bp，编码197个氨基酸的亲水可溶性蛋白质。主要分布于成熟细粒棘球蚴绦虫的睾丸中，主要调节***的产生和受精后表达一种虫卵膜蛋白。有研究表明，细粒棘球蚴绦虫的原头节感染实验犬35d后，开始形成受精卵，此阶段EgM123基因表达丰富，它在虫卵成熟的过程中起决定作用。
目前，现有技术中EgM123单克隆抗体的制备方法包括以下步骤：
(1)EgM123基因克隆
根据Genbank公布的EgM123基因组序列，设计特异性引物，再通过重组PCR方法将EgM123基因连接到PMD18-T克隆载体上，转化DH5α大肠杆菌，固体LB培养基37℃培养24h提取质粒，经PCR扩增、双酶切和基因序列鉴定。
(2)EgM123基因重组蛋白表达
通过酶切方法将EgM123基因连接到pcDNA3.1(+)真核表达载体，通过脂质体3000转染方法转染BHK-21细胞表达EgM123蛋白，经SDS-PAGE凝胶电泳鉴定EgM123蛋白的表达情况。
(3)EgM123基因重组蛋白纯化与浓度测定
将所表达的EgM123基因蛋白通过亲和层析方法，将细胞培养液中的EgM123基因蛋白浓缩纯化，再通过紫外分光光度计检测蛋白液的OD450值，通过BSA蛋白标准曲线计算EgM123基因蛋白浓度。
(4)BALB/c小鼠脾细胞的分离与培养
将纯化的EgM123蛋白按0.1m/只剂量，腹腔内注射免疫BALB/c小鼠，间隔2周免疫1次，连续免疫3次。将免疫后的小鼠颈椎脱臼处死，无菌解剖小鼠取出脾脏，研磨分离脾细胞，将分离的脾细胞用10％胎牛血清DMEM培养液稀释至1×108/ml。
(5)小鼠骨髓瘤细胞的培养
将培养的SP2/0细胞进行稀释，并接种于96孔板中，采用10％胎牛血清的DMEM培养液培养3d，每天收取3孔细胞进行计数。
(6)EgM123基因与杂交瘤细胞的融合
将稀释的SP2/0细胞和脾细胞，共同加入到50ml融合管中混均，离心弃上清将沉淀轻弹使之松散，在40℃水浴锅中向装有细胞的离心管中缓慢加入50％PEG4000(PH8.0)1ml，然后再向管中加入10％胎牛血清DMEM培养液终止PEG作用，再离心弃上清，加入HAT培养基吹散细胞，再将细胞悬液加入到96孔板中100ul/孔，37℃融合培养，分别在3、5、7、10、14d观察融合细胞生长状况。
(7)EgM123重组杂交瘤细胞的筛选
当融合杂交瘤长满细胞孔底1/2时，采用间接ELISA方法进行阳性杂交瘤细胞筛选。首先将EgM123基因蛋白浓缩，加入酶标板孔中包被过夜。经1％BSA抗原封闭后，向检测孔中加入待检杂交瘤上清液100ul/孔，同时设SP2/0细胞裂解液(阴性对照)，37℃温育，PBS洗涤3次；加入HRP标记二抗100ul/孔，37℃温育，PBS洗涤3次，加入显色液放置室温暗处，最后加入终止液终止反应，在酶标仪上OD450波长检测单个细胞孔OD450值。将两次检测P/N均≥2.1的杂交瘤细胞，确定为分泌单克隆抗体阳性的杂交瘤细胞，挑选状态良好的杂交瘤细胞进行克隆扩大培养。
(8)EgM123基因重组杂交瘤细胞的克隆与鉴定
①EgM123基因重组杂交瘤细胞的克隆
无菌条件下将阳性孔中的杂交瘤移入6cm的玻璃凹皿中，用吸管吸取单个细胞移到预先加有饲养细胞的96孔板内培养，观察孔内细胞集落生长情况，待克隆到8d用间接ELISA检测，两次阳性细胞孔进行扩大培养、传代和冻存。
②EgM123基因重组杂交瘤细胞染色体数目的鉴定
向传代24h的杂交瘤细胞中加入秋水仙素，37℃培养48h离心收集细胞，经0.3％KCL溶液低渗37℃处理；再向低渗处理的细胞悬液内滴加，预冷的甲醇、冰醋酸固定液固定，离心弃上清，再加入固定液吹散细胞，滴于载玻片上，自然干燥，用姬姆萨染液染色，流水冲洗玻片自然干燥，镜检观察杂交瘤细胞染色体数目的变化。
(9)EgM123基因单克隆抗体的大量制备、纯化与鉴定
①单克隆抗体的大量制备
将筛选的阳性杂交瘤细胞株以无菌PBS悬浮计数(1.2×106/0.5ml)，将杂交瘤细胞接种小鼠腹腔，10d后抽取腹水37℃作用2-4h，随后置4℃过夜，离心取上清，56℃灭活30min后，分装-20℃保存。
②单克隆抗体的纯化
将制备的单克隆抗体采用辛酸-硫酸铵法进行纯化。首先用醋酸盐缓冲液将腹水进行2：1稀释，室温下搅拌加入正辛酸，4℃澄清2-4h，12000rpm离心，将上清过0.22um滤器进行过滤；将过滤的上清液加入10倍浓度的PBS母液(PH7.4)，边搅拌边加入等体积4℃预冷饱和硫酸铵溶液，使溶液浓度达到50％，4℃过夜，离心弃上清，沉淀以1ml PBS重悬4℃透析48h以上，可将上清液浓缩10倍。
③单克隆抗体的浓度测定
采用紫外吸收法，测定纯化后的单克隆抗体浓度。吸取0.1ml浓缩蛋白液用生理盐水10倍稀释至1ml，在280nm处检测吸光值，按BSA蛋白定量标准曲线，计算单克隆抗体的蛋白含量。
④单克隆抗体纯度的鉴定
制备SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶，将纯化蛋白液与样品缓冲液等量混合100℃煮沸5min，再将样品加入到SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳4-6h，电泳完毕后经考马氏亮蓝染色过夜，脱色液脱色后观察蛋白条带数目。如纯化蛋白会出现单一目的蛋白条带，而未经纯化的单克隆抗体则出现多个蛋白杂带。
⑤单克隆抗体效价的测定
将所纯化的蛋白液进行倍比稀释，同时以SP2/0上清作对照，用简接ELISA方法测出作同等稀释倍数的单抗和阴性腹水的OD450值，二者P/N≥2.1的最高稀释倍数为单克隆抗体的效价。
由上所述，现有技术中尚缺少能够同时检测感染动物(牛、羊、犬)血清的单克隆抗体，不方便直接用于检测感染动物脏器组织抗原定位，检测诊断的便捷性及效率不佳。因此，本发明旨在设计提供一种细粒棘球绦虫EgM123蛋白单克隆抗体的制备方法，以解决上述问题。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述问题，提供细粒棘球绦虫EgM123蛋白单克隆抗体的制备方法，本发明方法制备的EgM123蛋白单克隆抗体可直接用于检测感染动物脏器组织抗原定位，节省检测诊断时间，实现高效定性诊断；同时，也可用于犬粪便虫体抗原的检测，实现对细粒棘球绦虫感染犬更为高效、便捷的诊断，利于对包虫病的净化，实现从感染源头到易感群体形成综合性的防控体系。
为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：细粒棘球绦虫EgM123蛋白单克隆抗体的制备方法，构建EgM123基因原核表达载体：pET28a-EgM123，通过双酶切与基因测序验证，构建成功质粒转化BL21感受态细胞，IPTG诱导pET28a-EgM123基因表达，SDS-PAGE电泳分析蛋白大小及表达，并优化出最佳表达条件，将复性浓缩后的蛋白使用Westernblot和ELISA检测其反应原性，为制备EgM123蛋白单克隆抗体提供免疫蛋白，具体包括以下步骤：
S1、构建EgM123基因原核表达载体：
(1)利用EcorI和XhoI限制性内切酶将pcDNA3.1/His-EgM123基因重组质粒和pET28a载体双酶切，设置反应体系与反应条件，按照胶回收说明书回收酶切产物；
(2)连接产物转化DH5α，将菌液涂布于LB固体培养基，在37℃培养箱过夜培养；
(3)次日观察菌落生长，在LB液体培养基中加入单菌落过夜培养，待菌液出现浑浊，进行菌液PCR，1％琼脂糖电泳跑胶验证；
(4)将菌液PCR结果阳性的菌液按照天根小提质粒试剂盒的提取方法进行质粒提取；使用单滴分光计检测质粒浓度，将260/280值在1.8～2.0之间的质粒使用EcorI和XhoI内切酶双酶切，酶切体系为25μL；酶切产物使用1％琼脂糖电泳验证；
(5)将酶切条带正确的质粒测序；
S2、EgM123蛋白的原核表达：
(1)将S1中连接成功的质粒与pET28a载体分别转化BL21，检测蛋白EgM123基因表达，方法同步骤S1中转化DH5α相同；
(2)在LB液体培养基中加入单菌落培养12h，次日菌液PCR检测。
(3)将阳性菌液按照1:100加入到液体培养基培养，至OD600nm值为0.6时，加入IPTG使终浓度达0.4mM培养3h；
(4)将菌液离心弃去上清，PBS重悬菌液再次离心弃去上清；
(5)使用PBS将菌液重悬，冰上超声15min，超声3s停5s，将超声后菌液低温离心，分装上清与沉淀，使用SDS-PAGE电泳检测；
S3、EgM123蛋白原核表达诱导条件的优化：
分别针对诱导温度、IPTG浓度和诱导时间优化EgM123蛋白原核表达诱导条件；
S4、EgM123蛋白的纯化、复性及浓缩：
根据按照步骤S3中优化的诱导条件，诱导1L菌液，收集菌液沉淀，使用PBS洗涤三次，将沉淀分装到4个50mL离心管内，使用包涵体BindingBuffer超声菌体，使目的蛋白溶解于上清中，将超声后菌液于5000r/min低温离心10min，回收上清低温保存，进行下一步纯化；
S5、EgM123蛋白的反应原性检测：
A、Westernblot检测EgM123蛋白的表达；
B、ELISA检测EgM123的反应原性。
进一步地，所述步骤S3的具体方法为：
A、诱导温度的优化：培养四管20mL菌液至OD600nm值为0.6，三管内加入IPTG至终浓度0.4mM，分别置于16℃、25℃和37℃过夜诱导表达，其中未加入IPTG诱导菌液置于37℃过夜培养作为对照，收集菌液沉淀PBS超声，分别取超声后上清与沉淀每孔上样20μL进行检测；
B、IPTG浓度的优化：培养四管20mL菌液至OD600nm值为0.6，加入IPTG至终浓度0.3mM、0.6mM、0.9mM和1.1mM于37℃过夜诱导表达，收集菌液沉淀PBS超声，分别取不同IPTG浓度诱导后沉淀每孔上样20μL进行检测；
C、诱导时间的优化：培养四管20mL菌液至OD600nm值为0.6，分别加入IPTG至终浓度为0.3mM，置于37℃分别诱导1h、3h、5h、7h，收集菌液沉淀PBS超声，分别取不同诱导时间沉淀每孔上样20μL检测。
进一步地，步骤S4的具体方法包括：
A、EgM123蛋白的纯化：
(1)抽取1mL的Ni-NTA树脂加入到柱中，垂直放置使液体通过重力流出；
(2)柱子内加入8mL包涵体BindingBuffer缓冲液；以0.5～1mL/min将缓冲液流出柱子；
(3)将步骤(2)中回收的上清直接上柱，放于4℃冰箱3h，使EgM123蛋白与Ni-NTA树脂结合；
(4)收集流穿液到15mL离心管内，如有多余上清，可重复步骤(3)；往柱内加入8mL包涵体BindingBuffer缓冲液，将柱子内杂蛋白流出，重复2～3次，直到OD280nm接近基线；
(5)加入8mL包涵体ElutionBuffer，放于4℃冰箱1h，收集洗脱液，重复此步骤2～3次，直至OD280nm接近基线，将流穿液与洗脱液分别进行凝胶电泳，检测纯化效果。洗脱液保存于-80℃冰箱备用；
B、EgM123蛋白的复性和浓缩：
采用透析复性的方法，将纯化后的蛋白使用单滴分光计检测其浓度并稀释到0.1mg/mL；提前配置分别含6M、3M、0M尿素的透析液并置于4℃预冷，将目的蛋白加入透析袋中，分别在6M，3M，0M尿素的透析液中放置12h，最后移入PBS内放置12h；将复性后的蛋白倒于玻璃瓶内放置-80℃冰箱成固体状，使用真空冻干机在真空度为1P、冷阱温度为-70℃时冻干，待使用时使用PBS稀释。
进一步地，步骤S5中的步骤A的具体方法为：
(1)将复性的EgM123蛋白进行SDS-PAGE电泳，使用80V电压将浓缩胶跑完，在使用120V电压将溴酚蓝跑到凝胶底部；
(2)裁剪一块和凝胶一样大的PVDF膜，将膜于甲醇内激活20s；按照阳极、无纺纤维垫、滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸、无纺纤维垫、阴极顺序排列，在冰上转膜；电压90V时间90min；
(3)使用TBST每次5min洗膜3次；5％脱脂乳室温封闭2h；
(4)按照上一步骤洗膜三次；将膜分别于His单克隆抗体中(1:1000稀释)和细粒棘球绦虫EgM123多克隆抗体(1:2500稀释)在4℃过夜孵育；
(5)次日洗膜3次；分别使用HRP标记的山羊抗小鼠IgG和兔抗犬IgG(1:10000稀释)于37℃孵育2h；
(6)洗膜3次；加入显色液作用1min后曝光观察抗原抗体结合结果。
进一步地，步骤S5中的步骤B的具体方法为：
(1)在96孔板上使用方针法纵向分别包被0.05μg、0.2μg、0.4μg、0.6μgEgM123蛋白于4℃过夜；
(2)PBST洗板三次，每次5min；5％脱脂乳37℃封闭2h；
(3)按照上一步骤洗板三次；将EgM123多克隆抗体横向分别稀释成1:1000、1:2000、1:4000、1:8000于37℃孵育2h；
(4)洗板三次；加入HRP标记兔抗犬(1:10000稀释)二抗37℃孵育1h；
(5)洗板三次；每孔加入TMB显色液，避光15min，加入同体积的ELISA终止液，立即使用酶标仪读取OD450nm值。
以下为本发明中的pET28a-EgM123序列：
TTGGGGGGTACATTCCCCTCTAGAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGCGGATCCGAATTCATGGAACCGGTGAACTTTGCGTGCCCGTTCATGTTCAAGGCGCAGCCGATCCCGATGCCGGAGTTCATTCTGACCCCGCCACCACCGCCGCCAGTGCAAAAGTGCATCTACAGCACGATGTTCTTTCCGGAGCCGATGACCGAAGTGGTGCTCCCGACGAAATGCGCCATGCAGTGCCCATGTCCGACGGTGCTGATGGCGGAACCGACCACGGAGGTGATCTTCCCGCCGCAGCACATGAAGAAGTTCCCGTGCCACAGTGTTCTGATGGCGGAGCCGACCACGAAGTTCATCTTTCCGAGTCAGCCGATGAAGAAATTCCCGTGCCATAGCGTGCTGAAGGCCGAGCCAACCACGAAAGTGATTCTGCCAAGCCAAACGCTCAAGAAGTGCAGTTGCAGTACGGTGCTCAAGACCGAGCCAAAGGCGGAAGTGATCCTCAGCAGCCAACCGGTGCAAGATTGCAGTTGTCCAAGCGAGGTTAGCCAGAGCAGCAAGAGCAGCAAAGAGTTCCCGAATTGCGCGGAGGATGAAGAGCTCACCGACGGCCTCCAGAGTCTGTTCAAGCTCTTCCGCGCGCTGAAGACCAAATAACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCCTTGGAGAGGGGTT
与现有技术相比，本方案的有益效果：
1、本发明对细粒棘球绦虫EgM123基因进行基因表达载体构建、蛋白表达、小鼠注射免疫、脾脏淋巴细胞杂交瘤细胞融合试验，制备出“细粒棘球绦虫EgM123蛋白单克隆抗体”，便于建立EL I SA检测方法，为临床犬细粒棘球绦虫感染的筛查和EgM123基因免疫功能研究提供精确检测试剂；
2、此外，本发明方法能够应用于降低终末宿主(犬)对细粒棘球蚴的感染率，减少犬体内细粒棘球绦虫的发育和和孕节排出情况，以实现从感染源头到易感群体形成综合性的防控体系，为解决我国广大农牧区群众和养殖动物免受包虫病的威胁，在我国西北五省和内蒙古等农牧区的应用前景和社会效益极为显著。
附图说明
图1是本发明实施例中pET28a-EgM123菌液PCR扩增；
图2是本发明实施例中pET28a-EgM123酶切结果；
图3是本发明实施例中测序比对结果；
图4是本发明实施例中EgM123蛋白可溶性表达(M:蛋白marker；1/2:IPTG诱导pET28a-EgM123的上清与沉淀；3/4:IPTG诱导pET28a的上清与沉淀；5/6:未经IPTG诱导的pET28a-EgM123)；
图5是本发明实施例中EgM123蛋白诱导温度优化(M:蛋白marker；1/2/3:分别为16℃，25℃，37℃诱导超声后菌液上清；4:未诱导菌液超声后上清；5/6/7:分别为16℃，25℃，37℃诱导超声后菌液沉淀；8:未诱导菌液超声后沉淀)；
图6是本发明实施例中不同温度诱导下灰度值(1、2和3分别为16℃，25℃和37℃)；
图7是本发明实施例中EgM123蛋白诱导时间优化(M:蛋白marker；1/2/3/4:分别为诱导1h，3h，5h，7h菌液蛋白沉淀)；
图8是本发明实施例中不同诱导时间下灰度值(1、2、3、4分别为1h、3h、5h、7h)；
图9是本发明实施例中EgM123蛋白诱导浓度的优化；
图10是本发明实施例中不同IPTG浓度诱导下灰度值；
图11是本发明实施例中亲和层析纯化pET28a-EgM123蛋白情况(M:蛋白marker；1/2:蛋白纯化后；3:未进行纯化前)；
图12是本发明实施例中12His单抗与EgM123蛋白结合的Westernblot结果；
图13是本发明实施例中EgM123多抗与EgM123蛋白结合的Western blot结果；
图14是本发明实施例中四只小鼠三免后血清抗体水平；
图15是本发明实施例中一号小鼠各免疫期抗体水平；
图16是本发明实施例中细胞形态(A:杂交瘤细胞，B:SP2/0
A:hybridoma cells,B:SP2/0)；
图17是本发明实施例中染色体吉姆萨染色400×(A:杂交瘤细胞；B:SP2/0细胞A:HybridomaCells；B:SP2/0Cells)；
图18是本发明实施例中抗体亚型检测；
图19本发明实施例中感染羊血清筛选。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明的实施例及附图，对本发明的技术方案进行进一步详细地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
实施例：
细粒棘球绦虫EgM123蛋白单克隆抗体的制备方法，构建EgM123基因原核表达载体：pET28a-EgM123，通过双酶切与基因测序验证，构建成功质粒转化BL21感受态细胞，IPTG诱导pET28a-EgM123基因表达，SDS-PAGE电泳分析蛋白大小及表达，并优化出最佳表达条件，将复性浓缩后的蛋白使用Western blot和ELISA检测其反应原性，为后续制备EgM123蛋白单克隆抗体提供免疫蛋白；具体包括以下步骤：
步骤一：
(1)利用EcorI和XhoI限制性内切酶将pcDNA3.1/His-EgM123基因重组质粒和pET28a载体双酶切，按照表2-3设置反应体系与反应条件，按照胶回收说明书回收酶切产物。
(2)连接产物转化DH5α，将菌液涂布于LB固体培养基，在37℃培养箱过夜培养。
(3)次日观察菌落生长。在LB液体培养基中加入单菌落过夜培养，待菌液出现浑浊，按照表1和表2进行菌液PCR，1％琼脂糖电泳跑胶验证。
表1 EgM123基因PCR反应体系
表2 EgM123基因PCR反应条件
(4)将菌液PCR结果阳性的菌液按照天根小提质粒试剂盒的提取方法质粒提取。使用单滴分光计检测质粒浓度，将260/280值在1.8～2.0之间的质粒使用EcorI和XhoI内切酶双酶切，酶切体系为25μL，酶切条件同上。酶切产物使用1％琼脂糖电泳验证。
(5)酶切条带正确的质粒送生物公司测序。
步骤二：EgM123蛋白的原核表达
(1)将上一步连接成功的质粒与pET28a载体分别转化BL21，检测蛋白EgM123基因表达，方法同转化DH5α相同。
(2)在LB液体培养基中加入单菌落培养12h，次日菌液PCR检测。
(3)将阳性菌液按照1:100加入到液体培养基培养，至OD600nm值为0.6时，加入IPTG使终浓度达0.4mM培养3h。
(4)将菌液离心弃去上清，PBS重悬菌液再次离心弃去上清。
(5)使用PBS将菌液重悬，冰上超声15min，超声3s停5s，将超声后菌液低温离心，分装上清与沉淀，使用SDS-PAGE电泳检测。
步骤三：EgM123蛋白原核表达诱导条件的优化
A、不同诱导温度对EgM123蛋白表达的影响
培养四管20mL菌液至OD600nm值为0.6，三管内加入IPTG至终浓度0.4mM，分别置于16℃、25℃和37℃过夜诱导表达，其中未加入IPTG诱导菌液置于37℃过夜培养作为对照，收集菌液沉淀PBS超声，分别取超声后上清与沉淀每孔上样20μL进行检测。
B、不同IPTG浓度对EgM123蛋白表达的影响
培养四管20mL菌液至OD600nm值为0.6，加入IPTG至终浓度0.3mM、0.6mM、0.9mM和1.1mM于37℃过夜诱导表达，收集菌液沉淀PBS超声。分别取不同IPTG浓度诱导后沉淀每孔上样20μL进行检测。
C、不同诱导时间对EgM123蛋白表达的影响
培养四管20mL菌液至OD600nm值为0.6，分别加入IPTG至终浓度为0.3mM，置于37℃分别诱导1h、3h、5h、7h，收集菌液沉淀PBS超声。分别取不同诱导时间沉淀每孔上样20μL检测
步骤四：EgM123蛋白的纯化、复性及浓缩
按照步骤三中的诱导条件，诱导1L菌液，收集菌液沉淀，使用PBS洗涤三次，将沉淀分装到4个50mL离心管内。使用包涵体Binding Buffer超声菌体，使目的蛋白溶解于上清中，将超声后菌液于5000r/min低温离心10min，回收上清低温保存，进行下一步纯化。
EgM123蛋白的纯化：
(1)抽取1mL的Ni-NTA树脂加入到柱中。垂直放置使液体通过重力流出。
(2)柱子内加入8mL包涵体Binding Buffer缓冲液。以0.5～1mL/min将缓冲液流出柱子。
(3)将上一步回收的上清直接上柱，放于4℃冰箱3h，使EgM123蛋白与Ni-NTA树脂结合。
(4)收集流穿液到15mL离心管内，如有多余上清，可重复步骤三。往柱内加入8mL包涵体Binding Buffer缓冲液，将柱子内杂蛋白流出，重复2～3次，直到OD280nm接近基线。
(5)加入8mL包涵体Elution Buffer，放于4℃冰箱1h，收集洗脱液，重复此步骤2～3次，直至OD280nm接近基线，将流穿液与洗脱液分别进行凝胶电泳，检测纯化效果。洗脱液保存于-80℃冰箱备用。EgM123蛋白的复性和浓缩：
采用透析复性的方法，将纯化后的蛋白使用单滴分光计检测其浓度并稀释到0.1mg/mL。提前配置分别含6M、3M、0M尿素的透析液并置于4℃预冷，将目的蛋白加入透析袋中，分别在6M，3M，0M尿素的透析液中放置12h，最后移入PBS内放置12h。将复性后的蛋白倒于玻璃瓶内放置-80℃冰箱成固体状，使用真空冻干机在真空度为1P、冷阱温度为-70℃时冻干，待使用时使用PBS稀释。
步骤五：EgM123蛋白的反应原性检测：
A、Western blot检测EgM123蛋白的表达：
(1)将复性的EgM123蛋白进行SDS-PAGE电泳，使用80V电压将浓缩胶跑完，在使用120V电压将溴酚蓝跑到凝胶底部。
(2)裁剪一块和凝胶一样大的PVDF膜，将膜于甲醇内激活20s。按照阳极、无纺纤维垫、滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸、无纺纤维垫、阴极顺序排列，在冰上转膜。电压90V时间90min。
(3)使用TBST每次5min洗膜3次。5％脱脂乳室温封闭2h。
(4)按照上一步骤洗膜三次。将膜分别于His单克隆抗体中(1:1000稀释)和细粒棘球绦虫EgM123多克隆抗体(1:2500稀释)在4℃过夜孵育。
(5)次日洗膜3次。分别使用HRP标记的山羊抗小鼠IgG和兔抗犬IgG(1:10000稀释)于37℃孵育2h。
(6)洗膜3次。加入显色液作用1min后曝光观察抗原抗体结合结果。
B、ELISA检测EgM123的反应原性：
(1)在96孔板上使用方针法纵向分别包被0.05μg、0.2μg、0.4μg、0.6μg EgM123蛋白于4℃过夜。
(2)PBST洗板三次，每次5min。5％脱脂乳37℃封闭2h。
(3)按照上一步骤洗板三次。将EgM123多克隆抗体横向分别稀释成1:1000、1:2000、1:4000、1:8000于37℃孵育2h。
(4)洗板三次。加入HRP标记兔抗犬(1:10000稀释)二抗37℃孵育1h。
(5)洗板三次。每孔加入TMB显色液，避光15min，加入同体积的ELISA终止液，立即使用酶标仪读取OD450nm值。
以下为本发明实施例的研究结果：
pET28a-EgM123原核表达载体的鉴定：
将菌液进行PCR后，经1％琼脂糖凝胶显示在500～750bp之间有一条特异条带结果见图1。质粒经EcorI和XhoI内切酶酶切后，经1％琼脂糖凝胶显示酶切条带位置与目的条带位置一致结果见图2。将测序结果比对序列正确见图3。
pET28a-EgM123在BL21中的诱导表达及条件优化结果：
经SDS-PAGE电泳检测得出EgM123蛋白以包涵体形式表达，大小为28KD结果见图4。
(1)不同诱导温度下蛋白表达结果
经过不同温度诱导表达的上清与沉淀，通过Image J软件分析。在16℃、25℃和37℃诱导表达后，均以包涵体形式表达结果见图5。且经过灰度值分析随着温度升高，蛋白表达量增多，在37℃时表达量达到最高结果见图6。
(2)不同诱导时间下蛋白表达结果
经过1h、3h、5h和7h诱导表达的上清与沉淀，通过Image J软件分析。在不同诱导时间诱导表达后，均在菌液沉淀内检测到EgM123蛋白结果见图7；经过灰度值分析在诱导后3h和5h的表达量差别不明显，在诱导7h时表达量最高结果见图8。
(3)不同IPTG浓度诱导蛋白表达结果
经过不同IPTG浓度表达的上清与沉淀，通过Image J软件分析。随着IPTG浓度增高表达量增加，但是随着IPTG浓度的再次增加，诱导表达量有所下降。因此，IPTG浓度为0.9mM时为最佳表达浓度结果见图9和图10。
EgM123蛋白纯化结果
使用亲和层析方法纯化EgM123蛋白，经蛋白电泳检测EgM123蛋白纯化效果。可在25kDa与35kDa之间见单一条带，结果见图11。
EgM123蛋白的反应原性：
经Western blot验证EgM123蛋白可与犬EgM123多克隆抗体和His单克隆抗体特异性结合，在25KDa与35KDa之间有一特异性条带结果见图12和图13。
以纯化的EgM123蛋白为抗原，采用间接ELISA方法，检测在450μm处OD值使用P/N算得其最佳蛋白包被量为0.4μg，一抗最佳稀释倍数为1:8 000结果见表3。
表3 EgM123蛋白方针法测得其OD值及其P/N值
BALB/c的免疫程序：
具体免疫步骤：
(1)将上一章EgM123蛋白冻干粉末用1mL PBS溶解，使用紫外分光计测量其浓度。
(2)每只小鼠注射100μg EgM123蛋白，免疫4只小鼠，背部皮下多点注射。抽取800μg EgM123蛋白液体，与同体积弗氏完全佐剂混合乳化。
(3)两周后进行眼窝采血，分离一免后阳性血清。第二次免疫，抽取800μg EgM123蛋白，与同体积弗氏不完全佐剂混合乳化，每只小鼠注射100μg EgM123蛋白免疫4只小鼠。
(4)重复步骤3，进行第三次免疫。
(5)两周后再次进行眼窝采血，分离三免后阳性血清。
免疫小鼠血清效价的检测
(1)间接ELISA方法分别检测三次免疫后小鼠血清效价。按照上一章确定最佳包被浓度每孔包被0.4μg EgM123蛋白，4℃过夜包被。
(2)次日洗板三次。5％脱脂乳37℃封闭2h。
(3)洗板三次。将每次免疫后血清与阴性对照血清按照1:1 600开始倍比稀释至1:25 600加至96孔内，将犬EgM123多克隆抗体血清1:8 000稀释加入孔内作阳性对照。37℃孵育2h。
(4)洗板三次。使用兔抗犬和山羊抗小鼠作为二抗(1:10 000稀释)于37℃孵育1h。
(5)洗板三次。每孔加入TMB显色液，避光15min，加入同体积ELISA终止液，立即使用酶标仪读取OD450nm值。
骨髓瘤细胞的复苏、传代与冻存
骨髓瘤细胞的复苏：
(1)于融合前一周进行细胞复苏。提前准备好细胞复苏需要的试剂。需先将水浴锅温度升至42℃，细胞间的超净台在每次使用前先用紫外消毒0.5h，将细胞所需培养液温度升至室温。
(2)从液氮中拿出细胞后放置水浴锅内，待溶解后立即1000r/min离心10min。
(3)在超净台中将冻存液弃去，加1mL培养液将细胞沉淀悬起。
(4)离心弃上清，再次加入1mL细胞培养液将沉淀悬起移入T25瓶内，37℃，5％CO2无菌恒温培养箱内培养，每天半换液。细胞长至80％～90％进行传代。
骨髓瘤细胞的传代：
(1)提前将所需试剂在超净台内用紫外照射并放置常温以备使用。
(2)将T25瓶内培养液弃去，使用D-hanks将细胞清洗两次。
(3)加入5mL完全培养液使用移液器轻柔吹打数次，将细胞完全从瓶底吹下。
(4)加入15mL完全培养液，将所有细胞悬液分装两个T25瓶。37℃，5％CO2无菌恒温培养箱内培养。
骨髓瘤细胞的冻存：
(1)在4℃冰箱预冷冻存液。
(2)消化准备冻存的细胞，离心弃上清。
(3)预冷的冻存液加入细胞沉淀，成细胞悬液后移入冻存管内。
(4)4℃冰箱放置0.5h，-20℃冰箱放置1h，再次移入液氮口放置2h，之后每小时往液氮里移3cm，直至移到液氮内。
饲养层细胞的制备：
在融合前一天准备饲养层细胞，具体步骤如下：
(1)准备制备饲养层细胞所需试剂与耗材，器械、平皿、离心管、注射器提前高压备用，DMEM、HAT基础培养基需提前置于常温。
(2)眼眶采血收集阴性血清-20℃备用，颈椎脱臼处死小鼠于医用酒精中消毒5min后，移至细胞间，再次消毒5min，无菌取出小鼠放于平皿中。
(3)打开腹腔。小心不要触及腹膜，用75％酒精消毒腹膜表面。
(4)注射器抽l0mL DMEM培养液注入小鼠腹腔，晃动腹部3～4min。
(5)将腹腔内液体使用注射器缓慢抽出，移到离心管内，离心弃上清。
(6)使用10mL含HAT培养基重悬饲养细胞，加入96孔板中，37℃，5％CO2无菌恒温培养箱内培养。
脾细胞的制备：
根据小鼠免疫的检测结果，在进行细胞融合前选择检测出效价最高的小鼠，三天前腹腔注射100μg EgM123蛋白冲击免疫。融合当天，制脾细胞悬液。具体步骤如下：
(1)提前将器械、平皿、载玻片、离心管高压灭菌备用，所需试剂温度需恢复室温。
(2)取脾脏前先眼眶采血收集阳性血清-20℃备用，将颈椎脱臼处死的小鼠置于医用酒精消毒5min后，移至细胞间，再次消毒5min，无菌取出小鼠放于平皿中。
(3)右侧卧打开小鼠腹腔，完整取出脾脏置于培养皿中，用DMEM培养液冲洗数次，除去周围多余脂肪和***。
(4)使用5mL注射器针头在脾脏不同位置戳数下，吸5mL液体从脾脏一头注射进入，液体从穿刺的洞内流出(脾脏细胞一起流出)，将平皿中的液体移入到无菌离心管内，重复数次直到发现脾脏颜色变淡，用两张载玻片的磨砂面挤压脾脏，动作要轻柔、小心，不要磨擦玻璃，频繁用液体润滑数次，将液体回收到离心管内，离心弃上清，使用DMEM重悬细胞，离心弃上清，再次加入10mL DMEM成细胞悬液。
(5)台盼蓝染色，计数，备用。
细胞融合：
(1)提前将细胞融合所需要试剂全部回温至37℃，将水浴锅温度调至37℃。
(2)选择三瓶已经传代三次且折光性好的骨髓瘤细胞消化，台盼蓝染色计数，4℃冰箱备用。
(3)将1×108个脾细胞和1×107个骨髓瘤细胞在50mL离心管内混合，离心弃上清。
(4)中指轻弹离心管底部使细胞松散均匀并呈糊状；
(5)把离心管放入37℃水中，左手边将离心管匀速旋转，右手边往离心管中缓慢加入约1mL PEG4 000融合剂，添加的时间控制在1min左右，37℃静置1min。
(6)立即在第1min匀速加入1mL DMEM培养液，第2min加入2mL，第3min加入4mL，在随后的2min内加至25mL使PEG4 000稀释而失去融合作用。
(7)离心弃上清，20mL DMEM培养液悬浮细胞，离心弃上清。
(8)含HAT培养液将沉淀重悬后，加入含有饲养层细胞的孔内。37℃，5％CO2无菌恒温培养箱内培养。
(9)在融合后第一周每隔3d进行一次半换液，第二周每隔2d进行一次半换液，如果融合后第二日培养液变黄，应立即进行换液。前两周使用HAT培养液培养，然后第14d后用HT培养基。
阳性杂交瘤细胞的筛选：
(1)每孔包被0.4μg EgM123蛋白，4℃过夜包被。
(2)次日PBST洗板三次。5％脱脂乳37℃封闭2h。
(3)洗板三次。加入待检孔细胞培养液100μL作为一抗37℃孵育两小时，将SP2/0细胞培养液上清加入包被蛋白孔内37℃孵育2h作为阴性对照。
(4)洗板三次。使用山羊抗小鼠作为二抗(1:10 000稀释)于37℃孵育1h。
(5)洗板三次。每孔加入TMB显色液，避光15min，加入同体积ELISA终止液，立即使用酶标仪读取OD450nm值。
阳性杂交瘤细胞的亚克隆：
(1)提前一天按照3.3.3准备饲养层细胞。
(2)选择上一步检测出来的阳性孔，将阳性孔内的细胞及培养液全部抽到EP管内，按照有限稀释方法加到前一天铺好的含饲养层细胞板内。37℃，5％CO2无菌恒温培养箱内培养。
(3)在亚克隆后第一周每隔3d进行一次半换液，第二周每隔2d进行一次半换液。
(4)每周按照3.2.7的方法进行一次检测。每次标记出阳性孔。
(5)阳性孔细胞扩大培养，每次皆要按照3.2.7的方法检测培养液效价。
阳性杂交瘤细胞染色体的鉴定：
(1)分别取骨髓瘤细胞与杂交瘤细胞约1×105个，在培养瓶中将秋水仙素浓度加至终浓度为0.2μg/mL，37℃，5％CO2无菌恒温培养箱内培养2h。
(2)离心收集细胞，加入6mL室温KCl溶液浓度为0.075mol/L，立即制成细胞悬液。37℃静置20min。
(3)离心弃上清，将甲醇和冰醋酸按照3:1新鲜配置固定液，抽取6mL加入到细胞沉淀中，立即制成细胞悬液，37℃静置20min。离心弃上清。重复步骤一次。
(4)将甲醇和冰醋酸按照1:1新鲜配置固定液，抽取6mL加入到细胞沉淀中，立即制成细胞悬液。37℃静置20min。离心弃上清。
(5)加入1mL固定液成细胞悬液，抽20μL滴于载玻片上，自然扩散与干燥。
(6)滴加1mL吉姆萨染液，静置染色15min。
(7)顺着载玻片，使用PBS将染液冲洗干净，自然干燥，显微镜下观察。
单克隆抗体亚型鉴定：
将杂交瘤细胞培养液20倍稀释，按照小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒说明书要求检测。
试验结果：
免疫后小鼠的血清抗体水平
每次免疫14d的小鼠血清经间接ELISA方法检测效价，经过分析四只小鼠在第三次免疫后均产生较好抗体水平。血清稀释倍数在1:25600时P/N值均在6～10之间，数值远大于2.0结果见图14。
每次免疫后抗体水平则随着免疫次数增加，抗体水平成倍数增长结果见图15。
复苏后且生长状态良好的骨髓瘤细胞在倒置显微镜下观察其大小规则饱满，折光性较好，2d左右就可以进行传代。待传到三四代，方可进行细胞融合，图16为SP2/0细胞形态。融合后细胞经HAT和HT进行筛选，刚开始细胞生长较慢，不用经常换液，待细胞增多，可进行阳性孔筛选。图16中的A中为融合10d的杂交瘤细胞形态。
阳性杂交瘤细胞的筛选
将融合后细胞铺5块96孔板，经10d后检测每个孔效价，将其OD值与阴性对照孔之比大于2.0判为阳性孔，经检测有144个孔为阳性孔结果如表3-3，可认为融合成功率为24％。经7d后对阳性孔再次进行检测，剔除假阳性株，选出G2孔进行亚克隆。
表4杂交瘤细胞阳性孔OD值
续表4杂交瘤细胞阳性孔OD值
1.369、1.359、1.248、1.254为阳性对照，0.207、0.174、0.21、0.254为阴性对照
杂交瘤细胞染色体鉴定的结果：
杂交瘤细胞染色体经吉姆萨染色，在显微镜下观察对染色体进行计数结果如图17得出A中染色体数为92对，B为SP2/0细胞染色体数为58对。
单克隆抗体亚型的鉴定：
经小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒检测，在OD450nm处读取OD值，结果重链在IgG1处OD值最高，轻链在Kappa处OD值最高。
细粒棘球蚴感染ELISA方法应用
收集羊血清165份，如图19；通过本实验室建立的细粒棘球蚴EgM123蛋白间接ELISA检测方法筛选出阳性血清，如下表5，表6。选取OD值≥2.5的血清，重复上述实验，每个血清重复3组；最终选取值较大的三个血清作为阳性血清，标记为YXQP。选取OD值≤1.0的血清，重复上述实验，每个血清重复3组。最终选取值较小的三个血清作为阴性血清，标记为YXQN。
表5细粒棘球蚴EgM123蛋白间接ELISA检测结果
表6细粒棘球蚴EgM123蛋白间接ELISA检测
与本发明实施例的方案中的等同替换：对于单克隆抗体的制备方法均是通过免疫蛋白的原核表达载体构建、蛋白表达、小鼠注射免疫、脾脏淋巴细胞杂交瘤细胞融合试验，筛选出“EgM123重组杂交瘤细胞”，抗体的筛选、基因型鉴定，方法一致但目的蛋白不同。
本发明的上述实施例对细粒棘球绦虫EgM123基因进行基因表达载体构建、蛋白表达、小鼠注射免疫、脾脏淋巴细胞杂交瘤细胞融合试验，筛选出“EgM123基因重组蛋白荧光标记单克隆抗体”，并将所制备的单克隆抗体通过FITC荧光标记抗体、ELISA检测方法建立验证其检测效果，为临床犬细粒棘球绦虫感染的筛查和EgM123基因免疫功能研究提供精确检测试剂。本发明的方案可应用于降低终末宿主(犬)对细粒棘球蚴的感染率，减少犬体内细粒棘球绦虫的发育和和孕节排出情况，以实现从感染源头到易感群体形成综合性的防控体系，为解决我国广大农牧区群众和养殖动物免受包虫病的威胁，在我国西北五省和内蒙古等农牧区的应用前景和社会效益极为显著。
本发明上述方案的关键点是针对细粒棘球绦虫EgM123基因所表达的免疫蛋白，免疫小鼠后通过脾脏淋巴细胞与骨髓瘤杂交融合后，筛选出的单克隆抗体技术进行保护，所筛选出的单克隆抗体经鉴定为抗体亚型重链IgG1，轻链为Kappa。该单克隆抗体可为临床牛羊细粒棘球蚴的ELISA检测方法建立提供检测阳性抗体，也可为EgM123基因免疫功能研究提供精确检测试剂。
以上具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (5)

1.细粒棘球绦虫EgM123蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征是：构建EgM123基因原核表达载体：pET28a-EgM123，通过双酶切与基因测序验证，构建成功质粒转化BL21感受态细胞，IPTG诱导pET28a-EgM123基因表达，SDS-PAGE电泳分析蛋白大小及表达，并优化出最佳表达条件，将复性浓缩后的蛋白使用Western blot和ELISA检测其反应原性，为制备EgM123蛋白单克隆抗体提供免疫蛋白，具体包括以下步骤：
S1、构建EgM123基因原核表达载体：
(1)利用Ecor I和XhoI限制性内切酶将pcDNA3.1/His-EgM123基因重组质粒和pET28a载体双酶切，设置反应体系与反应条件，按照胶回收说明书回收酶切产物；
(2)连接产物转化DH5α，将菌液涂布于LB固体培养基，在37℃培养箱过夜培养；
(3)次日观察菌落生长，在LB液体培养基中加入单菌落过夜培养，待菌液出现浑浊，进行菌液PCR，1％琼脂糖电泳跑胶验证；
(4)将菌液PCR结果阳性的菌液按照天根小提质粒试剂盒的提取方法进行质粒提取；使用单滴分光计检测质粒浓度，将260/280值在1.8～2.0之间的质粒使用Ecor I和XhoI内切酶双酶切，酶切体系为25μL；酶切产物使用1％琼脂糖电泳验证；
(5)将酶切条带正确的质粒测序；
S2、EgM123蛋白的原核表达：
(1)将S1中连接成功的质粒与pET28a载体分别转化BL21，检测蛋白EgM123基因表达，方法同步骤S1中转化DH5α相同；
(2)在LB液体培养基中加入单菌落培养12h，次日菌液PCR检测。
(3)将阳性菌液按照1:100加入到液体培养基培养，至OD600nm值为0.6时，加入IPTG使终浓度达0.4mM培养3h；
(4)将菌液离心弃去上清，PBS重悬菌液再次离心弃去上清；
(5)使用PBS将菌液重悬，冰上超声15min，超声3s停5s，将超声后菌液低温离心，分装上清与沉淀，使用SDS-PAGE电泳检测；
S3、EgM123蛋白原核表达诱导条件的优化：
分别针对诱导温度、IPTG浓度和诱导时间优化EgM123蛋白原核表达诱导条件；
S4、EgM123蛋白的纯化、复性及浓缩：
根据按照步骤S3中优化的诱导条件，诱导1L菌液，收集菌液沉淀，使用PBS洗涤三次，将沉淀分装到4个50mL离心管内，使用包涵体Binding Buffer超声菌体，使目的蛋白溶解于上清中，将超声后菌液于5 000r/min低温离心10min，回收上清低温保存，进行下一步纯化；
S5、EgM123蛋白的反应原性检测：
A、Western blot检测EgM123蛋白的表达；
B、ELISA检测EgM123的反应原性。
2.如权利要求1所述的细粒棘球绦虫EgM123蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征是：所述步骤S3的具体方法为：
A、诱导温度的优化：培养四管20mL菌液至OD600nm值为0.6，三管内加入IPTG至终浓度0.4mM，分别置于16℃、25℃和37℃过夜诱导表达，其中未加入IPTG诱导菌液置于37℃过夜培养作为对照，收集菌液沉淀PBS超声，分别取超声后上清与沉淀每孔上样20μL进行检测；
B、IPTG浓度的优化：培养四管20mL菌液至OD600nm值为0.6，加入IPTG至终浓度0.3mM、0.6mM、0.9mM和1.1mM于37℃过夜诱导表达，收集菌液沉淀PBS超声，分别取不同IPTG浓度诱导后沉淀每孔上样20μL进行检测；
C、诱导时间的优化：培养四管20mL菌液至OD600nm值为0.6，分别加入IPTG至终浓度为0.3mM，置于37℃分别诱导1h、3h、5h、7h，收集菌液沉淀PBS超声，分别取不同诱导时间沉淀每孔上样20μL检测。
3.如权利要求1所述的细粒棘球绦虫EgM123蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征是：步骤S4的具体方法包括：
A、EgM123蛋白的纯化：
(1)抽取1mL的Ni-NTA树脂加入到柱中，垂直放置使液体通过重力流出；
(2)柱子内加入8mL包涵体BindingBuffer缓冲液；以0.5～1mL/min将缓冲液流出柱子；
(3)将步骤(2)中回收的上清直接上柱，放于4℃冰箱3h，使EgM123蛋白与Ni-NTA树脂结合；
(4)收集流穿液到15mL离心管内，如有多余上清，可重复步骤(3)；往柱内加入8mL包涵体BindingBuffer缓冲液，将柱子内杂蛋白流出，重复2～3次，直到OD280nm接近基线；
(5)加入8mL包涵体ElutionBuffer，放于4℃冰箱1h，收集洗脱液，重复此步骤2～3次，直至OD280nm接近基线，将流穿液与洗脱液分别进行凝胶电泳，检测纯化效果。洗脱液保存于-80℃冰箱备用；
B、EgM123蛋白的复性和浓缩：
采用透析复性的方法，将纯化后的蛋白使用单滴分光计检测其浓度并稀释到0.1mg/mL；提前配置分别含6M、3M、0M尿素的透析液并置于4℃预冷，将目的蛋白加入透析袋中，分别在6M，3M，0M尿素的透析液中放置12h，最后移入PBS内放置12h；将复性后的蛋白倒于玻璃瓶内放置-80℃冰箱成固体状，使用真空冻干机在真空度为1P、冷阱温度为-70℃时冻干，待使用时使用PBS稀释。
4.如权利要求1所述的细粒棘球绦虫EgM123蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征是：步骤S5中的步骤A的具体方法为：
(1)将复性的EgM123蛋白进行SDS-PAGE电泳，使用80V电压将浓缩胶跑完，在使用120V电压将溴酚蓝跑到凝胶底部；
(2)裁剪一块和凝胶一样大的PVDF膜，将膜于甲醇内激活20s；按照阳极、无纺纤维垫、滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸、无纺纤维垫、阴极顺序排列，在冰上转膜；电压90V时间90min；
(3)使用TBST每次5min洗膜3次；5％脱脂乳室温封闭2h；
(4)按照上一步骤洗膜三次；将膜分别于His单克隆抗体中(1:1000稀释)和细粒棘球绦虫EgM123多克隆抗体(1:2500稀释)在4℃过夜孵育；
(5)次日洗膜3次；分别使用HRP标记的山羊抗小鼠IgG和兔抗犬IgG(1:10000稀释)于37℃孵育2h；
(6)洗膜3次；加入显色液作用1min后曝光观察抗原抗体结合结果。
5.如权利要求1所述的细粒棘球绦虫EgM123蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征是：步骤S5中的步骤B的具体方法为：
(1)在96孔板上使用方针法纵向分别包被0.05μg、0.2μg、0.4μg、0.6μgEgM123蛋白于4℃过夜；
(2)PBST洗板三次，每次5min；5％脱脂乳37℃封闭2h；
(3)按照上一步骤洗板三次；将EgM123多克隆抗体横向分别稀释成1:1000、1:2000、1:4000、1:8000于37℃孵育2h；
(4)洗板三次；加入HRP标记兔抗犬(1:10000稀释)二抗37℃孵育1h；
(5)洗板三次；每孔加入TMB显色液，避光15min，加入同体积的ELISA终止液，立即使用酶标仪读取OD450nm值。
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