CN117051130B - 一种与卵形鲳鲹鱼抗无乳链球菌性状关联的snp分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与卵形鲳鲹鱼抗无乳链球菌性状关联的SNP分子标记，所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中第121位为A/C，当基因型为CC时，卵形鲳鲹抗无乳链球菌能力显著优于基因型为AC和AA的卵形鲳鲹。还公开了扩增所述SNP分子标记的引物和试剂盒、抗无乳链球菌卵形鲳鲹的检测方法；以及上述SNP分子标记、引物、试剂盒或方法在卵形鲳鲹抗无乳链球菌性状的选择性育种中的应用。通过应用本发明的技术方案，可以对卵形鲳鲹的育种材料进行早期筛选，缩短育种周期，并提高选育的准确性，有助于提高卵形鲳鲹的遗传品质，丰富其分子标记资源，并最终实现对优质卵形鲳鲹新品种的高效选育。
Description
技术领域
本发明属于水产动物分子标记的筛选及辅助育种技术领域，具体涉及一种与卵形鲳鲹抗无乳链球菌性状相关的SNP分子标记及应用。
背景技术
卵形鲳鲹是一种经济价值高的养殖鱼类，然而，卵形鲳鲹养殖业面临许多疾病威胁，其中以无乳链球菌感染为主要病害之一。无乳链球菌疾病严重影响了卵形鲳鲹的生长和生存，导致养殖业巨大的经济损失。因此，提高卵形鲳鲹的抗无乳链球菌性状具有极其重要的经济和社会意义。
在现有技术中，主要通过药物治疗和疫苗接种等方式来防治无乳链球菌感染。然而，这些方式效果并不理想，且存在药物残留、抗药性产生以及环境污染等问题。此外，通过传统的选择育种方法提高卵形鲳鲹的抗病性需要很长时间，且效果往往受限于遗传和环境因素的复杂交互。
全基因关联分析（GWAS）是近年来在分子生物学和遗传学研究中得到广泛应用的一种技术，通过对大量个体的基因型和表型数据进行分析，可以发现基因变异与性状之间的关联。然而，尽管GWAS在很多物种中已经成功找到了许多重要性状的关联位点，但在卵形鲳鲹抗无乳链球菌性状方面的研究仍相对较少。
因此，开展全基因关联分析，以寻找与卵形鲳鲹对无乳链球菌抗性相关的SNP分子标记，并利用这些标记进行选择性育种，是解决上述问题的一种有前景的方案。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种与卵形鲳鲹抗无乳链球菌性状相关的SNP分子标记。
本发明的目的还在于提供一种用于扩增上述与卵形鲳鲹鱼抗无乳链球菌性状关联的SNP分子标记的引物及试剂盒和抗无乳链球菌卵形鲳鲹的检测方法。
本发明的最后一个目的在于提供上述SNP分子标记、引物、试剂盒或方法在卵形鲳鲹抗无乳链球菌性状的选择性育种中的应用。
本发明的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现：一种与卵形鲳鲹抗无乳链球菌性状相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中第121位为A/C。
SEQ ID NO.1所示序列如下：
TTTAACCTGCTTCTCTTGATACTGAATGGAAATTATAGATGCAATCGTTTTACAGTAGATAGAATATAGAATCTCTTCTTTGTGTTTCAAGGACACACTCACTTT
TAGTCACAAAAATCTN(A/C)AAATTTTCCAAATTTATCAAAGTTTTGTCAGATTTAGGTTTGTATTAGGATTCAGTCTTTCACATGATTGTTCAACCATAAAAAAA
AAATTCCCTTTTCAGTTAAACATGCAAGCC。
本发明通过全基因组关联分析（GWAS）策略，发现了一个位于卵形鲳鲹第9号染色体上的与抗无乳链球菌性状显著关联的SNP分子标记。
特定地，该标记为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第121位碱基。
关于SEQ ID NO.1核苷酸序列，其第121位碱基的N代表A或C，这表示该位置存在多态性。
统计学分析显示，与CC基因型相比，AC和AA基因型对应的卵形鲳鲹在抗无乳链球菌性状上存在显著差异。
可选地，当基因型为CC时，卵形鲳鲹抗无乳链球菌能力显著优于基因型为AC和AA的卵形鲳鲹。
具体来说，当基因型为CC时，卵形鲳鲹在感染后120h半致死浓度无乳链球菌的抵抗能力显著优于基因型为AC和AA的卵形鲳鲹。
本发明中所描述的卵形鲳鲹抗无乳链球菌性状是指，当卵形鲳鲹经腹腔注射感染120h半致死浓度无乳链球菌后的存活情况。
抗性评定：认定注射120h内有明显无乳链球菌的感染特征并死亡的为易感无乳链球菌，而注射120h后仍无明显感染特征，游泳状态良好的认定为抗无乳链球菌。
本发明的核心部分涉及使用特定的SNP分子标记，在卵形鲳鲹选育中，对选定的候选群体进行精确的基因型检测。结合对其他与生长性状、抗病性及抗逆性状相关的基因位点的分析，本发明特别推荐选择SNP基因型为CC的个体，作为选育抗无乳链球菌性状的卵形鲳鲹的优选亲本。
本发明通过中筛选与卵形鲳鲹抗无乳链球菌性状显著相关的SNP分子标记，包括以下重要步骤：
（1）精选受到120h半致死浓度无乳链球菌PBS悬液腹腔注射感染的卵形鲳鲹鳍条样本，并从中高效提取DNA进行全基因组深度测序；
（2）将步骤（1）得到的测序数据与卵形鲳鲹的标准参考基因组进行严格比对，从而得到全基因组范围内的SNP分子标记；
（3）运用全基因组关联分析技术，深入研究卵形鲳鲹抗无乳链球菌性状与基因型之间的关联性，确定与卵形鲳鲹抗无乳链球菌性状有显著关联的SNP标记。
进一步地，本发明详述了筛选与卵形鲳鲹抗无乳链球菌性状相关的SNP分子标记的精确方法，该方法包含以下关键步骤：
（1）首先，选定约2000尾卵形鲳鲹，这些卵形鲳鲹均经过120h半致死浓度无乳链球菌PBS悬液的腹腔注射处理，随后，从最先死亡的100尾和在120h后活动状况仍佳的100尾卵形鲳鲹中剪取鳍条样本，随后进行DNA的提取和全基因组重测序；（2）将步骤(1)中获得的测序数据与卵形鲳鲹的标准参考基因组进行详细对比，从中准确获取全基因组范围的SNP信息；
（3）运用全基因组关联分析（GWAS）技术，对卵形鲳鲹抗无乳链球菌性状与各基因型间的关联性进行深入研究，从中筛选出与卵形鲳鲹抗无乳链球菌性状有显著关联的SNP标记。
通过上述方法，本发明为卵形鲳鲹选择育种领域贡献了宝贵的分子标记资源，实现了对SNP的精确分型，及通过GWAS筛选出与卵形鲳鲹抗无乳链球菌性状显著相关的SNP。这些SNP标记有望广泛应用于卵形鲳鲹抗无乳链球菌性状的选择育种。
本发明的上述第二个目的可以通过以下技术方案来实现：扩增与卵形鲳鲹鱼抗无乳链球菌性状关联的SNP分子标记的引物，所述引物包括引物SNPLG918597184FA、引物SNPLG918597184FC和引物SNPLG918597184R，其中所述引物SNPLG918597184FA的序列如seqid no.2所示，所述引物SNPLG918597184FC的序列如seq id no.3所示，所述引物SNPLG918597184R的序列如seq id no.4所示。
基于SEQ ID NO.1核苷酸序列，本发明设计了针对SNP分子标记的特异性引物，命名为SNPLG918597184FA、SNPLG918597184FC和SNPLG918597184R。使用这些引物进行PCR特异性扩增后，通过酶标仪读取荧光信号，进而解析该信号以获取待测卵形鲳鲹该SNP分子标记位点的基因型。
本发明详细描述了一系列与卵形鲳鲹抗无乳链球菌性状相关的引物，其设计基于标记上下游的120BP基因组序列，并使用专业的SNP primer软件工具进行精确的引物设计。
为详细说明，以下列出了这些特定引物的核苷酸序列：
Snplg918597184FA(seq id no.2)：
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTACACTCACTTTTAGTCACAAAATCTCA；
Snplg918597184FC(seq id no.3)：
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTACACTCACTTTTAGTCACAAAATCTCC；
Snplg918597184r(seq id no.4)：
TGAAAGACTGAATCCTAAATACAAACC。
为配合上述引物的应用，本发明还精心制备了专用的试剂盒，主要包含上述引物。
本发明还提出了一种抗无乳链球菌卵形鲳鲹的检测方法，包括以下步骤：
（1）从待测卵形鲳鲹中提取基因组DNA；
（2）利用前文描述的特定引物或试剂盒，对待测的卵形鲳鲹基因组DNA进行PCR扩增，从而获得PCR扩增产物；
（3）通过对PCR扩增产物的荧光信号进行分析，确定待测卵形鲳鲹的基因型，并据此判定其抗无乳链球菌的性能。
为保证检测方法的准确性，本发明优先推荐在步骤(1)中，从卵形鲳鲹中剪取部分鳍条进行总DNA的提取，同时确保所得DNA样品的质量和纯度，即A260/A280的比值应在1.8～2.0范围内，且DNA浓度不低于100μg/μL。
在步骤(2)中，进行PCR扩增的优化PCR体系如下表1所示：
表1 PCR体系
Pcr扩增程序如下表2所示：
表2 PCR扩增程序
在步骤(3)的基因分型过程中，完成PCR后，采用酶标仪读取得到的荧光信号。随后，应用专业在线软件snpdecoder对荧光信号进行解析与转换。根据荧光信号的颜色差异，该软件能输出相应的基因型。
在该步骤中，通过分析PCR产物的荧光信号以获取基因型是一种经济高效的策略，与传统测序方法相比具有成本优势。
基于数据结果，当基因型为CC的卵形鲳鲹在感染无乳链球菌后的存活率显著超过基因型为AC或AA的个体。因此，在育种选择中，优先选用SNP位点为CC基因型的卵形鲳鲹作为亲本是明智的，同时应避免使用SNP位点为AC或AA基因型的卵形鲳鲹作为亲本。
本发明的上述最后一个目的可以通过以下技术方案来实现：上述SNP分子标记、上述引物、上述试剂盒或上述方法在卵形鲳鲹抗无乳链球菌性状的选择性育种中的应用。
本发明不仅提供了上述SNP分子标记、引物对及试剂盒的制备和应用，更明确了它们在卵形鲳鲹抗无乳链球菌性状选择育种中的重要性和应用潜力。
总结来说，本发明提供了与卵形鲳鲹对无乳链球菌的抗性相关的SNP分析标记。涉及水产动物的分子标记筛选及辅助育种技术领域。除了标记的筛选方法，还详细描述了后续基因型的鉴定。该技术方案允许对卵形鲳鲹育种材料进行初级筛选，从而在提高抗无乳链球菌性状选育效率和准确性的同时，为卵形鲳鲹提供了一个全新的SNP分子标记。
本发明具有以下优点：
（1）根据本发明实施例的统计分析，当SNP标记的基因型为CC时，卵形鲳鲹对无乳链球菌的抗性明显优于基因型为AA或AC的卵形鲳鲹；
（2）因此，利用本发明的SNP分子标记，可以准确预测卵形鲳鲹对无乳链球菌的抗性，为卵形鲳鲹的选择育种提供了强有力的工具；
（3）通过应用本发明的技术方案，可以对卵形鲳鲹的育种材料进行早期筛选，缩短育种周期，并提高选育的准确性，有助于提高卵形鲳鲹的遗传品质，丰富其分子标记资源，并最终实现对优质卵形鲳鲹新品种的高效选育。
附图说明
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的描述。
图1是实施例1的曼哈顿图，其中，用箭头标注的部分表示本发明中筛选出的分子标记位置，此标记位于卵形鲳鲹的第9号染色体上。
实施方式
下面结合具体实施例详细说明本发明的技术方案，以便本领域技术人员更好理解和实施本发明的技术方案。下述实施例和附图仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。实施例中所用试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。除非特别说明，使用的实验仪器均为实验室常规仪器。
为更为详细地说明本发明，以下通过实施例进行展开。需要强调的是，以下实施例仅为了解释本发明，并不用于限制本发明的实质范围或内容。
实施例1：SNP标记的筛选
（1）无乳链球菌感染实验：
从种群中随机选择2000尾卵形鲳鲹。
对所选卵形鲳鲹进行120h的半致死浓度无乳链球菌PBS混悬液腹腔注射处理。实验所需的120h半致死浓度为2.0×106CFU/mL。
在处理后，详细记录每条卵形鲳鲹的生存状态，用此数据作为其对无乳链球菌的抗性的评估基准。
抗性评定：认定注射120h内有明显无乳链球菌的感染特征并死亡的为易感无乳链球菌，而注射120h后仍无明显感染特征，游泳状态良好的认定为抗无乳链球菌。
（2）DNA提取：
选择最先死亡的100尾鱼以及在120h后仍存活且表现出良好活性的100尾鱼。
从每条卵形鲳鲹身上切取鳍条，总重量为20mg。
采用磁珠法DNA提取试剂盒，按照其说明书的步骤，依次加入试剂对鳍条进行DNA的提取。
所提取的DNA均储存在150μL的Buffer AE中。
利用1％琼脂糖凝胶电泳进行DNA样本的检验，并使用Nanodrop2000来测定DNA的浓度和纯度。此处要求A260/A280的比值应在1.8～2.0范围内，同时要求DNA浓度不低于100μg/μL。
（3）文库制备与测序：
先将品质合格的DNA样本使用Covaris超声波破碎仪进行随机碎片化。
经过末端修复、加A尾、加测序接头、纯化以及PCR扩增的操作后，文库制备完成。
使用Illumina测序仪对所制备的文库进行高通量测序。
（4）文库测序前的质检：
完成文库构建后，使用Qubit2.0进行初步定量，随后将文库稀释至1ng/μL。
利用Agilent 2100对文库的insert size进行验证。确认insert size后，利用Q-PCR方法准确测定文库的有效浓度（要求有效浓度>2nM）以确保文库的质量。
合格的文库将根据有效浓度和目标测序数据量需求进行pooling，并进行Illumina PE150测序。
本发明所采用的全基因组重测序技术可以高效挖掘稀有变异，且SNP密度高，适用于全基因组关联分析。
高质量的测序数据被利用BWA软件（使用参数：mem -t 10 -k 32 -M）进行比对至目标参考基因组。随后，该比对输出通过SAMTOOLS软件进行了排序，采用的参数为“sort”。
SNP的筛选和关联分析：
利用SAMTOOLS和BCFTOOLS软件执行了群体SNP的高效检测。特定的检测参数如下：samtools-1.3.1 mpileup -q 1 -C 50 -t SP -t DP -m 2 -F 0.002 与 bcftools-1.4call -mv -f GQ。
200个样本中，原始的SNP位点总数为1,744,190，而经过筛选后的高质量SNP位点数量为803,713。
采用了GEMMA软件，混合线性模型（MLM）来筛选与抗无乳链球菌性状相关联的SNP位点。
具体的数学模型描述为：y = Xα + Zβ + Wμ + e
其中y代表表型性状，X、Z和W分别是各自效应的指示矩阵，α、β和μ是相应的效应参数，而e则是随机残差，其分布为e~(0，δe^2)。
根据全基因组关联分析(GWAS)，发现一个位于卵形鲳鲹9号染色体的与抗无乳链球菌相关的SNP标记（如图1所示，箭头指示的部位）。该SNP位于SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列第121个碱基。
SEQ ID NO.1所示序列如下：
TTTAACCTGCTTCTCTTGATACTGAATGGAAATTATAGATGCAATCGTTTTACAGTAGATAGAATATAGAATCTCTTCTTTGTGTTTCAAGGACACACTCACTTT
TAGTCACAAAAATCTN(A/C)AAATTTTCCAAATTTATCAAAGTTTTGTCAGATTTAGGTTTGTATTAGGATTCAGTCTTTCACATGATTGTTCAACCATAAAAAAA
AAATTCCCTTTTCAGTTAAACATGCAAGCC。
实施例2：SNP基因型验证
实验群体：采用另一个包含380尾卵形鲳鲹的种质群体，验证上述SNP分子标记。
抗性评定：与实施例1相同；
DNA提取：从卵形鲳鲹胸鳍中提取总DNA。DNA的提取、保存及其质量要求与实施例1一致。
特异性引物设计：利用SNP primer软件，根据上述SNP标记的上下游约120bp的碱基序列，设计了特异性扩增引物。
PCR扩增：使用如下的引物进行PCR扩增：
Snplg918597184FA(seq id no.2):
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTACACTCACTTTTAGTCACAAAATCTCA
Snplg918597184FC(seq id no.3):
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTACACTCACTTTTAGTCACAAAATCTCC
Snplg918597184r(seq id no.4):
TGAAAGACTGAATCCTAAATACAAACC
PCR体系如下表1所示：
表1 PCR体系
PCR扩增程序如下表2所示：
表2 PCR扩增程序
基因分型：
荧光信号读取：PCR扩增完成后，采用酶标仪读取PCR产物的荧光信号。
荧光信号解析：利用在线软件snpdecoder对荧光信号进行解析和转换。
基因型确定：基于荧光信号的不同颜色，分析并输出相应的基因型。从而明确本发明中所描述的SNP位点在各个样本中的基因型。
分型结果见下表3。
表3 SNPLG91597184多态性对卵形鲳鲹抗无乳链球菌能力的影响
根据表3的数据，可以观察到在重测序样本以及再验证的扩大群体中，具有CC基因型的卵形鲳鲹在面对无乳链球菌侵染时展现出了更高的存活率。相对于AC和AA基因型的样本，其存活率有显著的优势。这一发现为SEQ ID NO.1中所揭示的SNPLG918597184分子标记的多态性与卵形鲳鲹对无乳链球菌的抗性之间的显著联系提供了有力的证据。进一步地，通过对基因型频率的分析发现，当卵形鲳鲹的基因型为CC时，其对无乳链球菌的感染所展现出的存活能力明显优于AC和AA基因型的样本。
本发明提出的方法还有可能延伸至开发专门用于检测上述SNP分子标记的试剂盒，这一试剂盒将会包含上文提到的特定引物。更进一步地，当这一SNP分子标记在卵形鲳鲹的选育过程中被利用，它将主要在育种候选群体的基因型检测中发挥作用。通过结合与生长、疾病抵抗以及抗逆性相关的其他基因型，优先考虑具有CC基因型的卵形鲳鲹作为用于选育对抗无乳链球菌的优质亲本。
因此，本发明中描述的SNP分子标记、特定引物以及可能的试剂盒，都可以在选择性地育种卵形鲳鲹以增强其对无乳链球菌的抗性方面发挥重要作用。
因此，本发明涉及的SNP分子标记、引物和试剂盒在评估卵形鲳鲹对无乳链球菌的抗性方面的应用，都应被视为本发明的保护范围之内。
值得强调的是，尽管以上所述实施例详细地描述了本发明的某些具体实施方式，但这并不意味着对本发明专利范围的界定。事实上，对于本领域的技术专家，在不偏离本发明的基本思路和原理的前提下，仍然可以对其进行各种变形和优化，所有这些变化和优化均应被视为本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.扩增与卵形鲳鲹鱼抗无乳链球菌性状关联的SNP分子标记的引物，其特征是：所述引物包括引物SNPLG918597184FA、引物SNPLG918597184FC和引物SNPLG918597184R，其中所述引物SNPLG918597184FA的序列如SEQ ID NO.2所示，所述引物SNPLG918597184FC的序列如SEQ ID NO.3所示，所述引物SNPLG918597184R的序列如SEQ ID NO.4所示，所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中第121位为A/C；所述SNP分子标记基因型为CC的卵形鲳鲹抗无乳链球菌能力显著优于所述SNP分子标记基因型为AC和AA的卵形鲳鲹。
2.一种试剂盒，其特征是：包括权利要求1所述的引物。
3.权利要求1所述引物或权利要求2所述试剂盒在卵形鲳鲹抗无乳链球菌性状的选择性育种中的应用；所述SNP分子标记基因型为CC的卵形鲳鲹抗无乳链球菌能力显著优于所述SNP分子标记基因型为AC和AA的卵形鲳鲹。
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