CN103243060B - 一种二氯喹啉酸降解菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株二氯喹啉酸降解菌及其应用。本发明所提供的一株二氯喹啉酸降解菌J3属于产碱菌属(Alcaligenes sp.)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏日期为2013年3月28日，保藏编号为CGMCC No.7384，菌株16S rDNA的GenBank登录号为KC693648。该菌为革兰氏阴性菌，菌落表面光滑，中心凸起，呈淡黄色，圆形，边缘整齐，不透明。该菌具有降解二氯喹啉酸的功能，并能防治烟草受到二氯喹啉酸的药害。
Description
技术领域
本发明属于环境污染物生物处理技术领域，具体地说，涉及一种降解二氯喹啉酸的细菌，及其在降解二氯喹啉酸和防治烟草受二氯喹啉酸药害中的应用。
背景技术
二氯喹啉酸（quinclorac），化学名称：3，7—二氯—8—喹啉羧酸，是德国巴斯夫公司开发的芽前、芽后新型水田除草剂，因其具有用量少、持效期长、对稗草特效等优点而被广泛应用于农业生产，主要用于稻田防稗草。其结构式如下：
二氯喹啉酸呈酸性，在酸性土壤中降解缓慢，易给后茬敏感作物造成严重危害，特别是在水稻与烟草轮作区，土壤中残留的二氯喹啉酸易对茄科作物烟草生长产生危害，严重影响烟叶的产量和质量，目前尚无有效保护烟草受二氯喹啉酸残留的药害的方法或药剂。
目前减轻土壤中二氯喹啉酸污染的主要途径为光降解和微生物降解。大量研究证明，自然界中存在的多种微生物是降解环境中残留农药的重要因素。据报道，吕镇梅等（应用生态学报，2004，15(4)：605-609）在2004年分离得到一株二氯喹啉酸的高效降解菌（WZ1），经鉴定其属于洋葱假单胞菌属，11d内能将1000mg/L的二氯喹啉酸降解90%；刘华山等（安全与环境学报，2012，2：45-49）于2012年分离得到一株二氯喹啉酸的高效降解菌（HN36），该菌属于博德特氏菌属，48h内能将400mg/L的二氯喹啉酸降解96%。但是，对于烟草受到二氯喹啉酸的药害，并无保护作用。且目前国内外尚未见有关产碱菌属降解二氯喹啉酸的研究报道。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种能够降解二氯喹啉酸，并能防治烟草受二氯喹啉酸药害的产碱菌。
为了实现本发明目的，本发明提供了一株二氯喹啉酸降解菌，经鉴定为产碱菌属(Alcaligenes sp.)，编号J3，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101），保藏日期为2013年3月28日，保藏编号为CGMCC No.7384，其特征在于：该菌为革兰氏阴性菌，菌落表面光滑，中心凸起，呈淡黄色，圆形，边缘整齐，不透明；菌体为杆状，（0.5～1.2）μm×（0.5～2.6）μm；该菌专性好氧，氧化酶试验及硝酸盐还原试验呈阳性，尿素试验、硝酸盐产气试验、硫化氢试验及DNA水解试验呈阴性，不能利用葡萄糖和蔗糖。
所述降解菌经过富集培养-筛选纯化得到，具体步骤如下：
1、富集培养：取含有二氯喹啉酸的土壤样品，加入含100mg/L二氯喹啉酸的无机盐培养基中，在30℃、180r/min的摇床中振荡培养一周后，以4%的接种量接入到新鲜灭菌后的无机盐培养基中，每周转接1次，二氯喹啉酸浓度按100mg/L梯度递增，富集培养5次至二氯喹啉酸终浓度为500mg/L；
其中，所述无机盐培养基为硝酸钠4g，磷酸二氢钾1.5g，磷酸氢二钠0.5g，三氯化铁0.01g，氯化钙0.01g，酵母粉0.05g，微量元素母液（EDTA-二钠0.01g/L，氯化锰39mg/L，硫酸锌43mg/L，钼酸钠36mg/L）10mL。
2、筛选纯化：所述降解菌在富集培养后，采用划线法纯化菌株，将分离得到的降解菌接种至LB斜面上，保存于4℃下。
本发明还提供了所述降解菌在降解二氯喹啉酸中的应用。
所述降解二氯喹啉酸的应用，可通过对单菌的降解率进行测定，具体步骤为：将纯化后的菌株J3用液体LB培养基活化（24h）后以4%的接种量转接至二氯喹啉酸度为50mg/L的无机盐液体培养基中，30℃、150r/min摇床中黑暗条件下培养1周，检测菌株J3对二氯喹啉酸的降解率。
本发明还提供了所述降解菌防治烟草受二氯喹啉酸药害中的应用。
将二氯喹啉酸以混土法加入土壤，剂量分别为其田间推荐用量的25%、50%和100%，装入直径18cm，高20cm的盆钵。将培育至4～5叶期的烟苗移栽至盆钵中，每钵1株，移栽后用J3菌液进行灌根处理，接菌量为4%（降解菌J3经液体LB培养过夜，OD600=0.42，加8mlJ3菌液于200ml无菌水中，最后加入到盆钵中烟株根部附近）。分别设CK组（不加菌不加药）、生防组（加菌加药，二氯喹啉酸用量为田间推荐用量）和药害组（只加药不加菌，二氯喹啉酸用量分别为田间推荐用量），每个处理5个重复。
分别于20d、40d和60d后调查烟株叶宽（自顶端开始调查第4片叶），数据采用Microsoft Excel2000软件处理，并用DPS软件包分析，得出每个处理的平均叶宽，按照公式分别计算抑制率及恢复率。
本发明还提供了一种包含上述降解菌的菌剂以及所述菌剂在降解二氯喹啉酸和防治烟草受二氯喹啉酸药害中的应用。
本发明所述的降解菌为产碱菌属，弥补了国内外对产碱菌属降解二氯喹啉酸的空白。且本发明所述的降解菌不仅具有降解二氯喹啉酸的功能，还能有效防治二氯喹啉酸对烟草造成药害。
附图说明
图1为菌株J3的电镜照片；
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1降解菌J3的筛选及活性检测
本实验采用富集培养以及涂布划线的方法从采集到的长期施用二氯喹啉酸的三个土样中分离得到一株对二氯喹啉酸有较好降解能力的降解菌，将其命名为J3。菌株J3的电镜照片如图1所示。
从湖南农业大学附近水稻田、烟田以及湖南某农药厂排水口处集到了三个土壤样品命名编号如下：湖南农业大学附近水稻田土壤（Q）；湖南某农药厂排水口处土样（T）；湖南农业大学附近烟草田土壤（J）。
二氯喹啉酸解菌的富集：每份土壤样品取5g，分别加入到50mL含100mg/L二氯喹啉酸的无机盐培养基中，于30℃、180r/min下振荡培养一周。之后以4%（体积分数）的接种量接入到新鲜灭菌后的无机盐培养基中，每周转接1次，二氯喹啉酸浓度按100mg/L梯度递增，富集培养5次至二氯喹啉酸终浓度为500mg/L。经筛选纯化后，将分离得到的降解菌株接种至LB斜面上，保存于4℃冰箱中。
液相色谱检测：将1mL待测样品加入到2mL离心管中，每个处理设3个重复。分别加入0.25mL氯仿-正丁醇混合溶液[V(氯仿):V(正丁醇)=4:1]，充分振摇30min后,于12000r/min下离心2min。将上层水相转移到新的离心管中，重复上面操作提取2次。之后再将处理好的样品12000r/min离心5min，过0.22μm滤膜后用液相色谱测定。液相色谱检测条件：采用Athana C18色谱柱，流动相V(甲醇):V(0.2%乙酸水溶液）=60:40，柱温30℃，流速0.8mL/min，检测波长（UV）240nm，进样量20μL。
单菌降解率的测定：将纯化后的菌株J3用液体LB培养基活化（24h）后以4%的接种量转接至二氯喹啉酸度为50mg/L的无机盐液体培养基中，30℃、150r/min摇床中黑暗条件下培养1周，检测菌株J3对二氯喹啉酸的降解效率。
将从土样J中分离得到的单菌J3活化后以4%（体积分数，OD600=0.42）的接种量分别接种于二氯喹啉酸浓度为50mg/L的三角瓶中，培养7天后采用高效液相色谱测定单菌对二氯喹啉酸的降解率，其降解率为71.5%。
实例2菌株J3的鉴定
J3的形态及生理生化特性：通过显微镜及扫描电镜观察菌株J3的菌落、单菌形态。J3的生理生化鉴定采用试剂盒（单盒生化鉴定管，广东环凯微生物科技有限公司生产）。
J3的16S rDNA序列测定：采用试剂盒提取降解菌DNA（DNA提取试剂盒，北京全式金生物技术有限公司生产），所用扩增引物由华大基因公司合成：
上游引物为5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’；
下游引物为5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’。
扩增反应体系为：10×Buffer(Mg2+)4μL，dNTPs3μL，引物各1μL，菌体DNA2μL，Taq DNA聚合酶1μL，加去离子水至50μL。
PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火40s，72℃延长60s；40个循环；最后于72℃延伸10min。
PCR产物采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，TIANGEN公司生产）进行目的片段回收，回收产物测序工作由华大基因公司完成。测序结果进入GenBank数据库进行比对。
结果显示，J3菌株革兰氏染色阴性，专性好氧，氧化酶试验及硝酸盐还原试验呈阳性，尿素试验、硝酸盐产气试验、硫化氢试验及DNA水解试验呈阴性，不能利用葡萄糖和蔗糖。与粪产碱菌（Alcaligenes faecalis）的生物学特性相同。
将J3菌株的16S rDNA序列共1888bp，登录到GenBank中（登录号为KC693648）。与粪产碱菌（Alcaligenes faecalis）(FN667794)的同源性为99%。结果与生物学特性鉴定结果相同。经鉴定为产碱菌属(Alcaligenes sp.)，编号J3，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101），保藏日期为2013年3月28日，保藏编号为CGMCC No.7384。
实例3降解菌J3的降解特性研究
培养时间对降解菌J3生长及降解率的影响：配制600ml无机盐培养基分装于4个300ml的锥形瓶中（每瓶150ml），设一个锥形瓶为CK，其他三个为三个重复，调节pH为7.0～7.2，灭菌处理后备用。向灭菌后的锥形瓶中加入二氯喹啉酸，使其浓度为50mg/L，除CK外的其余三个锥形瓶以4%的接种量（OD600=0.42）接入活化好的降解菌J3，之后放入30℃、150r·min-1的恒温摇床中振荡培养。每隔24h取样测定其OD600值以及降解率变化。
二氯喹啉酸初始浓度对降解菌J3生长及降解率的影响：配制2700ml无机盐培养基分别分装于15个锥形瓶中，调节pH为7.0～7.2，灭菌处理后加入二氯喹啉酸使其浓度分别为10mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L、300mg/L和400mg/L（每个处理3个重复）。再以4%（体积分数）的接种量（OD600=0.42）接入活化好的降解菌J3菌液。0h时每瓶取样一次作为CK。之后放入30℃、150r·min-1的恒温摇床中振荡培养。7d后取样测定其OD600值以及降解率。
接种量对降解菌J3生长及降解率的影响：配制2700ml无机盐培养基分别分装于15个锥形瓶中，调节pH为7.0～7.2，灭菌处理后加入二氯喹啉酸，使每个锥形瓶中二氯喹啉酸的浓度为50mg/L，之后分别以2%、4%、10%、15%、18%、20%（体积分数）的接种量将活化好的降解菌J3菌液接种到每个锥形瓶中（每个处理3个重复），0h时每瓶取样一次作为CK。之后放入30℃、150r·min-1的恒温摇床中振荡培养。7d后取样测定其OD600值以及降解率。
培养基pH对降解菌J3生长及降解率的影响：配制2700ml无机盐培养基分别分装于15个锥形瓶中，调节培养基pH值分别为4、5、6、7、8、9（每个处理3个重复），灭菌处理后加入二氯喹啉酸，使每个锥形瓶中二氯喹啉酸的浓度为50mg/L，再以4%（体积分数）的接种量（OD600=0.42）接入活化好的降解菌J3菌液。0h时每瓶取样一次作为CK。之后放入30℃、150r·min-1的恒温摇床中振荡培养。7d后取样测定其OD600值以及降解率。
培养温度对降解菌J3生长及降解率的影响：配制2700ml无机盐培养基分别分装于15个锥形瓶中，调节pH为7.0～7.2，灭菌处理后加入二氯喹啉酸，使每个锥形瓶中二氯喹啉酸的浓度为50mg/L，以4%（体积分数）的接种量（OD600=0.42）接入活化好的降解菌J3菌液。0h时每瓶取样一次作为CK。之后分别放置于20℃、25℃、30℃、35℃、40℃和45℃（每个处理3个重复）的恒温摇床中黑暗振荡培养。7d后取样测定其OD600值以及降解率。
结果显示，二氯喹啉酸降解菌J3培养6d后在30℃、pH值7、接种量4%、二氯喹啉酸初始质量浓度为100mg/L的条件下表现出了最佳的降解效果，降解率超过70%。
实例4菌株J3对烟草药害的防治效果
以云烟87为供试烟草。将保存的降解菌J3转接到灭过菌的LB培养基中，于30℃、150r/min恒温摇床黑暗振荡培养过夜供试。
将二氯喹啉酸以混土法加入土壤，剂量分别为其田间推荐用量的25%、50%和100%，装入直径18cm，高20cm的盆钵。将培育至4～5叶期的烟苗移栽至盆钵中，每钵1株，移栽后用J3菌液进行灌根处理，接菌量为4%（降解菌J3经液体LB培养过夜，OD600=0.42，加8mlJ3菌液于200ml无菌水中，最后加入到盆钵中烟株根部附近）。分别设CK组（不加菌不加药）、生防组（加菌加药，二氯喹啉酸用量为田间推荐用量）和药害组（只加药不加菌，二氯喹啉酸用量分别为田间推荐用量），每个处理5个重复。
分别于20d、40d和60d后调查烟株叶宽（自顶端开始调查第4片叶），数据采用Microsoft Excel2000软件处理，并用DPS软件包分析，得出每个处理的平均叶宽，按照公式分别计算抑制率及恢复率。
调查结果为：药害组的烟草平均叶宽2.5cm，生防组的烟草平均叶宽4.5cm，CK组的烟草叶宽7.0cm。
按照公式计算出二氯喹啉酸的抑制率为64.3%，菌株J3的恢复率为44.4%。
计算结果说明，菌株J3能够防治烟草受二氯喹啉酸的药害。
实施例5微生态降解菌剂的制备
1、菌株的培养
配制细菌斜面培养基，接种，放入30℃培养箱中培养48小时，保存备用。
2、制备降解菌剂
其中根据不同的应用方面制备不同的剂型：
（1）液体制剂：用500mL三角瓶装100ml LB培养基，常规灭菌，冷却后再超净工作台上，用无菌水直接洗下斜面菌体接种入发酵三角瓶中，摇瓶培养30℃，200r/min，培养24h。马上转入发酵罐发酵，细菌发酵罐培养基的配制、灭菌，冷却后接种与发酵，30℃，200r/min，培养48h中止发酵。采用塑料瓶或者塑料袋包装发酵液。
（2）固体粉剂：参照细菌摇瓶培养基的配制，用500mL三角瓶装100ml LB培养基，常规灭菌，冷却后再超净工作台上，用无菌水直接洗下斜面菌体接种入发酵三角瓶中，摇瓶培养30℃，200r/min，培养24h。马上转入发酵罐发酵，细菌发酵罐培养基的配制、灭菌，冷却后接种与发酵，30℃，200r/min，培养48h中止发酵，离心发酵液，得到菌体，向其中加入木炭粉吸附菌体，用塑料袋进行包装。
实施例6微生态降解菌剂对烟草药害的防治效果
采用微生态降解菌剂（液体制剂）在烟草移栽时灌根。每1公斤降解菌剂用600-800倍清水混匀，烟草移栽后，淋在烟草根际及周围。在烟草团棵期，再进行施药1次。该施药方式的作用和特征为降解烟草根际周围的二氯喹啉酸，防止二氯喹啉酸侵入烟草根部并吸收，提高烟草产量20%。
采用微生态降解菌剂(固体制剂)与烟草基肥混合施用。按每1公斤降解菌剂与用于1亩烟田的烟草基肥混匀，施至田间。该施药方式的作用和特征为降解烟草根际周围的二氯喹啉酸，菌剂将侵入烟草，在烟草根际及茎秆中定殖，提高烟草产量20%。试验证明，说明所述菌剂能够防治烟草受二氯喹啉酸的药害。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (6)
1.一株二氯喹啉酸降解菌，经鉴定为产碱菌属(Alcaligenes sp.)，编号J3，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2013年3月28日，保藏编号为CGMCC No.7384。
2.权利要求1所述的降解菌在降解二氯喹啉酸中的应用。
3.权利要求1所述的降解菌在防治烟草受二氯喹啉酸药害中的应用。
4.一种包含权利要求1所述的降解菌的菌剂。
5.权利要求4所述的菌剂在降解二氯喹啉酸中的应用。
6.权利要求4所述的菌剂在防治烟草受二氯喹啉酸药害中的应用。
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