CN117043194A - 程序性死亡受体1（pd-1）抗体的组合物以及获得所述组合物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了在CDRH3重链区中Met105的氧化小于或等于约3.0％的抗PD‑1抗体或其抗原结合片段的组合物，以及获得纯化的所述组合物的方法。本发明还提供了包含抗PD‑1抗体主要物质及其酸性物质的组合物，其中所述酸性物质的量是约1.0‑12.0％。

Description

程序性死亡受体1(PD-1)抗体的组合物以及获得所述组合物 的方法

发明领域

本发明提供了在CDRH3重链区中Met105的氧化小于或等于约3.0％的抗PD-1抗体或其抗原结合片段或约1.0-12.0％酸性物质的纯化的组合物，以及获得本发明的纯化的组合物的方法。

对电子提交的序列表的参考

本申请的序列表通过EFS-Web以电子方式提交，作为ASCII格式的序列表，文件名为25195-WO-PCT_SEQLIST-20JAN2022.txt，创建日期为2022年1月20日，大小为30kb。通过EFS-Web提交的该序列表是本说明书的一部分，并且其全部内容通过引用并入本文。

发明背景

针对程序性死亡受体-1(PD-1)轴的免疫检查点疗法在多种人类癌症的临床应答中取得了突破性的改善(Brahmer等，N Engl J Med 2012,366:2455-65；Garon等，N Engl JMed 2015,372:2018-28；Hamid等，N Engl J Med 2013,369:134-44；Robert等，Lancet2014,384:1109-17；Robert等，N Engl J Med 2015,372:2521-32；Robert等，N Engl J Med2015,372:320-30；Topalian等，N Engl J Med 2012,366:2443-54；Topalian等，J ClinOncol 2014,32:1020-30；Wolchok等，N Engl J Med 2013,369:122-33)。T细胞上的PD-1受体与其配体PD-L1和PD-L2在肿瘤和免疫浸润细胞上的相互作用调节T细胞介导的免疫应答，并且可能在人类肿瘤的免疫逃逸中发挥作用(Pardoll DM.Nat Rev Cancer 2012,12:252-64)。PD-1与其任一配体的结合导致向T细胞递送抑制性刺激。靶向PD-1轴的免疫疗法包括针对PD-1受体的单克隆抗体(KEYTRUDA^TM(派姆单抗)，Merck and Co.,Inc.,Kenilworth,NJ；和OPDIVO^TM(纳武单抗)，Bristol-Myers Squibb,Princeton,NJ)；以及结合至PD-L1配体的抗体(MPDL3280A；TECENTRIQ^TM(阿特珠单抗)，Genentech,San Francisco,CA)。这两种疗法均已在很多癌症类型中显示出抗肿瘤作用。

甲硫氨酸的氧化是很多蛋白药物的主要降解途径之一。蛋白中的甲硫氨酸残基易被氧化，导致形成甲硫氨酸亚砜，在极端条件下形成砜。暴露的甲硫氨酸残基或抗体CDR中的甲硫酸钠残基具有通过氧化影响抗体的生物活性的潜力。派姆单抗的主要降解途径包括暴露于光或氧化应激时重链CDR和Fc甲硫氨酸残基中甲硫氨酸105(Met105)的氧化。获得具有低氧化性的派姆单抗组合物是理想的，特别是在Met105位。

天冬酰胺残基的脱酰胺作用可导致琥珀酰亚胺的形成，然后可以转化为天冬氨酸或异天冬氨酸。抗体中的脱酰胺，特别是CDR区中的脱酰胺，具有影响抗体的生物活性的潜力。因此，获得具有低脱酰胺变体的派姆单抗组合物也是理想的。

发明内容

本发明提供了在CDRH3重链区中Met105的氧化小于或等于约3.0％的抗PD-1抗体或其抗原结合片段的组合物。本发明还提供了一种组合物，其包含抗人PD-1抗体主要物质以及抗人PD-1抗体主要物质的酸性物质，所述抗人PD-1抗体的主要物质包含由两条重链和两条轻链组成的抗体，每条重链由SEQ ID NO:11的氨基酸序列组成和每条轻链由SEQ IDNO:5的氨基酸序列组成，其中酸性物质的量是约1.0-12.0％。本发明还提供了一种组合物，其包含抗人PD-1抗体主要物质以及抗人PD-1抗体主要物质的酸性物质和碱性物质，所述抗人PD-1抗体的主要物质包含由两条重链和两条轻链组成的抗体，每条重链由SEQ ID NO:11的氨基酸序列组成和每条轻链由SEQ ID NO:5的氨基酸序列组成，其中所述主要物质的量是约65-85％。令人吃惊的是，与通过分批补料工艺生产的派姆单抗相比，连续灌注上游工艺提供了具有更低Met105氧化％、更低酸性物质％和/或更高主要物质％的派姆单抗组合物。本发明还提供了通过连续灌注工艺获得纯化的组合物的方法。

本文还提供了在有此需要的人类患者中治疗癌症的方法，所述方法包括：向所述患者施用有效量的本发明的组合物。

附图说明

图1：2L和50L规格的连续灌注培养物的细胞培养性能。左上图：活细胞密度(VCD)；右上图：活力；左下图：渗透物效价和右下图：产物筛分。

图2：总离子色谱图是通过在实施例3中描述的还原肽消化来产生的。类似地上样分批补料生产的派姆单抗配制的药品参考标准品(上图)和连续灌注生产的派姆单抗(下图)，并且相对丰度显示两种样品的肽和保留时间相同。NL指标准化水平；m/z指质荷比；FTMS指傅立叶变换质谱，ESI指电喷雾电离。

图3：分批补料产生的派姆单抗参考标准品(上图)和连续灌注产生的派姆单抗(下图)的未修饰M105肽的萃取离子色谱图。包含M105的未修饰肽的保留时间是～37.8min。NL指标准化水平；m/z指质荷比；FTMS指傅立叶变换质谱，ESI指电喷雾电离；RT指保留时间。

图4：分批补料产生的派姆单抗参考标准品(上图)和连续灌注产生的派姆单抗(下图)的未修饰M105肽的萃取离子色谱图。含有M105的未修饰肽的保留时间是36.4min。NL指标准化水平；m/z指质荷比；FTMS指傅立叶变换质谱，ESI指电喷雾电离；RT指保留时间。

图5：在收获的细胞培养液(HCCF)样品中派姆单抗随着时间的推移的M105氧化的变化。黑色圆圈是每种样品注射的结果，和线是数据的线性拟合，并且由y＝0.038x+0.94描述，其中R的平方值是0.9833。

图6：来自连续灌注过程的HCCF的蛋白A色谱纯化后的派姆单抗的离子交换色谱分析图。图中标注了每个峰的保留时间。

图7：来自连续灌注过程的HCCF的离子交换色谱和蛋白A色谱纯化后的派姆单抗的离子交换色谱分析图。图中标注了每个峰的保留时间。

图8：本发明阴离子交换步骤之后的派姆单抗和获自分批补料方法的派姆单抗参考标准品的离子交换色谱分析图的叠加。菱形描绘了积分峰的起点和终点。

图9：在培养数天的时程中，在生物反应器的细胞培养液(BRX)中、在无细胞渗透物(PERM)中、在蛋白A色谱步骤(PAP)之后、在阴离子交换色谱(AEXP)之后的总酸性物质(酸性1+酸性变体+主峰前)％。

图10：在培养数天的时程中，在无细胞渗透物(PERM)中、在蛋白A色谱步骤(PAP)之后、在阴离子交换色谱(AEXP)之后的总主要物质％(如通过离子交换所测量的)。

图11：在培养数天的时程中，在无细胞渗透物(PERM)中、在蛋白A色谱步骤(PAP)之后、在阴离子交换色谱(AEXP)之后的总碱性物质(碱性1+碱性2+碱性变体A+碱性变体B)％。

图12：在培养数天的时程中，在无细胞渗透物(PERM)中、在蛋白A色谱步骤(PAP)之后、在阴离子交换色谱(AEXP)之后的碱性1物质％。

具体实施方式

I.定义和缩写

如在整个说明书和所附权利要求中使用的，应用以下缩写：

API 活性药物成分

CDR 在免疫球蛋白可变区中的互补性决定区

CHO 中国仓鼠卵巢

CI 置信区间

DS 原料药

EC50 引起50％功效或结合的浓度

ELISA 酶联免疫吸附测定

FFPE ***固定，石蜡包埋

FR 框架区

HC 重链

HNSCC 头颈部鳞状细胞癌

HP-HIC 高效疏水相互作用色谱

HP-IEX 高效离子交换色谱

HP-SEC 高效体积排阻色谱

IC50 引起50％抑制的浓度

IgG 免疫球蛋白G

IHC 免疫组织化学或免疫组织化学的

mAb 单克隆抗体

NCBI 国家生物技术信息中心

NSCLC 非小细胞肺癌

PCR 聚合酶链反应

PD-1 程序性死亡1(也称为程序性细胞死亡-1和程序性死亡受体1)

PD-L1 程序性细胞死亡1配体1

PD-L2 程序性细胞死亡1配体2

PS80或PS-80 聚山梨醇酯80

SWFI 无菌注射用水

TNBC 三阴性乳腺癌

V_H 免疫球蛋白重链可变区

VK 免疫球蛋白κ轻链可变区

V_L 免疫球蛋白轻链可变区

v/v 体积/体积

WFI 注射用水

w/v 重量/体积

为了可更容易理解本发明，在下文中具体地定义某些技术和科学术语。除非在本文件中别处具体地定义，否则本文所使用的所有其它技术和科学术语均具有本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义。

如在整个说明书和所附权利要求中使用的，单数形式“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”包括其复数指代，除非上下文另有明确规定。

提及“或”表示一种或两种可能性，除非上下文明确规定了其中一种可能性。在一些情况下，“和/或”是用于强调任一种或两种可能性。

如本文所用，“酸性物质”指酸性高于(例如，如通过阳离子交换色谱所确定的)抗PD-1抗体主要物质的抗PD-1抗体物质。此类酸性物质是通过各种用于通过电荷分离分子变体的色谱纯化方法，如离子交换，例如，阳离子交换色谱(例如，实施例5中所述的方法)或WCX-10HPLC(弱阳离子交换色谱)，任选地随后通过质谱法来检测的。一般情况下，酸性物质的等电点(pI)比主要物质低，并且由于例如甲硫氨酸氧化、天冬酰胺残基的唾液酸化或抗体的脱酰胺变体或其组合，可以具有更强的酸性特征。酸性物质的实例包括但不限于本发明的图6或图7中鉴定出的酸性变体、酸性1和主峰前。任何酸性物质还可以具有选自以下的一个或多个CHO N-连接聚糖：G0-F、G1-F、G2-F、G0、G1、G2和Man5，例如在CH2结构域中的N297处。

在一个实施方式中，抗PD-1抗体酸性物质是通过根据阳离子交换方法在主峰之前洗脱的峰来鉴定的。在另一个实施方式中，抗PD-1抗体酸性物质如根据弱阳离子离子交换方法在主峰之前洗脱的峰来鉴定。在离子交换色谱法中，“酸性物质％”指酸性物质峰的总面积除以洗脱色谱图中所有峰的总面积。

如本文所用，“酸性1物质”指在PD-1抗体主要物质重链的N384、N389和N390中的一个或多个中存在脱酰胺作用、琥珀酰亚胺、天冬氨酸或异天冬氨酸形成中的一个或多个的酸性物质。此类酸性1物质是通过各种用于通过电荷分离分子变体的色谱纯化方法，如离子交换，例如，阳离子交换色谱(例如，在实施例5中所描述的方法)或WCX-10HPLC(弱阳离子交换色谱)，随后通过酸性物质峰的质谱法来检测。

在一个实施方式中，抗PD-1抗体酸性1物质是在如图6或图7的酸性1峰中所鉴定的，并且根据实施例5中所描述的阳离子交换方法洗脱。在离子交换色谱法中，“酸性1物质％”指酸性1物质峰的总面积除以洗脱色谱图中所有峰的总面积。

如本文所用，“酸性变体物质”指在抗PD-1抗体主要物质重链的N31、N52、N55、N59和N61中的一个或多个中存在脱酰胺作用、琥珀酰亚胺、天冬氨酸盐或异天冬氨酸盐形成中的一个或多个；或者在重链中存在M105氧化；或其组合的酸性物质。此类酸性物质变体是通过各种用于通过电荷分离分子变体的色谱纯化方法，如离子交换，例如，阳离子交换色谱(例如，在实施例5中所描述的方法)或WCX-10HPLC(弱阳离子交换色谱)，随后通过酸性物质峰的质谱法来检测。

在一个实施方式中，抗PD-1抗体酸性变体物质是在如图6或图7的酸性变体峰中所鉴定的，并且根据实施例5中所描述的阳离子交换方法洗脱。在离子交换色谱法中，“酸性变体物质％”指酸性变体峰的总面积除以洗脱色谱图中所有峰的总面积。

如本文所用，“碱性物质”指碱性(例如，如通过阳离子交换色谱所确定的)高于抗PD-1抗体主要物质的抗PD-1抗体物质。此类碱性物质是通过各种用于通过电荷分离分子变体的色谱纯化方法，如离子交换，例如，阳离子交换色谱(例如，在实施例5中所描述的方法)或WCX-10HPLC(弱阳离子交换色谱)，任选地随后通过质谱法来检测。在通常情况下，碱性物质具有高于主要物质的pI，并且由于修饰或与主要物质的差异可以具有更强的碱性特征，所述与主要物质的差异包括但不限于存在C末端赖氨酸残基(SEQ ID NO:10或12)、存在N末端谷氨酰胺残基(SEQ ID NO:10或13)或C末端亮氨酸残基α酰胺化(SEQ ID NO:14或15)、根据SEQ ID NO:10-15中任一者的氨基酸序列在一个或多个重链中的N末端氨基酸残基阶段或者其组合。碱性物质的实例包括但不限于在本发明的图6或图7中鉴定的碱性变体A、碱性变体B、碱性1和碱性2峰。任何碱性物质还可以具有选自以下的一个或多个CHO N-连接聚糖：G0-F、G1-F、G2-F、G0、G1、G2和Man5，例如在CH2结构域中的N297处。

在一个实施方式中，抗PD-1抗体碱性物质根据阳离子离子交换方法通过在主峰之后洗脱出的峰来鉴定。在另一个实施方式中，抗PD-1抗体碱性物质根据弱阳离子交换方法通过在主峰之后洗脱出的峰来鉴定。在离子交换色谱法中，“碱性物质％”指碱性物质峰的总面积除以洗脱色谱图中所有峰的总面积。

如本文所用，“主峰物质”指在与一个或多个酸性或碱性物质的混合物中鉴定为大多数抗体物质的抗PD-1抗体物质。此类主峰物质是通过各种用于通过电荷分离分子变体的色谱纯化方法，如离子交换，例如，阳离子交换色谱(例如，在实施例5中所描述的方法)或WCX-10HPLC(弱阳离子交换色谱)，任选地随后通过质谱法来检测。混合物可以是例如来自哺乳动物细胞的抗体制剂及其翻译后修饰、上游和下游加工或储存的结果。主峰物质还可以具有选自以下的一个或多个CHO N-连接聚糖：G0-F、G1-F、G2-F、G0、G1、G2和Man5，例如在CH2结构域中的N297处。

在一个实施方式中，主峰物质包含由两条重链和两条轻链组成的抗PD-1抗体，每条重链由SEQ ID NO:11的氨基酸序列组成和每条轻链由SEQ ID NO:5的氨基酸序列组成。在另一个实施方式中，抗PD-1抗体主峰物质是由中国卵巢细胞产生的，其包含编码由SEQID NO:5的氨基酸序列组成的轻链的多核苷酸和编码由SEQ ID NO:10、13或15的氨基酸序列组成的重链的多核苷酸，或者编码轻链和重链的多核苷酸。

在一个实施方式中，主峰物质根据阳离子交换方法鉴定为主峰。在离子交换色谱法中，“主峰物质％”指主峰的总面积除以洗脱色谱图中所有峰的总面积。

如本文所用，“碱性1物质”指由两条重链和两条轻链组成的碱性物质，一条重链由SEQ ID NO:11的氨基酸序列组成，一条重链由SEQ ID NO:12的氨基酸序列组成以及每条轻链由SEQ ID NO:5的氨基酸序列组成；或者碱性物质由两条重链和两条轻链组成，一条重链由SEQ ID NO:11的氨基酸序列组成，一条重链由SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成，其中C末端亮氨酸是α酰胺化的，以及每条轻链由SEQ ID NO:5的氨基酸序列组成；或者其组合。此类碱性1物质是通过各种用于通过电荷分离分子变体的色谱纯化方法，如离子交换，例如，阳离子交换色谱(例如，在实施例5中所描述的方法)或WCX-10HPLC(弱阳离子交换色谱)，随后通过碱性物质峰的质谱法来检测。

在一个实施方式中，抗PD-1抗体碱性1物质是在如图6或图7的碱性1峰中所鉴定的，并且根据实施例5中所描述的阳离子交换方法洗脱。在离子交换色谱法中，“碱性1物质％”指碱性1峰的总面积除以洗脱色谱图中所有峰的总面积。

如本文所用，“脱酰胺变体”指其中一个或多个天冬酰胺残基已经脱酰胺的抗体。脱酰胺变体可以是琥珀酰亚胺、天冬氨酸盐或异天冬氨酸盐的形式，即，中性酰胺侧链已转化成具有整体酸性特征的残基。

在测量主峰物质、酸性物质或碱性物质的一个方面中，将Thermo ScientificProPac WCX-10柱用于阳离子交换方法。在另一个实施方式中，使用Thermo ScientificProPac WCX-10柱，其中流动相(A)是24mM MES pH 6.1和4％乙腈，以及流动相(B)是20mM磷酸钠、95mM NaCl pH 8.0和4％乙腈，以及柱温是35℃。在一个实施方式中，使用非线性梯度：22％–22％B 0–0.6min；22％–29％B 0.6–15.0min；29％–70％B 15.0–30.0min；70％–100％B 30.0–30.5min；以及100％–100％B 30.5–33.0min。在一个进一步的实施方式中，在实施例5中描述了阳离子交换方法。

如本文所用，“表达(express/expression)”是指允许或导致基因或编码序列(例如，RNA或DNA)中的信息变得明确；例如，通过激活参与相应基因的转录和翻译的细胞功能来产生蛋白。DNA序列可以在细胞中或通过细胞表达，以形成“表达产物”，如RNA(例如，mRNA)或蛋白。表达产物本身也可以说是由细胞“表达”的。

如本文所用，“表达载体”或“表达构建体”是指载剂(例如，质粒)，通过该载剂，可以将包含与编码序列可操作连接的调控序列的多核苷酸引入宿主细胞，其中编码序列是使用宿主细胞的转录和翻译机构来表达的。

如本文所用，“表达盒”是指包含足以控制基因表达的元件的多核苷酸，包括但不限于与基因序列可操作连接或与用于***基因序列的多克隆位点可操作连接的启动子，以及polyA信号。在一些实施方式中，表达盒还包含一个或多个调控元件，其能够在转录、翻译和/或染色质水平调控基因的表达。

如本文所用，“启动子”或“启动子序列”是指含有调控区的DNA片段，该调控区能够募集RNA聚合酶(例如，直接或通过其他启动子结合的蛋白或物质)并启动编码序列的转录。在启动子序列中可以发现转录起始位点(例如，通过核酸酶S1作图来方便地定义)，以及负责RNA聚合酶募集的蛋白结合结构域(共有序列)。

如本文所用，“增强子”或“增强子序列”是指独立于启动子与启动子的距离、位置或方向而增强启动子转录的DNA调控区在某些实施方式中，增强子紧邻启动子。在一些实施方式中，增强子与启动子相距甚远。在其他实施方式中，启动子和增强子是一个组合序列，本文称为“组合增强子/启动子”。

如本文所用，“内部核糖体进入位点”或“IRES”指的是RNA元件或序列，其允许通过直接募集核糖体以不依赖于帽的方式启动翻译。如本文所用，术语“内部核糖体进入位点”或“IRES”还包括可以转录成RNA序列的DNA序列，该序列允许通过直接募集核糖体以不依赖于帽的方式启动翻译。IRES可以是来自任何物种的野生型IRES或其变体或突变体，无论是天然存在的还是人为的。可以使用的IRES的实例包括但不限于脑心肌炎病毒(EMCV)的5’非翻译区的核苷酸序列(GenBank:M81861.1；Duke等，Sequence and structural elementsthat contribute to efficient encephalomyocarditis virus RNA translation.JVirol.1992Mar；66(3):1602-9)；Bochkov&Palmenberg描述的IRES元件(Translationalefficiency of EMCV IRES in bicistronic vectors is dependent upon IRESsequence and gene location.Biotechniques.2006Sep；41(3):283-4)；来自表达载体pInSRT-GFP的IRES元件(GenBank LC417349.1)；来自表达载体pCeMM-CTAP(SG)的IRES元件(GenBank EF467048.1)；Jang&Wimmer描述的IRES元件(Cap-independent translation ofencephalomyocarditis virus RNA:structural elements of the internal ribosomalentry site and involvement of a cellular 57-kD RNA-binding protein.GenesDev.1990Sep；4(9):1560-72)；来自表达载体pIRESneo3的IRES元件(Clontech/TakaraBio)；WO 2015/016786、WO 2015/021077、WO 2016/003368、WO 2016/074016或WO 2013/092743中描述的IRES元件或其变体。

如本文所用，“调控元件”、“调控区”或“调控序列”是指具有调控(如启动、激活、增强、增加、减少、抑制、遏制或沉默)基因表达能力的多核苷酸序列。在一些实施方式中，这种调控是通过细胞因子与多核苷酸序列的结合来实现的。在其他实施方式中，这种调控是通过细胞因子之间的相互作用来实现的。在从DNA到蛋白的表达过程中，这种调控可以发生在一个或多个不同的水平，包括但不限于转录、翻译或染色质水平。

如本文所用，“绝缘子”指一类DNA元件或序列，其具有通过防止染色体周围区域的位置效应来分离近端DNA区域的能力。在某些实施方式中，当绝缘子位于增强子和启动子之间时，绝缘子可以阻止增强子。在一些实施方式中，绝缘子可以起到屏障的作用，阻止附近浓缩染色质的前进，否则染色质可能会沉默表达。在其他实施方式中，绝缘子可以阻止增强子并起到屏障作用。

如本文所用，“表达增强序列元件”或“EASE”是指当DNA元件或序列位于控制蛋白表达的启动子上游时，可以增加蛋白表达的DNA元件或序列。

如本文所用，“三方前导子”或“TPL”是指腺病毒晚期表达的mRNA的5’-非翻译区中的RNA元件或序列，该元件或序列能够以不依赖于帽的方式启动晚期表达的信使核糖核酸的翻译。如本文所用，术语“三方前导子”或“TPL”还包括可以转录到腺病毒晚期表达的mRNA的5’-非翻译区中的RNA序列的DNA序列，其具有以不依赖于帽的方式启动晚期表达的信使核糖核酸翻译的能力。

如本文所用，在转座子技术的背景下，“倒置末端重复序列”或“ITR”是指DNA元件或序列及其位于转座子任一端的倒置形式，其发出断裂和连接发生的信号。

如本文所用，“选择性标记物”或“选择标记物”是指通过向培养基中添加相应的选择剂，能够特异性选择表达该蛋白的细胞的蛋白。在某些实施方式中，选择性标记物是真核生物选择性标记物，其可以选择表达标记蛋白的真核细胞。在一些实施方式中，选择性标记物是细菌选择性标记物，其允许选择表达标记蛋白的细菌细胞。

如本文所用，“多核苷酸序列”、“核酸序列”或“核苷酸序列”是指核酸中的一系列核苷酸碱基(也称为“核苷酸”)，如DNA或RNA，是指两个或多个核苷酸的任何链。

如本文所用，“宿主细胞”是指用于生产由表达载体编码的重组蛋白或繁殖引入宿主细胞的表达载体的任何生物体的任何细胞。“哺乳动物重组宿主细胞”是指包含异源表达载体的哺乳动物宿主细胞，其可以整合或不整合到宿主细胞染色体中。“细菌重组宿主细胞”是指包含异源表达载体的细菌宿主细胞，其可以整合或不整合到宿主细胞染色体中。

如本文所用，术语“分批补料培养”是指一种培养细胞的方法，其中在培养过程中向培养物提供额外的营养。分批补料培养通常在某个点停止，并且收获培养基中的细胞和/或组分。产物累积并保持在生物反应器中直到运行结束。

如本文所用，“收获”抗体或抗原结合片段包括将其从可包括宿主细胞、细胞聚集体和/或裂解的细胞片段的颗粒物中分离成基本上不含宿主细胞和细胞碎片的无细胞级分，即无细胞“渗透物”。这些细胞和细胞碎片例如通过离心、深度过滤和/或微滤从细胞培养肉汤中除去。例如，为制备无细胞渗透物，可以使用中空纤维膜或一系列过滤步骤如深度过滤。“连续收获”指在生物反应器中产生抗体的同时收获细胞培养肉汤。在通过灌注***去除培养基的过程中，可以通过微滤从细胞培养肉汤中连续收获生物反应器中分泌的蛋白产物，从而在离开灌注***的微滤器渗透物中分离出目标蛋白。微滤器可以是包括中空纤维模块的切向流过滤(TFF)单元或交替切向流过滤(ATF)单元。市售TFF单元包括但不限于TFF单元或/>Max。例如，市售中空纤维模块可以从Pall或Repligen获得。在一个实施方式中，灌注生物反应器对于包含抗体或抗原结合片段的细胞培养肉汤具有恒定的渗透速率，以保持到亲和色谱步骤的一致流速。

如本文所用，“细胞培养肉汤”是指在细胞生长和抗体产生过程中包含宿主细胞、细胞碎片、细胞培养基、抗体或抗原结合片段的肉汤。

如本文所用，“收获细胞培养液”或“HCCF”是指包含在收获细胞培养基后获得的抗体或抗原结合片段的细胞培养液，其基本上不含宿主细胞和细胞碎片。在一个实施方式中，HCCF是无细胞渗透物。

如本文所用，当含有目标蛋白的材料在步骤或***之间通过管道、卡套管或其他封闭导管流动而无需手动装载或卸载时，“流体连接”、“流体”或“流体连接到”或“流体接收来自……的材料”是指制造过程或来自另一细胞的另一步骤。

如本文所用，在HCCF的上下文中，“连续纯化”指对于至少加载步骤，HCCF不间断流动至至少一个亲和性固定相，以及任选地对于任何洗涤或洗脱步骤的不间断流动。

如本文所用，“灌注”指一种培养细胞的方法，其中在一段时间内连续地向培养物提供额外的新鲜培养基(在培养过程开始之后)，并且同时去除培养基，同时连续地从培养基中收获抗体或抗原结合片段。新鲜培养基通常为在培养过程中耗尽的细胞提供营养补充。

如本文所用，“灌注速率”指提供新鲜培养基并且去除细胞培养液的速率。

如本文所用，“灌注生物反应器”是指用于培养细胞的生物反应器，在该生物反应器中，可以向反应器中加入等量的培养基，也可以同时从反应器中去除培养基。在一个实施方式中，细胞保留在生物反应器中。灌注生物反应器包括生物反应器和可操作地附接的灌注***，所述灌注***提供稳定的新鲜培养基来源并去除细胞废料产物。灌注生物反应器的生物反应器和灌注***可以是协同运行的分开的机械单元。大量市售实例包括但不限于多种品牌单次使用生物反应器(SUB；GE Healthcare Life Sciences)和品牌灌注流动路径集成和***(Spectrum；Repligen)，专业人员可以适当地将所述生物反应器和灌注***组合成灌注生物反应器。或者，可以将生物反应器和灌注***组装成单一机械单元，例如，但不限于，3DBiotek品牌灌注生物反应器(Sigma-Aldrich)。

如本文所用，术语“缓冲容器”指在管道、进料器、坝(dam)、管或导管下游段的充分混合(提供充分混合以使流体均匀)的储存池、混合容器、进料槽或收集容器(或者可互换地，“收集槽”)，以吸收两个流体连接的单元操作之间的差异流动速率，例如，在本发明的连续或半连续形式过程的实施方式中来自生物反应器的渗透物的流动速率以及在自动化控制下的第一色谱***的流动速率。缓冲容器通过允许体积在流体连接的单元操作之间在预设的体积范围限制内缓冲来吸收流动速率的变化或差异。

如本文所用，术语“停留时间”指流体溶液在容器内部耗费的平均时间。对于灌注而言，这是交换速率的倒数(例如，2VVD的平均停留时间为0.5天)。筛分溶液组分时，忽略膜对溶液组分的停留时间。

如本文所用，“M105”、“Met105”或“甲硫氨酸105”指SEQ ID NO:8(RDYRFDMGFDY)中重链的CDRH3区中的甲硫氨酸。

如本文所用，“M105的氧化％”或“Met105的氧化％”指a)具有氧化的Met105的本发明抗PD-1抗体片段的总量比上具有和不具有氧化的Met105的本发明抗PD-1抗体片段的总量；或b)具有氧化的Met105的本发明的抗PD-1抗体的总量比上具有和不具有氧化的Met105的本发明抗PD-1抗体的总量。计算方法a)可以根据实施例中提供的还原肽作图的方法使用。计算方法b)可用于例如如WO2018/204368(其全部内容通过引用并入本文)中所描述的疏水相互作用色谱(HIC)或逆向HPLC方法中。

抗体或抗原结合片段与固定相“结合”指在适当条件(pH和/或电导性)下使抗体或抗原结合片段暴露于固定相，使得通过抗体或抗原结合片段与固定于固定相上的配体之间的相互作用而使抗体或抗原结合片段与固定相可逆地结合。

如本文所用，术语“平衡溶液”指用于在将抗体或抗原结合片段加载到固定相上之前平衡固定相的溶液。平衡溶液可以包含一种或多种盐或缓冲物质。在一个实施方式中，平衡溶液与包含抗体或抗原结合片段的加载溶液的条件相同。

如本文所用，术语“加载溶液”指用于将包含目标抗体或抗原结合片段和一种或多种杂质的组合物加载到固定相上的溶液。加载溶液可以任选地还包含一种或多种缓冲物质和盐。

如本文所用，术语“洗涤溶液”指在洗脱目标抗体或抗原结合片段之前，用于洗涤或再平衡固定相的溶液。对于洗涤，洗涤溶液的电导率和/或pH使得杂质从固定相去除。对于再平衡，洗涤溶液和平衡溶液可以是相同的，但这不是必需的。洗涤溶液可以包含一种或多种盐和缓冲物质。

如本文所用，“洗脱溶液”指用于从固定相洗脱目标抗体或抗原结合片段的溶液。洗脱溶液可以包含一种或多种盐或缓冲物质。洗脱溶液的盐、缓冲物质、pH或电导率中的一种或多种的存在使得抗体或抗原结合片段从固定相洗脱。

如本文所用，术语“电导率”指水溶液在两个电极之间传导电流的能力。在溶液中，电流通过离子传输流动。因此，随着水溶液中存在的离子量的增加，溶液将具有较高的电导率。电导率的测量单位是mS/cm，并且可以使用例如GE HealthcareSystem内销售的电导率仪来测量。溶液的电导率可以通过改变其中的离子浓度来改变。例如，可以改变溶液中缓冲剂的浓度和/或盐(例如，NaCl或KCl)的浓度，以获得所需电导率。优选地，对各种缓冲剂的盐浓度进行改进以获得所需的电导率，如下文实施例。

如本文所用，“纯化”目标抗体或抗原结合片段或“纯化的组合物”指通过从组合物去除(完全或部分)至少一种杂质来增加组合物中抗体或抗原结合片段的纯度。杂质可以是宿主细胞组分(如血清、蛋白或核酸)、细胞碎片、生长培养基或抗体聚集体。该术语并非旨在指此类生物分子完全不存在或水、缓冲剂或盐不存在，或包括抗体或抗原结合片段的药物组合物的组分。

如本文所用，“连续多重柱色谱***”指含有至少两个具有类似杂质分离功能的固定相的色谱***，其允许至少一个固定相加载样品，以及至少一个固定相来进行非加载步骤(平衡、洗涤、洗脱和再生的一个或多个)。

如本文所用，“固定相”指上面可固定一种或多种配体的任何表面。固定相可以是混悬液、离散粒子的不连续相、板、传感器、芯片、胶囊、滤筒、树脂、小珠、单片(monolith)、凝胶、膜或膜吸附剂等。固定相也可以封装在纯化柱(例如，填充有树脂珠粒)中。用于形成固定相的材料的实例包括机械稳定基质，如多孔或无孔小珠、无机材料(例如，多孔二氧化硅、受控的微孔玻璃(CPG)和羟基磷灰石)、合成有机聚合物(例如，聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯-二乙烯苯、聚(苯乙烯二乙烯基)苯、聚丙烯酰胺、陶瓷粒子以及上述任何一种的衍生物)以及多糖(例如，纤维素、琼脂糖和葡聚糖)。参见Jansson,J.C.；Rydén,L.Protein Purification；Wiley:New York,1998。

如本文所用，“杂质”指不同于所需抗体或抗原结合片段的材料。杂质可以是宿主细胞蛋白(HCP)、宿主细胞DNA(HC-DNA)、蛋白聚集体或片段(clip)以及其他不是所需的蛋白修饰(即，氧化物质、酸变体物质)。

如本文所用，“治疗(treat/treating)”癌症指将本发明组合物施用给患有免疫病况或癌性病况，或经诊断患有癌症或致病性感染(例如，病毒、细菌、真菌)的受试者以实现至少一种积极治疗效果，诸如比如癌细胞数量减少、肿瘤尺寸缩小、癌细胞浸润至周边器官中的速率降低或肿瘤转移或肿瘤生长速率降低。“治疗(treatment)”可以包括以下一种或多种：诱导/增强抗肿瘤免疫应答；刺激对病原体、毒素和/或自身抗原的免疫应答；刺激对病毒感染的免疫应答；减少一种或多种肿瘤标记物的数量；停止或延缓肿瘤或血液癌症的生长或与PD-1与其配体PD-L1和/或PD-L2的结合有关的疾病(“PD-1相关疾病”)的进展，诸如癌症的进展；稳定PD-1相关疾病；抑制肿瘤细胞的生长或存活；清除一种或多种癌性病灶或肿瘤或缩小其尺寸；降低一种或多种肿瘤标记物的含量；减缓、消除PD-1相关疾病的临床表现；降低诸如癌症的PD-1相关疾病的临床症状的最严重程度或减少其持续时间；相对于类似的未经治疗的患者的预期生存期，延长患者的生存期；导致癌性病况或其他PD-1相关疾病的完全或部分缓解。

“免疫病况”或“免疫病症”涵盖例如病理性炎症、炎性病症和自身免疫性病症或疾病。“免疫病况”亦指感染、持久性感染和增殖性病况，如癌症、肿瘤和新生血管生成，包括抵抗由免疫***进行根除的感染、肿瘤和癌症。“癌性病况”包括例如癌症、癌细胞、肿瘤、新生血管生成和癌前病况，如发育不良。

癌症的积极治疗效果可以多种方式测量(参见W.A.Weber,J.Nucl.Med.50:1S-10S(2009))。例如，就肿瘤生长抑制而言，根据NCI标准，T/C≦42％是抗肿瘤活性的最低水平。将T/C<10％认为是高抗肿瘤活性水平，其中T/C(％)＝经治疗的肿瘤体积中位数/对照的肿瘤体积中位数×100。在一些实施方式中，通过施用本发明的组合物实现的治疗是无进展生存期(PFS)、无病生存期(DFS)或总生存期(OS)中的任一者。PFS(也称为“至肿瘤进展时间”)指示在治疗期间和治疗之后癌症不生长的时长，并且包括患者经历完全缓解或部分缓解的时间量以及患者经历疾病稳定的时间量。DFS指患者保持无疾病的治疗期间和之后的时间长度。OS指与未经处理或未经治疗的个体或患者相比，预期寿命的延长。尽管本发明的组合物、治疗方法和用途的实施方式可能无法在每个患者中有效实现积极治疗效果，但其应在如通过此项技术中已知的任何统计学方法所测定的统计显著数量的受试者中实现积极治疗效果，所述统计学检验如Student t检验、卡方检验、Mann和Whitney的U检验、Kruskal-Wallis检验(H检验)、Jonckheere-Terpstra检验和Wilcoxon检验。

如本文所用，术语“患者”(或者在本文中称为“受试者”或“个体”)指能够用于本发明的组合物治疗的哺乳动物(例如，大鼠、小鼠、犬、猫、家兔)，最优选人类。在一些实施方式中，患者是成年患者。在其他实施方式中，患者是儿科患者。“需要治疗”的那些患者包括可以从用本发明的组合物进行治疗获益的那些患者，例如，罹患癌症或免疫病况的患者。

如本文所用，术语“抗体”指显示所需生物活性的抗体的任何形式。因此，其以最广泛意义使用并且特定地涵盖(但不限于)单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、人源化抗体、全人抗体和嵌合抗体。

在通常情况下，基本抗体结构单元包括四聚体。每个四聚体包含两个相同的多肽链对，每对具有一个“轻”链(约25kDa)和一个“重”链(约50-70kDa)。每条链的氨基末端部分包括一个主要负责抗原识别的具有约100指110个或110个以上氨基酸的可变区。每条轻链/重链对的可变区形成抗体结合位点。因此，在通常情况下，完整抗体具有两个结合位点。重链的羧基末端部分可定义主要负责效应物功能的恒定区。通常，人轻链分类为κ轻链和λ轻链。此外，人重链通常分类为μ、δ、γ、α或ε，并将抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链中，可变区和恒定区由约12个或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包括约10个以上氨基酸的“D”区。通常参见Fundamental Immunology Ch.7(Paul,W.编著，第2版，Raven Press,N.Y.(1989))。

通常，重链和轻链的可变结构域都包含三个高变区，也称为互补性决定区(CDR)，其位于相对保守的框架区(FR)内。CDR通常通过框架区排列，从而能够与特定表位结合。在通常情况下，从N末端到C末端，轻链和重链可变结构域均包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。每个结构域的氨基酸分配一般是根据Sequences of Proteins ofImmunological Interest,Kabat等；National Institutes of Health,Bethesda,Md.；第5版；NIH公开号91-3242(1991)；Kabat(1978)Adv.Prot.Chem.32:1-75；Kabat,等，(1977)J.Biol.Chem.252:6609-6616；Chothia等，(1987)J Mol.Biol.196:901-917或Chothia等，(1989)Nature 342:878-883的定义。

如本文所用，术语“药物有效量”或“有效量”是指将足够的治疗组合物或组合物引入患者以治疗疾病或病况的量。本领域技术人员认识到，该水平可以根据患者的特征(如年龄、体重等)而变化。

术语“约”在修饰物质或组合物的数量(例如，mM或M)、组合物组分的百分比(v/v或w/v)、溶液/组合物的pH值或表征方法中的步骤的参数值或其类似物时，指可能发生的数量变化，例如通过组合物的制备、表征和/或使用中涉及的典型测量、处理和取样程序；通过这些程序中的仪器误差；通过用于制备或使用组合物或执行程序的成分的制备、来源或纯度的差异；及其类似因素。在某些实施方式中，“约”可以指该值的±0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％或10％的变化。

如本文所用，术语“癌症”、“癌性”或“恶性”指或描述哺乳动物中的生理学状况，其特征典型地在于不受调节的细胞生长。癌症的实例包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、白血病、母细胞瘤和肉瘤。此类癌症的更特定的实例包括鳞状细胞癌、骨髓瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、胃肠(道)癌症、肾癌、卵巢癌、肝癌、成淋巴细胞白血病、淋巴细胞白血病、结直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、***癌、甲状腺癌、黑色素瘤、软骨肉瘤、神经母细胞瘤、胰腺癌、多形性胶质母细胞瘤、***、脑癌、胃癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌和头颈癌。

如本文所用，术语“PD-1结合片段”、“其抗原结合片段”、“其结合片段”或“其片段”涵盖抗体的片段或衍生物，其仍实质上保留与抗原(人PD-1)结合并抑制其活性(例如，阻断PD-1与PDL1和PDL2结合)的生物活性。因此，术语“抗体片段”或PD-1结合片段指全长抗体的一部分，通常为其抗原结合或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')₂和Fv片段。通常，结合片段或衍生物保留其PD-1抑制活性的至少10％。在一些实施方式中，结合片段或衍生物保留其PD-1抑制活性的至少25％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％(或更多)，但具有足够亲和力以发挥所需生物效应的任何结合片段均为有用的。在一些实施方式中，抗原结合片段以比与无关抗原的亲和力大至少两倍，优选地大至少十倍，更优选地大至少20倍且最优选大至少100倍的亲和力结合于其抗原。在一个实施方式中，抗体的亲和力大于约10⁹升/mol，例如，如通过Scatchard analysis.Munsen等，(1980)Analyt.Biochem.107:220-239所测定。还预期，PD-1结合片段可包括具有不实质上改变其生物活性的保守性氨基酸置换的变体。

如本文所用，“人源化抗体”是指包含非人(例如，小鼠)抗体和人抗体序列的抗体形式。此类抗体包含来源于非人免疫球蛋白的最小序列。在通常情况下，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个，通常是两个可变结构域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，并且所有或基本所有FR区是人免疫球蛋白序列的FR区。人源化抗体任选地还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区。啮齿动物抗体的人源化形式通常包括与亲代啮齿动物抗体相同的CDR序列，但是可以包括某些氨基酸置换以增加亲和力、增加人源化抗体的稳定性或出于其他原因。

本发明的抗体还包括具有修饰(或阻断)的Fc区以提供改变的效应物功能的抗体。参见，例如，美国专利号5,624,821；WO2003/086310；WO2005/120571；WO2006/0057702；Presta(2006)Adv.Drug Delivery Rev.58:640-656。这种修饰可用于增强或抑制免疫***的各种应答，在诊断和治疗中具有可能的有益效果。Fc区的改变包括氨基酸变化(置换、缺失和***)、糖基化或去糖基化以及添加多个Fc。Fc的变化也会改变抗体在治疗性抗体中的半衰期，半衰期越长，给药频率越低，同时增加了便利性，减少了材料的使用。参见Presta(2005)J.Allergy Clin.Immunol.116:731at 734-35。

如本文所用，“保守修饰的变体”或“保守性置换”指本领域技术人员公知的氨基酸的置换，并且通常可以在不改变所得分子的生物活性的情况下进行，即使在多肽的必需区域中也是如此。这样的示例性置换优选根据下表1中列出的那些进行：

表1：示例性保守性氨基酸置换

此外，本领域技术人员将意识到的是，在通常情况下，多肽非必需区域中的单个氨基酸置换基本上不会改变生物活性。参见，例如，Watson等，(1987)Molecular Biology ofthe Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.,p.224(第4版)。

如在整个说明书和权利要求书中所使用的，短语“基本上由……组成(consistsessentially of)”或变体“基本上由……组成(consist essentially of/consistingessentially of)”指包括任何所述要素或要素的群，并且任选地包括具有与所述要素类似或不同的性质的其他要素，所述其他要素不会实质上改变特定剂量方案、方法或组合物的基本或新性质。作为非限制性实例，基本上由所述氨基酸序列组成的结合化合物还可以包括一种或多种氨基酸，包括一个或多个氨基酸残基的置换，其不会实质性地影响结合化合物的性质。

在整个说明书和权利要求书中，“包含(Comprising或其变体comprise、comprises、comprised of)”在包括性含义上使用，即，指定所述特征的存在，但不排除可能实质上增强本发明任何实施方式的操作或实用性的进一步特征的存在或添加，除非上下文由于表达语言或必要的含义另有要求。

如本文所用，“单克隆抗体”或“mAb”或“Mab”指实质上同质的抗体的群，即，组成群的抗体分子在氨基酸序列上是相同的，除了可能少量存在的天然存在的突变。相比之下，常规(多克隆)抗体制剂通常包括在其可变结构域中具有不同氨基酸序列的多种不同抗体，特别是其CDR，其通常对不同表位具有特异性。修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体中获得的，不应被解释为需要通过任何特定方法生产抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可通过首先由Kohler等，(1975)Nature 256:495描述的杂交瘤方法制备，或者可由重组DNA方法(参见，例如，美国专利号4,816,567)制备。“单克隆抗体”也可以例如使用Clackson等，(1991)Nature 352:624-628和Marks等，(1991)J.Mol.Biol.222:581-597中描述的技术从噬菌体抗体文库分离。也参见Presta(2005)J.AllergyClin.Immunol.116:731。

“肿瘤”适用于被诊断患有或疑似患有癌症的受试者，是指任何尺寸的恶性或潜在恶性赘生物或组织块，包括原发性肿瘤和继发性赘生物。实体瘤是异常生长或组织块，通常不包含囊肿或液体区域。不同类型的实体瘤以形成其的细胞类型命名。实体瘤的实例是肉瘤、癌瘤和淋巴瘤。白血病(血液癌症)通常不会形成实体瘤(美国国立癌症研究院，癌症术语词典)。

术语“肿瘤尺寸”是指肿瘤的总尺寸，可以以肿瘤的长度和宽度测量。肿瘤尺寸可以通过本领域公知的各种方法确定，比如，例如通过通过使用卡尺来测量从受试者移除时肿瘤的尺寸，或者当在体内时使用成像技术测量，例如，骨扫描、超声、CT或MRI扫描。

“肿瘤比例评分(TPS)”指在任何强度(弱、中或强)下在细胞膜上表达PD-L1的肿瘤细胞的百分比。将线性部分或完整细胞膜染色解释为PD-L1阳性。

“单核炎症密度评分(MIDS)”指浸润或邻近肿瘤的表达PD-L1的单核炎症细胞(MIC)(肿瘤巢和邻近支持基质内的小型和大型淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞)的数量和肿瘤细胞的总数的比率。以0至4的标度记录MIDS，其中0＝不存在；1＝存在，但是每100个肿瘤细胞中存在少于一个MIC(<1％)；2＝每100个肿瘤细胞中存在至少一个MICk，但每10个肿瘤细胞中存在少于一个MIC(1-9％)；3＝每10个肿瘤细胞中存在至少一个MIC，但MIC比肿瘤细胞少(10-99％)；4＝MIC至少与肿瘤细胞一样多(≥100％)。

“组合阳性评分(CPS)”指在肿瘤巢和邻近支持基质内的PD-L1阳性肿瘤细胞和PD-L1阳性单核炎症细胞(MIC)的数量(分子)与肿瘤细胞的总数(分母；即，PD-L1阳性和PD-L1阴性肿瘤细胞的数量)的比率。将在任何强度下的PD-L1表达认为是阳性，即，弱(1+)、中(2+)或强(3+)。

“PD-L1表达阳性”指肿瘤比率评分、单核炎症密度评分或组合阳性评分是至少1％；AIS≥5；或与适当对照物相比，恶性细胞和/或肿瘤内的浸润免疫细胞的PD-L1表达量(蛋白和/或mRNA)升高。

“微卫星不稳定性(MSI)”指与肿瘤中的缺陷型DNA错配修复相关的基因组不稳定性形式。参见Boland等，Cancer Research 58,5258-5257,1998。在一个实施方式中，MSI分析可使用五种美国国立癌症研究院(NCI)推荐的微卫星标记物进行：BAT25(GenBank登录号9834508)、BAT26(GenBank登录号9834505)、D5S346(GenBank登录号181171)、D2S123(GenBank登录号187953)、D17S250(GenBank登录号177030)。可以使用其他标记物，例如，BAT40、BAT34C4、TGF-β-RII和ACTC。用于MSI分析的市售试剂盒包括例如Promega MSI多重PCR测定、基于CDx(F1CDx)下一代测序的体外诊断装置(使用从***固定、石蜡包埋(FFPE)的肿瘤组织标本分离的DNA)。

“高频微卫星不稳定性”或“高微卫星不稳定性(MSI-H)”指上文中所示的五种NCI标记物中的两种或更多种显示出不稳定性，或≥30-40％的总标记物显示出不稳定性(即，具有***/缺失突变)的情况。

如本文所用，“非MSI-H癌症”指微卫星稳定(MSS)和低频MSI(MSI-L)癌症。

“微卫星稳定(MSS)”指上文中所示的五种NCI标记物均不显示不稳定性(即，具有***/缺失突变)的情况。

“错配修复完整(pMMR)癌症”指通过IHC发现的肿瘤标本中的MMR蛋白(MLH1、PMS2、MSH2和MSH6)的正常表达。用于MMR分析的市售试剂盒包括Ventana MMR IHC测定。

“错配修复缺陷型(dMMR)癌症”指通过IHC发现的肿瘤标本中的一种或多种MMR蛋白(MLH1、PMS2、MSH2和MSH6)的少量表达。

如本文所用，“可变区”或“V区”指在不同抗体之间序列可变的I给G链的区段。其延伸至轻链中的Kabat残基109和重链中的Kabat残基113。

术语“缓冲剂”涵盖将本发明的组合物的溶液pH维持在可接受范围内的那些试剂，或对于本发明的冻干组合物，在冻干之前提供可接受的溶液pH。

术语“药物组合物”指具有药学上可接受的赋形剂的制剂，其形式允许活性成分有效，并且不包含对施用该组合物的受试者有毒的其他成分。

“药学上可接受的”指可合理地向受试者施用以提供所用活性成分的有效剂量且“通常视为安全”的赋形剂(载剂、添加剂)和组合物，例如，当向人类施用时，所述赋形剂和组合物为生理学上可耐受的且通常不产生过敏性或类似不良反应，如胃部不适等。在另一个实施方式中，该术语指经联邦政府或州政府的监管机构批准或在美国药典或另一公认药典中列出的适用于动物且更特定地适用于人类的分子实体和组合物。

“派姆单抗”(以前称为MK-3475、SCH 900475和兰洛利珠单抗)，或在本文中称为“派姆(pembro)”为具有WHO Drug Information,Vol.27,No.2，第161-162页(2013)中所描述的结构的人源化IgG4mAb，且其包含表2中所描述的重链和轻链氨基酸序列和CDR。派姆单抗已由美国FDA批准，如KEYTRUDA^TM(Merck&Co.,Inc.,Whitehouse Station,NJ USA；2014年美国最初批准)的处方资讯中所描述的。

如本文所用，“派姆单抗变体”指包含重链和轻链序列的单克隆抗体，所述重链和轻链序列与派姆单抗中的序列基本上相同，不同之处在于其具有位于轻链CDR以外的位置处的三个、两个或一个保守性氨基酸置换和位于重链CDR以外的六个、五个、四个、三个、两个或一个保守性氨基酸置换，例如，变***置位于FR区或恒定区，且任选地具有重链的C末端赖氨酸残基的缺失。换言之，派姆单抗和派姆单抗变体包含一致的CDR序列，但由于分别在其全长轻链和重链序列中的不超过三个或六个其他位置处具有保守性氨基酸置换而彼此不同。就以下特征而言，派姆单抗变体与派姆单抗基本上相同：对PD-1的结合亲和力和阻断PD-L1和PD-L2中的每一者与PD-1的结合的能力。

抗PD-1抗体及其抗原结合片段

在一些实施方式中，用于本发明的组合物中的抗人PD-1抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含三个轻链CDR CDRL1、CDRL2和CDRL3以及三个重链CDR CDRH1、CDRH2和CDRH3。

在本发明的一个实施方式中，CDRL1是SEQ ID NO:1，CDRL2是SEQ ID NO:2和CDRL3是SEQ ID NO:3。在一个实施方式中，CDRH1是SEQ ID NO:6，CDRH2是SEQ ID NO:7和CDRH3是SEQ ID NO:8。在一个实施方式中，三个轻链CDR是SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3，以及三个重链CDR是SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。

本发明组合物的抗PD-1结合片段包含轻链可变区和重链可变区。在本发明组合物的一个实施方式中，抗体或抗原结合片段包含轻链可变区，其包含或由SEQ ID NO:4组成，和重链可变区，其包含或由SEQ ID NO:9组成。

在另一个实施方式中，本发明的组合物包含抗体或抗原结合片段，其具有与上文所述的V_L结构域或V_H结构域之一具有至少95％、90％、85％、80％、75％序列同源性的V_L结构域和/或V_H结构域，并且显示出与PD-1的特异性结合。在另一个实施方式中，本发明组合物的抗体或抗原结合片段包含具有至多1、2、3、4或5个或更多个氨基酸置换的V_L和V_H结构域并且显示出与PD-1的特异性结合。

在任何上述实施方式中，抗PD-1抗体可以是特异性结合人PD-1的全长抗PD-1抗体。在某些实施方式中，全长抗PD-1抗体选自任何类别的免疫球蛋白，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE。优选地，抗体是IgG抗体。可以使用IgG的任何同种型，包括IgG₁、IgG₂、IgG₃和IgG₄。不同恒定结构域可以附接指本文提供的V_L和V_H区。例如，如果本发明的抗体(或片段)的特定预期用途是要求改变效应功能，则可以使用除IgG1以外的重链恒定结构域。尽管IgG1抗体提供长半衰期和效应功能，如补体活化和抗体依赖性细胞毒性，但此类活性可能并非抗体的所有用途所需的。在此类情况下，可使用例如IgG4恒定结构域。

在本发明的实施方式中，抗PD-1抗体包含轻链和重链，所述轻链包含或由SEQ IDNO:5中所示的氨基酸残基的序列组成，所述重链包含或由SEQ ID NO:10中所示的氨基酸残基的序列组成。在本发明的一些组合物中，抗PD-1抗体是派姆单抗或派姆单抗变体。

通常，本发明的抗PD-1抗体及抗原结合片段的氨基酸序列变体将具有与参考抗体或抗原结合片段(例如，重链、轻链、VH、VL或人源化序列)的氨基酸序列具有至少75％、更优选为至少80％、更优选为至少85％、更优选为至少90％且最优选为至少95％、98％或99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。与序列的同一性或同源性在本文中定义为在比对序列并引入空位(如有必要)以实现最大百分比序列同一性，并且不考虑任何保守性置换作为序列同一性的一部分之后，候选序列中与抗PD-1残基相同的氨基酸残基的百分比。抗体序列中的N末端、C末端或内部延伸、缺失或***均不应理解为影响序列同一性或同源性。

序列同一性指当两条序列最佳比对时，两个多肽的氨基酸在同等位置上的相同程度。可使用BLAST算法来确定序列同一性，其中对该算法的参数进行选择以在各自参考序列的整个长度上在各自序列之间产生最大匹配。通常将与BLAST算法相关的下述参考文献用于序列分析：BLAST ALGORITHMS：Altschul,S.F.等，(1990)J.Mol.Biol.215:403-410；Gish,W.等，(1993)Nature Genet.3:266-272；Madden,T.L.等，(1996)Meth.Enzymol.266:131-141；Altschul,S.F.等，(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402；Zhang,J.等，(1997)Genome Res.7:649-656；Wootton,J.C.等，(1993)Comput.Chem.17:149-163；Hancock,J.M.等，(1994)Comput.Appl.Biosci.10:67-70；ALIGNMENT SCORING SYSTEMS:Dayhoff,M.O.等，"A model of evolutionary change in proteins."Atlas of ProteinSequence and Structure,(1978)vol.5,suppl.3.M.O.Dayhoff(编著)，pp.345-352,Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,DC；Schwartz,R.M.等，"Matrices for detectingdistant relationships."Atlas of Protein Sequence and Structure,(1978)vol.5,suppl.3."M.O.Dayhoff(编著)，pp.353-358,Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,DC；Altschul,S.F.,(1991)J.Mol.Biol.219:555-565；States,D.J.等，(1991)Methods 3:66-70；Henikoff,S.等，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-10919；Altschul,S.F.,等，(1993)J.Mol.Evol.36:290-300；ALIGNMENT STATISTICS:Karlin,S.等，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268；Karlin,S.等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5877；Dembo,A.等，(1994)Ann.Prob.22:2022-2039；和Altschul,S.F."Evaluating the statistical significance of multipledistinct localalignments."Theoretical and Computational Methods in Genome Research(S.Suhai编著),(1997)pp.1-14,Plenum,New York。

同样，在本文的组合物和方法中可以使用任一类别的轻链。特别地，κ、λ或其变体在本组合物和方法中是有用的。

表2：示例性PD-1抗体序列

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蛋白表达

用于制备抗体的本发明的方法涉及培养分泌抗体的哺乳动物细胞。此类培养的哺乳动物细胞通常通过涉及短暂或稳定转染的重组DNA技术制备，例如，可使用阳离子脂质、聚乙烯亚胺、LipofectamineTM或ExpiFectamineTM或电穿孔将来自克隆步骤的混合质粒构建图(表达载体)转染至多个宿主细胞(例如，哺乳动物、HEK 293或CHO、细菌、昆虫、酵母细胞)中进行表达。本领域技术人员知晓用于转染以实现重组抗体表达的多种适宜手段。或者，编码目标蛋白的表达盒的稳定基因组整合方法可以用于制备分泌蛋白的哺乳动物细胞的生产细胞系。(参见，例如，Zhang,Crispr-Cas Systems and Methods for Alte ringExpression Of Gene Products,WO2014093661A2；Frendewey等，Methods andCompositions for the Targeted Modification of a Genome,US9228208 B2；Church等，Multiplex Automated Genome Engineering,WO2008052101A2,US8153432B2；Bradley等，Methods Cells and Organisms,US2015/0079680A1；Begemann等，Compositions andMethods for Modifying Genomes,WO2017141173A2；Gill等，Nucleic acid-guidednucleases,US9982279 B1；Minshull等，Enhanced nucleic acid constructs foreukaryotic gene expression,US9428767B2,US9580697B2,US9574209B2；Minshull等，DNAVectors,Transposons And Transposases For Eukaryotic Genome Modification,US10041077B2)。

在其他实施方式中，在WO2020068631中描述了有效地整合至真核转录活性热点中且确保目标基因(GOI)长期稳定和一致表达的表达盒。可以将这些表达盒转染至各种宿主CHO细胞系中，包括CHOK1SVTM(Lonza；Slough,U.K.)、HD-BIOP1(Horizon Discovery,U.K.)、(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)和GS敲除CHO宿主细胞系。在一个实施方式中，表达载体包含：

(a)第一表达盒，其包含以上游至下游顺序的以下元件：第一绝缘子、EASE、启动子、TPL、目标基因(GOI)的***位点、IRES、编码真核选择性标记物的多核苷酸、polyA信号和第二绝缘子；

(b)侧接第一表达盒的两条ITR序列；

(c)包含编码细菌选择性标记物的多核苷酸的第二表达盒；和

(d)细菌质粒复制原点。

在一个实施方式中，启动子是SV40启动子(Nature 273(5658):113-20(1978),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81(1):23-27(1984),GenBank:J02400.1)。在另一个实施方式中，启动子是hCMV立即早期增强子/启动子(GenBank X17403.1)。在另一个实施方式中，ITR是piggyBac ITR。在一个实施方式中，绝缘子是鸡β-球蛋白HS4绝缘子。

在一个实施方式中，真核选择性标记物是新霉素磷酸转移酶、组氨酸脱氢酶、潮霉素B磷酸转移酶、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶、二氢叶酸还原酶、色氨酸合成酶、嘌呤霉素N-乙酰基转移酶、胸苷激酶、腺嘌呤磷酸核糖基转移酶、谷氨酰胺合成酶、腺苷脱氨酶或金属硫蛋白-1。在一个实施方式中，真核选择性标记物是新霉素磷酸转移酶。在另一个实施方式中，真核选择性标记物是谷氨酰胺合成酶。在本文提供的各种表达载体的某些实施方式中，细菌选择性标记物是氨苄西林抗性基因、四环素抗性基因、潮霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、杀稻瘟菌素抗性基因等。在一个实施方式中，细菌选择性标记物是氨苄西林抗性基因。

上游细胞培养过程

用于生产本发明的抗体的宿主细胞可以在各种细胞培养基中培养。市售培养基如CD-CHO液体或CD-CHO AGT^TM粉末(Life Technoogies)、Ham F10(Sigma)、最小必需培养基(MEM)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)(Sigma)适于培养宿主细胞。此外，在Ham等，Meth.Enz.58:44(1979)，Barnes等，Anal.Biochem.102:255(1980)，美国专利号4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO90103430；WO 87/00195；或美国再颁专利号30,985中描述的任何培养基可用作宿主细胞的培养基。任何这些培养基都可以根据需要以本领域技术人员公知的适当浓度补充其他成分。例如，激素和/或其他生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)，盐(如氯化钠、碳酸氢钠、钙、铁、钾、锌、硫酸铜、锰、镁和磷酸盐)，核苷酸(如腺苷、腺嘌呤、胸苷、胞苷、鸟苷、尿苷、嘌呤)，20种氨基酸的任何一种(酪氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、谷氨酸)，维生素或补充剂(胆碱、肌醇、硫胺素、叶酸、生物素、钙、烟酰胺、对氨基苯甲酸、吡哆醇、核黄素、胸苷、氰钴胺、丙酮酸、硫辛酸、亚油酸、***、甘氨酸、腐胺、乙醇胺)，赋予对选择性标记物的抗性或存活的选择剂，如抗生素(如遗传霉素、新霉素、潮霉素B、嘌呤霉素、博来霉素、庆大霉素^TM)，痕量元素(定义为通常以微摩尔浓度范围内的最终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖、半乳糖或等效能量源，从而培养基中或培养基上的细胞的生理条件促进宿主细胞表达相关蛋白。通常，用于灌注的细胞培养基是更浓缩的，以允许细胞在更高密度下持续生长。在一个实施方式中，可以添加非离子表面活性剂(如2-10g/L的P188)以防止细胞在灌注过程中死亡且维持高细胞密度和活力。参见Xu等，Bioprocess Biosyst Eng(2017)40:1317–1326。在另一个实施方式中，灌注细胞培养基中的铜浓度为10-35ppb。取决于细胞密度和铜的细胞摄取，在灌注生物反应器中的铜浓度可以在1至35ppb范围内。培养基优选是无血清的。在一些实施方式中，水性介质是液体，以使得宿主细胞在液体培养基内的细胞悬液中培养。

培养条件，如温度(针对哺乳动物细胞，通常约37°±1℃)、pH(通常，但不一定，细胞培养基保持在约pH 6.5-7.5范围内)、氧化等将是本领域普通技术人员显而易见的。在一个实施方式中，溶解氧的水平为约15-100％，和pH是约6.7-7.3。显然，随着时间的推移，温度、pH或其他培养条件会有很小的变化，并且通过培养容器(即，生物反应器)从一个位置到另一个位置，使得这些参数有一个操作范围。(亦参见，例如，Oguchi等，pH Condition intemperature shift cultivation enhances cell longevity and specific hMabproductivity in CHO culture,Cytotechnology.52(3):199–207(2006)；Al-Fageeh等，The cold-shock response in cultured mammalian cells:Harnessing the responsefor the improvement of recombinant protein production,Biotechnol.Bioeng.93:829–835(2006)；Marchant,R.J.等，Metabolic rates,growth phase,and mRNA levelsinfluence cell-specific antibody production levels fromin vitro culturedmammalian cells at sub-physiological temperatures,Mol.Biotechnol.39:69–77(2008))。

在培养转化或转染的宿主细胞之后，抗体直接分泌到细胞培养基中(通过使用适当的分泌-引导信号肽)并从其中收获。

灌注生物反应器可以从生物反应器(直接地或间接地通过居间单元操作，例如缓冲容器)至亲和色谱***的不间断流动中流体连接至亲和色谱步骤。本发明的一些实施方式包括适于接收从灌注生物反应器移出的大量不含细胞的渗透物的第一单次使用缓冲容器(SUSV1)。这些渗透物体积可以从一个或多个灌注生物反应器自动且流体地进料至SUSV1中。

本发明提供了一种获得本发明的纯化的组合物的方法，其包括以下步骤：

a)通过应用至少约0.25-6.0容器体积/天(vvd)的灌注速率，将细胞培养基中的哺乳动物宿主细胞灌注于灌注生物反应器中，其中宿主细胞包含编码抗人PD-1抗体的抗体或其抗原结合片段的轻链可变结构域的多核苷酸和编码重链可变结构域的多核苷酸，或者编码轻链可变结构域和重链可变结构域的多核苷酸；

b)从细胞培养肉汤中连续收获抗体或其抗原结合片段以获得收获的细胞培养液；

c)任选地，将收获的细胞培养液(HCCF)转移至缓冲容器约0.5至8小时的停留时间；

d)用亲和色谱步骤连续纯化收获的细胞培养液以获得纯化的组合物。

在一个实施方式中，上述方法在步骤a)之前包括下述步骤：

(i)以细胞密度约0.2-0.6x 10⁶个细胞/ml用细胞培养基中的哺乳动物宿主细胞接种灌注生物反应器，

(ii)在灌注生物反应器中使细胞培养基中的哺乳动物宿主细胞生长至约1.0至6.0x 10⁶个细胞/ml的细胞密度。

在一个实施方式中，在步骤i)中在第1天细胞密度是约0.20至0.6x 10⁶个细胞/ml。在一个实施方式中，在步骤i)中在第1天细胞密度是约0.25至0.5x 10⁶个细胞/ml。在另一个实施方式中，在步骤i)中在第1天细胞密度是约0.4至0.5x 10⁶个细胞/ml。在另一个实施方式中，在步骤a)中在第3天开始灌注。在另一个实施方式中，在步骤a)中，在约2至10x10⁶个细胞/ml的细胞密度下开始灌注。在另一个实施方式中，在步骤a)中，在约4至8x 10⁶个细胞/ml的细胞密度下开始灌注。在另一个实施方式中，步骤(ii)是在灌注生物反应器中使细胞培养基中的哺乳动物宿主细胞生长至约2.0至6.0x10⁶个细胞/ml的细胞密度。

灌注速率可以约0.5vvd开始，且可连续、逐渐或渐增地从约0.5vvd增加至6vvd。在一个实施方式中，在步骤a)中灌注速率为约0.5vvd至4vvd。在一个实施方式中，在步骤a)中灌注速率为约0.5vvd至2vvd。优选地，灌注速率在达到目标之后保持恒定。或者，灌注速率可以在整个连续制备过程中根据连续测量的活细胞密度进行调整。在一个实施方式中，灌注速率在第3天为约0.5vvd，在第4天为约1vvd，和在第5天为约2vvd。在一个进一步的实施方式中，步骤d)是在第5天或之后进行。在一个进一步的实施方式中，进行细胞排放以维持例如约80至100x 10⁶个细胞/ml的特定细胞密度或电容值(约70-90或80pF/cm)。在一个实施方式中，在灌注期间最大细胞密度是约80-100x 10⁶个细胞/ml。在一个实施方式中在灌注期间最大细胞密度是约100x 10⁶个细胞/ml。在一个实施方式中，哺乳动物宿主细胞是CHO细胞。在另一个实施方式中，灌注细胞培养基具有10-35ppb的铜浓度。在一个进一步的实施方式中，在灌注生物反应器中的铜浓度范围从1至35ppb。

在另一个方面中，通过设置恒定的渗透速率以通过连接到灌注生物反应器的中空纤维膜获得无细胞渗透物来进行连续收获。在一个实施方式中，灌注速率等于渗透速率和细胞渗出速率之和。具有进料流、灌注流和细胞排放流的典型灌注***描述在Goudar,C.T.&Chen,C.&Le,H..(2015).SBE special section:Biopharmaceuticals-Continuousprocessing in upstream operations.p111中。

下游过程

来自上游过程的本发明组合物可进一步进行连续或半连续下游纯化或下游分批纯化过程，以进一步纯化抗体或抗原结合片段组合物。

亲和色谱基于相关分子与树脂的官能团之间的高度特异性相互作用(如抗原与抗体、酶与第五、受体与配体或蛋白与核酸之间的相互作用等)分离分子。一些常用亲和色谱数据包括用于纯化抗体的蛋白A或蛋白G树脂，用于纯化生物素/抗生物素蛋白及其衍生物的抗生物素蛋白生物素宿主，用于纯化被GST标记的重组蛋白的谷胱甘肽树脂，用于分离血浆凝固蛋白的肝素树脂，用于纯化与金属离子特异性相互作用的蛋白的IMAC树脂等。各种亲和色谱的操作条件取决于相互作用的机制以及影响相互作用的因素。市售亲和色谱树脂包括但不限于MabSelect Sure、UNOsphere SUPrATM、和/>在一个实施方式中，亲和色谱步骤是以结合和洗脱模式进行的蛋白A色谱。

在一个实施方式中，收获的细胞培养液是用蛋白A亲和色谱来纯化的，其包括以下步骤：

a)将HCCF结合至固相；

b)用洗脱溶液从蛋白A固相洗脱抗体或抗原结合片段；

c)任选地，清洁和消毒固相以用于重复循环。

在一个实施方式中，在步骤(a)之前，用平衡溶液对固相进行平衡。在一个实施方式中，一种或多种杂质在步骤a)的流通中。

在该方法的另一个方面中，在步骤a)之后但在步骤b)之前，该方法进一步包括用一种或多种洗涤溶液洗涤固定相的步骤。在一个实施方式中，从洗涤步骤中去除一种或多种杂质。在一个实施方式中，洗涤溶液或洗脱溶液包含盐，优选地单价金属离子盐，如NaCl或KCl。在一个实施方式中，洗涤溶液包含约400-600mM NaCl或KCl。在另一个实施方式中，洗涤溶液包含约500mM NaCl或KCl。在另一个实施方式中，洗涤溶液包含约400-500mM NaCl或KCl。在一个进一步的实施方式中，第一洗涤溶液、第二洗涤溶液和第三洗涤溶液包含约5-20mM磷酸钠且第二洗涤溶液进一步包含约400-600mM NaCl或KCl。在一个进一步的实施方式中，第一洗涤溶液、第二洗涤溶液和第三洗涤溶液包含约10mM磷酸钠和第二洗涤溶液进一步包含约500mM NaCl或KCl。

在一个实施方式中，洗涤溶液或洗脱溶液的pH是约6-7。在一个实施方式中，洗涤溶液或洗脱溶液的pH是约6.5。在另一个实施方式中，洗脱溶液包含约5-50mM乙酸钠。在另一个实施方式中，洗脱溶液包含约5-30mM乙酸钠。在另一个实施方式中，洗脱溶液包含约20mM乙酸钠。

在另一个方面中，洗脱溶液包含约5-50mM乙酸钠。在另一个实施方式中，洗脱溶液包含约5-30mM乙酸钠。在另一个实施方式中，洗脱溶液包含约20mM乙酸钠。在一个实施方式中，洗脱溶液具有约3.5-3.6的pH。在另一个实施方式中，洗脱溶液具有约3-4的pH。

在一个实施方式中，亲和色谱在连续多重柱色谱(至少两个、三个或四个柱)***中操作，从而允许HCCF不间断流动至色谱滑架。

在一个实施方式中，包含HCCF的灌注生物反应器或灌注***间接或直接流体连接至亲和色谱。在一个实施方式中，亲和色谱是流体连接至灌注生物反应器。

在另一个实施方式中，包含HCCF的灌注生物反应器或***是经由缓冲容器流体连接至亲和色谱。对缓冲容器设定尺寸，以此方式来控制流体控制容量在缓冲容器中耗费的停留时间。在本发明的一些实施方式中，平均停留时间是0.5-30小时。在本发明的一些实施方式中，平均停留时间是0.5-20小时。在本发明的一些实施方式中，平均停留时间是0.5-8小时。在一些实施方式中，平均停留时间是2hr。在一些实施方式中，平均停留时间是1hr。在一些实施方式中，平均停留时间是0.5hr。HCCF可以在4-25℃下贮存在缓冲容器中。在一个实施方式中，HCCF流动至缓冲容器的流动速率等于从缓冲容器至连续多重柱***的进料速率。或者，HCCF可以在进料至亲和色谱之前储存在-40至-80℃的容器中。在一个实施方式中，抗体储存在缓冲容器或容器中期间使其避光。

在一个进一步的实施方式中，亲和色谱之后是一个或多个以下步骤：病毒灭活、深度过滤、第二色谱、第三精制色谱、病毒过滤、超滤、渗滤、单通切向流过滤和在线渗滤，其任选地流体连接，或者任选地通过缓冲容器流体连接和/或通过储存容器连接。

在一个方面中，亲和色谱以不间断流动方式流体连接至病毒灭活***，并且任选地以不间断流动方式流体连接至超滤，流体连接至第二色谱***、任选地存在的第三精制色谱***、病毒过滤***和超滤/渗滤***，所有均以不间断流动方式流动连接至上述上游处理步骤并且依次彼此连接，任选地存在居间缓冲容器。参见WO2020168315的图1C。最终超滤步骤可由以流体方式连接或通过任选地选用的缓冲容器操作的单通切向流过滤步骤和在线渗滤步骤构成，以维持从亲和色谱步骤贯穿在线渗滤产物的连续性。

在另一个方面中，亲和色谱以不间断流动方式流体连接至病毒灭活***，并且任选地以不间断流动方式流体连接至深度过滤***，用于暂时储存病毒灭活产物混合物的储存容器(HV1)；以不间断流动方式或分批模式依次彼此流体连接的第二色谱***、任选地选用的第三精制色谱***和超滤/渗滤***，任选地存在居间缓冲容器或存储容器(即，在存在两个或更多个批次步骤或操作的情况下的存储容器)，视情况而定。参见例如，WO2020168315的图1D。最终超滤步骤可由直接连接或通过任选地选用的缓冲容器操作的单通切向流过滤步骤和在线渗滤步骤构成，以维持从亲和色谱步骤贯穿在线渗滤产物的连续性。

在本发明的一些实施方式中，亲和色谱步骤之后是病毒灭活步骤。对于病毒灭活，将一系列亲和色谱洗脱物合并至两个病毒灭活合并容器中的一个中。在已将离散数量的洗脱物收集在合并容器中之后，通过添加酸溶液将合并体积从洗脱pH自动调节至病毒灭活pH(pH＝3.4-3.7)，然后通过添加碱将合并体积调节至中性pH。在一些实施方式中，中性pH是4.0-7.5.在一些实施方式中，中性pH是4-6。在一些实施方式中，中性pH是7.2。在这个自动调节循环期间，新的亲和色谱洗脱物被收集在第二个病毒灭活合并容器中。在两个病毒灭活合并容器之间切换允许单元操作连续地进行。在本发明的一些实施方式中，病毒灭活产物(VIP)连续转移至对其他下游单元操作进行进料的缓冲容器中。

在本发明的一些实施方式中，病毒灭活***/中和***的下游操作步骤涉及通过将VIP转移至缓冲容器中的连续加工，该缓冲容器可进料至第二色谱步骤或任选地通过深度过滤来过滤以产生经过滤病毒灭活产物混合物(FVIP)。通过以规律间隔循环深度过滤消耗品或第二色谱柱来维持这些单元操作中的半连续流动。在这些情况下，在消耗品切换之间的冲洗和再生阶段期间和色谱阶段的非上样步骤期间暂停流动。

在本发明的一些实施方式中，病毒灭活***/中和***下游的操作涉及病毒灭活产物混合物的连续加工(其还可以任选地由深度过滤来过滤以产生经过滤病毒灭活产物混合物(FVIP))；在此类实施方式中，将病毒灭活产物混合物收集在容器中，并在后续分批步骤或操作中，将纯化产物混合物或不含病毒的滤液任选地在步骤之间收集在其他收集容器中。在这种分批或批式离散操作加工中，来自一个步骤的收集容器或可互换地“收集槽”(其在某些实施方式中还可以视为用于后续步骤的“进料槽”)可实体上类似于缓冲容器，此类收集容器(或可互换地“收集槽”)或进料槽称作“储存容器”或可互换地“HV”(例如，HV1、HV2、HV3、HV4或HV5)。“储存容器”可以是单次使用储存容器(SUHV)，其不同于连续或半连续形式的生产加工步骤或操作集合中的单次使用收集容器(SUCV，例如SUCV1或SUCV2)。参见WO2020168315的图1D。

亲和色谱步骤之后可以是第二和/或第三色谱步骤以去除例如蛋白聚集体、宿主细胞蛋白或DNA。IEX色谱基于分子的静电荷分离分子。分离是由于带电目标分子与反离子之间竞争IEX色谱树脂上带相反电荷的配体基团而发生的。分子与IEX树脂的结合强度取决于分子的净电荷，而净电荷受操作条件的影响，如pH和离子强度。IEX树脂包括AEX树脂和CEX树脂。AEX树脂可以含有取代基，如二乙氨基乙基(DEAE)、三甲氨基乙基(TMAE)、季氨基乙基(QAE)和季胺(O)基团。CEX树脂可以含有取代基，如羧甲基(CM)、磺乙基(SE)、磺丙基(SP)、磷酸根(P)和磺酸根(S)。诸如DE23、DE32、DE52、CM-23、CM-32和CM-52的纤维素IEX树脂可购自Whatman Ltd.Maidstone,Kent,U.K.。基于Sephadex的和交联的IEX树脂也是公知的。例如，DEAE-、QAE-、CM-和SP-Sephadex以及DEAE-、Q-、CM-和S-Sepharose以及Sepharose均可购自GE Healthcare,Piscataway,NJ。此外，DEAE和CM衍生的甲基丙烯酸乙二醇酯共聚物如TOYOPEARLTM DEAE-650S或M和TOYOPEARLTM CM-650S或M可购自Toso Haas Co.,Philadelphia,PA。POROSTM HS,POROSTM HQ,POROSTM XS购自Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA。在一个实施方式中，第二色谱步骤是在pH约6.5-8.0下以流通模式进行的AEZ色谱。在一个实施方式中，pH是约6.5至7.5。

在通过色谱步骤纯化之后，抗体或抗原结合片段可以通过一系列过滤步骤进行处理，包括用于去除病毒的纳滤和用于浓缩和缓冲剂交换的超滤。纳滤可以通过使用容纳容器分批操作，或者通过以适当的频率循环纳滤膜连续操作。超滤步骤可以通过从含有病毒过滤的纳米过滤产品的容纳容器中进料单元操作以传统的分批模式进行。或者，超滤可以通过使用单程超滤，然后直接连接或通过使用中间缓冲罐进行在线渗滤来连续进行。

纯化的组合物

本发明提供了一种包含具有小于约3.0％甲硫氨酸105氧化的抗人PD-1抗体或其抗原结合片段的组合物，其中抗人PD-1抗体或其抗原结合片段包含含有三个轻链CDR的轻链可变区，所述轻链CDR包括SEQ ID NO:1的CDRL1、SEQ ID NO:2的CDRL2和SEQ ID NO:3的CDRL3，以及包含三个重链CDR的重链可变区，所述重链CDR包括SEQ ID NO:6的CDRH1、SEQID NO:7的CDRH2和SEQ ID NO:8的CDRH3。在一个实施方式中，抗人PD-1抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列的重链可变区。在另一个实施方式中，抗人PD-1抗体包含含有SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列的重链。在一个进一步的实施方式中，抗人PD-1抗体由两条轻链和两条重链组成，其中所述两条轻链由SEQ IDNO:5中所示的氨基酸序列组成，其中所述两条重链由SEQ ID NO:10-15中任一个示的氨基酸序列或其组合组成。在一个进一步的实施方式中，抗人PD-1抗体由两条轻链和两条重链组成，其中所述两条轻链由SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列组成，其中所述两条重链由SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列组成。

在一个实施方式中，甲硫氨酸105的氧化是约0.2-3.0％。在一个实施方式中，甲硫氨酸105的氧化是0.2-3.0％。在另一个实施方式中，甲硫氨酸105的氧化是约0.5-3.0％。在另一个实施方式中，甲硫氨酸105的氧化是0.5-3.0％。在另一个实施方式中，甲硫氨酸105的氧化是约0.5-2.5％。在另一个实施方式中，甲硫氨酸105的氧化是0.5-2.5％。在另一个实施方式中，甲硫氨酸105的氧化是约0.5-2.0％。在另一个实施方式中，甲硫氨酸105的氧化是0.5-2.0％。在另一个实施方式中，甲硫氨酸105的氧化是约0.5-1.5％。在另一个实施方式中，甲硫氨酸105的氧化是0.5-1.5％。

在一个实施方式中，通过还原肽作图且随后通过液相色谱和质谱法来测量甲硫氨酸氧化％。在另一个实施方式中，通过疏水相互作用色谱(HIC)测量甲硫氨酸氧化％。在一个实施方式中，HIC方法是通过HPLC进行，所述HPLC具有Tosoh Phenyl-5PW柱，并且流动相含有以下组分的梯度(流动相A：含5mM磷酸钠的2％乙腈，pH 7.0；流动相B：400mM硫酸铵，含5mM磷酸钠的2％乙腈，pH 6.9)。Met 105氧化％是通过主峰前(含有Met105氧化)相对于主峰前、主峰和后峰的总和的百分比来确定。

在一个其他方面中，本发明提供了一种组合物，其包含抗PD-1抗体主要物质，所述抗PD-1抗体主要物质包含由两条重链和两条轻链组成的抗体，每条重链由SEQ ID NO:11的氨基酸序列组成和每条轻链由SEQ ID NO:5的氨基酸序列组成，以及抗PD-1抗体主要物质的酸性物质，其中酸性物质的量是约1.0-12.0％。在另一个方面中，本发明提供了一种组合物，其包含抗PD-1抗体主要物质，所述抗PD-1抗体主要物质包含由两条重链和两条轻链组成的抗体，每条重链由SEQ ID NO:11的氨基酸序列组成和每条轻链由SEQ ID NO:5的氨基酸序列组成，以及抗PD-1抗体主要物质的酸性和碱性物质，其中主要物质的量是约65-85％。在一个其他方面中，本发明提供了一种组合物，其包含由中国仓鼠卵巢细胞产生的抗PD-1抗体主要物质，所述细胞包含编码轻链的多核苷酸和编码重链的多核苷酸或编码轻链和重链的多核苷酸，其中所述重链由SEQ ID NO:10、13或15的氨基酸序列组成，并且所述轻链由SEQ ID NO:5的氨基酸序列组成，以及所述抗PD-1抗体主要物质的酸性物质，其中酸性物质的量是1.0-12.0％。在一个实施方式中，主要物质的量是约65-80％。在另一个实施方式中，主要物质的量是约70-80％。在另一个实施方式中，主要物质的量是约70-85％。在一个进一步的实施方式中，主要物质的量是约70-75％。在一个进一步的实施方式中，主要物质的量是至少约65％。

在另一个方面中，本发明提供了一种组合物，其包含抗PD-1抗体主要物质，所述抗PD-1抗体主要物质包含由两条重链和两条轻链组成的抗体，每条重链由SEQ ID NO:11的氨基酸序列组成和每条轻链由SEQ ID NO:5的氨基酸序列组成，以及抗PD-1抗体主要物质的酸性物质，其中酸性物质的量是1.0-12.0％。在另一个方面中，本发明提供了一种组合物，其包含抗PD-1抗体主要物质，所述抗PD-1抗体主要物质包含由两条重链和两条轻链组成的抗体，每条重链由SEQ ID NO:11的氨基酸序列组成和每条轻链由SEQ ID NO:5的氨基酸序列组成，以及抗PD-1抗体主要物质的酸性物质，其中酸性物质的量是65-85％。在一个其他方面中，本发明提供了一种组合物，其包含由中国仓鼠卵巢细胞产生的抗PD-1抗体主要物质，所述细胞包含编码轻链的多核苷酸和编码重链的多核苷酸或编码轻链和重链的多核苷酸，其中所述重链由SEQ ID NO:10、13或15的氨基酸序列组成和所述轻链由SEQ ID NO:5的氨基酸序列组成，以及所述抗PD-1抗体主要物质的酸性物质，其中酸性物质的量是1.0-12.0％。在一个实施方式中，主要物质的量是65-80％。在一个实施方式中，主要物质的量是65-80％。在另一个实施方式中，主要物质的量是70-80％。在另一个实施方式中，主要物质的量是70-85％。在一个进一步的实施方式中，主要物质的量是70-75％。在一个进一步的实施方式中，主要物质的量是至少65％。

在一个实施方式中，酸性物质的量是约6-10％。在一个实施方式中，酸性物质的量是约7-9％。在另一个实施方式中，酸性1物质的量是约1-4％。在另一个实施方式中，酸性1物质的量是约2-4％。在另一个实施方式中，酸性1物质的量是约2-3％。在一个进一步的实施方式中，酸性变体物质的量是约1-5％。在一个进一步的实施方式中，酸性变体物质的量是约2-5％。在一个进一步的实施方式中，酸性变体物质的量是约2-4％。在又一个实施方式中，组合物还包含约12-27％的碱性物质。在又一个实施方式中，组合物还包含约15-20％的碱性物质。在又一个其他实施方式中，碱性1物质的量是约4-12％。在又一个其他实施方式中，碱性1物质的量是约8-12％。

在一个实施方式中，酸性物质的量是6-10％。在一个实施方式中，酸性物质的量是7-9％。在另一个实施方式中，酸性1物质的量是1-4％。在另一个实施方式中，酸性1物质的量是2-4％。在另一个实施方式中，酸性1物质的量是2-3％。在一个进一步的实施方式中，酸性变体物质的量是1-5％。在一个进一步的实施方式中，酸性变体物质的量是2-5％。在一个进一步的实施方式中，酸性变体物质的量是2-4％。在又一个实施方式中，组合物还包含12-27％的碱性物质。在又一个实施方式中，组合物还包含15-20％的碱性物质。在又一个其他实施方式中，碱性1物质的量是4-12％。在又一个其他实施方式中，碱性1物质的量是8-12％。

在测量主要物质、酸性物质或碱性物质的一个方面中，使用阳离子交换色谱。在一个实施方式中，阳离子交换柱是ProPac WCX-10、Sepax Proteomix WCX-NP1.7、ThermoMAbPac SCX-10G或Thermo MAbPac SCX50G。本领域技术人员将理解使用与前述柱相当的任何工业方法。在另一个实施方式中，使用具有羧酸酯官能团的弱阳离子交换柱。在一个进一步的实施方式中，具有羧酸酯官能团的弱阳离子交换柱粒度10μm、直径4mm、长度250mm。在一个实施方式中，将Thermo Scientific ProPac WCX-10柱用于阳离子交换方法。在另一个实施方式中，在35℃下使用Thermo Scientific ProPac WCX-10柱，其中流动相(A)为24mMMES pH 6.1和4％乙腈，以及流动相(B)为20mM磷酸钠、95mM NaCl pH 8.0和4％乙腈，并且使用在280nm下的检测产生色谱图。在一个实施方式中，使用非线性梯度：22％–22％B 0–0.6min；22％–29％B 0.6–15.0min；29％–70％B 15.0–30.0min；70％–100％B 30.0–30.5min；以及100％–100％B 30.5–33.0min。在一个进一步的实施方式中，在实施例5中描述了阳离子交换方法。在测量主要物质、酸性物质或碱性物质的另一个方面中，使用阴离子交换色谱。

在一个实施方式中，组合物是来自灌注生物反应器的细胞培养液。在另一个实施方式中，组合物是收获的细胞培养液。另一个实施方式中，组合物是不含细胞的渗透物。在另一个实施方式中，组合物是收获的细胞培养液，其是通过蛋白A和/或阴离子交换色谱纯化的。在另一个实施方式中，抗体是从CHO细胞产生的。

在上述实施方式的另一个方面中，组合物包含约5-200mg/ml抗体。在一个实施方式中，组合物包含约25-165mg/ml抗体。在一个实施方式中，组合物包含约25mg/ml抗体。在一个实施方式中，组合物包含约120mg/ml抗体。在一个实施方式中，组合物包含约130mg/ml抗体。在一个实施方式中，组合物包含约165mg/ml抗体。在一个实施方式中，药物组合物包含约165mg/mL抗人PD-1抗体、约10mM组氨酸缓冲剂；约10mM L-甲硫氨酸或其药学上可接受的盐、约7％w/v蔗糖和约0.02％w/v聚山梨醇酯80。在一个实施方式中，药物组合物包含约130mg/mL抗人PD-1抗体、约10mM组氨酸缓冲剂、约10mM L-甲硫氨酸或其药学上可接受的盐、约7％w/v蔗糖和约0.02％w/v聚山梨醇酯80。在另一个实施方式中，药物组合物包含约25mg/mL抗人PD-1抗体、约10mM组氨酸缓冲剂、约7％w/v蔗糖和约0.02％w/v聚山梨醇酯80。

在上述实施方式的另一个方面中，组合物包含约200-800mg抗体。在一个实施方式中，组合物包含约200mg抗体。在一个实施方式中，组合物包含约400mg抗体。

使用方法

本发明还涉及一种在受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的任何本发明组合物；即，本文所述的任何组合物。在该方法的一些实施方式中，通过皮下施用向受试者施用组合物。

在任何本发明方法中，癌症可以选自由以下组成的组：黑色素瘤、肺癌、头颈部癌、膀胱癌、乳腺癌、胃肠道癌症、多发性骨髓瘤、肝细胞癌、梅克尔细胞癌、皮肤鳞状细胞癌、淋巴瘤、癌症、间皮瘤、卵巢癌、食管癌、***癌、胆道癌、结直肠癌、子宫内膜癌、***、甲状腺癌、唾液癌、***癌(例如，激素难治性***癌)、胰腺癌、结肠癌、肝癌、甲状腺癌、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤和其他恶性肿瘤。

在一个实施方式中，癌症是黑色素瘤、非小细胞肺癌、头颈部癌症、尿路上皮癌、乳腺癌、胃癌、胃食管交界腺癌、多发性骨髓瘤、肝细胞癌、梅克尔细胞癌、肾细胞癌、子宫内膜癌、皮肤鳞状细胞癌癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、间皮瘤、卵巢癌、小细胞肺癌、食管癌、***癌、胆道癌症、结直肠癌、***、甲状腺癌、唾液腺癌、***癌、胶质母细胞瘤、肿瘤突变负荷高或MSI-H癌症。

在一些实施方式中，肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)。在一些实施方式中，肺癌是鳞状非小细胞肺癌。在一些实施方式中，肺癌是非鳞状非小细胞肺癌。在一个实施方式中，NSCLC是转移性的。

在替代性实施方式中，肺癌是小细胞肺癌(SCLC)。在一个实施方式中，SCLC是转移性的。

在一些实施方式中，淋巴瘤是霍奇金淋巴瘤。

在其他实施方式中，淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤。在特定实施方式中，淋巴瘤是纵隔大B细胞淋巴瘤。在一些实施方式中，淋巴瘤是弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。

在一些实施方式中，乳腺癌是三阴性乳腺癌。

在其他实施方式中，乳腺癌是ER+/HER2-乳腺癌。

在一些实施方式中，膀胱癌是尿路上皮癌。

在一些实施方式中，头颈部癌症是鼻咽癌。在一些实施方式中，癌症是甲状腺癌。在其他实施方式中，癌症是唾液腺癌。在其他实施方式中，癌症是头颈部鳞状细胞癌。

在一些实施方式中，癌症是具有高微卫星不稳定性(MSI-H)水平的转移性结直肠癌。

在一些实施方式中，癌症是具有高微卫星不稳定性(MSI-H)水平的实体瘤。

在一些实施方式中，癌症是具有高突变负荷的实体瘤。在一个实施方式中，如通过FDA批准的测试所测定的，肿瘤突变负荷(TMB)是≥10个突变/兆碱基。在一个实施方式中，肿瘤是转移性的或不可切除的。

在一些实施方式中，癌症选自由以下组成的组：黑色素瘤、非小细胞肺癌、复发性或难治性典型霍奇金淋巴瘤、头颈部鳞状细胞癌、尿路上皮癌、食管癌、胃癌、DLBCL和肝细胞癌。

在上述治疗方法的其他实施方式中，癌症是血液恶性肿瘤。在某些实施方式中，血液恶性肿瘤是急性淋巴母细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)、DLBCL、EBV-阳性DLBCL、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、富含T细胞/组织细胞的大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤(HL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、多发性骨髓瘤(MM)、髓细胞白血病-1蛋白(Mcl-1)、骨髓增生异常综合征(MDS)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)或小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)。

本文所描述的方法和治疗中涵盖相对于在活检或手术材料中存在肿瘤浸润淋巴细胞的情况下显示无病和总生存期改善的恶性肿瘤，例如，黑色素瘤、结直肠癌、肝癌、肾癌、胃癌/食管癌、乳腺癌、胰腺癌和卵巢癌。已知此类癌症亚型易于受到T淋巴细胞的免疫控制。此外，包括可使用本文中所描述的抗体来抑制生长的难治性或复发性恶性肿瘤。

在一些实施方式中，向患有癌症的受试者施用本发明的组合物，所述癌症的特征为在所测试组织样品中PD-L1和/或PD-L2的表达升高，包括：卵巢癌、肾癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、食管癌和黑色素瘤。可以从使用抗PD-1抗体(如人源化抗PD-1抗体派姆单抗)的治疗中获益的其他癌症包括与持续病毒感染相关的癌症，如人免疫缺陷病毒，A型、B型和C型肝炎病毒，爱泼斯坦-巴尔病毒，已知可引起例如卡波西氏肉瘤、肝癌、鼻咽癌、淋巴瘤、***、外阴癌、***癌、***癌和口腔癌的人***瘤病毒。

在一个实施方式中，本发明包括一种在人患者中治疗癌症的方法，其包括向患者施用任何本发明的组合物。

在一个实施方式中，本发明包括一种在人患者中治疗不可切除性或转移性黑色素瘤的方法，其包括向患者施用任何本发明的组合物。

在一个实施方式中，本发明包括一种在人患者中治疗转移性非小细胞肺癌(NSCLC)的方法，其包括向患者施用本发明的组合物。在特定实施方式中，患者的肿瘤具有高PD-L1表达[(肿瘤比例评分(TPS)≥50％)]。在其他实施方式中，患者的肿瘤具有PD-1表达(TPS≥1％)。在另外其他实施方式中，患者此前使用或未使用含铂化学疗法治疗。在特定实施方式中，患者在接受含铂化学疗法时或之后，疾病出现进展。在一个实施方式中，NSCLC是转移性的或III期。

在某些实施方式中，通过FDA批准的测试来确定PD-L1 TPS。

在某些实施方式中，患者的肿瘤不具有EGFR或ALK基因组畸变。

在某些实施方式中，患者的肿瘤具有EGFR或ALK基因组畸变，并且在接受本发明组合物之前，在接受对EGFR或ALK畸变的治疗时或之后，疾病出现进展。

在某些实施方式中，患者具有PD-L1表达CPS≥1％的肿瘤。

在一个实施方式中，本发明包括一种治疗非鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)的方法，其中所述方法包括向患者施用本发明的组合物、培美曲塞和铂化学疗法。在一个实施方式中，本发明包括一种在人患者中治疗非鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)的方法，包括：(1)向患者施用本发明的组合物，和(2)向患者施用培美曲塞和卡铂。在特定实施方式中，患者在开始用本发明的组合物、培美曲塞和卡铂的组合治疗方案之前，此前未使用抗癌治疗剂治疗。在某些实施方式中，患者患有转移性非鳞状非小细胞肺癌。

在某些实施方式中，以500mg/m²的量向患者施用培美曲塞。在子实施方式中，每21天一次通过静脉内输注向患者施用培美曲塞。在特定实施方式中，输注时间是约10分钟。

在其中患者用本发明的组合物与培美曲塞组合治疗的本发明的实施方式中，本发明还包括每天一次向患者施用约400μg至约1000μg叶酸，在向患者施用培美曲塞之前约7天开始且持续直至向患者施用最后一次剂量培美曲塞之后约21天。在某些实施方式中，口服施用叶酸。在一些实施方式中，本发明还包括在第一次施用培美曲塞之前约1周和约每三个培美曲塞施用周期(即，约每9周)向患者施用约1mg维生素B12。在某些实施方式中，肌内施用维生素B₁₂。在某些实施方式中，本发明还包括在施用培美曲塞之前一天、当天和之后一天，一天两次向患者施用约4mg***。在某些实施方式中，口服施用***。

在一个实施方式中，本发明包括一种在人患者中治疗鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)的方法，其包括：(1)向患者施用本发明的组合物，和(2)向患者施用紫杉醇或蛋白结合的紫杉醇和卡铂。在特定实施方式中，在开始组合治疗方案之前，患者此前未用抗癌治疗剂治疗。在某些实施方式中，患者患有转移性鳞状非小细胞肺癌。

在一个实施方式中，本发明包括一种在人患者中治疗复发性或转移性头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)的方法，其包括向患者施用任何本发明的组合物。在某些实施方式中，患者此前用含铂化学疗法治疗。在某些实施方式中，患者在接受含铂化学疗法时或之后，疾病出现进展。在特定实施方式中，患者的肿瘤表达PD-L1[组合阳性评分(CPS)≥1]。在一个实施方式中，治疗与铂和FU组合。

在一个实施方式中，本发明包括一种在人患者中治疗难治性经典霍奇金淋巴瘤(cHL)的方法，其包括向患者施用本发明的组合物。在某些实施方式中，患者在接受2线或更多线的cHL疗法之后复发。在特定实施方式中，患者是成人患者。在替代性实施方式中，患者是儿科患者。

在一个实施方式中，本发明包括一种在人患者中治疗局部晚期或转移性尿路上皮癌的方法，其包括向患者施用本发明的组合物。在某些实施方式中，患者不适合接受含顺铂化学疗法。在某些实施方式中，患者在接受含铂化学疗法期间或之后或在用含铂化学疗法进行新辅助或辅助治疗12个月内，疾病出现进展。在特定实施方式中，患者的肿瘤表达PD-L1[组合阳性评分(CPS)≥1]。在一个实施方式中，患者患有卡介苗(BCG)无应答的、高风险、非肌肉浸润性膀胱癌。

在一个实施方式中，本发明包括一种在人患者中治疗不可切除性或转移性、高微卫星不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷型实体瘤的方法，其包括向患者施用本发明的组合物。在特定实施方式中，患者在此前抗癌治疗之后，疾病出现进展。

在一个实施方式中，本发明包括一种在人患者中治疗不可切除性或转移性高微卫星不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷型实体瘤或结直肠癌的方法，其包括施用本发明的组合物。在特定实施方式中，患者在此前用氟嘧啶、奥沙利铂和伊立替康治疗之后，疾病出现进展。

在一个实施方式中，本发明包括一种在人患者中治疗复发性局部晚期或转移性胃癌的方法，其包括向患者施用本发明的组合物。

在一个实施方式中，本发明包括一种在人患者中治疗复发性局部晚期或转移性胃食管接合部腺癌的方法，其包括向患者施用本发明的组合物。在特定实施方式中，患者的肿瘤表达PD-L1[组合阳性评分(CPS)≥1]。在特定实施方式中，患者在接受此前2线或更多线疗法(包括氟嘧啶和含铂化学疗法)时或之后，疾病出现进展。在特定实施方式中，患者在接受此前2线或更多线疗法(包括HER2/neu靶向疗法)时或之后，疾病出现进展。

在一个实施方式中，本发明包括一种在人患者中治疗食管的复发性局部晚期或转移性鳞状细胞癌的方法，其包括向患者施用本发明的组合物。在特定实施方式中，患者的肿瘤表达PD-L1[组合阳性评分(CPS)≥1]。

在一个实施方式中，本发明包括一种在人患者中治疗复发性局部晚期或转移性***的方法，其包括向患者施用本发明的组合物。在特定实施方式中，患者的肿瘤表达PD-L1[组合阳性评分(CPS)≥1]。

在一个实施方式中，本发明包括一种在人患者中治疗肝细胞癌的方法，其包括向患者施用本发明的组合物。在一个实施方式中，本发明包括一种在人患者中治疗复发性局部晚期或转移性梅克尔细胞癌的方法，其包括向患者施用本发明的组合物。在一个实施方式中，本发明包括一种在人患者中治疗复发性或转移性皮肤鳞状细胞癌的方法，其包括向患者施用本发明的组合物。

在一个实施方式中，本发明包括一种在人患者中治疗晚期肾细胞癌的方法，其包括向患者施用本发明的组合物和阿西替尼。在一个实施方式中，本发明包括一种在人患者中治疗晚期子宫内膜癌的方法，其包括向患者施用本发明的组合物和乐伐替尼。在一个实施方式中，子宫内膜癌不是MSI-H或dMMR。

在一个实施方式中，本发明包括一种在人患者中治疗癌症的方法，其包括向患者施用本发明的组合物，其中患者患有选自以下的组的癌症：黑色素瘤、肺癌、头颈癌、膀胱癌、乳腺癌、胃肠道癌症、多发性骨髓瘤、肝细胞癌、淋巴瘤、肾癌、间皮瘤、卵巢癌、食管癌、***癌、胆道癌、结直肠癌、***、甲状腺癌和唾液腺癌。

在一个实施方式中，本发明包括一种在人患者中治疗小细胞肺癌的方法，其包括向患者施用本发明的组合物。

在一个实施方式中，本发明包括一种在人患者中治疗非霍奇金淋巴瘤的方法，其包括向患者施用本发明的组合物。在特定实施方式中，非霍奇金淋巴瘤是纵隔大B细胞淋巴瘤。在特定实施方式中，非霍奇金淋巴瘤是弥漫性大B细胞淋巴瘤。

在一个实施方式中，本发明包括一种在人患者中治疗乳腺癌的方法，其包括向患者施用本发明的组合物。在某些实施方式中，乳腺癌是三阴性乳腺癌，任选地与化学疗法组合。在某些实施方式中，乳腺癌是ER+/HER2-乳腺癌。在特定实施方式中，患者的肿瘤表达PD-L1[组合阳性评分(CPS)≥1]。

在一个实施方式中，本发明包括一种在人患者中治疗鼻咽癌的方法，其包括向患者施用本发明的组合物。

在一个实施方式中，本发明包括一种在人患者中治疗甲状腺癌的方法，其包括向患者施用本发明的组合物。

在一个实施方式中，本发明包括一种在人患者中治疗唾液腺癌的方法，其包括向患者施用本发明的组合物。

如上文所指出的，在本发明的方法的一些实施方式中，所述方法还包括施用其他治疗剂。在特定实施方式中，其他治疗剂是抗LAG3抗体或其抗原结合片段、抗GITR抗体或其抗原结合片段、抗TIGIT抗体或其抗原结合片段、抗CD27抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，其他治疗剂是表达IL-12的新城疫病毒载体。在一个进一步的实施方式中，其他治疗剂是dinaciclib。在另外其他实施方式中，其他治疗剂是STING激动剂。在一个实施方式中，其他治疗剂是柯萨奇病毒CVA21。

适用于其他治疗剂的适宜途径可以是例如包括胃肠外递送，包括肌内、皮下以及鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内。药物可以各种常规方式(如腹膜内、胃肠外、动脉内或静脉内注射)施用。

选择其他治疗剂的剂量取决于几个因素，包括实体的血清或组织周转率、症状水平、实体的免疫原性以及被治疗个体中靶细胞、组织或器官的可及性。其他治疗剂的剂量应该是提供可接受水平副作用的量。因此，每个其他治疗剂(例如，生物治疗剂或化学治疗剂)的剂量和给药频率将部分取决于特定的治疗剂、正在治疗的癌症的严重程度和患者特征。可以获得选择适当剂量的抗体、细胞因子和小分子的指导。参见，例如，Wawrzynczak(1996)Antibody Therapy,Bios Scientific Pub.Ltd,Oxfordshire,UK；Kresina(编著)(1991)Monoclonal Antibodies,Cytokines and Arthritis,Marcel Dekker,New York,NY；Bach(编著)(1993)Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases,Marcel Dekker,New York,NY；Baert等，(2003)New Engl.J.Med.348:601-608；Milgrom等，(1999)New Engl.J.Med.341:1966-1973；Slamon等，(2001)New Engl.J.Med.344:783-792；Beniaminovitz等，(2000)New Engl.J.Med.342:613-619；Ghosh等，(2003)NewEngl.J.Med.348:24-32；Lipsky等，(2000)New Engl.J.Med.343:1594-1602；Physicians'Desk Reference 2003(Physicians'Desk Reference，第57版)；Medical EconomicsCompany；ISBN:1563634457；第57版(2002年11月)。适当剂量方案的确定可以由临床医师进行，例如，使用本领域公知或怀疑影响治疗或预测影响治疗的参数或因素，并且将取决于例如患者的临床病史(例如，此前的治疗)，待治疗的癌症类型和分期以及在联合治疗中对一种或多种治疗剂的应答的生物标志物。

对于其他治疗剂，有各种文献参考可用于协助选择药学上可接受的载体或赋形剂。参见，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences and U.S.Pharmacopeia:National Formulary,Mack Publishing Company,Easton,PA(1984)；Hardman等，(2001)Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics,McGraw-Hill,New York,NY；Gennaro(2000)Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott,Williams,and Wilkins,New York,NY；Avis等(编著)(1993)PharmaceuticalDosage Forms:Parenteral Medications,Marcel Dekker,NY；Lieberman,等(编著)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets,Marcel Dekker,NY；Lieberman等(编著)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Disperse Systems,Marcel Dekker,NY；Weiner和Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity and Safety,Marcel Dekker,Inc.,New York,NY。

药物组合物可通过连续输注或通过以例如一天，每周1至7次、一周、两周、三周、每个月、每两个月等时间间隔的剂量施用。优选剂量方案是涉及避免明显不良副作用的最大剂量或给药频率的方案。每周总剂量通常是至少0.05μg/kg、0.2μg/kg、0.5μg/kg、1μg/kg、10μg/kg、100μg/kg、0.2mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、10mg/kg、25mg/kg、50mg/kg体重或更高。参见，例如，Yang等，(2003)New Engl.J.Med.349:427-434；Herold等，(2002)NewEngl.J.Med.346:1692-1698；Liu等，(1999)J.Neurol.Neurosurg.Psych.67:451-456；Portielji等，(20003)Cancer Immunol.Immunother.52:133-144。以摩尔/kg计，小分子治疗剂(例如，肽模拟物、天然产物或有机化学品)的所需剂量与抗体或多肽的所需剂量大致相同。

在某些实施方式中，给药将包括在治疗过程内向受试者施用1.0、3.0和10mg/kg的递增剂量的本发明的药物组合物或组合物。组合物可以是重构液体组合物，或者其可以是此前未冻干的液体组合物。时程可不同且可持续，只要获得所需效果即可。在某些实施方式中，剂量递增将持续至高达约10mg/kg的剂量。在某些实施方式中，受试者将在组织学或细胞学上诊断为黑色素瘤或其他形式的实体瘤，且在某些情况下，受试者可能患有不可测量的疾病。在某些实施方式中，受试者已用其他化学治疗剂治疗，而在其他实施方式中，受试者未接受过治疗。

在另外其他实施方式中，给药方案将包括在整个治疗过程中施用1、3或10mg/kg剂量的任何本文所描述的药物组合物或组合物。对于此类给药方案，剂量之间的时间间隔将是约14天(±2天)。在某些实施方式中，剂量之间的时间间隔将是约21天(±2天)。

在某些实施方式中，给药方案将包括施用约0.005mg/kg至约10mg/kg的剂量，患者内剂量递增。在某些实施方式中，将以每3周一次或每2周一次的时间间隔施用5mg/kg或10mg/kg的剂量。在另外其他实施方式中，对于黑色素瘤患者或患有其他实体瘤的患者，以三周的时间间隔施用3mg/kg的剂量。在这些实施方式中，患者应患有不可切除性疾病；然而，患者此前可能已接受过手术。

在某些实施方式中，将向受试者施用任一本文中所描述的任何药物组合物或组合物的30分钟IV输注。在递增剂量的在某些实施方式中，第一剂量和第二剂量之间的给药时间间隔将是约28天(±1天)。在某些实施方式中，第二剂量和第三剂量之间的给药时间间隔将是约14天(±2天)。在某些实施方式中，对于第二剂量之后的剂量，给药时间间隔将是约14天(±2天)。在某些实施方式中，对于第二剂量之后的剂量，给药间隔将是约3周。在某些实施方式中，对于第二剂量之后的剂量，给药间隔将是约6周。

在某些实施方式中，如WO2012/018538或WO2008/156712中所描述的，细胞表面标记物和/或细胞因子标记物的使用将用于监测、诊断、患者选择和/或涉及阻断PD-1途径的治疗方法的生物测定中。可通过使用注射器或使用其他注射装置(例如，装置)；注射笔；或无针装置(例如，MediJector和/>)注射来进行皮下施用。

本发明的实施方式还包括(i)用于如下，(ii)用作用于如下的药物或组合物，或(iii)用以制备用于如下的药物的本文所述的一种或多种生物组合物：(a)疗法(例如，人体的)；(b)药物；(c)诱导或增加抗肿瘤免疫应答；(d)减少患者中的一种或多种肿瘤标记物的数量；(e)阻止或延缓肿瘤或血液癌症的生长；(f)阻止或延缓PD-1相关疾病的进展；(g)阻止或延缓癌症的进展；(h)稳定PD-1相关疾病；(i)抑制肿瘤细胞的生长或存活；(j)消除一个或多个癌性病灶或肿瘤或减小其尺寸；(k)减少PD-1相关疾病的进展、发作或严重程度；(l)降低诸如癌症的PD-1相关疾病的临床症状的严重程度或减少其持续时间；(m)相对于类似未治疗患者的预期生存期延长患者的生存期；(n)诱导癌性病况或其他PD-1相关疾病的完全或部分缓解，或o)治疗癌症。

一般方法

分子生物学中的标准方法描述于Sambrook,Fritsch和Maniatis(1982&1989，第2版，2001，第3版)Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Sambrook和Russell(2001)MolecularCloning，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Wu(1993)Recombinant DNA,Vol.217,Academic Press,San Diego,CA)中。标准方法也出现于Ausbel,等，(2001)Current Protocols in Molecular Biology,Vols.1-4,John Wileyand Sons,Inc.New York,NY，其描述了细菌细胞中的克隆和DNA诱变(Vol.1)、哺乳动物细胞和酵母中的克隆(Vol.2)、糖缀合物和蛋白表达(Vol.3)和生物信息学(Vol.4)。

描述了用于蛋白纯化的方法，包括免疫沉淀、色谱、电泳、离心和结晶(Coligan,等，(2000)Current Protocols in Protein Science,Vol.1,John Wiley and Sons,Inc.,New York)。描述了化学分析、化学修饰、翻译后修饰、融合蛋白的产生、蛋白的糖基化(参见，例如，Coligan,等，(2000)Current Protocols in Protein Science,Vol.2,JohnWiley and Sons,Inc.,New York；Ausubel,等，(2001)Current Protocols in MolecularBiology,Vol.3,John Wiley and Sons,Inc.,NY,NY,pp.16.0.5-16.22.17；Sigma-Aldrich,Co.(2001)Products for Life Science Research,St.Louis,MO；pp.45-89；Amersham Pharmacia Biotech(2001)BioDirectory,Piscataway,N.J.,pp.384-391)。描述了多克隆和单克隆抗体的产生、纯化和片段化(Coligan,等，(2001)Current Protocols inImmunology,Vol.1,John Wiley and Sons,Inc.,New York；Harlow和Lane(1999)UsingAntibodies,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Harlowand Lane，同上)。用于表征配体/受体相互作用的标准技术是可获得的(参见，例如，Coligan,等，(2001)Current Protocols in Immunology,Vol.4,John Wiley,Inc.,NewYork)。

可制备单克隆、多克隆和人源化抗体(参见，例如，Sheperd和Dean(编著)(2000)Monoclonal Antibodies,Oxford Univ.Press,New York,NY；Kontermann和Dubel(编著)(2001)Antibody Engineering,Springer-Verlag,New York；Harlow和Lane(1988)Antibodies ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,NY,pp.139-243；Carpenter等，(2000)J.Immunol.165:6205；He等，(1998)J.Immunol.160:1029；Tang等，(1999)J.Biol.Chem.274:27371-27378；Baca等，(1997)J.Biol.Chem.272:10678-10684；Chothia等，(1989)Nature 342:877-883；Foote和Winter(1992)J.Mol.Biol.224:487-499；美国专利号6,329,511)。

已经参考附图在本文中描述了本发明的不同实施方式，应当理解，本发明不限于那些精确的实施方式，并且在不脱离所附权利要求中限定的本发明的范围或精神的情况下，本领域技术人员可以在其中进行各种改变和修改。

实施例1：连续灌注过程

在以下程序和实施例中施用谷氨酰胺合成酶基因敲除CHO宿主细胞，其中包含编码具有SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列的轻链的多核苷酸和编码具有SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列的重链的多核苷酸(表达派姆单抗)。

3L生物反应器操作

使用具有船用叶轮(70mm直径)和钻孔喷射器(直接0.5mm的14×孔)的玻璃生物反应器(3L,Sartorius Stedim,Germany)。生物反应器以0.5×10⁶个细胞/mL的靶细胞密度接种。施用纯O₂将溶解氧(DO)控制在30-60％空气饱和度，搅拌速度在260–450rpm范围内逐渐增加以控制O₂喷射速率<0.30vvm，从而避免形成过量泡沫。根据需要添加/>消泡剂(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)用于泡沫控制。将覆盖空气控制在0.1L/min。在整个培养期间，将温度维持在36.5℃。培养期间将生物反应器的pH控制在7.0±0.3。

将商业上可获得的基础培养基用于初始生物反应器分批生长，随后将灌注培养基用于培养基交换。灌注培养基具有10-35ppb的铜浓度。生物反应器以1.6L的工作体积开始并且在灌注期间维持在相同水平。在第3天，当细胞密度达到2至4x10⁶个细胞/mL时，开始培养基交换，且灌注速率根据从0.5vvd开始的预定时程递增。在第4天，施加1vvd灌注速率，并在第5天与生产结束之间达到2vvd的最大灌注速率。使用具有磁悬浮泵的TFF***(KML System,Repligen,Waltham,MA)用于细胞保留和培养基交换。TFF***连续使细胞培养液循环通过中空纤维模块，同时以预定速率收集渗透物。中空纤维模块规格如下：模块长度：32cm；有效过滤表面积：0.09m²；纤维腔ID：1.4mm；孔径：0.2μm(Pall,PortWashington,NY)。在所有实验中均使用1.0L/min的TFF交叉流速。一旦细胞密度达到100×10⁶个细胞/mL或80pF/cm的电容目标，则打开细胞排放泵以保持细胞密度或生物体积(电容，pF/cm)。细胞排放由电容探针(Incyte DN12,Hamilton Bonaduz AG,Switzerland)自动控制。灌注培养持续时间为28-32天。生物反应器中的铜浓度在1至35ppb范围内。第5天后开始连续收获，此时生物反应器的灌注速率已达到2vvd。

50L生物反应器操作

使用Xcellerx XDR 50单次使用生物反应器(GE healthcare,Marlborough,MA)作为此研究的生产用生物反应器。生物反应器以0.5×10⁶个细胞/mL的靶细胞密度接种，使用纯O₂供应将溶解氧(DO)控制在30-60％空气饱和度。将生物反应器的搅拌控制在86-93rpm，以确保适当混合和质量转移。根据需要添加消泡剂(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)用于泡沫控制。将覆盖空气控制在0.1-0.5L/min。在整个培养期间，将温度维持在36.5℃。培养期间将生物反应器的pH控制在7.0±0.3。

将商业上可获得的基础培养基用于初始生物反应器分批生长，随后将灌注培养基用于培养基交换。灌注培养基具有32.5ppb的铜浓度。生物反应器以50L的工作体积开始，并且在灌注期间维持在相同水平。在第3天，当细胞密度达到2至4x10⁶个细胞/mL时，开始培养基交换，且灌注速率根据从第3天0.5vvd开始的预定时程递增，在第4天达到1vvd，并在第5天达到2vvd的最大灌注速率(平均停留时间0.5天)。使用具有磁悬浮泵的TFF***(KML System,Repligen,Waltham,MA)用于细胞保留和培养基交换。TFF***连续使细胞培养液循环通过中空纤维模块，同时以预定速率收集渗透物。将孔径为0.2μm的中空纤维(Pall,Port Washington,NY)用作此研究的细胞保留装置。在此研究中使用10.5L/min的TFF交叉流动速率。一旦细胞密度达到100-10⁵×10⁶个细胞/mL或80-85pF/cm的电容目标，则打开细胞排放泵以保持细胞密度或生物体积(电容，pF/cm)。细胞排放由电容探针(Incyte DN12,Hamilton Bonaduz AG,Switzerland)自动控制。灌注培养持续28天。第5天后开始连续收获，此时生物反应器的灌注速率已达到2vvd。

每天从生物反应器和渗透物管线取样。在Cedex Hi-Res细胞计数器(RocheDiagnostics GmbH,Mannheim,Germany)上使用台盼蓝拒染法来测量活细胞密度(VCD)和活力。在相同细胞计数器上测定细胞直径并报告。使用ABL80血气分析仪(Radiometer,Denmark)测量离线pH、pO₂和pCO₂。使用RX Daytona+或Imola分析仪(Randox Laboratories,Ltd.,Crumlin,UK)测量葡萄糖、乳酸盐、铵和乳酸脱氢酶(LDH)。使用装配有蛋白A柱的Agilent 1100高效液相色谱(HPLC,Agilent Technologies,Santa Clara,CA)分析生物反应器上清液和渗透物抗体效价。

实施例2：下游纯化

蛋白A亲和色谱

将蛋白A亲和色谱作为主要捕获步骤，使用来自GE Healthcare^TM的MabSelectSuRe树脂用于大部分纯化。产物结合至树脂，而诸如培养基组分和宿主细胞蛋白的杂质不结合，并残留在柱流通级分中。蛋白A步骤以连续方式使用连续多重柱色谱滑架操作，以允许HCCF从生物反应器不间断地流动以对该滑架进料(BioSMB PD,Sartorius StedimBiotech GmbH Goettingen Germany)。这是通过在滑架上使用4个用相同的蛋白A树脂填充的类似柱来实现的。在任何时间，三个柱专用于上样，而第四个柱正在进行蛋白A方法中的非上样步骤(平衡步骤、洗涤步骤、洗脱步骤、再生步骤)。

来自生物反应器的HCCF通过3L单次使用缓冲容器(Cercell,Herlev Denmark)连接至连续多重柱色谱滑架。流动至单次使用缓冲容器的HCCF流动速率与从缓冲容器至连续多重柱色谱***的进料速率相匹配，维持容器中体积一致。缓冲容器中的可操作体积范围产生流体在容器中15-45分钟的平均停留时间，目标值为30分钟。

操作上，在多重柱蛋白A色谱中进行的步骤与单柱批式色谱中相同，包括用于柱平衡、上样、洗涤和再生的阶段。在用10mM磷酸钠(pH 6.5)平衡柱之后，开始上样阶段。上样蛋白至50g/L的蛋白A树脂的容量。蛋白A步骤的上样阶段之后是三个洗涤步骤，包括：10mM磷酸钠(pH 6.5)和10mM磷酸钠与0.5M氯化钠，其用以洗脱松散结合的杂质并增加产物流中抗体的纯度。产物用20mM乙酸钠pH 3.6通过低pH变化来洗脱，并通过在线分光光度法在280nm吸光度下监测。在环境温度(20±5℃)下进行缓冲容器中的步骤和蛋白A步骤。

在蛋白A色谱之后，通过额外纯化和过滤步骤加工蛋白，以在通过中间缓冲容器连接的连续过程中实现超滤产物，包括：病毒灭活、深度过滤、阴离子交换色谱、病毒过滤、单通切向流过滤和在线渗滤。

病毒灭活/深度过滤

使用1M乙酸将蛋白A亲和混合物调节至低pH(目标pH 3.6)，以使可能存在的病毒灭活。此步骤是在环境温度(20±5℃)下进行的。将病毒灭活后的混合物用1M Tris调节至5.5的目标pH，并通过带电深度过滤器(A1HC)和0.22μm过滤器来过滤以进行澄清(Millipore Sigma,Burlington MA)。可以在2-8℃储存经过滤中和的病毒灭活产物(FNVIP)，随后在后续阴离子交换色谱步骤中进一步处理。

阴离子交换

用来自Applied Biosystems的POROS HQ 50进行的阴离子交换色谱(AEX)是该过程中的第一精制步骤。派姆单抗抗体流过柱，而可能存在的残留杂质(如宿主细胞蛋白(HCP)、DNA、聚集体和病毒)结合至树脂。平衡柱，并用25mM磷酸钠pH 7.2洗涤。在开始该步骤之前，用1M Tris将病毒灭活后混合物pH调节至7.2的目标pH。在280nm波长下线上监测柱流出物UV吸光度并用于收集AEX混合物。用1M乙酸将混合物pH调节至pH 5.5，以在后步骤缓冲容器中继续处理。

病毒过滤

AEX产物通过0.1μm预过滤器或与Planova 20N(19nm平均孔径)病毒减少过滤器(Asahi Kasei Bioprocess,Glenview,IL)一致的等效物过滤。预过滤器和过滤器连接经高压处理并与纳米过滤器一致放置在生物安全柜中。然后用10mM组氨酸、10mM甲硫氨酸，pH5.4以封闭方式串联冲洗过滤器。

超滤浓缩和渗滤

将病毒过滤产物首先通过具有30kDa分子量截断的单通切向流过滤(SPTFF)模块浓缩8倍(Pall Corporation Westboro MA Port Washington,NY)。来自SPTFF步骤的产物然后用10mM组氨酸、10mM甲硫氨酸(pH 5.4)渗滤，导致浓缩蛋白流的缓冲剂交换。使用含有30kDa MW截断膜的六阶段在线渗滤模块(ILDF)单元(Pall Corporation Westboro MAPort Washington,NY)进行缓冲剂交换。渗滤产物，也称为超滤产物，通过无菌过滤器进一步过滤并收集到储存容器中。一旦已累积足够质量的超滤产物，则合并超滤产物并通过使用Ultracel 30kDa分子量截断膜(Millipore,Burlington,MA)的标准分批超滤步骤进一步浓缩，直至190-200g/L的最终浓度。添加储存赋形剂以在10mM组氨酸、10mM甲硫氨酸、7％(w/v)蔗糖和0.02％(w/v)PS-80缓冲剂pH 5.5中获得165mg/mL的最终原料药制剂。实施例3：用于确定M105氧化水平的方法

使用下文所概述的还原肽作图质谱法测定派姆单抗的氧化水平。

样品制备

用水将生产过程中的或原料药(DS)样品稀释至5mg/mL。将总共20μL的稀释样品(包含100μg)变性，并在含有6M盐酸胍、50μM Tris-HCl、50μM EDTA和200μM DTT的最终溶液(100μL)中还原。将混合样品在37℃的热混合器中以300rpm振荡培养30min。混合和旋转后，每个样品用5μL碘代乙酰胺(IAM)(1M)烷基化，在25℃避光30min。将500μL的赖氨酰内肽酶(Lys-C)(Wako，125-05061)酶(1:10(wt:wt))添加至蛋白样品中，移液管缓慢向上/向下移动3次以充分混合物。将消化物在热混合器中在37℃下孵育60min。用15μL的20％ TFA淬灭消化物。样品消化后24消失内通过LC-MS分析消化后的样品。否则，将消化后的样品储存在-80℃以供将来分析。

LC-MS方法和数据分析

将Waters Acquity液相色谱用于在柱上进样20μL样品(UPLC HSS T3 1.8μm,2.1mm X 150mm,P/N:186003540)。将自动进样器设定在5℃。流动相A是0.02％ TFA/水和流动相B是0.02％ TFA/乙腈，其中梯度为0.1％ B 0至5min，0.1％-10％ B 5至7min，随后在接下来38分钟内线性增加至35％ B。使用Q Exactive Orbitrap MS(Thermo)收集MS1数据。将Chromeleon和Xcalibur用于数据分析。M105未修饰和修饰肽(每种肽两种带电状态(+3和+4)和每种具有3个同位素离子)的提取离子色谱图(EIC)是用于使用下式测定M105氧化％[修饰肽的提取离子色谱图(EIC)的峰面积]/[修饰肽的EIC的峰面积+未修饰肽的EIC的峰面积]×100。参见图2-4。M105氧化的CV％(变异系数；经计算为(标准偏差/平均值)x100)小于20％。

表3

用于分批补料产生的派姆单抗药品参考标准品的制剂是含有7％(w/v)蔗糖和0.02％(w/v)聚山梨醇酯80，pH 5.5的10mM组氨酸缓冲剂中的25mg/mL派姆单抗。用于连续灌注产生的派姆单抗配制的原料药的制剂是165mg/mL派姆单抗、10mM L-组氨酸、7％(w/v)蔗糖、0.02％(w/v)PS80和10mM L-甲硫氨酸，pH 5.5。

用于分批补料产生的派姆单抗配制药品参考标准品的氧化M105％为约4.9％，而连续灌注产生的派姆单抗样品含有约0.5％-3.0％M105。来自蛋白A纯化、超滤产物(未配制DS)和配制DS的一些代表性样品显示在表3中。

实施例4：测量HCCF中派姆单抗随着时间的推移的M105氧化的变化

氧化速率是通过通过如下所述的ProA-HIC 2D-LC反复测量根据实施例1的HCCF样品中的氧化量来确定的。

从生物反应器取样并过滤以去除细胞，得到HCCF。在无菌条件下，将HCCF样品拆分成96孔板48个孔中的200μL等分试样。用铝箔盖覆盖板以保持无菌性并对样品遮光。紧接着将样品放置于设定在25℃的Agilent 1290自动进样器中，将内部灯关闭。根据时程，通过二维液相色谱分离按顺序分析每个样品孔。

将每个样品的所得色谱图进行积分以测定氧化百分比，并将数据总结显示在图5中。数据的线性回归显示氧化百分比从0.94％开始，并在接下来的26小时内以每小时约0.038％增加至最大氧化1.95％。

实施例5：测量抗PD-1抗体酸性物质的离子交换(IEX)方法

对于IEX方法，使用Waters Alliance LC***(Milford,MA,U.S.A.)，选择ThermoScientific的ProPac WCX-10(p/n：054993，粒径10μm，直径4mm，长度250mm)，上样80μg样品。将流动相(A)24mM MES pH 6.1与4％乙腈和流动相(B)20mM磷酸钠，95mM NaCl pH 8.0与4％乙腈用作非线性S形pH梯度，并在34min内监测分离，流速为0.5mL min^–1，柱温为35℃。所用梯度为：22％–22％B 0–0.6min；22％–29％B 0.6–15.0min；29％–70％B 15.0–30.0min；70％–100％B 30.0–30.5min；以及100％–100％B 30.5–33.0min。流动相(C)10mMCHES pH 8.0、40mM Tris、15mM EDTA、200mM NaCl和4％乙腈用于从33.1–34.0min以0.5mLmin^–1剥离柱，接下来从34.5–44.5min以1.0mL min^–1用22％ B重新平衡。从44.5–45min，将流速降低至0.5mL min^–1。在280nm下监测洗脱以检测峰。确定测定变异性在1％内。

派姆单抗参考样品的每个鉴定峰的化学组成是通过收集每个峰的样品，并根据与实施例3相同的方法进行肽图谱作图和反相液相色谱，然后进行质谱分析，并通过MS/MS进行分析来确定的。主峰是确定为主要含有分别针对轻链和重链具有SEQ ID NO:5和SEQIDNO:11中所示的氨基酸序列的抗体。在酸性变体峰中检测到前述抗体的天冬酰胺残基(例如，SEQ ID NO:11的重链中的N31、N52、N55、N59或N61)的氧化(例如，甲硫氨酸105)和脱酰胺作用。在酸性1峰中检测到前述抗体的天冬酰胺残基(例如，SEQ ID NO:11的重链中的N384、N389或N390)的脱酰胺作用。在碱性1峰中，检测到的抗体具有一条由SEQ ID NO:11的氨基酸序列组成的重链，一条由SEQ ID NO:12的氨基酸序列组成的重链以及两条由SEQ IDNO:5的氨基酸序列组成的轻链；或者具有一条由SEQ ID NO:11的氨基酸序列组成的重链，一条由SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成的重链，其中C末端亮氨酸是α酰胺化的，以及两条由SEQ ID NO:5的氨基酸序列组成的轻链。

根据实施例1-2中的程序，在蛋白A色谱(PAP)和阴离子交换色谱(AEXP)之后来自样品的离子交换色谱图和酸性物质、主峰和碱性物质％显示在图6-7和表4中。PAP和AEXP样品的酸性物质(酸性变体、酸性1和主峰前)的总和分别是7.86％和8.76％。通过分批补料方法获得的派姆单抗参考物的离子交换色谱图和酸性物质、主峰和碱性物质％显示在图8和表5中。参考样品的酸性物质(酸性变体、酸性1和主峰前)的总和是16.56％。参考样品的碱性物质(碱性1、碱性变体A、碱性2、碱性变体B)的总和是23.76％。参考样品的碱性变体(碱性变体A和碱性变体B)的总和是6.23％。总之，通过本发明的连续灌注过程制备的派姆单抗样品由于混合物中酸性物质的百分比较低而具有较高百分比的主峰物质。在通过实质上类似于实施例1-2的连续灌注过程制备的其他批次的派姆单抗样品中，主峰是约74-80％。

表4：获自本发明方法的派姆单抗：酸性、主峰和碱性物质

表5：派姆单抗参考物的酸性、主峰和碱性物质

名称	保留时间	面积％
			酸性变体	9.546	8.1
酸性1	10.513	6.41
			主峰前	11.79	2.05
主峰	13.269	59.68
			碱性1	14.726	8.07
碱性变体A	16.782	1.36
			碱性2	17.743	9.46
碱性变体B	21.795	4.87

图9-12还提供了在培养天数的时程中，在根据实施例1-2中的程序制备的无细胞渗透物(PERM)中，在蛋白A色谱步骤之后(PAP)，在阴离子交换色谱之后(AEXP)的总酸性物质％、主要物质％、总碱性物质％和碱性1物质％的时程。

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Claims (43)

1.一种组合物，其包含抗人PD-1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗人PD-1抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含三个轻链CDR，所述轻链CDR包括SEQ ID NO:1的CDRL1、SEQ ID NO:2的CDRL2和SEQ ID NO:3的CDRL3，所述重链可变区包含SEQ ID NO:6的CDRH1、SEQ ID NO:7的CDRH2和SEQ ID NO:8的CDRH3的三个重链CDR，其中所述抗体或其抗原结合片段的甲硫氨酸105的氧化小于或等于约3.0％。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述抗人PD-1抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列，所述重链可变区包含SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述抗人PD-1抗体包含轻链和重链，所述轻链包含SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列，所述重链包含SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列。

4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述抗人PD-1抗体由两条轻链和两条重链组成，其中所述两条轻链由SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列组成，其中所述两条重链由SEQ IDNO:10-15中任一个所示的氨基酸序列或其组合组成。

5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述抗人PD-1抗体由两条轻链和两条重链组成，其中所述两条轻链由SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列组成，其中所述两条重链由SEQ IDNO:11中所示的氨基酸序列组成。

6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述抗体是派姆单抗。

7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述抗体是派姆单抗变体。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述甲硫氨酸105的氧化是约0.2-3.0％。

9.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述甲硫氨酸105的氧化是约0.5-3.0％，其通过还原肽作图、液相色谱和质谱测量。

10.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述甲硫氨酸105的氧化是0.5-3.0％。

11.一种组合物，其包含抗人PD-1抗体主要物质以及所述抗人PD-1抗体主要物质的酸性物质，所述抗人PD-1抗体主要物质包含由两条重链和两条轻链组成的抗体，每条重链由SEQ ID NO:11的氨基酸序列组成，和每条轻链由SEQ ID NO:5的氨基酸序列组成，其中所述酸性物质的量是1.0-12.0％。

12.一种组合物，其包含从中国卵巢细胞产生的抗人PD-1抗体主要物质以及所述抗人PD-1抗体主要物质的酸性物质，所述中国卵巢细胞包含编码轻链的多核苷酸和编码重链的多核苷酸，或者编码轻链和重链的多核苷酸，其中所述重链由SEQ ID NO:10、13或15的氨基酸序列组成，和所述轻链由SEQ ID NO:5的氨基酸序列组成，其中所述酸性物质的量是1.0-12.0％。

13.一种包含抗人PD-1抗体主要物质以及所述抗人PD-1抗体主要物质的酸性和碱性物质的组合物，所述抗人PD-1抗体主要物质包含由两条重链和两条轻链组成的抗体，每条重链由SEQ ID NO:11的氨基酸序列组成，和每条轻链由SEQ ID NO:5的氨基酸序列组成，其中所述主要物质的量是65-85％。

14.根据权利要求11至13中任一项所述的组合物，其中所述酸性物质的量是约6-10％。

15.根据权利要求11-14中任一项所述的组合物，其包含约1-4％的酸性1物质。

16.根据权利要求11-15中任一项所述的组合物，其包含约1-5％的酸性变体物质。

17.根据权利要求11-16中任一项所述的组合物，其中所述主要物质的量是约65-80％。

18.根据权利要求11-16中任一项所述的组合物，其中所述主要物质的量是约70-80％。

19.根据权利要求12-18中任一项所述的组合物，其中所述碱性物质是约12-27％。

20.根据权利要求1-19中任一项所述的组合物，其中所述抗人PD-1抗体是从哺乳动物宿主细胞产生的，以及所述组合物是收获的细胞培养液。

21.根据权利要求11-20中任一项所述的组合物，其中所述主要物质、酸性、酸性1、酸性变体或碱性物质通过阳离子交换色谱法和任选地随后通过质谱法鉴定。

22.根据权利要求21所述的组合物，其中使用阳离子交换柱ProPac WCX-10、SepaxProteomix WCX-NP1.7、Thermo MAbPac SCX-10G或Thermo MAbPac SCX50G。

23.根据权利要求21所述的组合物，其中使用具有羧酸酯官能团的弱阳离子交换柱。

24.根据权利要求23所述的组合物，其中所述主要物质、酸性、酸性1、酸性变体或碱性物质通过ProPac WCX-10确定，流动相(A)是24mM MES pH 6.1和4％乙腈，以及流动相(B)是20mM磷酸钠、95mM NaClpH 8.0和4％乙腈，柱温35℃，应用梯度为：22％–22％B 0–0.6min；22％–29％B 0.6–15.0min；29％–70％B 15.0–30.0min；70％–100％B 30.0–30.5min；和100％–100％B 30.5–33.0min，以及使用280nm处的检测产生色谱图。

25.一种药物组合物，其包含约165mg/mL的根据权利要求1-24中任一项所述的抗人PD-1抗体、约10mM组氨酸缓冲剂；约10mM L-甲硫氨酸或其药学上可接受的盐；约7％w/v蔗糖；和约0.02％w/v聚山梨醇酯80。

26.一种药物组合物，其包含约130mg/mL的根据权利要求1-24中任一项所述的抗人PD-1抗体、约10mM组氨酸缓冲剂；约10mM L-甲硫氨酸或其药学上可接受的盐；约7％w/v蔗糖；和约0.02％w/v聚山梨醇酯80。

27.一种药物组合物，其包含约25mg/mL的根据权利要求1-24中任一项所述的抗人PD-1抗体、约10mM组氨酸缓冲剂、约7％w/v蔗糖和约0.02％w/v聚山梨醇酯80。

28.一种药物组合物，其包含约200-800mg的根据权利要求1-24中任一项所述的抗人PD-1抗体。

29.一种获得纯化的根据权利要求1-24中任一项所述的组合物的方法，所述方法包括以下步骤：

a)通过应用至少约0.25-6.0容器体积/天(vvd)的灌注速率，将细胞培养基中的哺乳动物宿主细胞灌注于灌注生物反应器中，其中所述宿主细胞包含编码所述抗人PD-1抗体或其抗原结合片段的轻链可变结构域的多核苷酸和编码重链可变结构域的多核苷酸，或者编码轻链可变结构域和重链可变结构域的多核苷酸；

b)从细胞培养肉汤中连续收获所述抗体或其抗原结合片段以获得收获的细胞培养液；

c)任选地，将所述收获的细胞培养液(HCCF)转移至缓冲容器约0.5至8小时的停留时间；

d)用亲和色谱步骤连续纯化所述收获的细胞培养液以获得所述纯化的组合物。

30.根据权利要求29所述的方法，其在步骤a)之前进一步包括以下步骤：

(i)以细胞密度约0.2-0.6x 10⁶个细胞/ml用细胞培养基中的哺乳动物宿主细胞接种灌注生物反应器，其中所述宿主细胞包含编码所述抗人PD-1抗体或其抗原结合片段的所述轻链可变结构域的多核苷酸和编码所述重链可变结构域的多核苷酸；和

(ii)在灌注生物反应器中使细胞培养基中的所述哺乳动物宿主细胞生长至约2.0至6.0x 10⁶个细胞/ml的细胞密度。

31.根据权利要求30所述的方法，其中在步骤i)中，在接种时，所述细胞密度是约0.25至0.5x 10⁶个细胞/ml。

32.根据权利要求29至31中任一项所述的方法，其中在步骤a)中，当所述细胞密度达到约2至10x 10⁶个细胞/ml时，开始所述灌注。

33.根据权利要求29至31中任一项所述的方法，其中在步骤a)中，当所述细胞密度达到约4至8x10⁶个细胞/ml时，开始所述灌注。

34.根据权利要求29至33中任一项所述的方法，其中在步骤a)中，所述灌注以约0.5vvd至2vvd进行。

35.根据权利要求29至34中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物宿主细胞是中国仓鼠卵巢细胞。

36.根据权利要求35所述的方法，其中在所述灌注生物反应器中的铜浓度范围是1至35ppb。

37.根据权利要求29至36中任一项所述的方法，其中所述连续收获是通过设定恒定渗透速率以通过连接至所述灌注生物反应器的中空纤维膜获得无细胞渗透物来进行的。

38.根据权利要求29-37中任一项所述的方法，其中所述亲和色谱步骤是蛋白A亲和色谱。

39.根据权利要求29-38中任一项所述的方法，其中所述亲和色谱是在连续多重柱色谱***中运行的。

40.根据权利要求29-39中任一项所述的方法，其中所述亲和色谱流体连接至步骤a)的所述灌注生物反应器。

41.根据权利要求39所述的方法，其中所述缓冲容器流体连接至所述灌注生物反应器和亲和色谱，对所述缓冲容器的HCCF流速等于从所述缓冲容器到所述连续多重柱色谱***的进料速率。

42.根据权利要求29-41中任一项所述的方法，其中步骤(d)之后是以下一个或多个步骤：病毒灭活、深度过滤、第二色谱、第三精制色谱、病毒过滤、超滤、渗滤、单通切向流过滤和在线渗滤，其任选地流体连接，或者任选地通过缓冲容器流体连接和/或通过储存容器连接。

43.一种通过根据权利要求29-42中任一项所述的方法产生或获得的包含抗人PD-1抗体或其抗原结合片段的纯化的组合物。