CN117007694A - 一种超高效液相色谱—串联质谱法测定稻米中还原型谷胱甘肽含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种超高效液相色谱—串联质谱法测定稻米中还原型谷胱甘肽含量的方法，属于化学分析检测领域，本发明所述的检测方法包括以下步骤：样品经超纯水超声提取5～30分钟，离心得到待测样品溶液；采用超高效液相色谱‑串联质谱进行检测，外标法定量；所用色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18或ACQUITY UPLC BEH HILIC，流动相的水相为pH3.0，含0.1％甲酸的超纯水，有机相为乙腈或甲醇；电喷雾离子源，正离子多反应监测模式扫描，质谱采集参数为：母离子m/z308.1，子离子m/z179.1，162.0，233.1；本发明对现有检测技术存在基质干扰严重以及准确性低等问题进行了改进，具有以下优点：方法重现性好、灵敏度高、准确性好，可定性定量。
Description
本申请是名为《一种超高效液相色谱—串联质谱法测定稻米中还原型谷胱甘肽含量的方法》的专利申请的分案申请，原申请的申请日为2020年09月03日，申请号为202010916104.2。
技术领域
本发明涉及化学分析检测技术领域，特别是涉及一种超高效液相色谱—串联质谱法测定稻米中还原型谷胱甘肽含量的方法。
背景技术
谷胱甘肽(Glutathione，GSH)是一种由半胱氨酸、谷氨酸和甘氨酸这三种氨基酸通过肽键缩合而成的三肽化合物，主要有还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)两种类型，其中，还原型谷胱甘肽是主要活性成分。药理学研究表明，谷胱甘肽具有解毒、抗氧化、抗惊厥、抗血栓和抗动脉粥样硬化等作用，在医疗、食品、保健品生产及体育运动和有关生物研究领域有广泛市场。
目前测定植物性食品中谷胱甘肽的方法，主要有荧光分光光度法、可见分光光度法、紫外分光光度法、碘量法和高效液相色谱(HPLC)法等，其中HPLC法为主要测定方法，可用于复杂基质中GSH和GSSG的分离，测定结果比较准确，但不足之处在于灵敏度不高，要求样本中谷胱甘肽的含量较高。
液质联用(LC-MS/MS)又称液相色谱-质谱联用技术，它以液相色谱作为分离***，质谱为检测***。样品在质谱部分和流动相分离，被离子化后，经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器得到质谱图。液质联用体现了色谱和质谱优势的互补，将色谱对复杂样品的高分离能力，与质谱具有高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息的优点结合起来，可以更准确地进行定性定量。
随着人们生活水平的提高，全谷物及其相关产品因其丰富的营养成分和生理活性物质倍受关注，稻米中含有丰富的谷胱甘肽，其系列产品近年来受到市场的热捧。在测定稻米中还原型谷胱甘肽含量的相关研究中发现，使用高效液相色谱在检测过程中存在严重的基质干扰，对检测结果的准确性和灵敏性有较大影响。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种准确性好、检测灵敏度高、可进行定性定量的一种超高效液相色谱-串联质谱法测定稻米中还原型谷胱甘肽含量的方法。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
一种超高效液相色谱-串联质谱法测定稻米中还原型谷胱甘肽含量的方法，包括以下步骤：
⑴选择对照物质：选择纯度大于98％的还原型谷胱甘肽标准品作为对照物质；
⑵制备标准品溶液：称取还原型谷胱甘肽标准品10mg，用乙腈-水溶液溶解，定容至100mL，充分摇匀，得到浓度为100㎎/L的标准储备液；依次将标准储备液分别配制成1μg/L、10μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L、500μg/L标准工作液，避光保存；
⑶待测样品中还原型谷胱甘肽的提取：准确称取1g粉碎后的待测样品于50mL离心管中，按一定的料液比加入提取溶剂进行超声提取，于4℃，8000rpm/min条件下离心5分钟，取上清液过滤，得到待测样品溶液，全程避光操作；
⑷将上述待测样品溶液采用超高效液相色谱-串联质谱仪进行定量分析，具体参数条件如下：
①超高效液相色谱条件：
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱，规格为：1.7μm，2.1×100mm或ACQUITY UPLCBEH HILIC柱，规格为1.7μm，2.1×100mm；
流动相：水相为pH3.0，含0.1％甲酸的超纯水，有机相为乙腈或甲醇；
流速：0.2mL/min；
柱温：30℃；
进样量：10μL；
②质谱条件：
电喷雾电离(ESI)源，采用正离子模式，扫描方式为多反应监测模式；
气帘气压力：25kPa；
喷嘴电压：5.5kV；
毛细管温度：550℃；
离子源气体1：50kPa；
离子源气体2：50kPa；
碰撞气压力：Medium；
步骤⑵中所述的乙腈水溶液为pH3.0，含0.1％甲酸，体积比50：50的乙腈-水溶液；
步骤⑶中所述的超声提取的提取时间为5～30分钟；所述的超声提取的料液比为待测样品：提取溶剂＝1：10～1：100；所述的超声提取的提取溶剂为超纯水、乙醇或0.01％～0.1％的盐酸水溶液；所述的超声提取采用的提取溶剂为超纯水，所述的料液比为待测样品：提取溶剂＝1：10，所述的超声提取的提取时间为5分钟；
步骤⑷中所述的流动相中有机相为乙腈或甲醇，水相为含0.1％甲酸的pH3.0的超纯水，所述有机相与水相的比例为50～75：50～25，所述的超高效液相色谱的洗脱方式为等度洗脱；所述质谱的采集参数为：母离子的质荷比m/z为308.1；子离子的质荷比m/z分别为179.1、162.0、233.1，其中质荷比m/z179.1为定量离子；去簇电压26V，对应的子离子碰撞气能量分别为25V、23V和22V；
所述的定量分析中的待测样品中还原型谷胱甘肽含量的计算公式为：
公式中：X—还原型谷胱甘肽的含量，单位μg/kg；
Csi—标准溶液中还原型谷胱甘肽的浓度，单位μg/L；
Ci—样品上机液中还原型谷胱甘肽的浓度，单位μg/L；
Asi—标准溶液中还原型谷胱甘肽的峰面积；
Ai—试样溶液中还原型谷胱甘肽的峰面积；
V1—样品定容体积，单位mL；
V2—样品体积，单位mL；
m—样品称样量，单位g；
f—稀释倍数。
优选地，所述待测样品为稻米相关产品，包括：糙米、精米、胚芽、糠粉、油糠。
优选地，所述待测样品的溶液组分加标平均回收率在95.60-98.40％之间。
优选地，所述步骤⑵中的过程全程避光进行操作。
优选地，乙腈、甲酸、甲醇、乙醇以及盐酸均为HPLC级别。
根据本发明提供的具体实施例，本发明公开了以下技术效果：
本发明的检测方法具有选择性好、灵敏度高、准确性好、可进行定性定量等优点；本发明通过使用UPLC-MS/MS能够快速、高效、准确地对稻米以及相关产品中的还原性谷胱甘肽进行限量测试，能够有效提高还原性谷胱甘肽的检测灵敏度，有效避免基质干扰。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明提供的实施例中的实验2中使用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱标准溶液图谱；
图2为本发明提供的实施例中的实验2中使用ACQUITY UPLC BEH HILIC色谱柱标准溶液图谱(有机相为乙腈)；
图3为本发明提供的实施例中的实验2中使用ACQUITY UPLC BEH HILIC色谱柱标准溶液图谱(有机相为甲醇)；
图4为本发明提供的实施例中的实验3中提取溶剂依次为纯水、盐酸、乙醇所得样品溶液图谱；
图5为本发明提供的实施例中的实验6还原型谷胱甘肽标准曲线图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本文中提及“实施例”意味着，结合实施例描述的特定特征、结构或特性可以包含在本申请的至少一个实施例中。在说明书中的各个位置出现该短语并不一定均是指相同的实施例，也不是与其它实施例互斥的独立的或备选的实施例。本领域技术人员显式地和隐式地理解的是，本文所描述的实施例可以与其它实施例相结合。
本申请的说明书和权利要求书及所述附图中的术语“第一”、“第二”、“第三”和“第四”等是用于区别不同对象，而不是用于描述特定顺序。此外，术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤、过程、方法等没有限定于已列出的步骤，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤元。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
一种超高效液相色谱-串联质谱法测定稻米中还原型谷胱甘肽含量的方法，包括
以下步骤：
⑴选择对照物质：选择纯度大于98％的还原型谷胱甘肽标准品作为对照物质；
⑵制备标准品溶液：称取还原型谷胱甘肽标准品10mg，用乙腈-水溶液溶解，定容至100mL，充分摇匀，得到浓度为100㎎/L的标准储备液；依次将标准储备液分别配制成1μg/L、10μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L、500μg/L标准工作液，避光保存；
⑶待测样品中还原型谷胱甘肽的提取：准确称取1g粉碎后的待测样品于50mL离心管中，按一定的料液比加入提取溶剂进行超声提取，于4℃，8000rpm/min条件下离心5分钟，取上清液过滤，得到待测样品溶液，全程避光操作；
⑷将上述待测样品溶液采用超高效液相色谱-串联质谱仪进行定量分析，具体参数条件如下：
①超高效液相色谱条件：
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱，规格为：1.7μm，2.1×100mm或ACQUITY UPLCBEH HILIC柱，规格为1.7μm，2.1×100mm；
流动相：水相为pH3.0，含0.1％甲酸的超纯水，有机相为乙腈或甲醇；
流速：0.2mL/min；
柱温：30℃；
进样量：10μL；
②质谱条件：
电喷雾电离(ESI)源，采用正离子模式，扫描方式为多反应监测模式；
气帘气压力：25kPa；
喷嘴电压：5.5kV；
毛细管温度：550℃；
离子源气体1：50kPa；
离子源气体2：50kPa；
碰撞气压力：Medium。
本发明所述待测样品为稻米相关产品，包括：糙米、精米、胚芽、糠粉、油糠。
本发明步骤⑵中所述的乙腈水溶液为pH3.0，含0.1％甲酸，体积比50：50的乙腈-水溶液。
本发明步骤⑶中所述的超声提取的提取时间为5～30分钟。
本发明步骤⑶中所述的超声提取的料液比为待测样品：提取溶剂＝1：10～1：100。
本发明步骤⑶中所述的超声提取溶剂为超纯水、乙醇或0.01％～0.1％的盐酸水溶液。
本发明步骤⑷所述的流动相中有机相为乙腈或甲醇，水相为含0.1％甲酸的pH3.0的超纯水，所述有机相与水相的比例为50～75：50～25，所述的超高效液相色谱的洗脱方式为等度洗脱。
本发明步骤⑷中所述的定量分析中的待测样品中还原型谷胱甘肽含量的计算公式为：
公式中：X—还原型谷胱甘肽的含量，单位μg/kg；
Csi—标准溶液中还原型谷胱甘肽的浓度，单位μg/L；
Ci—样品上机液中还原型谷胱甘肽的浓度，单位μg/L；
Asi—标准溶液中还原型谷胱甘肽的峰面积；
Ai—试样溶液中还原型谷胱甘肽的峰面积；
V1—样品定容体积，单位mL；
V2—样品体积，单位mL；
m—样品称样量，单位g；
f—稀释倍数；
实际检测过程中由计算机***自动计算结果。
实验例
实验用仪器与试剂：
AB Sciex 3200QTRAP质谱仪(美国AB Sciex公司)；AQUITY UPLCH-Class超高效液相色谱仪(美国waters公司)；MilliQ去离子水发生器(美国Millipore公司)。
乙腈、甲酸、甲醇、乙醇以及盐酸均为HPLC级别，CNW品牌；还原性谷胱甘肽(纯度98％，Acros公司)。
实验1：质谱分析条件优化
标准品溶液制备：称取还原型谷胱甘肽标准品10mg(精确到0.1mg)，用乙腈-水(含0.1％甲酸pH3.0)(50：50)，溶解，定容至100mL，充分摇匀，得到标准储备液(100mg/L)；将标准储备液分别配制成1μg/L、10μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L、500μg/L标准工作液，避光保存。
质谱分析条件：电喷雾电离(ESI)源，采用正离子模式，扫描方式为多反应监测模式；气帘气压力：25kPa；喷嘴电压：5.5kV；毛细管温度：550℃；离子源气体1：50kPa；离子源气体2：50kPa；碰撞气压力：Medium。按照上述质谱条件，取浓度为500μg/L标准工作液10μL注入质谱仪，分别优化碰撞能量(CE)和去簇电压(DP)、碰撞时入口电压(EP)、碰撞时出口电压(CXP)来提高还原型谷胱甘肽的响应强度，得到最优化的质谱采集参数见表1。
表1质谱采集参数
实验2：超高效液相色谱条件优化
根据实验1所得的标准溶液以及质谱条件，超高效液相色谱条件为：色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱(1.7μm，2.1×100mm)或ACQUITY UPLC BEH HILIC柱(1.7μm，2.1×100mm)；流动相：水相为超纯水(含0.1％甲酸，pH3.0)，有机相为乙腈或甲醇；流速：0.2mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL。取上述浓度为500μg/L标准工作液10μL，注入液相色谱仪，分别考察不同色谱柱和不同流动相配比下，还原型谷胱甘肽的峰形和响应强度，记录色谱图。
实验结果表明，使用ACQUITY UPLC BEH C18柱，采用流动相比例为乙腈：甲酸水(10：90)时，色谱图如图1所示，所得峰形和响应较好。使用ACQUITY UPLC BEH HILIC柱，采用流动相比例为乙腈：甲酸水(50：50)时，色谱图如图2所示，所得峰形和响应最佳；采用流动相比例为甲醇：甲酸水(75：25)时，响应也较好，色谱图如图3所示，所得峰形较宽，存在拖尾迹象。
实验3：样品提取溶剂的选择
待测样品溶液制备：各准确称取1g(精确到0.01g)粉碎后糙米于50mL离心管中，分别加入超纯水、乙醇、0.01％盐酸溶液25mL进行超声提取5min，于4℃，8000rpm/min下离心5min，取上清液过滤膜，得到待测样品溶液(全程避光操作)。
根据实验1所得的标准溶液、质谱条件以及实验2所确定的最佳超高效液相色谱测试条件，取上述待测样品溶液10μL，注入液相色谱质谱仪，记录色谱图。
检测结果如图4所示，用乙醇提取时，杂质干扰较大，峰形和保留时间都存在一定的偏离；超纯水和0.01％盐酸相比，二者提取效果相近，其中超纯水提效果更佳。
实验4：样品提取时间的选择
待测样品溶液制备：准确称取1g(精确到0.01g)粉碎后油糠于50mL离心管中，加入超纯水25mL进行超声提取，于4℃，8000rpm/min下离心5min，取上清液过滤膜，得到待测样品溶液(全程避光操作)。其中，超声提取时间分别为5min、10min、15min、20min、30min、45min、60min，每组做两个平行实验。
根据实验1所得的标准溶液、质谱条件以及实验2所确定的最佳超高效液相色谱条件，取上述待测样品溶液10μL，注入液相色谱质谱仪，记录检测结果。
表2油糠样品不同提取时间的检测结果
检测结果如表2所示，提取时间5min和10min的结果相似，提取时间30min内的检测结果较为合理。随着提取时间的延长，还原性谷胱甘肽含量逐渐降低，推测其可能的影响因素：⑴随着提取时间的延长，杂质溶出增多，干扰逐渐增大，从而影响出峰；⑵随着提取时间的延长，还原型谷胱甘肽在水相中发生氧化，导致浓度产生变化。
实验5：样品提取过程料液比的选择
待测样品溶液制备：准确称取1g(精确到0.01g)粉碎后胚芽于50mL离心管中，加入超纯水进行超声提取5min，于4℃，8000rpm/min下离心5min，取上清液过滤膜，得到待测样品溶液(全程避光操作)。其中，料液比分别为：1：10、1：25、1：50、1：100，每组做两个平行实验。
根据实验1所得的标准溶液、质谱条件以及实验2所确定的最佳超高效液相色谱条件，取上述待测样品溶液10μL，注入液相色谱质谱仪，记录检测结果。
表3胚芽样品不同提取料液比的检测结果
检测结果如表3所示，料液比为1：10和1：25时所检测的浓度相近。当料液比为1：50和1：100时，样品稀释倍数增大，丰度比存在偏差，不利于定性定量，使得检测结果可能存在一些偏差。
实验6：还原型谷胱甘肽标准曲线与回归方程制作
标准品溶液制备：称取还原型谷胱甘肽标准品10mg(精确到0.1mg)，用乙腈-水(含0.1％甲酸pH3.0)(50：50)，溶解，定容至100mL，充分摇匀，得到标准储备液(100mg/L)；再依次将标准储备液分别配制成1μg/L、10μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L、500μg/L标准工作液，避光保存。
根据实验1所得的质谱条件以及实验2所确定的最佳高效液相色谱条件，取上述标准工作液各10μL，注入液相色谱质谱仪，记录色谱图。
检测结果如图5所示。对于还原型谷胱甘肽，其线性为：y＝1209.05856x，R＝0.99993(其中x为还原型GSH浓度，y为相应的峰面积)；在0-500μg/L之间呈现良好的线性关系，可用于还原型谷胱甘肽的定量测定。
实验7：不同还原型谷胱甘肽添加浓度的回收率和精密度测定
待测样品溶液制备：分别准确称取1g(精确到0.01g)粉碎后的待测精米、糠粉，和2组不同还原型谷胱甘肽添加浓度(糠粉：5μg/kg，15μg/kg，30μg/kg；精米：1μg/kg，5μg/kg，10μg/kg)于50mL离心管中，加入25mL超纯水进行超声提取5min，于4℃，8000rpm/min下离心5min，取上清液过滤膜，得到待测样品溶液(全程避光操作)。
根据实验1所得的标准溶液、质谱条件以及实验2所确定的最佳超高效液相色谱条件，分别取上述待测样品溶液10μL，注入液相色谱质谱仪，记录检测结果。
回收率计算公式为：
回收率＝(加入标品后含量-样品含量)/加入标品量*100％。
表4不同样品加标回收率结果
检测结果如表4所示，通过加标试验以及加标回收率的计算，标准溶液组分加标平均回收率在95.60-98.40％之间，糠粉和精米样品所得数据相对标准偏差(RSD)分别为1.51％和1.50％，符合实验室质量控制规范—食品理化检测的相关要求。同时也进一步证实了该方法具有较高的回收率和准确率，适用于稻米中还原型谷胱甘肽的测定。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处。综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
Claims (5)
1.一种超高效液相色谱-串联质谱法测定稻米中还原型谷胱甘肽含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
⑴选择对照物质：选择纯度大于98％的还原型谷胱甘肽标准品作为对照物质；
⑵制备标准品溶液：称取还原型谷胱甘肽标准品10mg，用乙腈-水溶液溶解，定容至100mL，充分摇匀，得到浓度为100㎎/L的标准储备液；依次将标准储备液分别配制成1μg/L、10μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L、500μg/L标准工作液，避光保存；
⑶待测样品中还原型谷胱甘肽的提取：准确称取1g粉碎后的待测样品于50mL离心管中，按一定的料液比加入提取溶剂进行超声提取，于4℃，8000rpm/min条件下离心5分钟，取上清液过滤，得到待测样品溶液，全程避光操作；
⑷将上述待测样品溶液采用超高效液相色谱-串联质谱仪进行定量分析，具体参数条件如下：
①超高效液相色谱条件：
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱，规格为：1.7μm，2.1×100mm或ACQUITY UPLC BEHHILIC柱，规格为1.7μm，2.1×100mm；
流动相：水相为pH3.0，含0.1％甲酸的超纯水，有机相为乙腈或甲醇；
流速：0.2mL/min；
柱温：30℃；
进样量：10μL；
②质谱条件：
电喷雾电离(ESI)源，采用正离子模式，扫描方式为多反应监测模式；
气帘气压力：25kPa；
喷嘴电压：5.5kV；
毛细管温度：550℃；
离子源气体1：50kPa；
离子源气体2：50kPa；
碰撞气压力：Medium；
步骤⑵中所述的乙腈水溶液为pH3.0，含0.1％甲酸，体积比50：50的乙腈-水溶液；
步骤⑶中所述的超声提取的提取时间为5～30分钟；所述的超声提取的料液比为待测样品：提取溶剂＝1：10～1：100；所述的超声提取的提取溶剂为超纯水、乙醇或0.01％～0.1％的盐酸水溶液；所述的超声提取采用的提取溶剂为超纯水，所述的料液比为待测样品：提取溶剂＝1：10，所述的超声提取的提取时间为5分钟；
步骤⑷中所述的流动相中有机相为乙腈或甲醇，水相为含0.1％甲酸的pH3.0的超纯水，所述有机相与水相的比例为50～75：50～25，所述的超高效液相色谱的洗脱方式为等度洗脱；所述质谱的采集参数为：母离子的质荷比m/z为308.1；子离子的质荷比m/z分别为179.1、162.0、233.1，其中质荷比m/z179.1为定量离子；去簇电压26V，对应的子离子碰撞气能量分别为25V、23V和22V；
所述的定量分析中的待测样品中还原型谷胱甘肽含量的计算公式为：
公式中：X—还原型谷胱甘肽的含量，单位μg/kg；
Csi—标准溶液中还原型谷胱甘肽的浓度，单位μg/L；
Ci—样品上机液中还原型谷胱甘肽的浓度，单位μg/L；
Asi—标准溶液中还原型谷胱甘肽的峰面积；
Ai—试样溶液中还原型谷胱甘肽的峰面积；
V1—样品定容体积，单位mL；
V2—样品体积，单位mL；
m—样品称样量，单位g；
f—稀释倍数。
2.根据权利要求1所述的一种超高效液相色谱-串联质谱法测定稻米中还原型谷胱甘肽含量的方法，其特征在于，所述待测样品为稻米相关产品，包括：糙米、精米、胚芽、糠粉、油糠。
3.根据权利要求1所述的一种超高效液相色谱-串联质谱法测定稻米中还原型谷胱甘肽含量的方法，其特征在于，所述待测样品的溶液组分加标平均回收率在95.60-98.40％之间。
4.根据权利要求1所述的一种超高效液相色谱-串联质谱法测定稻米中还原型谷胱甘肽含量的方法，其特征在于，所述步骤⑵中的过程全程避光进行操作。
5.根据权利要求1所述的一种超高效液相色谱-串联质谱法测定稻米中还原型谷胱甘肽含量的方法，其特征在于，乙腈、甲酸、甲醇、乙醇以及盐酸均为HPLC级别。
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