CN109750035A - 靶向并引导Cas9蛋白高效切割TCR及B2M基因座的sgRNA - Google Patents

靶向并引导Cas9蛋白高效切割TCR及B2M基因座的sgRNA Download PDF

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Abstract

本发明提供靶向并引导Cas9蛋白高效切割TCR及B2M基因座的sgRNA。具体地，本发明提供一种用于制备通用型CAR‑T细胞的试剂，靶向TCR和/或B2M的sgRNA或用于表达所述sgRNA的表达载体。本发明的sgRNA能够高效、特异、稳定、不易脱靶、不相互干扰地敲除TCR和B2M基因，从而大幅度提高了基因敲除效率。此外，本发明还提供了用所述sgRNA改造的通用型CAR‑T细胞。本发明能有效降低移植物抗宿主病以及免疫排斥风险。

Description

靶向并引导Cas9蛋白高效切割TCR及B2M基因座的sgRNA
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，明涉及一种具有核酸酶导向功能的核苷酸序列。
背景技术
嵌合抗原受体T细胞技术(Chimeric Antigen Receptor T-Cell,CAR-T)是目前较为有效的恶性肿瘤的治疗方式之一。该技术的基本原理是从患者体内抽取出T细胞并在体外培养。在培养过程中，利用基因工程改造的方法，让患者自身T细胞表达特异的肿瘤抗原受体，在识别肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原后，T细胞能被高效激活并大量增殖，释放抗肿瘤活性分子，从而发挥强效的肿瘤杀伤效果。经过改造的T细胞在体外大量增殖后，CAR-T会被注射回患者体内，进而对表达特异性抗原的癌细胞进行攻击。CAR-T疗法目前已经在血液瘤的治疗方面获得巨大成功，是新型而强大的抗击肿瘤手段。CAR-T疗法的技术核心是嵌合抗原受体，即CAR分子，CAR分子一般由胞外的肿瘤识别区域、连接区、跨膜区以及胞内的T细胞激活结构域组成，充当抗原识别作用的是胞外识别区，往往由能够识别和结合特异性抗原的单链抗体可变区SCFv发展而来，而包内激活结构域主要由共刺激分子-CD3ζ分子共同组成CAR分子识别抗原不依赖于白细胞抗原HLA分子，因此在肿瘤相关抗原识别方面相比于内源性的TCR分子具有明显的优势。
T细胞受体介导的体细胞激活，即T细胞膜表面表达T细胞受体(T cell receptor,TCR)，负责识别由主要组织相容性复合体(MHC，人中称为白细胞抗原，即HLA分子)所呈递的抗原，与B细胞受体不同，TCR不能识别游离的抗原，而是识别经MHC分子提呈的抗原肽片段。通常情况下，T细胞受体是异源二聚体，由两个不同的亚基所构成。T细胞受体与MHC所呈递的多肽的特异性结合会引发一系列生化反应，并通过众多的辅助受体、酶和转录因子激活T细胞，促进其***与分化。在同种异体移植过程中，移植物中的淋巴细胞识别了受体细胞的抗原，发生免疫应答，攻击受体细胞，产生移植物抗宿主病(graft versus host Disease，GVHD)。
人白细胞抗原(human leucocyte antigen，HLA)，生物体对异种移植物或同种异体移植物常发生排斥作用，源于供体的基因编码受体所没有的抗原，被受体的免疫细胞识别后引起排斥反应，这一类抗原主要是人白细胞抗原即HLA抗原。同种异体移植(allotransplantation)，是指将来源于某一个体的器官、组织或细胞移植于另一个同种但不是同一个体上，使之形式相应替代功能的一直方式。同种异体移植往往面临着移植排斥以及移植物抗宿主病(GvHD)的风险。在本技术中，涉及将健康个体来源的CAR-T细胞移植至癌症患者体内，发挥抗肿瘤作用，属于同种异体移植范畴。
CRISPR/Cas9基因编辑技术，CRISPR(Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats)，全称为规律成簇间隔短回文重复，是近年来发展迅速的基因编辑工具，起初被发现是细菌用以保护自身对抗病毒感染的获得性免疫***应答现象，是一种对付攻击者的基因武器。后来，研究人员发现，它可以经过改造和发展成为精确而高效的基因编辑工具，可以介导基因组序列的删除、***、突变，甚至还可以激活或抑制目标基因，是一种可以广泛使用的基因编辑工具。
将健康个体来源的T细胞进行体外扩增培养，并使之表达CAR分子，随后采用CRISPR/Cas9基因编辑技术将CAR-T细胞中的TCR和B2M分子敲除，降低移植物抗宿主病以及免疫排斥风险，即制成通用型CAR-T，最后将改造好的CAR-T细胞回输至癌症患者体内发挥抗癌作用。但是目前仍存在以下问题：1、现有向导sgRNA序列仍具有一定的脱靶风险；2、现有向导sgRNA序列介导的目的基因序列切割效率偏低；3、多基因敲除效率低，序列之间会相互干扰。
因此，本领域亟需基因切割效率高、不相互干扰、不易脱靶、稳定的sgRNA。
发明内容
本发明的目的是提供一种基因切割效率高、不相互干扰、不易脱靶、稳定的sgRNA。
本发明的另一目的是提供一种用于制备通用型CAR-T细胞的试剂，能够高效、特异、稳定、不易脱靶、不相互干扰地敲除TCR和B2M基因。
本发明的第一方面，提供了一种用于制备通用型CAR-T细胞的试剂，所述试剂包括：
(i)靶向TCR和/或B2M的sgRNA或用于表达所述sgRNA的表达载体，所述sgRNA为选自下组的一种或多种核苷酸序列：
(A)靶向TCR的α链的sgRNA：
TRAC-sgRNA0、TRAC-sgRNA5、TRAC-sgRNA6、TRAC-sgRNA7、TRAC-sgRNA8、TRAC-sgRNA9、TRAC-sgRNA10、TRAC-sgRNA11、TRAC-sgRNA12、TRAC-sgRNA13、TRAC-sgRNA14、TRAC-sgRNA15、TRAC-sgRNA16、TRAC-sgRNA17、TRAC-sgRNA18、TRAC-sgRNA19、TRAC-sgRNA20；
较佳地，TRAC-sgRNA5、TRAC-sgRNA6、TRAC-sgRNA7、TRAC-sgRNA8、TRAC-sgRNA9、TRAC-sgRNA10、TRAC-sgRNA12、TRAC-sgRNA13、TRAC-sgRNA14、TRAC-sgRNA15、TRAC-sgRNA16、TRAC-sgRNA17、TRAC-sgRNA20；
(B1)靶向TCR的β1链的sgRNA：
TRBC1-sgRNA1、TRBC1-sgRNA2、TRBC1-sgRNA3、TRBC1-sgRNA4、TRBC1-sgRNA5、TRBC1-sgRNA6、TRBC1-sgRNA7、TRBC1-sgRNA8、TRBC1-sgRNA9、TRBC1-sgRNA10、TRBC1-sgRNA11、TRBC1-sgRNA12、TRBC1-sgRNA13、TRBC1-sgRNA14、TRBC1-sgRNA15；
较佳地，TRBC1-sgRNA3、TRBC1-sgRNA4、TRBC1-sgRNA5、TRBC1-sgRNA6、TRBC1-sgRNA7、TRBC1-sgRNA8、TRBC1-sgRNA9、TRBC1-sgRNA11、TRBC1-sgRNA12、TRBC1-sgRNA13、TRBC1-sgRNA14、TRBC1-sgRNA15；
(B2)靶向TCR的β2链的sgRNA：
TRBC2-sgRNA1、TRBC2-sgRNA2、TRBC2-sgRNA3、TRBC2-sgRNA4、TRBC2-sgRNA5、TRBC2-sgRNA6、TRBC2-sgRNA7、TRBC2-sgRNA8、TRBC2-sgRNA9、TRBC2-sgRNA10、TRBC2-sgRNA11、TRBC2-sgRNA12、TRBC2-sgRNA13、TRBC2-sgRNA14、TRBC2-sgRNA15；
较佳地，TRBC2-sgRNA1、TRBC2-sgRNA3、TRBC2-sgRNA4、TRBC2-sgRNA5、TRBC2-sgRNA6、TRBC2-sgRNA8、TRBC2-sgRNA9、TRBC2-sgRNA10、TRBC2-sgRNA12、TRBC2-sgRNA13；
(C)靶向B2M的sgRNA：
B2M-sgRNA1、B2M-sgRNA2、B2M-sgRNA3、B2M-sgRNA4、B2M-sgRNA5、B2M-sgRNA6、B2M-sgRNA7、B2M-sgRNA8、B2M-sgRNA9、B2M-sgRNA10、B2M-sgRNA11、B2M-sgRNA12、B2M-sgRNA13、B2M-sgRNA14、B2M-sgRNA15、B2M-sgRNA16、B2M-sgRNA17、B2M-sgRNA18、B2M-sgRNA19、B2M-sgRNA20；
较佳地，B2M-sgRNA1、B2M-sgRNA2、B2M-sgRNA3、B2M-sgRNA4、B2M-sgRNA5、B2M-sgRNA6、B2M-sgRNA7、B2M-sgRNA13、B2M-sgRNA17、B2M-sgRNA20；
以及任选的(ii)表达Cas9蛋白或表达Cas9蛋白的表达盒。
在另一优选例中，所述的靶向TCR的α链的sgRNA包括1、2、3、4或5种sgRNA。
在另一优选例中，所述的靶向TCR的β1链的sgRNA包括1、2、3、4或5种sgRNA。
在另一优选例中，所述的靶向TCR的β2链的sgRNA包括1、2、3、4或5种sgRNA。
在另一优选例中，所述的靶向B2M的sgRNA包括1、2、3、4或5种sgRNA。
在另一优选例中，所述的sgRNA包括靶向TCR的sgRNA和/或靶向B2M的sgRNA。
在另一优选例中，所述的靶向TCR的sgRNA包括靶向靶向TCR的α链和/或β链的sgRNA。
在另一优选例中，所述的靶向TCR的β链的sgRNA包括靶向靶向TCR的β1链和/或β2链的sgRNA。
在另一优选例中，所述的靶向TCR的α链的sgRNA包括选自下组的至少一种：TRAC-sgRNA5、TRAC-sgRNA6、TRAC-sgRNA17、或TRAC-sgRNA20。
在另一优选例中，所述的靶向TCR的β1链的sgRNA包括选自下组的至少一种：TRBC1-sgRNA4、TRBC1-sgRNA11、TRBC1-sgRNA13、TRBC1-sgRNA14、或TRBC1-sgRNA15。
在另一优选例中，所述的靶向TCR的β2链的sgRNA包括选自下组的至少一种：TRBC2-sgRNA1、TRBC3-sgRNA3、TRBC2-sgRNA6、或TRBC2-sgRNA10。
在另一优选例中，所述的靶向B2M的sgRNA包括选自下组的至少一种：B2M-sgRNA2、B2M-sgRNA3、B2M-sgRNA4、B2M-sgRNA5、或B2M-sgRNA6。
在另一优选例中，所述靶向TCR的sgRNA包括含有识别区序列为选自如SEQ IDNO.:1-47中任一所示的核苷酸序列的sgRNA。
在另一优选例中，所述靶向B2M的sgRNA包括含有识别区序列为选自如SEQ IDNO.:48-67中任一所示的核苷酸序列的sgRNA。
在另一优选例中，所述各sgRNA包括含有其对应识别区序列的核苷酸。例如，TRAC-sgRNA0包括含有如SEQ ID NO.:1所示序列的核苷酸。
在另一优选例中，所述各sgRNA的序列包括各sgRNA识别区序列和相应的全长sgRNA序列。
在另一优选例中，所述各sgRNA的序列包括sgRNA识别区序列或相应的全长sgRNA序列。例如TRAC-sgRNA0包括如SEQ ID NO.:1所示的序列和相应的全长sgRNA序列(SEQ IDNo.:1+SEQ ID No.:68)。
在另一优选例中，所述各sgRNA的序列包括选自下组的序列：(1)sgRNA识别区序列；或(2)相应的全长sgRNA序列。
在另一优选例中，所述的各sgRNA的序列如表1所示。
在另一优选例中，所述靶向TCR的sgRNA的识别区序列为选自如SEQ ID NO.:1-47中任一所示的核苷酸序列。
在另一优选例中，所述靶向B2M的sgRNA的识别区序列为选自如SEQ ID NO.:48-67中任一所示的核苷酸序列。
在另一优选例中，所述的靶向TCR的sgRNA或靶向B2M的sgRNA还包括与所述识别区序列相连且位于3’端的附加序列。
在另一优选例中，所述的靶向TCR的sgRNA或靶向B2M的sgRNA还包括位于所述识别区序列3’端的附加序列。
在另一优选例中，所述附加序列如SEQ ID No.:68所示。
在另一优选例中，所述靶向TCR和/或B2M基因的各sgRNA为经过或未经过化学基团修饰的。
在另一优选例中，所述TCR或B2M基因来源于哺乳动物，较佳地，来源于小鼠、大鼠、或人。
本发明的第二方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有：
(1)第一容器以及位于所述第一容器内的第一表达载体，所述第一表达载体含有第一表达盒，所述第一表达盒用于表达所述靶向TCR的sgRNA；和/或
(2)第二容器以及位于所述第二容器内的第二表达载体，所述第二表达载体含有第二表达盒，所述第二表达盒用于表达所述靶向B2M的sgRNA；以及任选的
(3)第三容器以及位于所述第三容器内的第三表达载体，所述第三表达载体含有第三表达盒，所述第三表达盒用于表达Cas9蛋白的表达盒。
在另一优选例中，所述靶向TCR的sgRNA的识别区序列为选自如SEQ ID NO.:1-47中任一所示的核苷酸序列。
在另一优选例中，所述靶向B2M的sgRNA的识别区序列为选自如SEQ ID NO.:48-67中任一所示的核苷酸序列。
在另一优选例中，所述第一、第二和第三容器中任何二个或三个为同一容器。
在另一优选例中，所述第一、第二和第三表达载体为独立的或相连的。
在另一优选例中，所述第一、第二和第三表达载***于相同或不同的容器内。
在另一优选例中，所述第一、第二和第三表达盒位于相同或不同的载体上。
在另一优选例中，所述第一、第二和第三表达盒位于同一载体。
在另一优选例中，所述的载体选自下组：DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、转座子、其他基因转移***、或其组合。
在另一优选例中，所述表达载体为所述sgRNA***PX458载体后得到的载体。
本发明的第三方面，提供了一种制备通用型CAR-T细胞的方法，所述方法包括：
(1)提供一待改造的CAR-T细胞；
(2)利用本发明第一方面所述的试剂改造所述CAR-T细胞，得到通用型CAR-T细胞；和
任选的(3)验证得到的CAR-T细胞为通用型CAR-T细胞。
在另一优选例中，所述待改造的CAR-T细胞来源于人和非人哺乳动物。
本发明的第四方面，提供了一种通用型CAR-T细胞，所述CAR-T细胞为利用本发明第一方面所述的试剂、本发明第二方面所述的试剂盒或本发明第三方面所述的方法制备的CAR-T细胞。
在另一优选例中，所述通用型CAR-T细胞为不表达或低表达TCR或B2M基因的CAR-T细胞。
在另一优选例中，所述“低表达”指所述CAR-T细胞TCR或B2M基因的表达量G1与正常CAR-T细胞TCR或B2M基因的表达量G0的比值，即G1/G0≤0.5，较佳地G1/G0≤0.3，更佳地≤0.2，更佳地≤0.1，最佳地为0。
本发明的第五方面，提供了一种细胞制剂，所述细胞制剂含有本发明第四方面所述的通用型CAR-T细胞。
在另一优选例中，所述细胞制剂为液态制剂。
在另一优选例中，所述细胞制剂的剂型包括注射剂。
在另一优选例中，所述制剂中所述CAR-T细胞的浓度为1×104-1×1010个细胞/ml，较佳地1×105-1×109个细胞/ml。
本发明的第六方面，提供了本发明第一方面所述的试剂的用途，所述试剂用于(a)敲除TCR和/或B2M基因；和/或(b)制备通用型CAR-T细胞。
本发明的第七方面，提供了一种sgRNA，所述sgRNA选自下组：
(1)靶向TCR的sgRNA，所述sgRNA的识别区序列为选自如SEQ ID NO.:1-47中任一所示的核苷酸序列；和/或
(2)靶向B2M的sgRNA，所述sgRNA的识别区序列为选自如SEQ ID NO.:48-67中任一所示的核苷酸序列。
在另一优选例中，所述的靶向TCR的sgRNA或靶向B2M的sgRNA还包括与所述识别区序列相连且位于3’端的附加序列。
在另一优选例中，所述的靶向TCR的sgRNA或靶向B2M的sgRNA还包括位于所述识别区序列3’端的附加序列。
在另一优选例中，所述附加序列如SEQ ID No.:68所示。
本发明的第八方面，提供了一种载体，所述载体包含本发明第七方面所述的sgRNA。
本发明的第九方面，提供了一种基因编辑***，所述基因编辑***包含本发明第七方面中所述的sgRNA。
在另一优选例中，所述基因编辑***为CRISPR/Cas***，优选地为CRISPR/Cas9***。
在另一优选例中，利用所述CRISPR/Cas9***进行基因失活编辑，获得的基因失活率≥70％，较佳地≥80％，更佳地≥90％。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了靶向TRAC位点的各sgRNA介导的基因组序列切割荧光信号统计结果。其中，TRAC-sgRNA#表示为sgRNA#，例如TRAC-sgRNA0表示为sgRNA0。
图2显示了靶向B2M位点的各sgRNA介导的基因组序列切割荧光信号统计结果。其中，B2M-sgRNA#表示为sgB2M-#，例如B2M-sgRNA1表示为sgB2M-1。
图3显示了靶向TRBC1位点的各sgRNA介导的基因组序列切割荧光信号统计结果。其中，TRBC1-sgRNA#表示为sgA#，例如TRBC1-sgRNA1表示为sgA1。
图4显示了靶向TRBC2位点的各sgRNA介导的基因组序列切割荧光信号统计结果。其中，TRBC2-sgRNA#表示为sgA#，例如TRBC2-sgRNA1表示为sgA1。
图5显示了以靶向TRAC、TRBC1、TRBC2的sgRNA共同与Cas9蛋白孵育后电转染人外周血细胞，同时以靶向B2M的sgRNA与Cas9蛋白孵育后电转染人外周血细胞，流式细胞术分析受转染细胞的TCR及B2M分子的表达情况。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，筛选了大量的靶向TCR的α链、β1链、β2链和B2M基因位点的sgRNA，意外地发现一种用于制备通用型CAR-T细胞的试剂，靶向TCR和/或B2M的sgRNA或用于表达所述sgRNA的表达载体。本发明的sgRNA能够高效、特异、稳定、不易脱靶、不相互干扰地敲除TCR和B2M基因，从而大幅度提高了基因敲除效率。此外，本发明用所述sgRNA改造的通用型CAR-T细胞能有效降低移植物抗宿主病以及免疫排斥风险。在此基础上完成了本发明。
术语
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语的意义与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同。本文中述及的所有出版物和其他参考文献都通过引用纳入本文。
如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”。
嵌合抗原受体T细胞技术
嵌合抗原受体T细胞技术(Chimeric Antigen Receptor T-Cell,CAR-T)是目前较为有效的恶性肿瘤的治疗方式之一。该技术的基本原理是从患者体内抽取出T细胞并在体外培养。在培养过程中，利用基因工程改造的方法，让患者自身T细胞表达特异的肿瘤抗原受体，在识别肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原后，T细胞能被高效激活并大量增殖，释放抗肿瘤活性分子，从而发挥强效的肿瘤杀伤效果。经过改造的T细胞在体外大量增殖后，CAR-T会被注射回患者体内，进而对表达特异性抗原的癌细胞进行攻击。CAR-T疗法目前已经在血液瘤的治疗方面获得巨大成功，是新型而强大的抗击肿瘤手段。CAR-T疗法的技术核心是嵌合抗原受体，即CAR分子，CAR分子一般由胞外的肿瘤识别区域、连接区、跨膜区以及胞内的T细胞激活结构域组成，充当抗原识别作用的是胞外识别区，往往由能够识别和结合特异性抗原的单链抗体可变区SCFv发展而来，而包内激活结构域主要由共刺激分子-CD3ζ分子共同组成CAR分子识别抗原不依赖于白细胞抗原HLA分子，因此在肿瘤相关抗原识别方面相比于内源性的TCR分子具有明显的优势。
T细胞受体(T cell receptor,TCR)
T细胞膜表面表达T细胞受体，负责识别由主要组织相容性复合体(MHC，人中称为白细胞抗原，即HLA分子)所呈递的抗原。
T细胞受体(TCR)是由α链/β链或者γ链/δ链以异二聚体形式存在的细胞膜表面的糖蛋白。免疫***的TCR总谱的组成是在胸腺中通过V(D)J重组，然后进行阳性和阴性选择而产生的。在外周环境中，TCR介导了T细胞对主组织相容性复合体-肽复合物(pMHC)的特异性识别，因此其对免疫***的细胞免疫功能是至关重要的。
可以采用国际免疫遗传学信息***(IMGT)来描述TCR。天然αβ异源二聚TCR具有α链和β链。广义上讲，各链包含可变区、连接区和恒定区，β链通常还在可变区和连接区之间含有短的多变区，但该多变区常视作连接区的一部分。通过独特的IMGT的TRAJ和TRBJ确定TCR的连接区，通过IMGT的TRAC和TRBC确定TCR的恒定区。
与B细胞受体不同，TCR不能识别游离的抗原，而是识别经MHC分子提呈的抗原肽片段。通常情况下，T细胞受体是异源二聚体，由两个不同的亚基所构成。T细胞受体与MHC所呈递的多肽的特异性结合会引发一系列生化反应，并通过众多的辅助受体、酶和转录因子激活T细胞，促进其***与分化。在同种异体移植过程中，移植物中的淋巴细胞识别了受体细胞的抗原，发生免疫应答，攻击受体细胞，产生移植物抗宿主病(graft versus host Disease，GVHD)。
B2M
β2微球蛋白(B2M)是人体白细胞抗原I类分子(HLA-I)的一个β轻链。其主要功能是参与淋巴细胞与靶细胞表面抗原的识别，因此B2M与组织相容性密切相关。体内几乎所有有核细胞均能合成β2微球蛋白，附着于细胞表面。β2微球蛋白的缺失会导致HLA-I类分子聚合异常，从而不能形成完整的功能分子。本发明正是利用这一特性，通过基因编辑技术敲除CAR T细胞中的B2M分子，从而是其不能表达正常的HLA-I类分子，进而降低CAR T细胞的移植排斥效应。
CRISPR/Cas基因编辑技术
本发明所称的“CRISPR/Cas技术”、“CRISPR/Cas基因组编辑”、“CRISPR/Cas基因组编辑技术”、“CRISPR/Cas基因组编辑方法”一般是指利用CRISPR/Cas***对目的DNA序列进行修改的技术。“CRISPR/Cas技术”也可以包含利用类似原理进行基因表达调控的方法，如基于CRISPR/dCas9的基因表达调控技术。
CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)，全称为规律成簇间隔短回文重复，是近年来发展迅速的基因编辑工具，起初被发现是细菌用以保护自身对抗病毒感染的获得性免疫***应答现象，是一种对付攻击者的基因武器。后来，研究人员发现，它可以经过改造和发展成为精确而高效的基因编辑工具，可以介导基因组序列的删除、***、突变，甚至还可以激活或抑制目标基因，这些目标基因包括人、鼠、斑马鱼、细菌、果蝇、酵母、线虫和农作物细胞内的基因，意味着CRISPR/Cas9是一种可以广泛使用的基因编辑工具。目前，来自Streptococcus pyogenes的CRISPR-Cas9***应用最为广泛。该***中的核酸酶Cas9蛋白含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA两条单链。CRISPR/Cas9***的工作原理是Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物，然后通过PAM序列结合特定DNA序列，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂，随后机体通过启动非同源末端链接或者同源重组机制对出现的双链断裂进行修复，继而介导核苷酸序列的缺失、***等。
本发明的sgRNA
如本文所用，“sgRNA”、“向导RNA”或“本发明sgRNA”可互换使用，均指靶向TCR和/或B2M基因的sgRNA，所述sgRNA选自下组的一种或多种核苷酸序列：
(A)靶向TCR的α链的sgRNA：
(B1)靶向TCR的β1链的sgRNA：
(B2)靶向TCR的β2链的sgRNA：
(C)靶向B2M的sgRNA。
在另一优选例中，所述的各sgRNA如本发明第一方面中所述。
在另一优选例中，所述的各sgRNA的序列如表1所示。
表1
注：各全长sgRNA序列等于相应的sgRNA的识别区序列+SEQ ID NO.:68所示的序列(从5’端至3’端)，即各全长sgRNA序列从5’端至3’端由相应的sgRNA的识别区序列和如SEQID NO.:68所示的序列共同构成。
在本发明中，提供了一种设计sgRNA的方法。典型地，所述合成和筛选sgRNA的方法包括步骤：
1 sgRNA的设计
设计并合成各条sgRNA的oligo，退火，连接到合适载体(如市售载体，例如PX458载体)。
2靶点的筛选
2.1荧光素酶报告***
1.从质粒转染48h后的96孔板中吸出50ul上清液至不透明的96孔板中用于检测荧光素酶的表达。
2.快速向已有的上清液的96孔板中每孔加入50ul反应液，立马放入发光检测仪中进行检测。
3.统计得到荧光素酶表达量最高的靶点，作为高效靶点。
2.2 T7E1酶切
1.针对靶点序列设计PCR产物，经过PCR获得靶位点附近的DNA片段，PCR产物经过普通DNA试剂盒纯化处理。
2.T7E1酶切分析：经过纯化后的PCR产物，进行一步退火处理，退火程序如下
退火后产物，进行T7E1酶切处理，37℃孵育1小时。
3.聚丙烯酰胺凝胶电泳
将DNA样品按顺序加入聚丙烯酰胺凝胶中，电泳槽中加入1xTBE溶液，恒压100V至Loading跑至聚丙烯酰胺凝胶底部。取出凝胶，放入含有EB的TBE溶液(EB含量5μL/100mL)中浸泡10分钟，十分钟后，取出聚丙烯酰胺凝胶，紫外光下拍照。
4.灰度分析或TA克隆计算不同靶点的切割效率，选取切割效率最高靶点(如前三个)作为高效率靶点。
Cas9蛋白
本领域技术人员知晓，CRISPR/Cas的核心是Cas蛋白以及sgRNA。基于本发明的教导，本领域技术人员可以理解本发明的sgRNA表达盒可以与各种Cas蛋白联用，从而用于各种CRISPR/Cas***，如CRISPR/Cas9***、CRISPR/nCas9***、CRISPR/dCas9***。
Cas9蛋白为多功能蛋白，其蛋白结构包括α-螺旋组成的识别区(REC)、由HNH结构域与RuvC结构域组成的核酸酶区以及位于C-端的PAM结合区。这两个重要的核酸酶结构域RuvC与HNH可分别对gRNA的DNA互补链与非互补链进行切割，产生平末端的DNA双链断裂。当RuvC结构域中的D10A发生突变时可导致RuvC结构域的失活，当HNH结构域中的H840A发生突变时则可导致HNH结构域的失活。单点突变体可使Cas9成为切口酶(nickase)，简称为nCas9，可形成单链DNA断裂。Cas9与靶DNA的识别依赖于tracrRNA:crRNA复合体以及位于靶位点下游的PAM序列。
本发明的sgRNA介导的CRISPR/Cas***
在本发明的sgRNA的基础上，本发明提供包含所述的sgRNA的基因编辑***，优选地为CRISPR/Cas***。
本领域技术人员知晓，CRISPR/Cas***可以用于各种领域，包括但不限于基因组编辑、基因表达调控与基因工程等等。在具体的实施方式中，本发明的CRISPR/Cas***用于基因组编辑和基因表达调控。
在具体的实施方式中，所述CRISPR/Cas***包括但不限于CRISPR/Cas9***、CRISPR/nCas9***或CRISPR/dCas9***；优选地，所述CRISPR/Cas***是CRISPR/Cas9***。
如上所述，本发明的CRISPR/Cas***的核心是Cas9蛋白以及sgRNA，二者可以在同一表达载体中也可以在不同的表达载体中。然而，由于sgRNA和Cas9蛋白在不同表达载体中减少了sgRNA表达盒亚克隆至Cas9质粒的过程，使得操作更为简便，因此，在优选的实施方式中，将sgRNA的表达盒与Cas9的表达质粒共转化。
基于本发明的技术内容以及本领域的技术常识，本领域技术人员知晓关于Cas9的表达、靶向序列的选择以及DNA转化***的各种技术要点，例如本领域技术人员可以参照Nodvig等(Nodvig et al.,2015)所述进行Cas9的表达以及实施DNA转化。
在本文中，术语“基因失活”是指在不涉及供体DNA的基础上，由Cas9在sgRNA的引导下对特定位点进行双链切割后，在真核生物中由非同源末端连接***引入DNA序列***或碱基缺失等而使得某一基因丧失生物学功能；而术语“基因精准编辑”是指在特定DNA位点进行精准的、可预测的遗传学操作，例如目标DNA片段的敲除、***、替换、点突变等等，涉及供体DNA以及同源重组机制。因此，本领域技术人员知晓，基因精准编辑的难度要远高于基因失活。此外，本领域技术人员知晓，供体DNA片段供体DNA的长度对于基因组编辑的效率也有很大影响。供体DNA片段供体DNA同源臂长度增加可提高DNA同源重组效率从而提高DNA编辑效率，但多数真核野生菌株中其同源重组的效率很低，有时仅有百分之几的效率，主要是非同源末端连接***发挥作用。而对于短同源臂的供体DNA片段供体DNA片段，其基因组编辑效率则更低。
然而，本发明的sgRNA介导的基因组编辑***相比于现有技术具备优异的基因组编辑能力。在具体的实施方式例中，利用本发明的基因组编辑***获得的基因失活率高于95％，更优选达到100％。
本发明中，“同源臂”具有与本领域技术人员常规理解相同的意义，是指供体DNA上位于靶序列两侧的、与基因组序列完全一致的侧翼序列，用于识别并发生重组的区域。因此，鉴于本发明的内容，本领域技术人员可以自行选择和决定同源臂的长度。同时，本领域技术人员也知晓，利用长同源臂获得的基因组编辑效率通常会高于利用短同源臂的。而相比于现有技术，本发明的显著优点在于可以进行基因精准编辑，特别是利用短同源臂的供体DNA进行基因精准编辑的效率显著提高。
在一优选例中，所述CRISPR/Cas9***可利用15-3000bp的同源臂的供体DNA进行基因精准编辑；在进一步的优选例中，所述CRISPR/Cas9***可利用20-200bp的同源臂的供体DNA进行基因精准编辑，例如，供体DNA的同源臂可以低于100bp，甚至低于40bp，更甚至低于20bp，而所述CRISPR/Cas9***利用短同源臂的供体DNA进行基因组编辑的效率可以达到60％以上，甚至75％以上，更甚至95％以上。
在优选的实施方式中，本发明的基因组编辑***尤其用于在CAR-T细胞中进行基因组编辑。在另一优选例中，本发明的基因组编辑***用于敲除CAR-T细胞中的TCR和/或B2M基因。
通用型CAR-T细胞
如本文所用，“通用型CAR-T细胞”、“本发明CAR-T细胞”、或“本发明通用型CAR-T细胞”均指不表达或低表达TCR或B2M基因的CAR-T细胞。所述的通用型CAR-T细胞能有效降低移植物抗宿主病以及免疫排斥风险，从而提高CAR-T细胞的治疗效果。
在另一优选例中，所述“低表达”指所述CAR-T细胞TCR或B2M基因的表达量G1与正常CAR-T细胞TCR或B2M基因的表达量G0的比值，即G1/G0≤0.5，较佳地G1/G0≤0.3，更佳地≤0.2，更佳地≤0.1，最佳地为0。
本发明的主要优点包括：
(a)本发明提供的用于制备通用型CAR-T细胞的试剂，稳定、不易脱靶、不相互干扰地敲除TCR和B2M基因，并且特异性好、切割效率高，大幅度提高了基因敲除效率。
(b)本发明提供的通用型CAR-T细胞能有效降低移植物抗宿主病以及免疫排斥风险，从而提高CAR-T细胞的治疗效果。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1 sgRNA筛选设计
1sgRNA的设计
各sgRNA序列的识别区序列和全长序列如表1所示。各sgRNA序列的识别区序列相应的靶点序列分别是将识别区序列中的“U”替换为“T”。
合成对应于相应sgRNA的oligo，退火，然后连接入PX458载体。
部分代表性oligo序列如下所示，对应于其他各sgRNA的oligo可同样制备。
用于TRBC1-sgRNA1的oligo：
TRBC1-sgRNA1-oligo-F:CACCGAGCTCAGCTCCACGTGGTC(SEQ ID No.:70)
TRBC1-sgRNA1-oligo-R:AAACGACCACGTGGAGCTGAGCTC(SEQ ID No.:71)
用于模板PCR克隆的oligo：
TRBC1-luci-Donor-F:ATCCTGGCTCCAACCCCTCTTC(SEQ ID No.:72)
TRBC1-luci-Donor-R:ATCTGTCTGCTACCTGGATCTTTC(SEQ ID No.:73)
2靶点的筛选
2.1荧光素酶报告***
1.从质粒转染48h后的96孔板中吸出50ul上清液至不透明的96孔板中用于检测荧光素酶的表达。
2.快速向已有的上清液的96孔板中每孔加入50ul反应液，立马放入发光检测仪中进行检测。
3.统计得到荧光素酶表达量最高的靶点，作为高效靶点。
2.2 T7E1酶切
1.针对靶点序列设计PCR产物，经过PCR获得靶位点附近的DNA片段，PCR产物经过普通DNA试剂盒纯化处理。
2.T7E1酶切分析：经过纯化后的PCR产物，进行一步退火处理，退火程序如下
退火后产物，进行T7E1酶切处理，37℃孵育1小时。
3.聚丙烯酰胺凝胶电泳
1)将DNA样品按顺序加入聚丙烯酰胺凝胶中，电泳槽中加入1xTBE溶液，恒压100V至Loading跑至聚丙烯酰胺凝胶底部。
2)取出凝胶，放入含有EB的TBE溶液(EB含量5μL/100mL)中浸泡10分钟，十分钟后，取出聚丙烯酰胺凝胶，紫外光下拍照。
4.灰度分析或TA克隆计算不同靶点的切割效率，选取切割效率最高的前三个靶点作为高效率靶点。
实施例2 sgRNA T7-oligo片段设计
设计靶向TCR的α链、β1链、β2链和B2M的sgRNA，将下述18个N替换成sgRNA靶向的靶序列。
TAATACGACTCACTATAGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAAT(SEQ IDNo.:69)
sgRNA T7-oligo合成后，根据合成反馈信息，用RNase free水稀释到100μM母液，然后放-20℃冰箱保存备用。
实施例3重叠PCR制备sgRNA前体
试剂盒为ToYoBo High FideliUUy DNA polymerase KOD-Plus-
液体引物稀释十倍作为模板，体系如下：
参数设置：Cycle 28,延伸温度68℃,20s，Tm 50℃。
每个靶点设置2个复管，PCR结束后取出5ul点样，琼脂糖凝胶电泳看条带亮度，是否单一。
实施例4酚氯仿法纯化sgRNA前体
1.两管合成一管共95μl，补加105μl RNase free水至200ul。
2.加200ul酚氯仿，漩涡震荡均匀，静置3min，普通离心机12000rpm离心5min；
3.吸取上层水相，加等体积氯仿，漩涡震荡均匀，静置3min，普通离心机12000rpm离心5min；
4.吸取上层水相，加1/10体积3M NaAC(醋酸钠)和2.5倍体积的无水乙醇，混匀，-20℃静置30-40min；
5.待絮状物出现后，4℃离心机12000rpm离心5min，弃上清，扣干
6.每管加500ul预冷的75％(须由DEPC水配制)乙醇，4℃离心机12000rpm离心5min，弃上清，晾干
7.RNase free水11ul溶解，1ul测浓度，之后置-20℃低温保存备用。
(注意：DNA浓度控制在1000—2000ng/ul)
实施例5体外转录制备sgRNA(TaKaRa体外转录T7试剂盒,#6140)
1、配制下列反应液；
(注意：模板DNA必须最后添加，以防止产生沉淀；全程RNase free环境)
2、将上述溶液均匀混合后轻微离心，将转录反应液收集于反应管底部，42℃反应3小时。
3、DNase处理；转录反应后，向其中加入3μl DNase I⑧，混匀。37℃反应30分钟。
实施例6转录sgRNA精制
按照下面方法进行苯酚/氯仿抽提、异丙醇沉淀。
反应液体积低于100μl时，加入RNase free H2O(或DEPC水)补足至100μl。
1.加入等体积的酚氯仿，vorTex搅拌，12,000rpm室温离心5分钟。
2.将上层(水层)移至新Tube中，加入等体积的氯仿，vortex搅拌，12,000rpm室温离心5分钟。
3.上层(水层)移至新tube中，加入1/10体积的3M醋酸钠、等体积的异丙醇，充分混合均匀。
4.室温放置5分钟后，-20℃放5分钟，15,000rpm室温离心5分钟。
5.除去上清，80％DEPC水配置的乙醇洗净沉淀。
6.干燥后加入20μl RNase free水溶解沉淀。测浓度，最好为2000ng/ul左右。
7.如有必要，可小量分装保存于-80℃。
实施例7电转制备U-CART
仪器与材料：
①Lonza 4D-NucleofectorTM System细胞核转仪
②试剂盒为P3Primary Cell 4D-NucleofectorTM X Kit，Lonza,V4XP-3024
③制备好的处于激活状态的CAR-T细胞
④商品化Cas9蛋白(放置冰上)(S.p.Cas9Nuclease 3NLS，IDT)
⑤各靶点的sgRNA(放置冰上)。
具体操作步骤(适用于100μl规格的电转杯)：
1.按照82μl Solution+18μl supplement/每个电转杯，按电转总数，配置一个电转液mix，混匀，放室温。
2.孵育Cas9蛋白和总的sgRNA(按照Cas9：总的sgRNA＝20ug:10ug为最优)，孵育体系为：
Cas9(10ug/ul):2μl
10×Cas9buffer:1μl
总sgRNA 10ug:xμl
RNase free水补加至10μl
3.电转之前细胞计数，每个电转杯细胞数控制在1-5×106。
4.13000rpm/min,室温离心3min，收集CART细胞，用PBS(预热)洗两遍，用之前配置好的电转液mix温和重悬细胞。
5.分别向每个孵育Cas9蛋白和总的sgRNA的EP管以及空白对照组中加100ul,吹匀之后，转至对应的电转杯中，注意不要产生气泡影响电转效率。
6.电转之前将加有完全培养基的细胞培养板放进培养箱中预热。
7.打开电转仪，将电转杯放入槽孔，选择相应程序(Stimulated human T cell)，启动电转。
8.电转之后，快速将细胞转入细胞培养板中，放入培养箱中培养。
9.如有需要，24h之后，将Cas9蛋白和总的sgRNA的用量减半或1/4用量以同等条件进行二次电转。
10.将上述细胞放置培养箱中扩增10day左右，流式检测TCR/B2M敲除效率以及用磁珠负选法富集单敲和双敲阴性细胞。
结果如图1-5所示。
从图1可以看出，敲除效率从高到低依次为：第一组(TRAC-sgRNA5、TRAC-sgRNA6、TRAC-sgRNA17、TRAC-sgRNA20)＞第二组(TRAC-sgRNA7、TRAC-sgRNA8、TRAC-sgRNA9、TRAC-sgRNA10、TRAC-sgRNA12、TRAC-sgRNA13、TRAC-sgRNA14、TRAC-sgRNA15、TRAC-sgRNA16)＞第三组(TRAC-sgRNA0、TRAC-sgRNA11、TRAC-sgRNA18、TRAC-sgRNA19)。
从图2可以看出，敲除效率从高到低依次为：第一组(B2M-sgRNA2、B2M-sgRNA3、B2M-sgRNA4、B2M-sgRNA5、B2M-sgRNA6)＞第二组(B2M-sgRNA1、B2M-sgRNA7、B2M-sgRNA13、B2M-sgRNA17、B2M-sgRNA20)＞第三组(B2M-sgRNA8、B2M-sgRNA9、B2M-sgRNA10、B2M-sgRNA11、B2M-sgRNA12、B2M-sgRNA14、B2M-sgRNA15、B2M-sgRNA16、B2M-sgRNA18、B2M-sgRNA19)。
从图3可以看出，敲除效率从高到低依次为：第一组(TRBC1-sgRNA4、TRBC1-sgRNA11、TRBC1-sgRNA13、TRBC1-sgRNA14、TRBC1-sgRNA15)＞第二组(TRBC1-sgRNA3、TRBC1-sgRNA5、TRBC1-sgRNA6、TRBC1-sgRNA7、TRBC1-sgRNA8、TRBC1-sgRNA9、TRBC1-sgRNA12)＞第三组(TRBC1-sgRNA1、TRBC1-sgRNA2、TRBC1-sgRNA10)。
从图4可以看出，敲除效率从高到低依次为：第一组(TRBC2-sgRNA1、TRBC3-sgRNA3、TRBC2-sgRNA6、TRBC2-sgRNA10)＞第二组(TRBC2-sgRNA4、TRBC2-sgRNA5、TRBC2-sgRNA8、TRBC2-sgRNA9、TRBC2-sgRNA12、TRBC2-sgRNA13)＞第三组(TRBC2-sgRNA2、TRBC2-sgRNA7、TRBC2-sgRNA11、TRBC2-sgRNA14、TRBC2-sgRNA15)。
此外，用本发明的sgRNA进行改造，即以靶向TRAC、TRBC1、TRBC2的sgRNA共同与Cas9蛋白孵育后电转染人外周血细胞，同时以靶向B2M的sgRNA与Cas9蛋白孵育后电转染人外周血细胞，流式细胞术分析。
结果如图5所示，受转染细胞的TCR及B2M分子的表达显著下降，这提示经改造后通用型CAR-T细胞能有效降低移植物抗宿主病以及免疫排斥风险。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 华东师范大学
上海邦耀生物科技有限公司
<120> 靶向并引导Cas9蛋白高效切割TCR及B2M基因座的sgRNA
<130> P2017-2120
<160> 73
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
caggguucug gauaucugu 19
<210> 2
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
ugugcuagac augaggucua 20
<210> 3
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
agagcaacag ugcuguggcc 20
<210> 4
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
ucucucagcu gguacacggc 20
<210> 5
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
aaguuccugu gaugucaagc 20
<210> 6
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
gagaaucaaa aucggugaau 20
<210> 7
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
uggauuuaga gucucucagc 20
<210> 8
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
agagucucuc agcugguaca 20
<210> 9
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
agcugguaca cggcaggguc 20
<210> 10
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 10
cuggggaaga aggugucuuc 20
<210> 11
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 11
acacggcagg gucaggguuc 20
<210> 12
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 12
cucgaccagc uugacaucac 20
<210> 13
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 13
uucggaaccc aaucacugac 20
<210> 14
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 14
uuaaucugcu caugacgcug 20
<210> 15
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 15
gauuaaaccc ggccacuuuc 20
<210> 16
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 16
cucucagcug guacacggca 20
<210> 17
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 17
uaggcagaca gacuugucac 20
<210> 18
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 18
cagcucagcu ccacgugguc 20
<210> 19
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 19
gcggcugcuc aggcaguauc 20
<210> 20
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 20
aggccucggc gcugacgauc 20
<210> 21
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 21
ggccucggcg cugacgaucu 20
<210> 22
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 22
ucuccgagag cccguagaac 20
<210> 23
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 23
ugacagcgga agugguugcg 20
<210> 24
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 24
cgcugucaag uccaguucua 20
<210> 25
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 25
acuggacuug acagcggaag 20
<210> 26
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 26
uugacagcgg aagugguugc 20
<210> 27
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 27
gacagcggaa gugguugcgg 20
<210> 28
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 28
cguagaacug gacuugacag 20
<210> 29
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 29
gacgaucugg gugacggguu 20
<210> 30
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 30
cuugacagcg gaagugguug 20
<210> 31
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 31
gcugucaagu ccaguucuac 20
<210> 32
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 32
ggcgcugacg aucuggguga 20
<210> 33
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 33
aggcuucuac cccgaccacg 20
<210> 34
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 34
ugacagcgga agugguugcg 20
<210> 35
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 35
agcucagcuc cacguggucg 20
<210> 36
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 36
acuggacuug acagcggaag 20
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 37
uugacagcgg aagugguugc 20
<210> 38
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 38
gacagcggaa gugguugcgg 20
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<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 39
aggccucggc gcugacgauc 20
<210> 40
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 40
ggccucggcg cugacgaucu 20
<210> 41
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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cacccagauc gucagcgccg 20
<210> 42
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 42
ggcucucgga gaaugacgag 20
<210> 43
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 43
ugacagguuu ggcccuaucc 20
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 44
ugacgagugg acccaggaua 20
<210> 45
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 45
gacagguuug gcccuauccu 20
<210> 46
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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gacgaucugg gugacagguu 20
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 47
gaucgucagc gccgaggccu 20
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
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ggccacggag cgagacaucu 20
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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ggccacggag cgagacaucu 20
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 50
acucacgcug gauagccucc 20
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 51
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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ggccgagaug ucucgcuccg 20
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 53
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gcuacucucu cuuucuggcc 20
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
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cgugaguaaa ccugaaucuu 20
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ucacgucauc cagcagagaa 20
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uccugaauug cuaugugucu 20
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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aagucaacuu caaugucgga 20
<210> 59
<211> 20
<212> RNA
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caguaaguca acuucaaugu 20
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<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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gaaguugacu uacugaagaa 20
<210> 61
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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uggagagaga auugaaaaag 20
<210> 62
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
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uucagacuug ucuuucagca 20
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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acuugucuuu cagcaaggac 20
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<212> RNA
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auacucaucu uuuucagugg 20
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
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cauacucauc uuuuucagug 20
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gcauacucau cuuuuucagu 20
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<212> RNA
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acaaagucac augguucaca 20
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<211> 80
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 68
guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60
ggcaccgagu cggugcuuuu 80
<210> 69
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(43)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 69
gatcactaat acgactcact ataggnnnnn nnnnnnnnnn nnngttttag agctagaaat 60
<210> 70
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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caccgagctc agctccacgt ggtc 24
<210> 71
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<212> DNA
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aaacgaccac gtggagctga gctc 24
<210> 72
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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atcctggctc caacccctct tc 22
<210> 73
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 73
atctgtctgc tacctggatc tttc 24

Claims (10)

1.一种用于制备通用型CAR-T细胞的试剂，其特征在于，所述试剂包括：
(i)靶向TCR和/或B2M的sgRNA或用于表达所述sgRNA的表达载体，所述sgRNA为选自下组的一种或多种核苷酸序列：
(A)靶向TCR的α链的sgRNA：
TRAC-sgRNA0、TRAC-sgRNA5、TRAC-sgRNA6、TRAC-sgRNA7、TRAC-sgRNA8、TRAC-sgRNA9、TRAC-sgRNA10、TRAC-sgRNA11、TRAC-sgRNA12、TRAC-sgRNA13、TRAC-sgRNA14、TRAC-sgRNA15、TRAC-sgRNA16、TRAC-sgRNA17、TRAC-sgRNA18、TRAC-sgRNA19、TRAC-sgRNA20；
较佳地，TRAC-sgRNA5、TRAC-sgRNA6、TRAC-sgRNA7、TRAC-sgRNA8、TRAC-sgRNA9、TRAC-sgRNA10、TRAC-sgRNA12、TRAC-sgRNA13、TRAC-sgRNA14、TRAC-sgRNA15、TRAC-sgRNA16、TRAC-sgRNA17、TRAC-sgRNA20；
(B1)靶向TCR的β1链的sgRNA：
TRBC1-sgRNA1、TRBC1-sgRNA2、TRBC1-sgRNA3、TRBC1-sgRNA4、TRBC1-sgRNA5、TRBC1-sgRNA6、TRBC1-sgRNA7、TRBC1-sgRNA8、TRBC1-sgRNA9、TRBC1-sgRNA10、TRBC1-sgRNA11、TRBC1-sgRNA12、TRBC1-sgRNA13、TRBC1-sgRNA14、TRBC1-sgRNA15；
较佳地，TRBC1-sgRNA3、TRBC1-sgRNA4、TRBC1-sgRNA5、TRBC1-sgRNA6、TRBC1-sgRNA7、TRBC1-sgRNA8、TRBC1-sgRNA9、TRBC1-sgRNA11、TRBC1-sgRNA12、TRBC1-sgRNA13、TRBC1-sgRNA14、TRBC1-sgRNA15；
(B2)靶向TCR的β2链的sgRNA：
TRBC2-sgRNA1、TRBC2-sgRNA2、TRBC2-sgRNA3、TRBC2-sgRNA4、TRBC2-sgRNA5、TRBC2-sgRNA6、TRBC2-sgRNA7、TRBC2-sgRNA8、TRBC2-sgRNA9、TRBC2-sgRNA10、TRBC2-sgRNA11、TRBC2-sgRNA12、TRBC2-sgRNA13、TRBC2-sgRNA14、TRBC2-sgRNA15；
较佳地，TRBC2-sgRNA1、TRBC2-sgRNA3、TRBC2-sgRNA4、TRBC2-sgRNA5、TRBC2-sgRNA6、TRBC2-sgRNA8、TRBC2-sgRNA9、TRBC2-sgRNA10、TRBC2-sgRNA12、TRBC2-sgRNA13；
(C)靶向B2M的sgRNA：
B2M-sgRNA1、B2M-sgRNA2、B2M-sgRNA3、B2M-sgRNA4、B2M-sgRNA5、B2M-sgRNA6、B2M-sgRNA7、B2M-sgRNA8、B2M-sgRNA9、B2M-sgRNA10、B2M-sgRNA11、B2M-sgRNA12、B2M-sgRNA13、B2M-sgRNA14、B2M-sgRNA15、B2M-sgRNA16、B2M-sgRNA17、B2M-sgRNA18、B2M-sgRNA19、B2M-sgRNA20；
较佳地，B2M-sgRNA1、B2M-sgRNA2、B2M-sgRNA3、B2M-sgRNA4、B2M-sgRNA5、B2M-sgRNA6、B2M-sgRNA7、B2M-sgRNA13、B2M-sgRNA17、B2M-sgRNA20；
以及任选的(ii)表达Cas9蛋白或表达Cas9蛋白的表达盒。
2.如权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述试剂中各sgRNA的序列包括各sgRNA识别区序列和相应的全长sgRNA序列。
3.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有：
(i)第一容器以及位于所述第一容器内的第一表达载体，所述第一表达载体含有第一表达盒，所述第一表达盒用于表达所述靶向TCR的sgRNA；和/或
(2)第二容器以及位于所述第二容器内的第二表达载体，所述第二表达载体含有第二表达盒，所述第二表达盒用于表达所述靶向B2M的sgRNA；以及任选的
(3)第三容器以及位于所述第三容器内的第三表达载体，所述第三表达载体含有第三表达盒，所述第三表达盒用于表达Cas9蛋白的表达盒；
其中，所述靶向TCR的sgRNA的识别区序列为选自如SEQ ID NO.:1-47中任一所示核苷酸序列；和/或
所述靶向B2M的sgRNA的识别区序列为选自如SEQ ID NO.:48-67中任一所示的核苷酸序列。
4.一种制备通用型CAR-T细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)提供一待改造的CAR-T细胞；
(2)利用权利要求1所述的试剂改造所述CAR-T细胞，得到通用型CAR-T细胞；和
任选的(3)验证得到的CAR-T细胞为通用型CAR-T细胞。
5.一种通用型CAR-T细胞，其特征在于，所述CAR-T细胞为利用权利要求1所述的试剂、权利要求3所述的试剂盒或权利要求4所述的方法制备的CAR-T细胞。
6.一种细胞制剂，其特征在于，所述细胞制剂含有权利要求5所述的通用型CAR-T细胞。
7.如权利要求1所述的试剂的用途，其特征在于，所述试剂用于(a)敲除TCR和/或B2M基因；和/或(b)制备通用型CAR-T细胞。
8.一种sgRNA，其特征在于，所述sgRNA选自下组：
(1)靶向TCR的sgRNA，所述sgRNA的识别区序列为选自如SEQ ID NO.:1-47中任一所示的核苷酸序列；和/或
(2)靶向B2M的sgRNA，所述sgRNA的识别区序列为选自如SEQ ID NO.:48-67中任一所示的核苷酸序列。
9.一种载体，其特征在于，所述载体包含权利要求8所述的sgRNA。
10.一种基因编辑***，其特征在于，所述基因编辑***包含权利要求8中所述的sgRNA。
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Denomination of invention: Targeting and guiding Cas9 protein to efficiently cleave sgRNA at TCR and B2M loci

Effective date of registration: 20231030

Granted publication date: 20200605

Pledgee: Minhang Branch of Shanghai Rural Commercial Bank Co.,Ltd.

Pledgor: BIORAY LABORATORIES Inc.

Registration number: Y2023310000689