CN1169533A - 用于测定血糖的试剂检验带 - Google Patents
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Abstract
一种试剂带,适用于血糖计中,全血试样本从试剂带的基质的一面加入,血糖计测量基质的相反面在约635nm和700nm处的反射率,并计算出全血样中的血糖浓度,穿过基质并以测试表面不可见的所用样本部分在700nm不吸收光,然而,含有糖样本与含试剂基质的成分作用,使模拟血色效果的在700nm的反射率变化。结果,试剂带用于血糖计,在存在光可见的血红蛋白时测量全血中的血糖浓度。
Description
本发明涉及一种用于测定生理液中的分析物浓度的固相检验带;尤其用于全血中血糖的比色法测量的检验带。
目前已有很多种可见的检验装置用于测定生理液中某一分析物的浓度。这些装置有,例如测定血、尿或唾液中的糖、胆固醇、蛋白质、酮、苯丙氨酸或酶。
固相试剂带是以酶为基本组成成份,广泛地应用于医院、临床实验室、内科医生办公室和家中以测定生理液中糖的浓度。事实上,试剂带已成为很多国家数亿糖尿病患者的每日必需品。因为糖尿病可能引起血液化学的危险的异常,导致失明、肾衰和其他严重的医学并发症。为降少这些并发症的危险,当今医生劝告并教会糖尿病患者根据各自的病情的自然和严重程度一天2到7次测定其血糖水平。根据测得的血溏水平,患者和医生可一起作出饮食调整、锻炼和胰岛素的注射量,以更好地控制疾病。显然,这一信息必须能很快地被患者利用,这就要通过使用一种快捷、价廉和准确的方便使用的测量计和带来达到。
大家知道试剂带包含一种依生理液中糖浓度而变化成不同色调的指示剂。这些试剂带使用还原化学成份,最多见的是可氧化染料或偶联染料。还有一些试剂带包含一种酶,如葡萄糖氧化酶,它能够氧化葡萄糖成为葡萄糖酸和过氧化氢。它们还包含一种可氧化染料和具有氧化能力的物质,它可以在过氧化氢存在的情况下选择性地催化可氧化染料的氧化。
美国专利号4,935,346,1990年6月19日颁发给R。Phillips等人的,其中阐述了一种用于测定全血样品中糖浓度的测量计,带和方法(见美国专利5,304,468)。这一方法包括简单地将全血样品加入一个惰性的多孔基质的第一层“(样本)”,使其和试剂一起渗透。样本移动到相对的另一“测试”面,结果糖与试剂反应产生一种可吸收光的反应产物,从测试面反射的读数即指示糖的浓度。用两个分离的波长测定反射以减少干扰。穿过基质的样本湿润测试面引起反射下降的瞬间启动定时电路。
美国专利号5,306,623,于1994年4月29日颁发,Kiser等人阐述了一种可见的血糖测试带,包括加入含糖的全血样本于测试带的一侧,在红细胞被分离出来,样本与试带中的试剂反应后,于试剂带的相对一侧获得糖读数。试剂带中非均质的聚砜膜做为单层基质尤其有用。
美国专利号5,453,360,1995年9月26日颁发,Y.S.Yu等人阐述了一种偶联染料于固相试剂带中以测定生理液中的分析物,如糖。这种偶联染料由3-甲基-2-苯噻唑酮腙和8-苯胺-1-萘硫酸盐组成,做为产生强氧化剂,如过氧化氢的联锁反应中的指示剂。偶联的优点在于它在水溶液中是可溶的,但与氧化剂偶联后变成不溶,因此减少褪色而提供一个稳定的终产物。
在上述的美国专利号4,935,346和5,304,468中的测量带应用于One Touch II测量计中被广泛用在自我监测血糖。测量计和带使患者能够快捷、简便和准确地测定全血样本中的血糖。样本加于测试带的一个面,而于另一相对面得到测量值。全血样本的一部分穿透样本而到达测试面,从测试面可观察到血的颜色。
本发明提供一种用于一个仪器上的试剂测试带,以测定全血样本的糖浓度。该仪器包括一个光学装置,用于测定置于测试带一端的基质的至少一部分在浓长635nm和700nm处的光强度。该基质组成:
<a>一样本接受面用于接受全血样本,及其一部分穿过样本面到达相对一侧的测试面。
<b>一个选择性阻碍红细胞穿过基质,减少基质中细胞溶解的结构。因此测试面可见的样本的任何一部分在700nm处不会以任何程度吸收可见光。及
<c>一种引起测试面在700nm处反射变化相等于血中血红蛋白吸收引起的635nm处的反射变化的试剂,指示糖浓度。
在本说明书和从属权利要求书中,提到的“测试面可见的样本在700nm处不会吸收任何程度的光”意思是在700nm处通过测试面可见的样本的吸收值小于700nm处由样本和试剂反应所引起的吸收值的20%。
本发明的另一实施例提供一种用于一个仪器上的试剂测试带,以检测全血样本的糖浓度。该仪器包括一个光学部分,用于测定置于测试带一端的基质的至少一部分在波长700nm和635nm处的光强度。该基质组成:
<a>一样本接受面,用于接受全血样本,及其一部分穿过样本面到达相对一侧的样本测试面。测试面在700nm处的反射值,当测试面湿润时其变化等于血中血红蛋白吸收所产生的反射值。
<b>一个选择性阻碍红细胞穿过基质,减少基质中细胞溶解的结构。因此测试面可见的样本的任何一部分在700nm处都不会吸收任何程度的光。
<c>通过引起测试面在635nm处的反射变化的试剂指示糖浓度。
本发明提供的试剂测试带适合用于One Touch R的全血糖测量计上。因为带中有可选择性阻碍穿过基质的红细胞的通过,从而减少基质中细胞的溶解的结构,因此糖的测定较少地依赖全血样本中的血细胞比容。
图1是本发明的测试带的一个实施例的透视图。
本发明提供一种快捷并简单的方法,用一个可信的且方便操作的仪器来测定全血中糖量。该方法包括,少量全血样本作用于一惰性的多孔基质的表面(“样本”面),充分饱和基质。当加入血液后,将基质置于反射测量仪上。至少一部分液体样本穿过基质,引起相对一面(“测试”)面的反射初值的变化。样本中的糖与基质中的一种或多种试剂反应,形成产物改变基质的反射指数。联系测试面或基质的反射指数的变化与样本中糖浓度可在反射指数的初值变化后一次或多次测定读数。
图1表示本发明的一个实施例,一个薄的亲水基质试剂衬垫11由粘合剂13连于塑料容器12的一侧末端。粘合剂13可直接并牢固地将试剂衬垫粘接于容器上。容器给测试带提供任一形状或硬度。孔14位于有试剂衬垫的塑料容器12的位置,以使样本可通过加孔14加入试剂衬垫,而光在另一面即测试面反射。
待测全血样本加入衬垫11。一般的试剂衬垫的表面积为10~100mm2,最好是10~50mm2。这样一般提供5~10μl的样本就足以饱和。
另外的细节与上述的美国专利号4,935,346(′346)和5,304,468(′468)中的测试带的结构一样,这里一并叙述以供参考。
本发明的分析方法依靠吸收指数的变化,通过漫反射测得,反射依赖于待测样本的糖浓度。这些变化可通过一次或多次间歇地测定反射变化而取得。
在操作过程中,应用样本之前首先将测试带升到一个装置中通过反射来读取光吸收率,即色强度。然后将含糖的血样-例如通过针刺指端获得-加入到测试带的基质中。最好血样超过所需,以使要测反射率的区域的基质饱和(即:大约5~10μl)。加入样本后,当液体渗透入基质,时间测量即被自动启动,仪器检测出测试面的反射变化结果。在预制时间的反射变化,做为反应产物形成的结果,与样本中的糖浓度相关。在这里特别提到的反射及在从属权利要求书中提到的都在可见波长范围和红外光及紫外光照射。
一种适宜的仪器,如具有合适软件的漫反射光度计,可使其在一或较长间隔期自动读出反射数,计算反射变化,运用校正因子,输出血样中糖浓度。这种仪器的细节描述,包括使用仪器将测得的反射值转变成血糖浓度的方法见′346和′468。值得一提的是,市售的One Touch R计就很适合使用本发明的测试带来检验全血样本的血糖浓度。这些测量计在波长635nm和700nm附近读出带的测试面的反射值。
本发明的基质最好采用能有效地将红细胞和血红蛋白从全血中分离,而留下含糖的血浆的膜结构。这种分离发生在样本从样本面穿过膜到测试面的过程中。能执行这种分离的膜应该有孔,以捕获红细胞,一般的孔的大小在0.1μm到5μm。最好这种膜在孔的尺寸范围是各向异性的。当基质由一各向异性膜组成时,样本面最好是较大的孔。如,孔大小梯度从0.1μm到150μm穿过此膜。在大孔面,孔大小最好在30μm到40μm范围。在膜的最小孔洞面(即测试面),空隙的体积相对小,构成此处膜的物质一般较致密,这一层约可达膜厚度的20%。在这一层内,孔大小范围从0.1μm到0.8μm,满意的孔的大小最好在0.3μm。
当全血样加入样本面时,血样穿过膜时遇到越来越小的孔。甚至,固体如红细胞到达膜的位置,一般就靠近样本面再不能穿过。这个膜不仅陷住红细胞在近样本面,而且能减少细胞的溶解,于是在测试面可见的样本的任何部分在700nm处都不会吸收任何程度的光。样本的平衡,还包含未溶解的糖,穿过膜到达测试面。当它们穿过膜时,样本中的糖与试剂反应,引起可吸收光的染料在测试面附近形成,从而影响测试面的反射值。膜的各向异性特点和/或分离结构的使用(下面将讨论),允许通过膜时有相对快的流速,既使在分离固体时也一样。
此基质是亲水性多孔膜,其上共价或非共价结合试剂。基质允许水性介质流过。它还允许结合蛋白质成份通过而不会损减蛋白质的生物功能,如酶的酶活性。在蛋白质共价结合的问题上,基质有活性位点,用于共价结合或用已知工艺方法激活。基质的成份是可反射的,它有足够的厚度以允许光吸收染料在空隙或表面形成,从而影响从基质反射的光。基质可以是单一的成分或在基质上可提供一层所需结构和物理特性如亲水性的外衣。
聚砜和聚酰胺(尼龙)是合适的基质材料。其它有相同特性的聚合物也可使用。聚合物可通过引入其它功能基团提供电荷结构加以调整,以使膜的表面具有中性、阳性或阴性。
选用的制备形成基质的多孔材料的方法是使用聚合物不要有支撑芯。这样的基质,如Memtec,Inc.,Timonium,MD.使用的各向异性聚砜膜。这里使用的术语“基质”和“膜”可以互换。每一术语理解为不限于单层而可包括,如吸收层。一般常用少于500μm厚的基质,较好是115μm到155μm。最好是130~140μm,尤其是基质为尼龙或各向异性聚砜时。基质一般湿润时不会变形,保持其原有形状和尺寸,并有足够的湿润力以允许常规操作。
膜具有充满它的孔的测试试剂,其可与糖结合产生光吸收反应产物。可把膜浸入试剂成分的混合液中,使膜饱和的方法加入试剂。过量的试剂可用机械方法除去,如气刀,手术刀,玻璃棒。然后将膜干燥。试剂倾向于集中在小孔(测试面)一侧的膜。其它将试剂加于膜上的方法,此工艺的熟练人员很容易应用。
测试试剂由能将糖转化为过氧化氢的成分和检出过氧化氢的成分组成。试剂还可任意由分离固体,如红细胞,使其陷入基质,有效地从全血去除固体成分的物质构成。另外的成分在下面描述。
选用的将葡萄糖转变成过氧化氢的物质包括葡萄糖氧化酶,这种酶常从曲霉菌属或青霉菌中得到。葡萄糖氧化酶与葡萄糖和氧反应产生葡萄糖酸内酯及过氧化氢。最适的葡萄糖氧化酶浓度依指示剂***的组成而定;然而一般适宜的葡萄糖氧化酶浓度约500~10,000U/ml范围,最好是700~2000U/ml。一般来讲,较高浓度的葡萄糖氧化酶引起反应速度较快,而低浓度则反应速度较慢。合适的浓度可由常规试验中确定。
如此产生的过氧化氢与检测过氧化氢的化合物反应,此化合物包括一个过氧化物酶,它可选择性催化过氧化氢和指示剂之间的反应。过氧化物酶以过氧化氢为氧化剂,它能够从各种底物上移走氧原子。合适的过氧化物酶可包含高铁原卟啉,从植物中获取的血红素。从动物,如从动物胸腺获取的过氧化酶同样适合。辣根过氧化物酶(HRPO)尤其适合做为探测过氧化氢的化合物成分。过氧化氢,最好以过氧化物酶做为催化剂,通过直接或间接的反应,形成指示剂染料,减少测试面在635nm处的反射值、测试面的反射值在635nm和700nm两个浓度处测量。
反射值测量在一个定时序列中进行。此序列由样本的一部分到达测试面引起在635mm处反射值下降而启动。我们将这种时间启动称做“反射开关”。700nm处的反射值测量在15秒钟后。在这一时间,血液将饱和试剂衬垫,样本中的糖与膜中的试剂相互作用引起在700nm处的反射值下降,基本上与测试面可见的血色引起的反射值下降相等。因此,尽管测试面可见的任何样本在700nm处都不会吸收任何程度的光,仪器测量出的700nm处的反射下降与血色吸收值有关,这引起之后在635nm处的反射测量。用700nm处的反射值计算出校正因子,从635nm计算出血样中的糖浓度。注意,因为在635nm处血吸收光,因此在700nm处也有模拟的吸收。理想的,血模拟材料必须在700nm处有相同于全血在635nm处的吸收率,但为简便起见,我们仅看700nm处血模拟材料的吸收率。计算的细节,包括700nm处血反射值的校正,见前面提到的′346中所述。
模拟血色在700nm处测试面的值下降可被四种方式所影响。第一,膜可以包含一种成分吸收700nm处的辐射,测试面应该不透明的,但湿润时变成较透明地透过700nm处的光。700nm处的吸收成分可以是非织物,例如,在干的测试面看不见。这种成分也可以是膜附着的支持结构,在膜一类的样本表面再涂一层外衣。
第二,膜可以含有一种水溶性染料,它在700nm处光吸收率随着染料在水中的溶解而加大。例如,这种染料可以是最初易分解的水溶性结晶,呈白色粉末加于膜上,在700nm处无吸收值。水样溶解染料后,它变成有色的,在700nm处有吸收。这种染料的一个例子是铜酞花青。
第三,糖与膜上的试剂反应可产生在635nm和700nm处吸收光的发色团,从而指示糖浓度,同时模拟血液的存在。
最后,血-试剂反应可产生两种发色团,之一在635nm处吸收光另一在700nm处吸收光。另外,因为需要足够的700nm反射值下降来模拟血色的存在,最好有少量的发色团在700nm处存在吸收光。在前两种情况,700nm的吸收值(即下降的反射值)由另一种膜成份产生,700nm处的吸收不需要发色团。
在第三和第四种情况,700nm处的反射值下降由发色团所影响。第三种情况需要糖-试剂反应产生发色团,其在700nm处的吸收率模拟全血,其在635nm处的吸收率测出全血中糖浓度。特殊情况下,635nm处反射值大幅度下降,其调整方式见′346,在时间序列启动后的适宜时间,测定全血样中的糖浓度。做为指示剂的合适的偶联染料包括4-氨安替比林(AAP)和亲色酸;8-苯胺-1-磺酸萘酚(ANS);AAP和N-乙烯-N-(2-羟-3-硫丙基)-m-甲苯胺(TOOS);3-甲基-2-苯噻唑酮腙盐酸盐(MBTH)和ANS;甲醛吖嗪。
最后一种情况包括分离发色团,其一指示635nm处吸收率反应的糖浓度,以测定血样中的糖浓度,其二模拟血(与700nm处全血吸收率适配)。适宜的指示糖浓度的染料指示剂是MBTH结合3-二甲基苯酸(DMAB)。
血-模拟染料可以多种方式产生。第一,可用氧化还原反应产生,类似于指示糖浓度的635nm处的吸收率。这种染料如MBTH结合二磷酸氨喹(PDP),AAP结合PDP,及等等此类结合。第二,血-模拟染料可通过pH值变化而产生。血的高pH值意味着血穿过基质时试剂的pH值从4.2升到7或更大。形成血模拟颜色的染料相应于pH值而改变,包括茜素红S(一种阴离子蒽醌染料)和酚红(酚磺酞)。第三,可通过与血液成分的自然反应(而不是糖)而产生染料。例如,金属色基染料可在血液中存在金属离子时形成色团。如酚酞复合体在血中有Ca′存在时会产生血-模拟色。常规试验可产生适当的染料或染料复合体,模拟700nm处全血的吸收率。
尽管各向异性膜最好是能够滤出红细胞,使它们不达到测试面,选用的测试试剂应包含分离成份。(见前述的美国专利号5,306,623,Kiser等人)分离成份具有从含红细胞的液体即全血中,分离红细胞在基质中,最好也分离任何小量的游离血红蛋白,而产生相对清亮无色的液体。在本发明中使用的分离成份包括,聚乙烯糖,聚(甲乙基醚/马来酸)酐,聚丙烯糖,聚苯乙烯磺酸,聚聚丙烯酸,聚乙基醇,和聚乙基磺酸,pH值约为4.0-8.0。在基质中的分离成分的量根据它们的电荷和分子量、基质中含的其它成分,基质的pH值和孔大小,及基质干燥后剩余的湿润物而变。这些参数对于本专业的熟练人员很易掌握。例如,当用聚丙烯糖做为分离成分(即,BSAFWyandotte,MI中的PPG-410),合适的重量/体积(W/U)是2-30%,最好是8~10%W/V。其它的分离剂的浓度也可在2~30%W/V。其它的聚合物分离成分渗入或埋于基质,或在生产中熔注在膜中。
一些水溶性盐也可影响血液分离。盐中适宜的分离血液成分是醋酸盐、甲酸盐、和硫酸盐,还有一些酸如氨基酸、醋酸、肌醇六磷酸、马来酸。(见美国专利号3,552,928,颁发于1971年1月5日、M.C.Fetter)。分离成分最好也存在于测试面,因为可增加膜的效应,保证没有相当量的红细胞穿过。从而保证测试面可见的样本不会在700nm处吸收任何程度的光。
其它成分也可加入基质,以增强测试带的色彩和读数,保证基质的一致性和完整性。例如,测试剂可包含盐和/或缓冲剂,以帮助基质中染料的分离。这样的缓冲剂可包括,如醋酸盐,以溶解状态,浓度从0.01M到1.0M,最好是,0.1M。也可使用其它缓冲剂。
其它使基质具亲水性或做为稳定剂的,如水解蛋白可以使用。这些成份包括但不限于如牛血清白蛋白、多肽和如Crotein SPA(CRODA,Inc.纽约,N.Y)所用的低分子量蛋白质。这些成分所用的浓度如从1mg/ml到100mg/ml。在Crotein,最好用30mg/ml。
其它稳定剂和保存剂也可包含于基质的外层中。如乙烯二胺四乙酸盐(EDTA),二乙烯三胺泛乙酸盐(DTPA)和相关成分都可用。浓度约为0.01mg/ml到10mg/l。
本文提出的各种变异的细节可以在没有离开本发明的范围和精神的范围内作出。
Claims (13)
1、一种试剂测试带,用在测试仪中测定全血样本中血溏的浓度,该测试仪包括一个光学装置,用于探测位于试剂带一侧末端的基质的至少一部分在635nm和700nm波长处的光强度。基质的组成包括:
a)样本接受面以用于接受全血样本,并有一部分穿过到达相对的测试
面。
b)一种能选择性地阻碍红细胞穿过基质并减少基质中细胞溶解的结构,
因此在测试面任何可见的部分在700nm处都不会吸收任何程度的
光,且
c)一种试剂通过引起测试面在700nm处的反射值变化,其等于血中
血红蛋白的吸收率和635nm处反射值变化,来指示血糖浓度。
2、如权利要求1的试剂带,其特征是,它的基质由一个能隔挡住全血样中红细胞的多孔膜构成。
3、如权利要求1的试剂带,其特征是,它的基质由一个各向异性膜构成。
4、如权利要求3的试剂带,其特征是,其中的膜在样本面有较大的孔,在测试面有较小的孔。
5、如权利要求1的试剂带,其特征是,其中的基质由聚砜膜构成。
6、如权利要求1的试剂带,其特征是,试剂由染料的前身物组成,它可以形成发色团指示血糖浓度,发色团可在635nm和700nm处吸收一定程度的光。
7、如权利要求6的试剂带,其特征是,染料前身从4-氨安替比林(AAP)和亲色酸;AAP和8-苯胺-1-磺酸萘酚(ANS)的组合偶联染料中选出。
8、如权利要求6的试剂带,其特征是,染料前身从3-甲基2-苯噻唑腙胺盐酸盐(MBTH)和ANS;MBTH结合它的甲醋吖嗪等组合中选出。
9、如权利要求1的试剂带,其特征是,试剂有第一染料前身,它形成的发色团在635nm处的吸收率代表血糖浓度,第二染料前身形成的发色团在700nm处的吸收率模拟全血的吸收率。
10、如权利要求9的试剂带,其特征是,第一试剂前身由MBTH和3-二甲基苯酸(DMAB)结合而成。
11、如权利要求9的试剂带,其特征是,试剂带的第二染料前身从MBTH和二磷酸氨喹(PDP);AAP和PDP组成的偶联染料组中选出。
12、如权利要求9的试剂带,其特征是,试剂带的第二染料前身从茜素红S、酚红等结合物中选出。
13、如权利要求9的试剂带,其特征是,试剂带的第二染料前身是酚酞复合物。
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