CN116941528A - 钩藤离体保存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种钩藤离体保存方法，属于钩藤组培技术领域，包括：钩藤种子经无菌发芽培养得到种子苗；种子苗经扩繁培养得到扩繁苗；扩繁苗置于含有0.01～0.1mg/L脯氨酸的壮苗培养基中进行壮苗培养，并在壮苗培养后期设置15～21℃低温培养期；将经过壮苗培养的组培苗置于离体培养基中进行离体培养，离体培养基含有1/2MS+6‑BA0.02mg/L+PPP3331.0～2.0mg/L+活性炭0.5g/L+脯氨酸0.01～0.1mg/L，培养温度为15～21℃，光照强度为1200Lx，光照时长为10小时/天。本发明延长了钩藤离体保存期，并显著提高了200天以上离体保存存活率。
Description
技术领域
本发明涉及植物组培技术领域，具体的说是钩藤组培技术领域，更具体地说，本发明涉及一种钩藤离体保存方法。
背景技术
钩藤[Uncaria rhynchopylla(Miq.)Jacks]为茜草科钩藤，属木质藤本植物，别称耿马钩藤、双钩藤、双钩、无柄果钩藤，产于广东、广西、云南、贵州、福建、湖南等地，常生于山谷溪边的疏林或灌丛中，为我国的著名中药。钩藤的功能为清血平肝、息风定惊等，可用于风热头痛、感冒夹惊、惊痛抽搐等症，所含钩藤碱有降血压作用，是一种较好的药材，其根也可入药。在进行钩藤种苗的生产过程中，最快速有效的一条繁殖途径为组织培养。通过组织培养技术可获得大量种苗，同时优良种质也能得到长期保存，而在钩藤组培苗长期保存过程中，现有技术中采用常规MS培养基进行钩藤离体保存时间较短，经常需要转接，短时间内就需要配制培养基进行继代才得以继续保存，因此不利于钩藤种质资源的长期离体保存。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种钩藤离体保存方法，其在壮苗培养阶段的培养基中添加脯氨酸并引入低温刺激，然后选择生长正常的芽苗置于低温、弱光的环境及含有多效唑和脯氨酸的培养基中离体保存，延长离体保存期，提高存活率。
为了实现本发明的这些目的和其它优点，本发明提供的钩藤离体保存方法，包括：钩藤种子经发芽培养得到无菌种子苗；种子苗经扩繁培养得到扩繁苗；扩繁苗置于含有0.01～0.1mg/L脯氨酸的壮苗培养基中进行壮苗培养，并在壮苗培养后期设置15～21℃低温培养期；
将经过壮苗培养的组培苗置于离体培养基中进行离体培养，离体培养基含有1/2MS+6-BA0.02mg/L+PPP3331.0～2.0mg/L+活性炭0.5g/L+脯氨酸0.01～0.1mg/L，培养温度为15～21℃，光照强度为1200Lx，光照时长为10小时/天。
优选的是，所述的钩藤离体保存方法中，所述低温培养期的培养温度为17℃，光照强度1200～1800Lx，光照时长为10～12小时/天，持续时间为6～8天。
优选的是，所述的钩藤离体保存方法中，壮苗培养的前期为正常培养，正常培养的培养温度为24～26℃，光照强度1800Lx，光照时长为10～12小时/天；正常培养后为7天的低温培养期，低温培养期的培养温度为17℃，光照强度1200～1800Lx，光照时长为10～12小时/天。
优选的是，所述的钩藤离体保存方法中，低温培养期的培养温度为17℃，光照强度1800Lx，光照时长为12小时/天。
优选的是，所述的钩藤离体保存方法中，所述壮苗培养基含有MS+IBA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+活性炭1g/L+脯氨酸0.05mg/L。
优选的是，所述的钩藤离体保存方法中，所述离体培养基的1/2MS+6-BA 0.02mg/L+PPP3331.5mg/L+活性炭0.5g/L+脯氨酸0.05mg/L，培养温度为17℃，光照强度为1200Lx，光照时长为10小时/天。
优选的是，所述的钩藤离体保存方法中，包括以下步骤：
S1:取无损伤、籽粒饱满、质地均匀、不携带病虫卵的钩藤种子；
S2：取S1的种子，经无菌水冲洗3-5次后，放入75％的酒精消毒30秒，接着无菌水冲洗3-5次，再放入0.1％的升汞溶液中灭菌7分钟，然后用无菌水冲洗3-5次，最后接种入不含任何激素的MS培养基中，进行发芽培养得到无菌种子苗，培养时间为14天左右，培养温度为24℃，光照强度为1800Lx，光照时长为10小时/天；
S3：取S2中的种子苗，接种到含MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.20mg/L的培养基中进行扩繁培养，培养温度为24℃，光照强度为1800Lx，光照时长为12小时/天；
S4：取S3中扩繁芽，接种到MS+IBA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+活性炭1g/L+脯氨酸0.01～0.1mg/L的壮苗培养基中进行壮苗培养；其中壮苗培养前期的培养温度为24～26℃，光照强度为1800Lx，光照时长为12小时/天；在壮苗培养的最后6～8天，培养温度为15～21℃，光照强度为1200～1800Lx，光照时长为12小时/天；
S5：取S4的正常组培苗，接种到1/2MS+6-BA0.02mg/L+PPP3331.0～2.0mg/L+活性炭0.5g/L+脯氨酸0.01～0.1mg/L的离体保存培养基中，进行离体保存培养，培养温度为15～21℃，光照强度为1200Lx，光照时长为10小时/天。
本发明至少包括以下有益效果：
1、本发明在壮苗培养基中添加了脯氨酸对扩繁芽进行壮苗培养，使得扩繁芽中积累脯氨酸，在壮苗培养期的后半段引入低温刺激时，积累的脯氨酸提高扩繁苗的抗性而顺利过渡，并因低温刺激而激活组培苗抵抗机制产生更强抗逆性，提高后续低温弱光条件下离体保存培养的保存期以及存活率。
2、本发明的离体培养中低温弱光的培养条件可以减缓组培苗的生长速度，同时添加多效唑和脯氨酸提高组培苗对低温弱光的抗性，在延长组培苗保存时间的同时，提高离体保存的存活率。
3、本发明的方法的实施例中，在壮苗培养基中添加脯氨酸0.05mg/L，并在壮苗培养后7天设置培养温度17℃进行低温刺激，结果发现壮苗培养存活率达100％，与正常条件下的壮苗培养存活率相同，相比不添加脯氨酸的低温刺激对比例，可以有效提高壮苗培养存活率。在一个实施例中，经低温刺激后，再置于PPP3331.5mg/L+脯氨酸0.05mg/L+培养温度17℃的离体保存培养基中进行培养，最终离体保存200天存活率高达95.0％，400天离体保存存活率达47.5％。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明实施例2的组培苗在200天时的生长状况图片；
图2为本发明实施例2的组培苗在400天时的生长状况图片。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
实施例1
本发明的一种钩藤离体保存方法，包括以下步骤：
(1)取优良钩藤种质资源的种子，从中挑出无损伤、籽粒饱满、质地均匀、不携带病虫卵的种子备用。
(2)取(1)的种子，经无菌水冲洗3-5次后，放入75％的酒精消毒30秒，接着无菌水冲洗3-5次，再放入0.1％的升汞溶液中灭菌7分钟，然后用无菌水冲洗3-5次，最后接种入不含任何激素的MS培养基中，进行发芽培养，培养时间为14天左右，培养温度为24℃，光照强度为1800Lx，光照时长为10小时/天。
(3)取(2)中萌发出来的无菌种子苗，接种到MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.20mg/L的培养基中进行扩繁培养，培养温度为24℃，培养时间为14天左右，光照强度为1800Lx，光照时长为12小时/天；温度适宜，光照充足，使得种子苗正常生长。
(4)取(3)中得到的扩繁芽，接种到MS+IBA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+活性炭1g/L+脯氨酸0.01mg/L的培养基中进行壮苗培养，培养时间为14天左右；其中前7天左右的培养温度为24℃，光照强度为1800Lx，光照时长为12小时/天；后7天，培养温度为17℃，光照强度为1800Lx，光照时长为12小时/天；扩繁苗先用脯氨酸进行培养，脯氨酸提前在扩繁苗中积累，提高抗性以应对低温刺激培养而顺利过渡，再经低温且光照充足的培养后，扩繁苗产生更加强大的抗性机制，提高在后续低温弱光条件下离体保存的存活率。
(5)立即取(4)中经过壮苗培养的正常组培苗，接种到1/2MS+6-BA0.02mg/L+PPP3331.5mg/L+活性炭0.5g/L+脯氨酸0.05mg/L的离体保存培养基中，进行离体保存培养，培养温度为17℃，光照强度为1200Lx，光照时长为10小时/天。壮苗培养完成到接种至离体保存培养基，时间间隔越短越好，间隔时间不宜超过1天，下同。
各步骤的培养基中均含有蔗糖25g/L，pH＝5.8。
实施例2
本发明的一种钩藤离体保存方法，包括以下步骤：
(1)取优良钩藤种质资源的，从中挑出无损伤、籽粒饱满、质地均匀、不携带病虫卵的种子备用；
(2)取(1)的种子，经无菌水冲洗3-5次后，放入75％的酒精消毒30秒，接着无菌水冲洗3-5次，再放入0.1％的升汞溶液中灭菌7分钟，然后用无菌水冲洗3-5次，最后接种入不含任何激素的MS培养基中，进行发芽培养，培养时间为14天左右，培养温度为24℃，光照强度为1800Lx，光照时长为10小时/天；
(3)取(2)中萌发出来的无菌种子苗，接种到MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.20mg/L的培养基中进行扩繁培养，培养温度为24℃，培养时间为14天左右，光照强度为1800Lx，光照时长为12小时/天；温度适宜，光照充足，使得种子苗正常生长。
(4)取(3)中得到的扩繁芽，接种到MS+IBA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+活性炭1g/L+脯氨酸0.05mg/L的培养基中进行壮苗培养，培养时间为14天左右；其中前7天左右的培养温度为24℃，光照强度为1800Lx，光照时长为12小时/天；后7天，培养温度为17℃，光照强度为1800Lx，光照时长为12小时/天；扩繁苗先用脯氨酸进行培养，脯氨酸提前在扩繁苗中积累，提高抗性以应对低温刺激培养而顺利过渡，再经低温且光照充足的培养后，扩繁苗产生更加强大的抗性机制，提高在后续低温弱光条件下离体保存的存活率。
(5)取(4)中经过壮苗培养的正常组培苗，接种到1/2MS+6-BA0.02mg/L+PPP3331.5mg/L+活性炭0.5g/L+脯氨酸0.05mg/L的离体保存培养基中，进行离体保存培养，培养温度为17℃，光照强度为1200Lx，光照时长为10小时/天。
各步骤的培养基中均含有蔗糖25g/L，pH＝5.8。
实施例3
本发明的一种钩藤离体保存方法，包括以下步骤：
(1)取优良钩藤种质资源的，从中挑出无损伤、籽粒饱满、质地均匀、不携带病虫卵的种子备用；
(2)取(1)的种子，经无菌水冲洗3-5次后，放入75％的酒精消毒30秒，接着无菌水冲洗3-5次，再放入0.1％的升汞溶液中灭菌7分钟，然后用无菌水冲洗3-5次，最后接种入不含任何激素的MS培养基中，进行发芽培养，培养时间为14天左右，培养温度为24℃，光照强度为1800Lx，光照时长为10小时/天；
(3)取(2)中萌发出来的无菌种子苗，接种到MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.20mg/L的培养基中进行扩繁培养，培养温度为24℃，培养时间为14天左右，光照强度为1800Lx，光照时长为12小时/天；温度适宜，光照充足，使得种子苗正常生长。
(4)取(3)中得到的扩繁芽，接种到MS+IBA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+活性炭1g/L+脯氨酸0.1mg/L的培养基中进行壮苗培养，培养时间为14天左右；其中前7天的培养温度为24℃，光照强度为1800Lx，光照时长为12小时/天；后7天，培养温度为17℃，光照强度为1800Lx，光照时长为12小时/天；扩繁苗先用脯氨酸进行培养，脯氨酸提前在扩繁苗中积累，提高抗性以应对低温刺激培养而顺利过渡，再经低温且光照充足的培养后，扩繁苗产生更加强大的抗性机制，提高在后续低温弱光条件下离体保存的存活率。
(5)立即取(4)中经过壮苗培养的正常组培苗，接种到1/2MS+6-BA0.02mg/L+PPP3331.5mg/L+活性炭0.5g/L+脯氨酸0.05mg/L的离体保存培养基中，进行离体保存培养，培养温度为17℃，光照强度为1200Lx，光照时长为10小时/天。
各步骤的培养基中均含有蔗糖25g/L，pH＝5.8。
实施例4
本发明的一种钩藤离体保存方法，包括以下步骤：
(1)取优良钩藤种质资源的，从中挑出无损伤、籽粒饱满、质地均匀、不携带病虫卵的种子备用；
(2)取(1)的种子，经无菌水冲洗3-5次后，放入75％的酒精消毒30秒，接着无菌水冲洗3-5次，再放入0.1％的升汞溶液中灭菌7分钟，然后用无菌水冲洗3-5次，最后接种入不含任何激素的MS培养基中，进行发芽培养，培养时间为14天左右，培养温度为24℃，光照强度为1800LX，光照时长为10小时/天；
(3)取(2)中萌发出来的无菌种子苗，接种到MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.20mg/L的培养基中进行扩繁培养，培养温度为24℃，培养时间为14天左右，光照强度为1800LX，光照时长为12小时/天；温度适宜，光照充足，使得种子苗正常生长。
(4)取(3)中得到的扩繁芽，接种到MS+IBA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+活性炭1g/L+脯氨酸0.05mg/L的培养基中进行壮苗培养，培养时间为14天左右；其中前7天的培养温度为24℃，光照强度为1800Lx，光照时长为12小时/天；后7天，培养温度为17℃，光照强度为1800Lx，光照时长为12小时/天；扩繁苗先用脯氨酸进行培养，脯氨酸提前在扩繁苗中积累，提高抗性以应对低温刺激培养而顺利过渡，再经低温且光照充足的培养后，扩繁苗产生更加强大的抗性机制，提高在后续低温弱光条件下离体保存的存活率。
(5)立即取(4)中经过壮苗培养的正常组培苗，接种到1/2MS+6-BA0.02mg/L+PPP3331.5mg/L+活性炭0.5g/L+脯氨酸0.01mg/L的离体保存培养基中，进行离体保存培养，培养温度为17℃，光照强度为1200Lx，光照时长为10小时/天。
各步骤的培养基中均含有蔗糖25g/L，pH＝5.8。
实施例5
本发明的一种钩藤离体保存方法，包括以下步骤：
(1)取优良钩藤种质资源的，从中挑出无损伤、籽粒饱满、质地均匀、不携带病虫卵的种子备用；
(2)取(1)的种子，经无菌水冲洗3-5次后，放入75％的酒精消毒30秒，接着无菌水冲洗3-5次，再放入0.1％的升汞溶液中灭菌7分钟，然后用无菌水冲洗3-5次，最后接种入不含任何激素的MS培养基中，进行发芽培养，培养时间为14天左右，培养温度为24℃，光照强度为1800LX，光照时长为10小时/天；
(3)取(2)中萌发出来的无菌种子苗，接种到MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.20mg/L的培养基中进行扩繁培养，培养温度为24℃，培养时间为14天左右，光照强度为1800Lx，光照时长为12小时/天；温度适宜，光照充足，使得种子苗正常生长。
(4)取(3)中得到的扩繁芽，接种到MS+IBA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+活性炭1g/L+脯氨酸0.05mg/L的培养基中进行壮苗培养，培养时间为14天左右；其中前7天的培养温度为24℃，光照强度为1800Lx，光照时长为12小时/天；后7天，培养温度为17℃，光照强度为1800Lx，光照时长为12小时/天；扩繁苗先用脯氨酸进行培养，脯氨酸提前在扩繁苗中积累，提高抗性以应对低温刺激培养而顺利过渡，再经低温且光照充足的培养后，扩繁苗产生更加强大的抗性机制，提高在后续低温弱光条件下离体保存的存活率。
(5)立即取(4)中经过壮苗培养的正常组培苗，接种到1/2MS+6-BA0.02mg/L+PPP3331.5mg/L+活性炭0.5g/L+脯氨酸0.1mg/L的离体保存培养基中，进行离体保存培养，培养温度为17℃，光照强度为1200Lx，光照时长为10小时/天。
各步骤的培养基中均含有蔗糖25g/L，pH＝5.8。
实施例6
本发明的一种钩藤离体保存方法，包括以下步骤：
(1)取优良钩藤种质资源的，从中挑出无损伤、籽粒饱满、质地均匀、不携带病虫卵的种子备用；
(2)取(1)的种子，经无菌水冲洗3-5次后，放入75％的酒精消毒30秒，接着无菌水冲洗3-5次，再放入0.1％的升汞溶液中灭菌7分钟，然后用无菌水冲洗3-5次，最后接种入不含任何激素的MS培养基中，进行发芽培养，培养时间为14天左右，培养温度为24℃，光照强度为1800LX，光照时长为10小时/天；
(3)取(2)中萌发出来的无菌种子苗，接种到MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.20mg/L的培养基中进行扩繁培养，培养温度为24℃，培养时间为14天左右，光照强度为1800LX，光照时长为12小时/天；温度适宜，光照充足，使得种子苗正常生长。
(4)取(3)中得到的扩繁芽，接种到MS+IBA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+活性炭1g/L+脯氨酸0.05mg/L的培养基中进行壮苗培养，培养时间为14天左右；其中前7天的培养温度为24℃，光照强度为1800Lx，光照时长为12小时/天；后7天，培养温度为17℃，光照强度为1800Lx，光照时长为12小时/天；扩繁苗先用脯氨酸进行培养，脯氨酸提前在扩繁苗中积累，提高抗性以应对低温刺激培养而顺利过渡，再经低温且光照充足的培养后，扩繁苗产生更加强大的抗性机制，提高在后续低温弱光条件下离体保存的存活率。
(5)立即取(4)中经过壮苗培养的正常组培苗，接种到1/2MS+6-BA0.02mg/L+PPP3331.0mg/L+活性炭0.5g/L+脯氨酸0.05mg/L的离体保存培养基中，进行离体保存培养，培养温度为17℃，光照强度为1200Lx，光照时长为10小时/天。
各步骤的培养基中均含有蔗糖25g/L，pH＝5.8。
实施例7
本发明的一种钩藤离体保存方法，包括以下步骤：
(1)取优良钩藤种质资源的，从中挑出无损伤、籽粒饱满、质地均匀、不携带病虫卵的种子备用；
(2)取(1)的种子，经无菌水冲洗3-5次后，放入75％的酒精消毒30秒，接着无菌水冲洗3-5次，再放入0.1％的升汞溶液中灭菌7分钟，然后用无菌水冲洗3-5次，最后接种入不含任何激素的MS培养基中，进行发芽培养，培养时间为14天左右，培养温度为24℃，光照强度为1800Lx，光照时长为10小时/天；
(3)取(2)中萌发出来的无菌种子苗，接种到MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.20mg/L的培养基中进行扩繁培养，培养温度为24℃，培养时间为14天左右，光照强度为1800Lx，光照时长为12小时/天；温度适宜，光照充足，使得种子苗正常生长。
(4)取(3)中得到的扩繁芽，接种到MS+IBA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+活性炭1g/L+脯氨酸0.05mg/L的培养基中进行壮苗培养，培养时间为14天左右；其中前7天的培养温度为24℃，光照强度为1800Lx，光照时长为12小时/天；后7天，培养温度为17℃，光照强度为1800Lx，光照时长为12小时/天；扩繁苗先用脯氨酸进行培养，脯氨酸提前在扩繁苗中积累，提高抗性以应对低温刺激培养而顺利过渡，再经低温且光照充足的培养后，扩繁苗产生更加强大的抗性机制，提高在后续低温弱光条件下离体保存的存活率。
(5)立即取(4)中经过壮苗培养的正常组培苗，接种到1/2MS+6-BA0.02mg/L+PPP3332.0mg/L+活性炭0.5g/L+脯氨酸0.05mg/L的离体保存培养基中，进行离体保存培养，培养温度为17℃，光照强度为1200Lx，光照时长为10小时/天。
各步骤的培养基中均含有蔗糖25g/L，pH＝5.8。
实施例8
本发明的一种钩藤离体保存方法，包括以下步骤：
(1)取优良钩藤种质资源的，从中挑出无损伤、籽粒饱满、质地均匀、不携带病虫卵的种子备用；
(2)取(1)的种子，经无菌水冲洗3-5次后，放入75％的酒精消毒30秒，接着无菌水冲洗3-5次，再放入0.1％的升汞溶液中灭菌7分钟，然后用无菌水冲洗3-5次，最后接种入不含任何激素的MS培养基中，进行发芽培养，培养时间为14天左右，培养温度为24℃，光照强度为1800Lx，光照时长为10小时/天；
(3)取(2)中萌发出来的无菌种子苗，接种到MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.20mg/L的培养基中进行扩繁培养，培养温度为24℃，培养时间为14天左右，光照强度为1800Lx，光照时长为12小时/天；温度适宜，光照充足，使得种子苗正常生长。
(4)取(3)中得到的扩繁芽，接种到MS+IBA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+活性炭1g/L+脯氨酸0.05mg/L的培养基中进行壮苗培养，培养时间为14天左右；其中前7天的培养温度为24℃，光照强度为1800Lx，光照时长为12小时/天；后7天，培养温度为17℃，光照强度为1800Lx，光照时长为12小时/天；扩繁苗先用脯氨酸进行培养，脯氨酸提前在扩繁苗中积累，提高抗性以应对低温刺激培养而顺利过渡，再经低温且光照充足的培养后，扩繁苗产生更加强大的抗性机制，提高在后续低温弱光条件下离体保存的存活率。
(5)立即取(4)中经过壮苗培养的正常组培苗，接种到1/2MS+6-BA0.02mg/L+PPP3331.5mg/L+活性炭0.5g/L+脯氨酸0.05mg/L的离体保存培养基中，进行离体保存培养，培养温度为15℃，光照强度为1200Lx，光照时长为10小时/天。
各步骤的培养基中均含有蔗糖25g/L，pH＝5.8。
实施例9
本发明的一种钩藤离体保存方法，包括以下步骤：
(1)取优良钩藤种质资源的，从中挑出无损伤、籽粒饱满、质地均匀、不携带病虫卵的种子备用；
(2)取(1)的种子，经无菌水冲洗3-5次后，放入75％的酒精消毒30秒，接着无菌水冲洗3-5次，再放入0.1％的升汞溶液中灭菌7分钟，然后用无菌水冲洗3-5次，最后接种入不含任何激素的MS培养基中，进行发芽培养，培养时间为14天左右，培养温度为24℃，光照强度为1800Lx，光照时长为10小时/天；
(3)取(2)中萌发出来的无菌种子苗，接种到MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.20mg/L的培养基中进行扩繁培养，培养温度为24℃，培养时间为14天左右，光照强度为1800Lx，光照时长为12小时/天；温度适宜，光照充足，使得种子苗正常生长。
(4)取(3)中得到的扩繁芽，接种到MS+IBA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+活性炭1g/L+脯氨酸0.05mg/L的培养基中进行壮苗培养，培养时间为14天左右；其中前7天的培养温度为24℃，光照强度为1800Lx，光照时长为12小时/天；后7天，培养温度为17℃，光照强度为1800Lx，光照时长为12小时/天；扩繁苗先用脯氨酸进行培养，脯氨酸提前在扩繁苗中积累，提高抗性以应对低温刺激培养而顺利过渡，再经低温且光照充足的培养后，扩繁苗产生更加强大的抗性机制，提高在后续低温弱光条件下离体保存的存活率。
(5)立即取(4)中经过壮苗培养的正常组培苗，接种到1/2MS+6-BA0.02mg/L+PPP3331.5mg/L+活性炭0.5g/L+脯氨酸0.05mg/L的离体保存培养基中，进行离体保存培养，培养温度为21℃，光照强度为1200Lx，光照时长为10小时/天。
各步骤的培养基中均含有蔗糖25g/L，pH＝5.8。
实施例10
本发明的一种钩藤离体保存方法，包括以下步骤：
(1)取优良钩藤种质资源的，从中挑出无损伤、籽粒饱满、质地均匀、不携带病虫卵的种子备用；
(2)取(1)的种子，经无菌水冲洗3-5次后，放入75％的酒精消毒30秒，接着无菌水冲洗3-5次，再放入0.1％的升汞溶液中灭菌7分钟，然后用无菌水冲洗3-5次，最后接种入不含任何激素的MS培养基中，进行发芽培养，培养时间为14天左右，培养温度为24℃，光照强度为1800LX，光照时长为10小时/天；
(3)取(2)中萌发出来的无菌种子苗，接种到MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.20mg/L的培养基中进行扩繁培养，培养温度为24℃，培养时间为14天左右，光照强度为1800Lx，光照时长为12小时/天；温度适宜，光照充足，使得种子苗正常生长。
(4)取(3)中得到的扩繁芽，接种到MS+IBA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+活性炭1g/L+脯氨酸0.05mg/L的培养基中进行壮苗培养，培养时间为14天左右；其中前7天的培养温度为24℃，光照强度为1800Lx，光照时长为12小时/天；后7天，培养温度为17℃，光照强度为1200Lx，光照时长为10小时/天；扩繁苗先用脯氨酸进行培养，脯氨酸提前在扩繁苗中积累，提高抗性以应对低温刺激培养而顺利过渡，再经低温且光照充足的培养后，扩繁苗产生更加强大的抗性机制，提高在后续低温弱光条件下离体保存的存活率。
(5)立即取(4)中经过壮苗培养的正常组培苗，接种到1/2MS+6-BA0.02mg/L+PPP3331.5mg/L+活性炭0.5g/L+脯氨酸0.05mg/L的离体保存培养基中，进行离体保存培养，培养温度为17℃，光照强度为1200Lx，光照时长为10小时/天。
各步骤的培养基中均含有蔗糖25g/L，pH＝5.8。
对比例1
一种钩藤离体保存方法，包括以下步骤：
(1)取优良钩藤种质资源的，从中挑出无损伤、籽粒饱满、质地均匀、不携带病虫卵的种子备用。
(2)取(1)的种子，经无菌水冲洗3-5次后，放入75％的酒精消毒30秒，接着无菌水冲洗3-5次，再放入0.1％的升汞溶液中灭菌7分钟，然后用无菌水冲洗3-5次，最后接种入不含任何激素的MS培养基中，进行发芽培养，培养时间为14天左右，培养温度为24℃，光照强度为1800Lx，光照时长为10小时/天。
(3)取(2)中萌发出来的无菌种子苗，接种到MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.20mg/L的培养基中进行扩繁培养，培养温度为24℃，培养时间为14天左右，光照强度为1800Lx，光照时长为12小时/天；温度适宜，光照充足，使得种子苗正常生长。
(4)取(3)中得到的扩繁芽，接种到MS+IBA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+活性炭1g/L的培养基中进行壮苗培养，培养时间为14天左右；培养温度为24℃，光照强度为1800Lx，光照时长为12小时/天。
(5)立即取(4)中经过壮苗培养的组培苗，接种到1/2MS+6-BA0.02mg/L+PPP3331.5mg/L+活性炭0.5g/L+脯氨酸0.05mg/L的离体保存培养基中，进行离体保存培养，培养温度为17℃，光照强度为1200Lx，光照时长为10小时/天。各步骤的培养基中均含有蔗糖25g/L，pH＝5.8。
对比例2
一种钩藤离体保存方法，包括以下步骤：
(1)取优良钩藤种质资源的，从中挑出无损伤、籽粒饱满、质地均匀、不携带病虫卵的种子备用。
(2)取(1)的种子，经无菌水冲洗3-5次后，放入75％的酒精消毒30秒，接着无菌水冲洗3-5次，再放入0.1％的升汞溶液中灭菌7分钟，然后用无菌水冲洗3-5次，最后接种入不含任何激素的MS培养基中，进行发芽培养，培养时间为14天左右，培养温度为24℃，光照强度为1800Lx，光照时长为10小时/天。
(3)取(2)中萌发出来的无菌种子苗，接种到MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.20mg/L的培养基中进行扩繁培养，培养温度为24℃，培养时间为14天左右，光照强度为1800Lx，光照时长为12小时/天；温度适宜，光照充足，使得种子苗正常生长。
(4)取(3)中得到的扩繁芽，接种到MS+IBA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+活性炭1g/L的培养基中进行壮苗培养，培养时间为14天左右；培养温度为17℃，光照强度为1800Lx，光照时长为12小时/天。
(5)立即取(4)中经过壮苗培养的组培苗，接种到1/2MS+6-BA0.02mg/L+PPP3331.5mg/L+活性炭0.5g/L+脯氨酸0.05mg/L的离体保存培养基中，进行离体保存培养，培养温度为17℃，光照强度为1200Lx，光照时长为10小时/天。各步骤的培养基中均含有蔗糖25g/L，pH＝5.8。
对比例3
一种钩藤离体保存方法，包括以下步骤：
(1)取优良钩藤种质资源的，从中挑出无损伤、籽粒饱满、质地均匀、不携带病虫卵的种子备用。
(2)取(1)的种子，经无菌水冲洗3-5次后，放入75％的酒精消毒30秒，接着无菌水冲洗3-5次，再放入0.1％的升汞溶液中灭菌7分钟，然后用无菌水冲洗3-5次，最后接种入不含任何激素的MS培养基中，进行发芽培养，培养时间为14天左右，培养温度为24℃，光照强度为1800Lx，光照时长为10小时/天。
(3)取(2)中萌发出来的无菌种子苗，接种到MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.20mg/L的培养基中进行扩繁培养，培养温度为24℃，培养时间为14天左右，光照强度为1800Lx，光照时长为12小时/天；温度适宜，光照充足，使得种子苗正常生长。
(4)取(3)中得到的扩繁芽，接种到MS+IBA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+活性炭1g/L的培养基中进行壮苗培养，培养时间为14天左右；培养温度为24℃，光照强度为1800Lx，光照时长为12小时/天。
(5)立即取(4)中经过壮苗培养的组培苗，接种到1/2MS+6-BA0.02mg/L+PPP3331.5mg/L+活性炭0.5g/L的离体保存培养基中，进行离体保存培养，培养温度为17℃，光照强度为1200Lx，光照时长为10小时/天。各步骤的培养基中均含有蔗糖25g/L，pH＝5.8。
实施例1～10和对比例1～3各统计观测40株扩繁苗壮苗培养存活率，以及各统计观测40株组培苗离体保存培养200天和400天的存活率。
实施例1～10和对比例1～3的离体保存培养条件和存活率如下表1所示：
表1实施例和对比例培养条件和存活率
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从上表1可以看到，实施例1～10中200天存活率最高可达95％，最低也有77.5％，均能满足200天以下的保苗保种需要。实施例1～3、实施例5～10的400天存活率在30％及以上，可以满足长达400天的保苗保种需求。
实施例2～10在壮苗培养基中添加脯氨酸0.05mg/L或0.1mg/L，并在壮苗培养后7天设置培养温度17℃进行低温刺激，结果发现壮苗培养存活率达100％，与对比例1正常条件下的壮苗培养存活率相同。相比不添加脯氨酸的低温刺激对比例2，可以有效提高壮苗培养存活率。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。
Claims (7)
1.钩藤离体保存方法，其特征在于，包括：钩藤种子经无菌发芽培养得到种子苗；种子苗经扩繁培养得到扩繁苗；扩繁苗置于含有0.01～0.1mg/L脯氨酸的壮苗培养基中进行壮苗培养，并在壮苗培养后期设置15～21℃低温培养期；
将经过壮苗培养的组培苗置于离体培养基中进行离体培养，离体培养基含有1/2MS+6-BA0.02mg/L+PPP3331.0～2.0mg/L+活性炭0.5g/L+脯氨酸0.01～0.1mg/L，培养温度为15～21℃，光照强度为1200Lx，光照时长为10小时/天。
2.如权利要求1所述的钩藤离体保存方法，其特征在于，所述低温培养期的培养温度为17℃，光照强度1200～1800Lx，光照时长为10～12小时/天，持续时间为6～8天。
3.如权利要求1所述的钩藤离体保存方法，其特征在于，壮苗培养的前期为正常培养，正常培养的培养温度为24～26℃，光照强度1800Lx，光照时长为10～12小时/天；正常培养后为7天的低温培养期，低温培养期的培养温度为17℃，光照强度1200～1800Lx，光照时长为10～12小时/天。
4.如权利要求2或3所述的钩藤离体保存方法，其特征在于，低温培养期的培养温度为17℃，光照强度1800Lx，光照时长为12小时/天。
5.如权利要求1所述的钩藤离体保存方法，其特征在于，所述壮苗培养基含有MS+IBA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+活性炭1g/L+脯氨酸0.05mg/L。
6.如权利要求1或3或5所述的钩藤离体保存方法，其特征在于，所述离体培养基为1/2MS+6-BA 0.02mg/L+PPP3331.5mg/L+活性炭0.5g/L+脯氨酸0.05mg/L，培养温度为17℃，光照强度为1200Lx，光照时长为10小时/天。
7.如权利要求1所述的钩藤离体保存方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：取无损伤、籽粒饱满、质地均匀、不携带病虫卵的钩藤种子；
S2：取S1的种子，经无菌水冲洗3-5次后，放入75％的酒精消毒30秒，接着无菌水冲洗3-5次，再放入0.1％的升汞溶液中灭菌7分钟，然后用无菌水冲洗3-5次，最后接种入不含任何激素的MS培养基中，进行发芽培养得到无菌种子苗，培养时间为14天左右，培养温度为24℃，光照强度为1800Lx，光照时长为10小时/天；
S3：取S2中的种子苗，接种到含MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L的培养基中进行扩繁培养，培养温度为24℃，光照强度为1800Lx，光照时长为12小时/天；
S4：取S3中的扩繁芽，接种到MS+IBA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+活性炭1g/L+脯氨酸0.01～0.1mg/L的壮苗培养基中进行壮苗培养；其中壮苗培养前期的培养温度为24～26℃，光照强度为1800Lx，光照时长为12小时/天；在壮苗培养的最后6～8天，培养温度为15～21℃，光照强度为1200～1800Lx，光照时长为12小时/天；
S5：取S4的正常组培苗，接种到1/2MS+6-BA0.02mg/L+PPP3331.0～2.0mg/L+活性炭0.5g/L+脯氨酸0.01～0.1mg/L的离体保存培养基中，进行离体保存培养，培养温度为15～21℃，光照强度为1200Lx，光照时长为10小时/天。
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