CN116879443A - 化妆品中21种寡肽的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种化妆品中21种寡肽的检测方法，包括以下步骤：在待测化妆品中加入乙酸铵水溶液，涡旋分散均匀后，再加甲醇超声提取，离心后，将上清液过滤后，进行超高效液相色谱串联质谱检测。在本发明中，通过优化样品前处理的提取溶剂和提取方式，并结合优化的色谱分离条件和质谱参数，提高了21种寡肽的加标回收率，使21种寡肽达到了有效分离，建立了化妆品中21种寡肽的同时检测方法，为化妆品中寡肽的定性定量检测提供有效的检测手段。本发明的检测方法操作简便，测定结果准确可靠，有效弥补了现有检验方法的缺失，该方法为化妆品行业的产品研发和产品质量控制及市场监管提供重要的技术支撑。
Description
技术领域
本发明属于分析检测技术领域，更具体地，本发明涉及一种化妆品中21种寡肽的检测方法。
背景技术
肽是由特定的氨基酸以不同序列构成，结构相对简单，却具有重要生理活性。多种小分子寡肽已被证明对人体皮肤具有除皱、调节细胞的新陈代谢、修复代替受损衰老细胞、延缓衰老、补充营养等功能。化妆品中常用的是二肽至十肽之间的寡肽，如乙酰基六肽-8、谷胱甘肽、L-肌肽、三肽-1、棕榈酰三肽-1、棕榈酰五肽-4等。寡肽具有安全、高活性、易吸收等特点，其作为功效成分在化妆品中扮演着越来越重要的角色。然而，寡肽原料种类繁多且价格一般较为昂贵，市售化妆品可能存在错误或虚假标识等情况，无法保证产品的实际功效。因此亟需建立科学、高效的化妆品中寡肽的检测方法，能对产品中的寡肽成分实现快速、准确的测定。
目前，关于化妆品中寡肽的检测方法主要有电泳法、高效液相色谱法、液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)法。其中LC-MS/MS法具有特异性强、灵敏度高等特点，是寡肽定性定量检测的优选方法。然而，由于不同种类寡肽性质差异巨大，溶解性和色谱保留行为各异，目前已报道的LC-MS/MS检测方法仅针对少数几种寡肽的同时检测，且这几种寡肽需同为亲水性寡肽或同为亲油性寡肽。
因此，建立一种可以同时检测包括亲水性寡肽和亲油性寡肽的多种寡肽的方法非常有必要。
发明内容
基于此，本发明的目的在于提供一种化妆品中21种寡肽的检测方法。
实现上述发明目的的技术方案包括如下。
本发明的第一方面，提供了一种化妆品中21种寡肽的检测方法，包括以下步骤：在待测化妆品中加入乙酸铵水溶液，涡旋分散均匀后，再加甲醇超声提取，离心，将上清液过滤后，进行超高效液相色谱串联质谱检测。
在本发明中，通过优化样品前处理的提取溶剂和提取方式，并结合优化的色谱分离条件和质谱参数，提高了21种寡肽的加标回收率，使21种寡肽达到了有效分离，建立了化妆品中21种寡肽的同时检测方法，为化妆品中寡肽的定性定量检测提供有效的检测手段。本发明的检测方法操作简便，测定结果准确可靠，有效弥补了现有检验方法的缺失，该方法为化妆品行业的产品研发和产品质量控制及市场监管提供重要的技术支撑。
附图说明
图1为本发明实施例1中21种寡肽混合标准溶液(500μg/L)的MRM色谱图，其中，1～21分别表示棕榈酰六肽-12、棕榈酰四肽-7、棕榈酰三肽-8、二肽-2、三肽-1、棕榈酰三肽-1、棕榈酰四肽-10、乙酰基六肽-1、棕榈酰五肽-4、乙酰基四肽-2、肉豆蔻酰五肽-4、乙酰基四肽-9、谷胱甘肽、四肽-4、六肽-9、二肽二氨基丁酰苄基酰胺二乙酸盐、乙酰基六肽-8、乙酰基四肽-5、L-肌肽、五肽-3和三肽-10瓜氨酸。
图2为本发明试验例1中不同色谱柱条件下的21种寡肽MRM色谱图，其中，(a)C18柱；(b)氰基柱；(c)HILIC柱(Agilent)；(d)氨基柱；(e)HILIC柱(Waters)；1～21分别表示棕榈酰六肽-12、棕榈酰四肽-7、棕榈酰三肽-8、二肽-2、三肽-1、棕榈酰三肽-1、棕榈酰四肽-10、乙酰基六肽-1、棕榈酰五肽-4、乙酰基四肽-2、肉豆蔻酰五肽-4、乙酰基四肽-9、谷胱甘肽、四肽-4、六肽-9、二肽二氨基丁酰苄基酰胺二乙酸盐、乙酰基六肽-8、乙酰基四肽-5、L-肌肽、五肽-3和三肽-10瓜氨酸。
图3为本发明试验例3中不同流动相条件下21种寡肽MRM色谱图，其中，(a)～(u)分别表示棕榈酰六肽-12、棕榈酰四肽-7、棕榈酰三肽-8、二肽-2、三肽-1、棕榈酰三肽-1、棕榈酰四肽-10、乙酰基六肽-1、棕榈酰五肽-4、乙酰基四肽-2、肉豆蔻酰五肽-4、乙酰基四肽-9、谷胱甘肽、四肽-4、六肽-9、二肽二氨基丁酰苄基酰胺二乙酸盐、乙酰基六肽-8、乙酰基四肽-5、L-肌肽、五肽-3和三肽-10瓜氨酸；1～10分别表示流动相为：水+甲醇、水+乙腈、0.1％甲酸水溶液+乙腈、0.1％甲酸水溶液+乙腈(含0.1％甲酸)、5mmol/L乙酸铵水溶液(含0.05％甲酸)+乙腈(含0.05％甲酸)、10mmol/L乙酸铵水溶液(含0.05％甲酸)+乙腈(含0.05％甲酸)、15mmol/L乙酸铵水溶液(含0.1％甲酸)+乙腈(含0.1％甲酸)、20mmol/L乙酸铵水溶液(含0.2％甲酸)+乙腈(含0.2％甲酸)、25mmol/L乙酸铵水溶液(含0.1％甲酸)+乙腈(含0.1％甲酸)、15mmol/L乙酸铵水溶液(含0.2％甲酸)+乙腈(含0.2％甲酸)。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Green和Sambrook等人，分子克隆实验指南(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2013)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
在本发明中的化妆品21种寡肽的检测方法中，首先优化了待测化妆品的前处理方法(使用含甲酸的乙酸铵水溶液涡旋分散化妆品，再加入甲醇超声提取；乙酸铵的加入，使提取溶液的离子强度增加，破坏基质原有的离子体系，使寡肽更容易游离出来，甲酸的加入可调节溶液pH值，使亲水性寡肽在溶液中溶解度更高；加入甲醇超声提取使亲油性寡肽提取更加完全；协同作用从而提高了寡肽的加标回收率)，然后再进一步优化了超高效液相色谱的色谱条件(色谱柱选用HILIC色谱柱，优选Poroshell 120HILIC-Z色谱柱，能较好分离寡肽，能与基质有效分离；流动相选用A：含0.05％～0.2％甲酸的10mmol/L～20mmol/L乙酸铵水溶液，B：含0.05％～0.2％甲酸的乙腈，添加甲酸可提高离子化效率，提高寡肽响应，加入具有竞争作用的乙酸铵，可有效改善二次保留引起的峰拖尾现象)和质谱条件(包括离子模式、母离子、子离子、碰撞能、辅助气温度、喷雾电压、鞘气和辅助气流量)，从而使化妆品中21种寡肽(包括亲水性和亲油性寡肽)达到有效分离，建立了化妆品中21种寡肽的同时检测方法。
在本发明的其中一些实施例中，公开了一种化妆品中21种寡肽的检测方法，包括以下步骤：在待测化妆品中加入乙酸铵水溶液，涡旋分散均匀后，再加甲醇超声提取，离心，将上清液过滤后，进行超高效液相色谱串联质谱检测。
在其中一些实施例中，所述乙酸铵水溶液中乙酸铵的浓度为0.05mol/L～0.15mol/L，优选为0.1mol/L。
在其中一些实施例中，所述乙酸铵水溶液中还含有0.1％～0.5％(体积浓度)的甲酸，优选为0.25％。
在其中一些实施例中，所述乙酸铵水溶液和甲醇的体积比为30～60：70～40。
在其中一些实施例中，所述超声提取的时间为10min～20min。
在其中一些实施例中，所述化妆品中21种寡肽的检测方法，包括以下步骤：精确称取待测化妆品0.1g～0.5g，加入1.5mL～3mL含0.1％～0.5％甲酸的0.05mol/L～0.15mol/L乙酸铵水溶液涡旋分散均匀后，加甲醇至5mL，混匀超声提取10min～20min，离心，上清液经0.22μm有机滤膜过滤，进行超高效液相色谱串联质谱检测。
在其中一些实施例中，所述超高效液相色谱所采用的色谱柱为Poroshell120HILIC-Z色谱柱。
在其中一些实施例中，所述超高效液相色谱所采用的流动相为：A：含0.05％～0.2％甲酸的10mmol/L～20mmol/L乙酸铵水溶液，B：含0.05％～0.2％甲酸的乙腈。
在其中一些实施例中，所述超高效液相色谱采用梯度洗脱，所述梯度洗脱程序为：0.0～1.0min，90％B；1.0～8.0min，90％B～50％B；8.0～12.0min，50％B；12.1～17.0min，90％B。
在其中一些实施例中，所述质谱条件包括：
电喷雾离子源正离子模式；
喷雾电压：3500±500V；
鞘气：40±10Unit；
辅助气：12±5Unit；
辅助气温度：350±50℃；
离子传输管温度：325±50℃；
数据采集模式为多反应监测MRM。
在其中一些实施例中，所述21种寡肽包括棕榈酰六肽-12、棕榈酰四肽-7、棕榈酰三肽-8、二肽-2、三肽-1、棕榈酰三肽-1、棕榈酰四肽-10、乙酰基六肽-1、棕榈酰五肽-4、乙酰基四肽-2、肉豆蔻酰五肽-4、乙酰基四肽-9、谷胱甘肽、四肽-4、六肽-9、二肽二氨基丁酰苄基酰胺二乙酸盐、乙酰基六肽-8、乙酰基四肽-5、L-肌肽、五肽-3和三肽-10瓜氨酸。
21种寡肽的保留时间、母离子、子离子、碰撞能量等信息见表1。
表121种寡肽的质谱参数
注：“*”为定量离子
以下实施例中所用仪器包括：Ultimate 3000超高效液相色谱仪：美国赛默飞公司产品；TSQ Quantiva三重四极杆质谱仪：美国赛默飞公司产品，配有电喷雾离子源(ESI)；BSA224S-CW电子天平：德国赛多利斯公司产品；MS3 basic涡旋振荡器：德国IKA公司产品；KQ-250DV型数控超声波清洗仪：昆山市超声仪器有限公司产品；Milli-Q纯水***：美国Millipore公司产品。
以下实施例中所用试剂包括如下：21种寡肽对照品(信息详见表2)；甲醇、乙腈：LC-MS级，德国Merck公司产品；甲酸：LC-MS级，美国sigma-aldrich公司产品；乙酸铵：分析纯，广州化学试剂厂产品；实验用纯水(18.2MΩ·cm)由Milli-Q纯水***制备；有机滤膜：尼龙，0.22μm，天津市津腾实验设备有限公司产品；含寡肽化妆品：市售产品。
表221种寡肽对照品信息
以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。
实施例1化妆品中21种寡肽的检测方法
包括以下步骤：
1、标准溶液的配制
称取21种寡肽对照品各10.0mg(精确至0.1mg)，置于10mL棕色容量瓶中，用60％甲醇水(含0.25％甲酸)定容至刻度，混匀，即得质量浓度为1000μg/mL的寡肽标准储备液。分别精密移取100μL的各标准储备液于10mL棕色容量瓶中，用60％甲醇水(含0.25％甲酸)定容，配制成质量浓度分别为10μg/mL的混合标准溶液，再用相同溶剂稀释成5μg/L、10μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L、500μg/L和1000μg/L的标准工作溶液。
2、样品前处理
称取化妆品试样约0.25g(精确至0.0001g)于10mL塑料离心管中，加入2mL0.1mol/L乙酸铵水溶液(含0.25％甲酸)，涡旋分散均匀后，加甲醇至5mL，混匀超声提取15min，以5000r/min离心10min，上清液经0.22μm有机滤膜过滤，滤液供上机测定。
3、UPLC-MS/MS检测
(1)、色谱条件
色谱柱：Agilent Poroshell 120HILIC-Z色谱柱(100mm×3.0mm，2.7μm，美国安捷伦公司产品)；
流动相：A：15mmol/L乙酸铵水溶液(含0.1％甲酸)，B：乙腈(含0.1％甲酸)；
梯度洗脱程序：
0.0～1.0min，90％B；
1.0～8.0min，90％B～50％B；
8.0～12.0min，50％B；
12.1～17.0min，90％B；
流速：0.3mL/min；
柱温：30℃；
进样体积：2μL。
(2)、质谱条件
电喷雾离子源正离子模式(ESI+)；
喷雾电压：3500V；
鞘气：40Unit；
辅助气：12Unit；
辅助气温度：350℃；
离子传输管温度：325℃；
数据采集模式为多反应监测(MRM)。
21种寡肽的保留时间、母离子、子离子、碰撞能量等信息见表1。
21种寡肽标准溶液的MRM色谱图见图1。
实施例2化妆品中21种寡肽的检测方法
包括以下步骤：
1、标准溶液的配制
同实施例1操作步骤。
2、样品前处理
称取化妆品试样(同实施例1)约0.1g(精确至0.0001g)于10mL塑料离心管中，加入1.5mL 0.05mol/L乙酸铵水溶液(含0.1％甲酸)，涡旋分散均匀后，加甲醇至5mL，混匀超声提取10min，以5000r/min离心10min，上清液经0.22μm有机滤膜过滤，滤液供上机测定。
3、UPLC-MS/MS检测
(1)、色谱条件
色谱柱：Agilent Poroshell 120HILIC-Z色谱柱(100mm×3.0mm，2.7μm)；
流动相：A：10mmol/L乙酸铵水溶液(含0.05％甲酸)，B：乙腈(含0.05％甲酸)；
梯度洗脱程序：
0.0～1.0min，90％B；
1.0～8.0min，90％B～50％B；
8.0～12.0min，50％B；
12.1～17.0min，90％B；
流速：0.3mL/min；
柱温：30℃；
进样体积：2μL。
(2)、质谱条件
电喷雾离子源正离子模式(ESI+)；
喷雾电压：3000V；
鞘气：30Unit；
辅助气：7Unit；
辅助气温度：300℃；
离子传输管温度：275℃；
数据采集模式为多反应监测(MRM)。
21种寡肽的保留时间、母离子、子离子、碰撞能量等信息见表1。
实施例3化妆品中21种寡肽的检测方法
包括以下步骤：
1、标准溶液的配制
同实施例1操作步骤。
2、样品前处理
称取化妆品试样(同实施例1)约0.5g(精确至0.0001g)于10mL塑料离心管中，加入3mL 0.15mol/L乙酸铵水溶液(含0.5％甲酸)，涡旋分散均匀后，加甲醇至5mL，混匀超声提取20min，以5000r/min离心10min，上清液经0.22μm有机滤膜过滤，滤液供上机测定。
3、UPLC-MS/MS检测
(1)、色谱条件
色谱柱：Agilent Poroshell 120HILIC-Z色谱柱(100mm×3.0mm，2.7μm)；
流动相：A：20mmol/L乙酸铵水溶液(含0.2％甲酸)，B：乙腈(含0.2％甲酸)；
梯度洗脱程序：
0.0～1.0min，90％B；
1.0～8.0min，90％B～50％B；
8.0～12.0min，50％B；
12.1～17.0min，90％B；
流速：0.3mL/min；
柱温：30℃；
进样体积：2μL。
(2)、质谱条件
电喷雾离子源正离子模式(ESI+)；
喷雾电压：4000V；
鞘气：50Unit；
辅助气：17Unit；
辅助气温度：400℃；
离子传输管温度：375℃；
数据采集模式为多反应监测(MRM)。
21种寡肽的保留时间、母离子、子离子、碰撞能量等信息见表1。
表3实施例1～3检测方法的平均加标回收率和精密度结果(n＝6)
表3结果显示：实施例1～3的检测方法均能实现化妆品中21种寡肽的测定，且平均加标回收率大于80％，相对标准偏差小于10％，满足实际检测需求。
实施例4本发明方法的方法学验证
1、线性关系、方法检出限和定量限
移取适量21种寡肽的标准工作溶液，按实施例1的方法进行测定，并绘制标准曲线。21种寡肽的质量浓度均在一定范围内与其对应的峰面积呈线性关系，分别以3倍信噪比(S/N＝3)和10倍信噪比(S/N＝10)计算方法检出限和定量限。线性回归方程、相关系数、检出限和定量限等，详见表4。结果显示，21种寡肽在本方法下具有线性范围广，线性关系好，相关系数均大于0.995，且灵敏度高，方法检出限可达0.1～1μg/g，完全满足化妆品中多种寡肽的定性定量需求。
表421种寡肽的线性范围、回归方程、相关系数、方法检出限和定量限
2、回收率和精密度
在三种基质(水剂、膏霜、乳液)的空白样品中分别加入低、中、高3个不同浓度水平的标准工作溶液，每个浓度水平均制作6个平行样品，分别按实施例1的方法进行样品前处理和分析测定。结果如表5所示。
表521种寡肽的加标回收率和精密度(n＝6)
/>
表5结果显示，在三种基质3个加标浓度水平上，21种寡肽的回收率为81.7％～95.3％，相对标准偏差为1.44％～8.92％。说明本发明方法的准确度较高且重复性较好，回收率和精密度均可以满足实际检测需求。
实施例5实际样品测定
采用本发明实施例1所建立的检测方法对28批次标识含有寡肽的化妆品进行检测，检测结果见表6。
表6实际样品中21种寡肽的检测结果(n＝2)
/>
从表6结果可知，大部分样品检出寡肽种类与标识一致；有5批次样品标识含有谷胱甘肽、乙酰基六肽-8、乙酰基四肽-2等，但检测结果为未检出，出现实际成分与标识不一致。
试验例1不同色谱柱对检测结果的影响
采用不同色谱柱，如C18柱(Hypersil Gold C18，50mm×2.1mm，1.9μm)、氰基柱(Waters HSS Cyano，100mm×2.1mm，1.8μm)、氨基柱(Waters BEH Amide，100mm×2.1mm，2.5μm)、HILIC柱(Agilent Poroshell 120HILIC-Z，100mm×3.0mm，2.7μm；Waters ACQUITYBEH HILIC，100mm×2.1mm，1.7μm)五种色谱柱，其余步骤同实施例1。
对比上述不同色谱柱对检测21种寡肽混合标准溶液(500μg/L)的效果。图2为不同色谱柱条件下的21种寡肽MRM色谱图。结果显示，C18柱和氰基柱对脂肪酰改性的寡肽(如棕榈酰三肽-1、棕榈酰四肽-7、肉豆蔻酰五肽-4等)保留较好，但其余大部分寡肽保留较弱(如三肽-1、L-肌肽、乙酰基四肽-5、谷甘光肽、四肽-4等)，无法达到有效分离，二肽二氨基丁酰苄基酰胺二乙酸盐出现分峰，大部分寡肽色谱峰拖尾和峰展宽。氰基柱峰形较C18柱好，保留能力也较C18柱强，仍有谷甘光肽等7种寡肽无法有效保留。氨基柱全部寡肽均有一定保留，但峰形较差，色谱峰出现分峰、展宽和拖尾较严重，调整流动相也改善不明显。HILIC柱能较好分离寡肽，除三肽-1外其余寡肽峰形较好，能与基质有效分离。由于三肽-1在C18柱、氰基柱上没有保留，在氨基柱和HILIC柱保留较强，但有拖尾现象，氨基柱更明显，调整流动相能使拖尾现象有所改善。因此，综合考虑选择HILIC柱为分离柱，全部寡肽均能实现有效分离。
进一步对比不同品牌HILIC柱(Agilent Poroshell 120HILIC-Z，100mm×3.0mm，2.7μm；Waters ACQUITY BEH HILIC，100mm×2.1mm，1.7μm)，所有寡肽在色谱柱上均能实现有效分离，但Agilent Poroshell 120HILIC-Z峰形更优。因此优选Agilent Poroshell120HILIC-Z色谱柱。
试验例2不同样品前处理方法对检测结果的影响
样品前处理方法分别采用：(1)、甲醇；(2)乙腈；(3)、水/甲醇(40/60,v/v)直接提取；(4)、先用乙酸铵水溶液分散再用甲醇提取(40/60,v/v)；(5)、先用乙酸铵水溶液(含甲酸)分散再用甲醇提取(40/60,v/v)，其余检测步骤同实施例1。
对比不同前处理方法对21种寡肽的加标回收率的影响，结果详见表7。
表7不同前处理方法的21种寡肽加标回收率结果
表7结果显示，采用甲醇、乙腈作为溶剂直接超声提取时，甲醇提取效果比乙腈稍好，但仍有二肽-2、三肽-1、棕榈酰五肽-4、乙酰基四肽-2的加标回收率小于80％。采用60％甲醇水(v/v)作为提取溶剂直接超声提取时，棕榈酰四肽-7、棕榈酰三肽-8、棕榈酰四肽-10、乙酰基六肽-1、棕榈酰五肽-4、乙酰基四肽-2回收率小于80％，但二肽-2、三肽-1等亲水性寡肽回收率明显提高。
先用水溶液分散，再加入有机溶剂超声提取的样品前处理方法有利于寡肽回收率的提高。对比了乙酸铵水溶液/甲醇(40/60，v/v)、乙酸铵水溶液(含甲酸)/甲醇(40/60，v/v)，先分散提取再加入甲醇超声提取的前处理方法对寡肽的加标回收率影响。从表7结果可知，采用乙酸铵水溶液(含甲酸)先分散再用甲醇提取效果最好。
由于待检测的21种寡肽的Log P值范围从-5.53到5.50，一部分为亲水性化合物，一部分为具有脂肪酰基亲油端的亲油性化合物。寡肽的化学性质差异较大，在溶剂中的溶解度不同，使用一种溶剂对其提取难以达到良好的效果，同时化妆品基质复杂使得提取效果也不佳。本发明经过大量的实验后发现，采用乙酸铵水溶液(含甲酸)先分散提取寡肽化合物，提取溶液的离子强度增加，破坏基质原有的离子体系，使亲水性寡肽更容易游离出来，基质更好分散，甲酸的加入可调节溶液pH值，使寡肽在溶液中溶解度更高，从而提高了亲水性寡肽的加标回收率；然后加入甲醇使乳化体系破乳，超声提取进一步将基质包裹的亲油性寡肽提取出来，分散提取和超声提取协同作用，使化妆品中21种寡肽更好提取出来，极大提高了方法的准确性。
乙酸铵水溶液中，乙酸铵的浓度为0.05mol/L～0.15mol/L，含0.1％～0.5％的甲酸(体积浓度)，乙酸铵水溶液和甲醇的体积比为30～60：70～40，优选为：使用乙酸铵水溶液(乙酸铵的浓度为0.1mol/L，含0.25％甲酸)先分散，再加入甲醇超声提取，乙酸铵水溶液和甲醇的体积比为40：60。
试验例3不同流动相对检测结果的影响
采用五种不同流动相体系：I水+甲醇、II水+乙腈、III甲酸水溶液+乙腈、IV甲酸水溶液+乙腈(含甲酸)、V乙酸铵水溶液(含甲酸)+乙腈(含甲酸)，其余检测步骤同实施例1。
对比不同流动相对寡肽的峰形和强度的影响。图3为不同流动相条件下21种寡肽MRM色谱图。如图3所示，采用流动相体系I、II、III时，所有寡肽均有拖尾，保留时间长的寡肽尤为明显，三肽-1峰展宽和拖尾导致不出峰。流动相体系III、IV添加甲酸后，响应和保留增强。采用流动相体系V，乙酸铵的加入，寡肽保留明显增强，峰形改善，随着浓度的增大，峰形改善越明显，但寡肽响应强度有抑制，在乙酸铵浓度10～20mmol/L时达到相对平衡状态，响应强度减弱不明显；同时添加甲酸，响应有所增强，当含甲酸0.05％～0.2％时，寡肽峰形较好，响应较优。
以上结果表明，添加甲酸可提高离子化效率，提高寡肽响应。由于寡肽都具有肽键、氨基或羧基等氢键作用力较强的基团，在HILIC色谱柱上保留能力较强，可与固定相颗粒表面的硅醇基作用，导致二次保留，引起色谱峰出现拖尾现象，而在流动相中加入具有竞争作用的乙酸铵，可有效改善二次保留引起的峰拖尾现象。考虑到乙酸铵浓度越高越容易在高比例有机相中结晶析出，进而可能会磨损液相柱塞杆密封垫或在质谱离子源口析出结晶，因此，综合考虑选取10mmol/L～20mmol/L乙酸铵水溶液(含0.05％～0.2％甲酸)+乙腈(含0.05％～0.2％甲酸)作为流动相，优选15mmol/L乙酸铵水溶液(含0.1％甲酸)+乙腈(含0.1％甲酸)作为流动相。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种化妆品中21种寡肽的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：在待测化妆品中加入乙酸铵水溶液，涡旋分散均匀后，再加甲醇超声提取，离心后，将上清液过滤后，进行超高效液相色谱串联质谱检测。
2.根据权利要求1所述的化妆品中21种寡肽的检测方法，其特征在于，所述乙酸铵水溶液中乙酸铵的浓度为0.05mol/L～0.15mol/L，优选为0.1mol/L。
3.根据权利要求1所述的化妆品中21种寡肽的检测方法，其特征在于，所述乙酸铵水溶液中还含有0.1％～0.5％的甲酸，优选为0.25％。
4.根据权利要求1所述的化妆品中21种寡肽的检测方法，其特征在于，所述乙酸铵水溶液和甲醇的体积比为30～60：70～40，优选为40：60。
5.根据权利要求1所述的化妆品中21种寡肽的检测方法，其特征在于，所述超声提取的时间为10min～20min。
6.根据权利要求1～5任一项所述的化妆品中21种寡肽的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：精确称取待测化妆品0.1g～0.5g，加入1.5mL～3mL含0.1％～0.5％甲酸的0.05mol/L～0.15mol/L乙酸铵水溶液涡旋分散均匀后，加甲醇至5mL，混匀超声提取10min～20min，离心，上清液经0.22μm有机滤膜过滤，进行超高效液相色谱串联质谱检测。
7.根据权利要求1～5任一项所述的化妆品中21种寡肽的检测方法，其特征在于，所述超高效液相色谱所采用的色谱柱为HILIC色谱柱；和/或所述超高效液相色谱所采用的流动相为：A：含0.05％～0.2％甲酸的10mmol/L～20mmol/L乙酸铵水溶液，B：含0.05％～0.2％甲酸的乙腈。
8.根据权利要求1～5任一项所述的化妆品中21种寡肽的检测方法，其特征在于，所述超高效液相色谱采用梯度洗脱，所述梯度洗脱程序为：0.0～1.0min，90％B；1.0～8.0min，90％B～50％B；8.0～12.0min，50％B；12.1～17.0min，90％B。
9.根据权利要求1～5任一项所述的化妆品中21种寡肽的检测方法，其特征在于，所述质谱条件包括：电喷雾离子源正离子模式；喷雾电压：3500±500V；鞘气：40±10Unit；辅助气：12±5Unit；辅助气温度：350±50℃；离子传输管温度：325±50℃；数据采集模式为多反应监测MRM。
10.根据权利要求1～5任一项所述的化妆品中21种寡肽的检测方法，其特征在于，所述21种寡肽包括棕榈酰六肽-12、棕榈酰四肽-7、棕榈酰三肽-8、二肽-2、三肽-1、棕榈酰三肽-1、棕榈酰四肽-10、乙酰基六肽-1、棕榈酰五肽-4、乙酰基四肽-2、肉豆蔻酰五肽-4、乙酰基四肽-9、谷胱甘肽、四肽-4、六肽-9、二肽二氨基丁酰苄基酰胺二乙酸盐、乙酰基六肽-8、乙酰基四肽-5、L-肌肽、五肽-3和三肽-10瓜氨酸。
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|---|---|---|---|---|
| CN117740993A (zh) * | 2023-12-18 | 2024-03-22 | 广州美域医学检验有限公司 | 一种化妆品中肽类物质的检测方法及其应用 |
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- 2023-07-13 CN CN202310865069.XA patent/CN116879443A/zh active Pending
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