CN111505151B - 高效液相色谱法测定l-缬氨酸原料中其他氨基酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用高效液相色谱法测定L‑缬氨酸原料中其他氨基酸的方法,配制L‑正缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸对照品溶液;经高效液相色谱仪检测,供试品色谱图与对照品溶液色谱图中L‑正缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸的出峰时间及峰形进行对比,判定供试品溶液中是否含有其他氨基酸。本方法通过筛选氨丙基键合硅胶色谱柱,找到分离效果,筛选波长,找到各氨基酸的最大吸收,并利用乙腈/磷酸盐缓冲液二元流动相,通过调节三乙胺比例、pH值及两相比例来调控各氨基酸峰在色谱柱上的保留时间,有效防止氨基柱中键合氨丙基的水解脱落,解决氨基柱反相使用寿命不长,基线不稳的问题。
Description
技术领域
本发明涉及一种测定L-缬氨酸原料中其他氨基酸的方法,具体为采用高效液相色谱法检测L-缬氨酸原料中L-正缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸的残留的方法。
技术背景
L-缬氨酸(L-2-氨基-3-甲基丁酸;CAS号:72-18-4)属人体必需氨基酸,作为氨基酸类药,营养增补剂,可作氨基酸输液、综合氨基酸制剂的主要成分。其具有分子式C10H20N2O4,且具有下述结构式:
L-缬氨酸是三个支链氨基酸之一,属必需氨基酸,可治疗肝功能衰竭、中枢神经***功能紊乱,其作为氨基酸输液、综合氨基酸制剂的主要成分,具有广泛的市场前景。针对发酵法生产缬氨酸均为L-型,无需旋光拆分,但在成品中会存在一些其他氨基酸,给其临床应用带来一些影响。同时由于L-缬氨酸其他氨基酸检测,在中国药典2015年版和美国药典42版均采用薄层色谱法,其检测灵敏度差,各类氨基酸不明确,无法明确显示各类其他氨基酸的具体含量。采用美国药典40版的磷酸盐和乙腈二元流动相体系,氨基柱使用寿命不长,基线不稳,且L-缬氨酸与本发明提到的其他氨基酸无法基线分离。采用氨基酸分析仪,设备成本和检测成本昂贵,不宜普及。本发明针对现有技术不足,经过长期实践研究,确定一种灵敏度高,检测时间短的其他氨基酸检测方法,其能够快速灵敏的检测出L-正缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸的含量,并且能够使L-缬氨酸与其他氨基酸基线分离。
发明内容
本发明的技术方案利用高效液相色谱法测定L-缬氨酸原料中其他氨基酸含量的检测方法。本方法通过筛选不同品牌的氨丙基键合硅胶色谱柱,找到分离效果,基线效果最好的色谱柱,筛选波长,找到各氨基酸的最大吸收,并利用乙腈/磷酸盐缓冲液二元流动相,通过调节三乙胺比例、pH值及两相比例,选择合适三乙胺的量、pH及两相比例来调控各氨基酸峰在色谱柱上的保留时间,提高峰的分离度和理论塔板数,改善色谱峰形,空白溶剂不干扰各氨基酸的检测,并有效防止氨基柱中键合氨丙基的水解脱落,解决氨基柱反相使用寿命不长,基线不稳的问题。
本发明实施例采用了如下技术方案:
一种用高效液相色谱法测定L-缬氨酸原料中其他氨基酸的方法,在以下色谱条件下进行高效液相色谱分析:
色谱柱:氨丙基键合硅胶色谱柱;
流动相:体积比为70~76:24~30的乙腈与磷酸盐缓冲液的混合溶液,其中磷酸盐缓冲液浓度为10~20mmol/L,加入0.1%-0.3%的三乙胺,用磷酸调节pH为6.0~6.5;
流速:0.8~1.2ml/min;
柱温:20~30℃;
进样体积:20μl;
检测波长:UV210nm。
相对于现有技术,本方法简单,高效,灵敏度高,在本发明提供的检测条件下,各氨基酸峰在色谱柱上的保留时间合适,色谱峰形和分离度良好,理论塔板数高,且空白溶剂不干扰各氨基酸的检测,并有效防止氨基柱中键合氨丙基的水解脱落,解决氨基柱反相使用寿命不长,基线不稳的问题。该方法同时检测了7种氨基酸,为控制L-缬氨酸生产工艺中的L-正缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸检测提供了准确可靠的检测方法。
具体的,优选的,在以下色谱条件下进行高效液相色谱分析,测定L-缬氨酸原料中其他氨基酸的含量:
优选的色谱柱:氨丙基键合硅胶色谱柱,250mm×4.6mm,5μm,Phenomenex LunaNH2。
优选的流动相:体积比为72:28的乙腈与磷酸盐缓冲液的混合溶液,其中磷酸盐缓冲液浓度为15mmol/L,加入0.2%的三乙胺,用磷酸调节pH为6.2;
优选的所述磷酸盐缓冲液为:称取1.2g磷酸二氢钾和0.7g磷酸氢二钠溶解于1L水中,加入0.2%的三乙胺,用磷酸调pH为6.2;
用50%乙腈平衡柱子至少30分钟,然后用流动相平衡柱子至少30分钟。
优选的流速为1.0ml/min;
检波长:210nm;
柱温:25℃;
进样方式:自动进样;
检测器:紫外检测器;
优选的,进样量为20μl;
洗脱方式:等度洗脱。
从色谱图1-14,采用本发明的检测方法,可以快速分离L-缬氨酸、L-正缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸,并能够确定各氨基酸的具体类型和含量,本发明的检测方法对于提高L-缬氨酸的纯度,更好的应用于临床用药具有重要意义。
附图说明
图1实施例1色谱图。
图2实施例2色谱图。
图3实施例3色谱图。
图4 L-缬氨酸对照溶液色谱图。
图5苯丙氨酸对照溶液色谱图。
图6亮氨酸对照溶液色谱图。
图7异亮氨酸对照溶液色谱图。
图8 L-正缬氨酸对照溶液色谱图。
图9丙氨酸对照溶液色谱图。
图10甘氨酸对照溶液色谱图。
图11混合对照1色谱图。
图12混合对照2色谱图。
图13混合溶液1色谱图。
图14混合溶液2色谱图。
图15实施例4色谱图。
具体实施方式
实施例1
取S200308批L-缬氨酸原料约20mg,加流动相10ml溶解,作为供试品溶液,进样20μl,色谱条件如下:
色谱柱:氨丙基键合硅胶色谱柱,250mm×4.6mm,5μm,Phenomenex Luna NH2。
流动相:体积比为72:28的乙腈与磷酸盐缓冲液的混合溶液,其中磷酸盐缓冲液浓度为15mmol/L,加入0.1%的三乙胺,用磷酸调节pH为6.1;
磷酸盐缓冲液为:称取1.2g磷酸二氢钾和0.7g磷酸氢二钠溶解于1L水中,加入0.1%的三乙胺,用磷酸调pH为6.1;
用50%乙腈平衡柱子至少30分钟,然后用流动相平衡柱子至少30分钟。
流速为1.0ml/min;
检波长:210nm;
柱温:25℃;
进样方式:自动进样;
检测器:紫外检测器;
进样量为20μl;
洗脱方式:等度洗脱,得到色谱图,如图1所示。
实施例2
取S200301批L-缬氨酸原料约20mg,加流动相10ml溶解,作为供试品溶液,进样20μl,色谱条件如下:
色谱柱:氨丙基键合硅胶色谱柱,250mm×4.6mm,5μm,Phenomenex Luna NH2。
流动相:体积比为74:26的乙腈与磷酸盐缓冲液的混合溶液,其中磷酸盐缓冲液浓度为15mmol/L,加入0.3%的三乙胺,用磷酸调节pH为6.4;
磷酸盐缓冲液为:称取1.2g磷酸二氢钾和0.7g磷酸氢二钠溶解于1L水中,加入0.3%的三乙胺,用磷酸调pH为6.4;
用50%乙腈平衡柱子至少30分钟,然后用流动相平衡柱子至少30分钟。
流速为1.0ml/min;
检波长:210nm;
柱温:25℃;
进样方式:自动进样;
检测器:紫外检测器;
进样量为20μl;
洗脱方式:等度洗脱,得到色谱图,如图2所示。
实施例3
取200309批L-缬氨酸原料约20mg,加流动相10ml溶解,作为供试品溶液,进样20μl,色谱条件如下:
色谱柱:氨丙基键合硅胶色谱柱,250mm×4.6mm,5μm,Phenomenex Luna NH2。
流动相:体积比为72:28的乙腈与磷酸盐缓冲液的混合溶液,其中磷酸盐缓冲液浓度为15mmol/L,加入0.2%的三乙胺,用磷酸调节pH为6.2;
磷酸盐缓冲液为:称取1.2g磷酸二氢钾和0.7g磷酸氢二钠溶解于1L水中,加入0.2%的三乙胺,用磷酸调pH为6.2;
用50%乙腈平衡柱子至少30分钟,然后用流动相平衡柱子至少30分钟。
流速为1.0ml/min;
检波长:210nm;
柱温:25℃;
进样方式:自动进样;
检测器:紫外检测器;
进样量为20μl;
洗脱方式:等度洗脱,得到色谱图,如图3所示。
实施例4
取S200307批L-缬氨酸原料约20mg,加流动相10ml溶解,作为供试品溶液,进样20μl,色谱条件如下:
色谱柱:氨丙基键合硅胶色谱柱,250mm×4.6mm,5μm,Phenomenex Luna NH2。
流动相:体积比为72:28的乙腈与磷酸盐缓冲液的混合溶液,其中磷酸盐缓冲液浓度为15mmol/L;
磷酸盐缓冲液为:称取1.2g磷酸二氢钾和0.7g磷酸氢二钠溶解于1L水中;
用50%乙腈平衡柱子至少30分钟,然后用流动相平衡柱子至少30分钟。
流速为1.0ml/min;
检波长:210nm;
柱温:25℃;
进样方式:自动进样;
检测器:紫外检测器;
进样量为20μl;
洗脱方式:等度洗脱,得到色谱图,如图15所示。
实施例5
对照样品试验:
取对照溶液20μl,注入液相色谱仪,记录色谱图。色谱图中主成分峰的拖尾因子应不大于1.5,重复进样6次,RSD应不大于2.0%,理论塔板数按L-缬氨酸峰计算应不低于2000。
其中有关物质的确定方法如下:
XP205电子天平,Dionex U3000液相色谱仪
对照溶液的制备:
L-缬氨酸对照溶液:称取L-缬氨酸对照品(含量:99.0%)10.00mg,用流动相溶解并稀释至20ml,摇匀,再量取500μl用流动相稀释至25ml,摇匀。
L-正缬氨酸对照溶液:称取L-正缬氨酸对照品(含量:99.0%)10.00mg,用流动相溶解并稀释至20ml,摇匀,作为L-正缬氨酸储备液;再量取500μl用流动相稀释至25ml,摇匀。
亮氨酸对照溶液:称取亮氨酸对照品(含量:99.0%)28.76mg,用流动相溶解并稀释至50ml,摇匀,作为亮氨酸储备液;再量取500μl用流动相稀释至20ml,摇匀。
异亮氨酸对照溶液:称取异亮氨酸对照品(含量:99.0%)26.24mg,用流动相溶解并稀释至50ml,摇匀,作为异亮氨酸储备液;再量取500μl用流动相稀释至20ml,摇匀。
甘氨酸对照溶液:称取甘氨酸对照品(含量:99.0%)10.00mg,用流动相溶解并稀释至20ml,摇匀,作为甘氨酸储备液;再量取500μl用流动相稀释至25ml,摇匀。
丙氨酸对照溶液:称取丙氨酸对照品(含量:99.5%)19.79mg,用流动相溶解并稀释至50ml,摇匀,作为丙氨酸储备液;再量取500μl用流动相稀释至20ml,摇匀。
苯丙氨酸对照溶液:称取苯丙氨酸对照品(含量:99.5%)20.39mg,用流动相溶解并稀释至100ml,摇匀,作为苯丙氨酸储备液;再量取500μl用流动相稀释至20ml,摇匀。
混合对照:量取L-正缬氨酸储备液、甘氨酸储备液、亮氨酸储备液、异亮氨酸储备液、苯丙氨酸储备液各100μl,丙氨酸储备液200μl,用流动相溶解并稀释至10ml,摇匀,进样两针。
混合溶液:称取L-缬氨酸(含量:99.0%)20mg,分别加入上述的L-正缬氨酸储备液、甘氨酸储备液、亮氨酸储备液、异亮氨酸储备液、苯丙氨酸储备液各100μl,储备液对照溶液200μl,用流动相溶解并稀释至10ml,摇匀,进样两针。
按照以下色谱条件和方法进行:
色谱柱:氨丙基键合硅胶色谱柱,250mm×4.6mm,5μm,Phenomenex Luna NH2。
流动相:体积比为72:28的乙腈与磷酸盐缓冲液的混合溶液,其中磷酸盐缓冲液浓度为15mmol/L,加入0.2%的三乙胺,用磷酸调节pH为6.2;磷酸盐缓冲液为:称取1.2g磷酸二氢钾和0.7g磷酸氢二钠溶解于1L水中,加入0.2%的三乙胺,用磷酸调pH为6.2;
用50%乙腈平衡柱子至少30分钟,然后用流动相平衡柱子至少30分钟。
流速为1.0ml/min;
检波长:210nm;
柱温:25℃;
进样方式:自动进样;
检测器:紫外检测器;
进样量为20μl;
洗脱方式:等度洗脱。
取上述混合溶液20μl注入液相色谱仪,得到色谱图,如图13和14所示,从混合溶液色谱中检查各峰之间能否分开,计算其分离度。
测定结果:取各氨基酸对照溶液20μl注入液相色谱仪,记录色谱图,对各氨基酸进行定位,结果如下表1。
表1
名称 | 保留时间 | 相对保留时间 | 理论塔板数 | 分离度 | 图谱号 |
苯丙氨酸 | 5.987 | 0.70 | 6894 | 2.57 | 图5 |
亮氨酸 | 6.730 | 0.79 | 8529 | 1.80 | 图6 |
异亮氨酸 | 7.273 | 0.85 | 8570 | 2.30 | 图7 |
L-正缬氨酸 | 7.943 | 0.93 | 13889 | 1.72 | 图8 |
L-缬氨酸 | 8.530 | 1.00 | 6772 | 5.61 | 图4 |
丙氨酸 | 11.090 | 1.30 | 7841 | 2.48 | 图9 |
甘氨酸 | 12.380 | 1.45 | 8318 | NA | 图10 |
混合对照 | NA | NA | NA | NA | 图11和图12 |
混合溶液 | NA | NA | NA | NA | 图13和图14 |
本领域技术人员知晓,上述检测的L-正缬氨酸和L-缬氨酸为异构体,性质相似,亮氨酸和异亮氨酸为异构体,性质相似,且L-正缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸均为含有羧基和氨基的一类小分子物质,理化性质相似,不易实现分离,本申请人按照中国药典2015年版和美国药典42版均采用薄层色谱法,其检测灵敏度差,各类氨基酸不明确,无法显示各类其他氨基酸的具体含量。本申请人采用美国药典40版的磷酸盐和乙腈二元流动相体系,氨基柱使用寿命不长,基线不稳,且L-缬氨酸与本发明提到的其他氨基酸无法基线分离。但采用本申请的检测方法,调控了L-缬氨酸、L-正缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸峰在色谱柱上的保留时间,提高峰的分离度和理论塔板数,改善色谱峰形,且空白溶剂不干扰各氨基酸的检测,使各氨基酸在检测时分离,并准确定量,同时有效解决了氨基柱反相使用寿命不长,基线不稳的问题。
Claims (1)
1.高效液相色谱法测定L-缬氨酸原料中其他氨基酸的方法,所述的其他氨基酸为L-正缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸和苯丙氨酸,其特征在于,包括如下步骤:
(1)制备对照品溶液:称取L-正缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸和苯丙氨酸分别置于不同量瓶中,用流动相溶解、定容、摇匀;
(2)制备供试品溶液:称取L-缬氨酸原料用流动相溶解、定容、摇匀;
(3)高效液相色谱法测定:分别取对照品溶液注入高效液相色谱仪,记录保留时间和峰面积;取供试品溶液注入高效液相色谱仪,供试品色谱图中出峰时间及峰形与对照品溶液色谱图中L-正缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸的出峰时间及峰形进行比对,判定供试品溶液是否含有L-正缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸和苯丙氨酸,将供试品色谱图中L-正缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸和苯丙氨酸峰面积与对照溶液相应氨基酸峰面积对比,计算出L-缬氨酸原料中各氨基酸的含量;
色谱条件如下:
色谱柱: 氨丙基键合硅胶色谱柱,250mm×4.6mm,5µm;
流动相:体积比为72:28的乙腈与磷酸盐缓冲液的混合溶液,其中磷酸盐缓冲液浓度为15mmol/L,加入0.2%的三乙胺,用磷酸调节pH为6.2;
流速:1.0ml/min;
柱温:25℃;
进样体积:20µl;
检测波长:UV210nm。
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