CN116836868B - 一株干酪乳杆菌bigtree-b101142及其菌剂与应用 - Google Patents
一株干酪乳杆菌bigtree-b101142及其菌剂与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株干酪乳杆菌BIGTREE‑B101142及其菌剂与应用。本发明提供的干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus casei）BIGTREE‑B101142，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2023463，该菌株具有良好的繁殖能力和产酸能力，耐受胃酸能力较强，同时具有较好的耐热能力和极高的耐胆盐能力，可以适应复杂多变的胃肠道环境，起到增强人体的免疫能力、调节肠道菌群平衡之目的。同时，该菌株对福氏志贺氏菌、鲍曼不动杆菌、耐药鲍曼不动杆菌、蜡样芽胞杆菌等菌株具有良好的抑制效果，在治疗早期微生物感染方面具有良好的开发应用前景。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株干酪乳杆菌BIGTREE-B101142及其菌剂与应用。
背景技术
干酪乳杆菌属于乳杆菌属，是革兰氏阳性菌，不产芽孢，无鞭毛，不运动，可发酵多种糖。与嗜酸乳杆菌和双歧杆菌一起被称为“健康三益菌”。
干酪乳杆菌作为益生菌的一种，能够耐受机体的防御机制，包括口腔中的酶、胃液中低pH及小肠的胆汁酸等。所以其可在肠道内的大量存活，起到调节肠道菌群平衡，促进消化吸收等功能。同时，干酪乳杆菌还具有缓解乳糖不耐症、高效降血压、降胆固醇、增强人体免疫以及抑制肿瘤生长等作用。
干酪乳杆菌由于具有良好的耐酸及胆汁抗性，因此可用于医疗保健，畜牧养殖，功能性食品等多个行业，但当今应用干酪乳杆菌的产品仍为少数，由于如今抗生素的大量使用，使得许多微生物产生了耐药性变异，食品中的药物残留也给人体胃肠道带来了难以解决的问题，因此，发现一株具有良好抑菌效果，同时可调节人体胃肠道环境的益生菌极为重要。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一株干酪乳杆菌BIGTREE-B101142及其菌剂与应用。本发明提供的干酪乳杆菌BIGTREE-B101142，具有良好的胃酸耐受力、高温耐受力，同时还具有良好的产酸能力和适应机体胃肠道的生理生化能力，对福氏志贺氏菌、鲍曼不动杆菌、耐药鲍曼不动杆菌、蜡样芽胞杆菌等菌株具有良好的抑制效果，可以增强机体的免疫能力，应用于病原菌的早期治疗和预防有十分明显的效果。
本发明的技术方案是：
本发明提供了一株干酪乳杆菌（Lacticaseibacilluscasei）BIGTREE-B101142，已于2023年4月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为中国武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2023463，分类学命名为干酪乳杆菌(Lacticaseibacilluscasei)；其16S rRNA 如核苷酸序列如 SEQ ID NO:1所示，所述的16S rRNA全序列已上传GenBank数据库，接收序列号为：OQ608442.1。
进一步地，本发明提供一种干酪乳杆菌BIGTREE-B101142在制备具有抑菌作用的药品中的应用。
更进一步地，所述的抑菌作用中抑制的病原菌包括福氏志贺氏菌、鲍曼不动杆菌、蜡样芽胞杆菌。
更进一步地，所述福氏志贺氏菌的保藏编号为BNCC 186377，蜡样芽胞杆菌的保藏编号为BNCC 192974，鲍曼不动杆菌的保藏编号为BNCC 337173，耐药鲍曼不动杆菌的保藏编号为ATCC BAA-1605。
进一步地，本发明还提供了一种所述的干酪乳杆菌BIGTREE-B101142在制备降低甘油三酯的药品中的应用。
进一步地，本发明的干酪乳杆菌BIGTREE-B101142具有较强的繁殖能力，可以耐受高温环境，产酸能力强，在MRS培养基中37℃培养25小时pH可达4.37，同时耐胃酸能力优良，同时具有良好的耐胆盐能力。
本发明的另一技术方案为，提供一种菌剂，所述菌剂包含上述的干酪乳杆菌BIGTREE-B101142。
进一步地，所述菌剂中干酪乳杆菌BIGTREE-B101142的活菌数为500~3000亿CFU/g。
进一步地，所述菌剂为固态菌剂或液态菌剂。
本发明中通过对干酪乳杆菌BIGTREE-B101142进行菌体生长状态观察、温度耐受能力评价、产酸能力评价、耐酸能力评价、耐胆盐能力评价及其菌液和发酵物对多种可致病菌的抑菌效果进行研究分析，可得，本发明的干酪乳杆菌BIGTREE-B101142生长繁殖能力强，耐高温能力强、产酸能力强、耐酸能力强、耐胆盐能力强，其菌液及发酵产物对微生物早期感染有一定的作用，对于福氏志贺氏菌、鲍曼不动杆菌、耐药鲍曼不动杆菌、蜡样芽胞杆菌等具有良好的抑制效果。最后本发明对干酪乳杆菌BIGTREE-B101142进行全基因组测序，为后续干酪乳杆菌HP-B1142的深入研究提供基础。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
（1）本发明提供的干酪乳杆菌BIGTREE-B101142筛选自新疆奶疙瘩（购自新疆乌鲁木齐市头屯河区），在MRS固体培养基上生长良好，生长繁殖能力，产酸能力强，且耐酸能力强，同时对胆盐有很高的耐受能力，可以有效提高对胃肠道环境的耐受能力，可以适应调节胃肠道菌群平衡，调节及增强机体的免疫功能，促进机体健康。
（2）本发明筛选的干酪乳杆菌BIGTREE-B101142具有优异的抑菌作用，对福氏志贺氏菌、鲍曼不动杆菌、耐药鲍曼不动杆菌、蜡样芽胞杆菌的抑制作用较强。可应用于病原菌的早期治疗和预防。
本发明筛选的干酪乳杆菌BIGTREE-B101142的菌液及其发酵产物可以有效降甘油三酯，经试验验证，本发明的干酪乳杆菌BIGTREE-B101142的菌液对于甘油三酯的降解率为43.5%。同时，经过生物信息学比对分析，本发明的干酪乳杆菌BIGTREE-B101142基因组中不含抗性基因、耐药基因及毒力因子，为一株安全性较高的益生菌，可大量用于医疗保健等行业。
生物保藏说明：
干酪乳杆菌（Lacticaseibacilluscasei）BIGTREE-B101142，已于2023年4月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为中国武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCCNO：M 2023463，分类学命名为干酪乳杆菌(Lacticaseibacilluscasei)。
附图说明
图1为干酪乳杆菌BIGTREE-B101142的生长形态图；
图2为干酪乳杆菌BIGTREE-B101142的16S rRNA进行PCR扩增反应，所得PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中，M：2K plus II DNA marker；1，2，3，4：干酪乳杆菌BIGTREE-B101142的16S rRNA PCR扩增产物；
图3为干酪乳杆菌BIGTREE-B10114单克隆菌体PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中M：2K plus II DNA marker；1：单克隆抗体PCR产物；
图4为干酪乳杆菌BIGTREE-B101142的遗传进化树；
图5为干酪乳杆菌BIGTREE-B10114碳水化合物发酵试验颜色变化图；其中，1-11分别以七叶苷、纤维二糖、麦芽糖、甘露醇、水杨苷、山梨醇、蔗糖、棉子糖、菊糖、乳糖、1%马尿酸钠为碳源；
图6为干酪乳杆菌BIGTREE-B101142发酵液的抑菌效果图，其中A为福氏志贺氏菌BNCC186377，B为蜡样芽胞杆菌BNCC192974，C为鲍曼不动杆菌BNCC337173，D为耐药鲍曼不动杆菌ATCC BAA-1605；
图7为干酪乳杆菌BIGTREE-B101142全基因组图谱；
图8为编码基因通用数据库注释共有和特有注释统计图；
图9为PFAM结构域统计图；
图10为GO注释结果分类图；其中，A为生物学过程的基因功能分类图，B为细胞组分的基因功能分类图，C为分子功能的基因功能分类图；
图11为KEGG pathway结果分类图；
图12为COG结果分类图；
图13为NR物种分布图；
图14为TCDB结果分类图。
实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的保护范围之内。
以下实施例和对比例中，未作特别说明的试剂为常规试剂，均可在常规试剂生产销售公司购买，所用方法，如无特殊说明，均为现有技术。
本发明所述菌株分离自新疆奶疙瘩（购自新疆乌鲁木齐市头屯河区），所述MRS固体培养基（型号为CM188）、MRS液体培养基（型号CM187）、LB固体培养基（型号CM159）均购自北京陆桥技术股份有限公司。
实施例1：干酪乳杆菌（Lacticaseibacilluscasei）BIGTREE-B101142的分离、纯化与鉴定
（1）干酪乳杆菌（Lacticaseibacilluscasei）BIGTREE-B101142的分离与纯化
此菌株来源于新疆奶疙瘩。分离纯化过程如下：取1 g新鲜新疆奶疙瘩于9 ml生理盐水中溶解，稀释至浓度为10-5~10-9 CFU∙ml−1后涂布于固体MRS培养基中37 ℃培养24 h，获得单菌落；挑取单菌落于固体MRS培养基中进行三区划线37℃培养24 h，后挑取单菌落进行菌株鉴定，得纯化后的菌株。
本发明干酪乳杆菌BIGTREE-B101142在MRS固体培养基上生长的照片如图1所示，
肉眼观察菌落形态为乳白色、呈圆形状、菌落直径1~3 mm。
（2）干酪乳杆菌（Lacticaseibacilluscasei）BIGTREE-B101142的16S rRNA全测序鉴定
挑取已经纯化的菌株，用改良的SDS-碱裂解法得菌株DNA片段。用16S引物27F-PBACS和1541R-PBACS对菌株的16S rRNA进行PCR扩增反应。所述PCR扩增反应的体系：预变性（95℃，10 min），变性（95℃，30 s），退火（55℃，30 s），延伸（72℃，90 s），循环31个，后延伸（72℃，10 min）。所述引物序列I如表1所示。
将所得PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，如图2所示。后进行胶回收，胶回收产物基因重组到GB05-dir中，于含有卡那霉素的固体LB培养基37℃倒置培养12 h后挑取单克隆菌体，用16S引物T7-Elong和T7-TermElong对所得单克隆抗体进行PCR扩增反应，反应体系为：预变性（95℃，10 min），变性（95℃，30 s），退火（55℃，30 s），延伸（72℃，90 s），循环31个，后延伸（72℃，10 min）。所述引物序列II如表2所示。将所得PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，如图3所示。
将PCR产物送至苏州金唯智生物科技有限公司测序，菌株的16S rRNA的核苷酸序列为SEQ ID NO：1：GAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGAGTTTTGGTCGATGAACGGTGCTTGCACTGAGATTCGACTTAAAACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCTTAAGTGGGGGATAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAAATCCAAGAACCGCATGGTTCTTGGCTGAAAGATGGCGCAAGCTATCGCTTTTGGATGGACCCGCGGCGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGATGATACGTAGCCGAACTGAGAGGTTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTGGAGAAGAATGGTCGGCAGAGTAACTGTTGTCGGCGTGACGGTATCCAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCTCGGCTTAACCGAGGAAGCGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAATGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTTTGATCACCTGAGAGATCAGGTTTCCCCTTCGGGGGCAAAATGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATGACTAGTTGCCAGCATTGAGTTGGGCACTCTAGTAAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAGACCGCGAGGTCAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCGAAGCCGGTGGCGTAACCCTTTTAGGGAGCGAGCCGTCTAAGGTGGGACAAATGATTAGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTAGGAGAACCTGCGGCTGGATCACCTCCTT。
经BLAST基因比对，与GenBank中干酪乳杆菌DSM 20011相似度达99.80%，为一株干酪乳杆菌，命名为BIGTREE-B101142，16S rRNA序列已上传NCBI，序列号为OQ608442.1。
作遗传进化树对干酪乳杆菌（Lacticaseibacilluscasei）BIGTREE-B101142进行比对，结果如图4所示。
（3）干酪乳杆菌（Lacticaseibacilluscasei）BIGTREE-B101142碳水化合物发酵试验
选用HBI G11乳酸菌生化鉴定条（购自青岛海博生物技术有限公司）鉴定干酪乳杆菌（Lacticaseibacilluscasei）BIGTREE-B101142对11种碳水化合物的反应情况。颜色变化如图5所示，其中，1-11分别以七叶苷、纤维二糖、麦芽糖、甘露醇、水杨苷、山梨醇、蔗糖、棉子糖、菊糖、乳糖、1%马尿酸钠为碳源。结果如表3所示，由表3可知，干酪乳杆菌BIGTREE-B101142在11种碳水化合物发酵试验中，能够利用、分解并代谢七叶苷、纤维二糖、麦芽糖、甘露醇、水杨苷、山梨醇、蔗糖、菊糖、乳糖、1%马尿酸钠10种碳水化合物。
实施例2：干酪乳杆菌（Lacticaseibacilluscasei）BIGTREE-B101142的菌株生长状态评价
用竹签将MRS固体培养基上干酪乳杆菌（Lacticaseibacilluscasei）BIGTREE-B101142的单菌落接种至新鲜灭菌完全冷却的MRS液体培养基中，37℃，100 rpm厌氧培养24h。移液枪吸取1 ml发酵液，8000 rpm离心1 min，弃上清液，留菌体，称量计算得湿重。55℃烘干12 h后再次称量计算得干重，试验结果如表4所示。称量所得的菌体的干重仍有1.915×10-3±0.002 g/mL，由此可得干酪乳杆菌（Lacticaseibacilluscasei）BIGTREE-B101142有较强的生长能力，可进行大量繁殖。
实施例3：干酪乳杆菌（Lacticaseibacilluscasei）BIGTREE-B101142的温度耐受能力评价
用竹签将MRS固体培养基上干酪乳杆菌（Lacticaseibacilluscasei）BIGTREE-B101142的单菌落接种至新鲜灭菌完全冷却的MRS液体培养基中，37℃，100 rpm厌氧培养24h。分别对37℃、45℃、60℃、75℃时的菌液加热1 min、2 min、3 min，将菌液稀释至浓度为10-6、10-7、10-8、10-9 CFU∙ml−1，分别取100 μL涂布至固体MRS培养基37℃厌氧培养18 h~24h。对平板单菌落进行计数，试验结果如表5所示。
由表5可知，本发明的干酪乳杆菌BIGTREE-B101142在60℃加热3 min仍然有大量活菌存在，可见，干酪乳杆菌BIGTREE-B101142的具有良好的高温耐受力。
实施例4：干酪乳杆菌（Lacticaseibacilluscasei）BIGTREE-B101142的产酸能力评价
用竹签将MRS固体培养基上干酪乳杆菌（Lacticaseibacilluscasei）BIGTREE-B101142的单菌落接种至新鲜灭菌完全冷却的MRS液体培养基中，37℃，100 rpm厌氧培养，分别于25 h、43 h、50 h时3580 rpm离心15 min后测量其上清液pH，试验结果如表6所示。
由表6可知，干酪乳杆菌（Lacticaseibacilluscasei）BIGTREE-B101142在厌氧培养25 h时就可达较强酸性，pH可达4.37，可见干酪乳杆菌（Lacticaseibacilluscasei）BIGTREE-B101142有较强的产酸能力。
实施例5：干酪乳杆菌（Lacticaseibacilluscasei）BIGTREE-B101142的耐酸能力评价
配置人工胃液（8.2 ml稀盐酸，400 ml双蒸水，5 g胃蛋白酶，摇匀后加双蒸水定容至500 ml，取一定量的溶液调pH至2.48、3.53、4.59。用0.45 μm滤膜除菌，放至4℃冰箱保存备用）。用竹签将MRS固体培养基上干酪乳杆菌（Lacticaseibacilluscasei）BIGTREE-B101142的单菌落接种至新鲜灭菌完全冷却的MRS液体培养基中，37℃，100 rpm厌氧培养18-24 h。取60 ml菌液3580 rpm离心15 min，倒掉上清液，用1.5 ml生理盐水重悬菌体。取4支离心管，分别加入6 ml人工胃液，后分别加入200 μl重悬菌液混匀。于0 min、150 min稀释至浓度为10-6、10-7、10-8、10-9 CFU∙ml−1，分别取100 μL溶液涂布至固体MRS培养基培养18-24 h后对平板单菌落进行计数并计算存活率，试验结果如表7所示。
由表7可知，干酪乳杆菌（Lacticaseibacilluscasei）BIGTREE-B101142在pH为2.48的人工胃液于150 min时的存活率达到了117.6%。由此可见，干酪乳杆菌（Lacticaseibacilluscasei）BIGTREE-B101142有较强的耐酸能力，对于胃液有较强的耐酸能力。
实施例6：干酪乳杆菌（Lacticaseibacilluscasei）BIGTREE-B101142的胆盐耐受能力评价
配置人工肠液（3.4 g磷酸二氢钾，250 ml双蒸水水溶，用0.1 mol/L的氢氧化钠溶液调pH至6.8，加2.5 g胰蛋白酶，摇匀后加双蒸水定容至500 ml，取一定量的溶液加入一定量牛胆盐，配置成胆盐浓度分别为0.03%、0.1%、0.2%、0.3%的人工肠液。用0.45 μm滤膜除菌，放至4℃冰箱保存备用）。用竹签将MRS固体培养基上干酪乳杆菌（Lacticaseibacilluscasei）BIGTREE-B101142的单菌落接种至新鲜灭菌完全冷却的MRS液体培养基中，37℃，100 rpm厌氧培养16-20 h。取60 ml菌液3580 rpm离心15 min，倒掉上清液，用1.5 ml生理盐水重悬菌体。取4支离心管，分别加入6 ml人工肠液，后分别加入200 μl重悬菌液混匀。于0 min、150 min稀释至浓度为10-6、10-7、10-8、10-9 CFU∙ml−1，分别取100 μL溶液涂布至固体MRS培养基培养16~20 h后对平板单菌落进行计数并计算存活率，试验结果如表8所示。
由表8可知，干酪乳杆菌（Lacticaseibacilluscasei）BIGTREE-B101142在胆盐浓度为0.3%时的存活率高达188.88%。可说明干酪乳杆菌（Lacticaseibacilluscasei）BIGTREE-B101142对胆盐有较高的耐受能力。
实施例7：干酪乳杆菌（Lacticaseibacilluscasei）BIGTREE-B101142发酵液抑菌效果评价
用竹签将MRS固体培养基上干酪乳杆菌（Lacticaseibacilluscasei）BIGTREE-B101142的单菌落接种至新鲜灭菌完全冷却的MRS液体培养基中，37℃，100 rpm·min-1厌氧培养16 h。取一定量菌液，8000 rpm离心1 min，收集上清液。另取一定量菌液备用。分别取福氏志贺氏菌（BNCC 186377），蜡样芽胞杆菌（BNCC 192974），鲍曼不动杆菌（BNCC337173），耐药鲍曼不动杆菌（ATCC BAA-1605），用LB固体培养基按5%的菌浓度（即每100 ml固体培养基加入5 ml的菌液）进行混菌，倒至LB固体培养基上，待混菌平板稍干后均匀放置直径为8.0 mm的4个牛津杯，静止5 min；两个牛津杯加入200 μl上清液（发酵液上清S），两个牛津杯加入200 μl未离心的菌液（发酵液含菌F），放4℃冰箱静置4 h，后37℃正置培养24h后观察并记录抑菌直径。试验结果如图6和表9所示，图6为干酪乳杆菌BIGTREE-B101142发酵液的抑菌效果图，其中A为福氏志贺氏菌BNCC186377，B为蜡样芽胞杆菌BNCC192974，C为鲍曼不动杆菌BNCC337173，D为耐药鲍曼不动杆菌ATCC BAA-1605；在图6的A~D中，F表示未离心的干酪乳杆菌BIGTREE-B101142发酵液（发酵液含菌），S表示离心后干酪乳杆菌BIGTREE-B101142发酵液的上清液（发酵液上清）。
结果表明干酪乳杆菌（Lacticaseibacilluscasei）BIGTREE-B101142发酵产物福氏志贺氏菌、蜡样芽胞杆菌、鲍曼不动杆菌、耐药鲍曼不动杆菌有较强的抑菌效果。
实施例8：干酪乳杆菌（Lacticaseibacilluscasei）BIGTREE-B101142全基因组测定
基于Nanopore三代测序技术和二代测序技术平台进行测序及基因组组装获得干酪乳杆菌（Lacticaseibacilluscasei）BIGTREE-B101142基因组完成图，图7为该菌的可视化基因组图，由外到内依次为：第一圈，基因组序列信息；第二圈，基因组序列的GC含量曲线，以2000bp为一滑窗在基因组上滑动，统计的平均GC含量；虚线展示了参考基因组的平均GC含量；第三圈，基因组序列的GC skew曲线，以2000bp为一滑窗在基因组上滑动，统计的平均GC含量；虚线展示了GC skew为0的参考线；第四圈，二代测序深度及覆盖度信息，以2000bp为一滑窗在基因组上滑动，统计的平均测序深度，反应出不同区域的reads覆盖情况；虚线展示了整体水平的平均reads覆盖度；第五圈，三代测序深度及覆盖度信息，以2000bp为一滑窗在基因组上滑动，统计的平均测序深度，反应出不同区域的reads覆盖情况；虚线展示了整体水平的平均reads覆盖度；第六圈，展示了参考基因组中的基因编码区（CDS）以及非编码RNA区（rRNA、tRNA），以内外两层表示，外层代表正链，内层代表负链。该菌基因组大小为2912063 bp，GC比为47.91%，其基因组含2873个CDS、59个tRNA和15个rRNA，不含质粒。
实施例9：干酪乳杆菌（Lacticaseibacilluscasei）BIGTREE-B101142通用数据库基因组功能注释分析
（1）通用数据库注释比例统计
本发明为获得全面的基因功能信息，进行了八大数据库的基因功能注释，包括：UniProt、KEGG及KEGG Pathway、GO、Pfam、COG、TIGERfams、RefSeq、NR。将预测得到的基因序列与COG、KEGG、Uniprot、Refseq等功能数据库做 BLAST+（Version：2.11.0+）比对，得到基因功能注释结果。使用软件hmmer（Version：3.3.2）基于Pfam、TIGERFAM数据库进行功能注释。注释统计结果如表10所示。编码基因通用数据库注释共有和特有注释如图8所示，图中左侧为通用数据库基因注释统计；右侧为共有和特有统计，其中横坐标是根据黑点所在位置对应的左侧的数据库，纵坐标代表着该菌株在横坐标的各数据库组合中所含的基因数目。例如第一列为所有通用数据库共有统计，上方为数目统计，下方为共有或特有数据库的的标注。根据数据可得，干酪乳杆菌（Lacticaseibacilluscasei）BIGTREE-B101142所含较多的基因片段都能在各大通用数据库中获得全面的基因功能信息，且能获得的基因功能信息较多，对该菌株各基因研究提供了一定的基础。
（2）Pfam结构域分类
Pfam数据库是同源蛋白家族数据库，是一个蛋白质结构域家族的集合，包括了一万六千多个蛋白质家族。蛋白质一般是由一个或多个功能区域组成，这些功能区域通常称作结构域（domain）。在不同的蛋白质中结构域以不同的组合出现，形成了蛋白质的多样性，识别出蛋白质中的结构域对于了解蛋白质的功能有重要意义。
本发明基于Pfam结构域的注释，对每个结构域注释的基因进行统计汇总，并将注释最多的前20个结构域绘图展示，结果如图9所示，图中横坐标是蛋白质家族的名称，纵坐标是比对到该蛋白质家族的基因的数。
通过与Pfam同源蛋白家族数据库进行比对，发现干酪乳杆菌（Lacticaseibacilluscasei）BIGTREE-B101142中含有较多结构域，并对注释最多的前20个结构域绘图展示，这些结构域对蛋白质分子功能的研究提供了研究依据。
（3）Gene Ontology分类
Gene Ontology（简称GO）是一个国际标准化的基因功能分类体系，提供了一套动态更新的标准词汇表（controlled vocabulary）来全面描述生物体中基因和基因产物的属性。
本发明将GO（Gene Ontology）注释信息经简化后得到GOslim分类，将基因的功能从细胞组分、分子功能、生物学过程三个方面进行汇总统计后，选取每个分类下前20个注释最多的GOslim的二级分类进行绘图，结果如图10所示，图中横坐标为GO各分类内容，纵坐标为基因数目，在图10中，A为生物学过程的基因功能分类图，B为细胞组分的基因功能分类图，C为分子功能的基因功能分类图。图10展示的是在全部基因背景下GO各二级功能的基因富集的情况，体现此背景下各二级功能的地位；从图10中可以得出干酪乳杆菌（Lacticaseibacilluscasei）BIGTREE-B101142中基因和基因产物的功能以及显示该功能基因的数量，显示了各个功能的强弱，为后续深入研究提供了研究的方向。
（4）KEGG Pathway 分类
KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）是***分析基因产物在细胞中的代谢途径（Pathway）以及这些基因产物功能的主要公共数据库，利用KEGG可以进一步研究基因在生物学上的复杂行为。
本发明对基因组做KEGG注释后，根据它们参与的KEGG代谢通路进行分类，结果如图11所示，图中横坐标为Pathway分类下注释的基因数目；纵坐标为Pathway分类，不同颜色代表所属的不同的大分类；图11展示了干酪乳杆菌（Lacticaseibacilluscasei）BIGTREE-B101142各基因产物在细胞中的代谢途径的方式。
（5）COG分类
COG（Cluster of Orthologous Groups of proteins）是对基因产物进行直系同源分类的数据库，每个COG蛋白都被假定来自祖先蛋白，COG数据库是基于细菌、藻类、真核生物具有完整基因组的编码蛋白、***进化关系进行构建的，将Unigene和COG数据库进行比对，预测gene可能的功能并对其做功能分类统计，从宏观上认识该物种的基因功能分布特征。COG分为26个group。
本发明将COG注释的基因按COG的group进行分类，结果如图12所示，图中横坐标为COG各分类内容，纵坐标为基因数目。在不同的功能类中，基因所占多少反映对应时期和环境下代谢或者生理偏向等内容，可以结合研究对象在各个功能类别的分布作出科学的解释。
（6）Uniprot注释
UniProt Archive是一个综合性的非冗余数据库，它包含了所有主要的、公开的数据库的蛋白质序列。由于蛋白质可能在不同的数据库中存在，并且可能在同一个数据库中有多个版本。
本发明所述干酪乳杆菌（Lacticaseibacilluscasei）HP-B1142全基因组注释到Uniprot数据库的基因数为2842，占比98.92%。
（7）Refseq注释
Refseq（Reference Sequences）数据库是一个收录注释过的非冗余转录体、蛋白质和基因组序列数据库，是经过NCBI和其他组织校正的数据库，使用人类基因命名委员会定义的术语，并且包括了官方的基因符号和可选的符号。RefSeq序列是NCBI筛选过的非冗余数据库，一般可信度比较高。
本发明所述干酪乳杆菌（Lacticaseibacilluscasei）HP-B1142全基因组注释到Refseq数据库的基因数为2827，占比98.40%。
（8）NR注释
NR数据库：非冗余蛋白质的氨基酸序列数据库，包含SwissProt、PIR（ProteinInformation Resource）、PRF（Protein Research Foundation）、PDB（Protein Data Bank）蛋白质数据库非冗余的数据以及从GenBank和RefSeq的CDS数据翻译来的蛋白质数据。
本发明所述干酪乳杆菌（Lacticaseibacilluscasei）HP-B1142的NR物种分布图如图13所示。图中不同颜色代表不同的物种。
（9）TIGRFAMs注释
TIGRFAMs是一个由多序列比对、隐马尔可夫模型（HMMs）和相关信息组成的数据库，是interPro中的一个成员，用于蛋白质序列分类，并支持自动注释（大部分是原核生物）蛋白质。从v10.0开始，TIGRFAMs模型使用HMMER 3，它具有出色的检索速度和敏感性。
本发明所述干酪乳杆菌（Lacticaseibacilluscasei）HP-B1142全基因组注释到Tigrfams数据库的基因数为1419，占比49.39%。
实施例10：干酪乳杆菌（Lacticaseibacilluscasei）BIGTREE-B101142专有数据库注释
本发明为个性化分析干酪乳杆菌（Lacticaseibacilluscasei）BIGTREE-B101142，对其进行专有数据库注释，包括ARDB数据库注释、基于CAZy数据库的碳水化合物酶注释、病原与宿主互作分析、耐药基因注释、细胞色素P450注释、VFDB注释、信号肽预测、TCDB转运蛋白注释。
本发明所述干酪乳杆菌（Lacticaseibacilluscasei）BIGTREE-B101142全基因组经专有数据库注释后发现：于ARDB数据库注释到抗性基因结果如表11所示；于病原与宿主互作数据库中未注释到完全匹配的基因序列；于CARD数据库未注释到耐药基因；细胞色素P450注释未得到完全匹配的基因序列；于VFDB数据库未注释到完全匹配的毒力因子。碳水化合物酶注释结果如表12所示；干酪乳杆菌BIGTREE-B101142全基因组信号肽预测结果如表13所示，跨膜蛋白及分泌蛋白预测结果如表14所示；TCDB膜转运蛋白注释结果如图14所示，图中横坐标为TCDB各分类内容，纵坐标为基因数目。
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实施例11：干酪乳杆菌降甘油三酯（TG）体外实验
（1）实验菌株制备
用竹签蘸取甘油菌于MRS培养基进行三区划线培养24 h，后挑取生长状态良好的菌落接种于MRS液体培养基和甘油三脂培养基中，备用。
甘油三酯培养基配方的制备：将2％的聚乙烯醇水溶液与100%的大豆植物油按体积比3：1混合，混合均匀制成植物油乳化液，作为甘油三酯的来源。将上述制备的植物油乳化液按5％的比例加入到MRS培养基中，调pH至6.4，121℃，15 min灭菌，制成甘油三酯培养基并于4℃冰箱贮存备用。
（2）单试剂法甘油三酯含量测定实验(GPO-PAP法)
分别取10 mL培养24 h后的干酪乳杆菌BIGTREE-B101142菌液及10 mL未接种菌液的甘油三酯培养基用冷冻离心机，4℃，4000r/min离心10 min，取上清液，使用甘油三酯试剂盒(南京建成生物试剂公司A110- 1-1)，测定其510 nm处的OD值。TG（mmol/L）=（样品OD510-空白OD510）/（校准OD510-空白OD510）×标准品浓度（mmol/L）
（3）干酪乳杆菌TG降解率计算
依照公式TG降解率（%）=（总TG含量-残留TG含量）/总TG含量×100%计算得到本发明干酪乳杆菌对于TG的降解率为43.5%。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (6)
1.一株干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus casei ）BIGTREE-B101142，其特征在于，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2023463。
2.一种根据权利要求1所述的干酪乳杆菌BIGTREE-B101142在制备具有抑菌作用的药品中的应用，其特征在于，抑菌作用中抑制的病原菌包括福氏志贺氏菌、鲍曼不动杆菌、蜡样芽胞杆菌。
3.一种根据权利要求1所述的干酪乳杆菌BIGTREE-B101142在制备降甘油三酯的药品中的应用。
4.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂包含权利要求1所述的干酪乳杆菌BIGTREE-B101142。
5.根据权利要求4所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂中干酪乳杆菌BIGTREE-B101142的活菌数为500~3000亿CFU/g。
6.根据权利要求4所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂为固态菌剂或液态菌剂。
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| "干酪乳杆菌的益生特性及在食品中应用研究进展";迟珺曦等;《农产品加工》(第9期);第70-74、83页 * |
Also Published As
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