CN111004735A - 一株发酵乳杆菌及其在改善肠道健康方面的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株发酵乳杆菌及其在改善肠道健康方面的应用，属于微生物技术领域以及医药技术领域。本发明筛选得到的发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)CCFM1037可改善肠道健康，具体体现在：(1)能以低聚果糖、低聚木糖和低聚半乳糖为唯一碳源生长并代谢产酸，具有广谱低聚糖利用能力；(2)体外代谢能产生乙酸、丙酸、丁酸等多种短链脂肪酸；(3)可显著降低肠道中Parabacteroides的相对丰度，因此，发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)CCFM1037在制备改善肠道健康的产品(如食品、药品或保健品等)中，具有巨大的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一株发酵乳杆菌及其在改善肠道健康方面的应用，属于微生物技术领域以及医药技术领域。
背景技术
肠道微生态是人体最重要且最复杂的生态环境，而肠道菌群是肠道微生态最活跃的组成部分之一。人体肠道中的微生物种类达500～1000种，其中，厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门、变形菌门和疣微菌门是正常人体肠道菌群结构的主体部分。
肠道菌群结构是微生物及其宿主的共同选择，二者相互作用以维持肠道微生态***的功能稳定性。一般来说，健康宿主的肠道菌群处于一个动态的平衡状态，若是受饮食、环境以及抗生素的使用等影响，平衡被打破，将会引发肠道通透性的改变，随后导致细菌及其代谢物的转移，从而引起宿主的胃肠道疾病，并具有产生一系列并发症的可能。因此，保持肠道菌群平衡对人体健康十分重要。
Parabacteroides是存在于人体肠道内的一种致病菌，若人体肠道菌群失衡，Parabacteroides会在人体大量增殖，进而引起人体阑尾炎、腹腔炎症、菌血症等疾病；并且，由于抗生素无法选择性抑制Parabacteroides，Parabacteroides在抗生素施用过程中也易获耐药性，另外，有研究显示，低剂量的青霉素甚至能提高肠道中Parabacteroides的相对丰度，增加患菌血症的风险，因此，人体一但感染Parabacteroides很难治疗，急需找到可抑制肠道内Parabacteroides的方法。
目前，虽然已经有部分研究通过筛选获得了一些具有改善肠道菌群失衡的益生菌，例如，公开号为CN107312726A的专利申请文本公开了一种植物乳杆菌，此植物乳杆菌可抑制肠道内大肠杆菌、沙门氏菌、猪链球菌以及金黄色葡萄球菌等有害菌的生长；公开号为CN104232515A的专利申请文本公开了一种动物双歧杆菌，此动物双歧杆菌能够增加肠道中双歧杆菌和乳杆菌的数量，同时，能够降低肠道中拟杆菌和大肠杆菌的数量。
但是，上述益生菌均对Parabacteroides缺乏针对性，目前，仍没有一株可显著抑制人体肠道内Parabacteroides的益生菌，这无疑阻碍了Parabacteroides感染的治疗。
发明内容
[技术问题]
本发明要解决的技术问题是提供一株可显著抑制人体肠道内Parabacteroides相对丰度的发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)；所述相对丰度是指样品中某一种菌的数量占样品中细菌总数量的百分比。
[技术方案]
为解决上述问题，本发明提供了一株发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)CCFM1037，所述发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)CCFM1037已于2018年11月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60488，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
所述发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)CCFM1037是从来源于海南省澄迈县老城镇罗驿村的村民粪便样本中分离得到的，该菌株经测序分析，其16S rRNA序列如SEQID NO.1所示，将测序得到的序列在NCBI中进行核酸序列比对，结果显示菌株为发酵乳杆菌，命名为发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)CCFM1037。
所述发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)CCFM1037具有以下特征：
(1)在MRS培养基上培养48h后的菌落呈圆形、白色、透明、光滑；
(2)耐模拟胃肠液：在pH为3的含有3g/L胃蛋白酶的生理盐水中培养3h后，存活率高达110.9±7.58％；在pH为8的含有1g/L胰蛋白酶和0.3％(m/v)(即0.3g/100mL)胆盐的生理盐水中培养4h后，存活率为14.15±5.54％；在pH为3的含有3g/L胃蛋白酶的生理盐水中培养3h后，继续在pH为8的含有1g/L胰蛋白酶和0.3％(m/v)胆盐的生理盐水中培养4h，存活率仍有15.69±0.42％；
(3)能以低聚果糖、低聚木糖和低聚半乳糖为唯一碳源生长并代谢产酸，具有广谱低聚糖利用能力；
(4)体外代谢能产生乙酸、丙酸、丁酸等多种短链脂肪酸；
(5)可显著降低肠道中Parabacteroides的相对丰度。
本发明提供了上述一株发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)CCFM1037在制备改善肠道健康的产品中的应用。
本发明的一种实施方式中，所述产品中，发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)CCFM1037的活菌数为不低于1×106CFU/mL或1×106CFU/g。
本发明的一种实施方式中，所述产品中，发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)CCFM1037的活菌数为不低于1×108CFU/mL或1×108CFU/g。
本发明的一种实施方式中，所述产品包含食品、药品或保健品。
本发明的一种实施方式中，所述药品含有发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)CCFM1037、药物载体和/或药用辅料。
本发明提供了一种用于改善肠道健康的产品，所述产品含有上述发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)CCFM1037。
本发明的一种实施方式中，所述产品中，发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)CCFM1037的活菌数为不低于1×106CFU/mL或1×106CFU/g。
本发明的一种实施方式中，所述产品中，发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)CCFM1037的活菌数为不低于1×108CFU/mL或1×108CFU/g。
本发明的一种实施方式中，所述产品包含食品、药品或保健品。
本发明的一种实施方式中，所述药品含有发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)CCFM1037、药物载体和/或药用辅料。
有益效果：
本发明筛选出了一株发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)CCFM1037，此发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)CCFM1037可改善肠道健康，具体体现在：
(1)功能性低聚糖不能被胃与小肠中被消化吸收，但可以被大肠中的益生菌利用，增殖有益菌、抑制有害菌，调节肠道菌群平衡，而本发明的发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)CCFM1037能以低聚果糖、低聚木糖和低聚半乳糖为唯一碳源生长并代谢产酸，具有广谱低聚糖利用能力；
(2)短链脂肪酸可以降低肠道内pH值，改善肠道酸性环境，增殖有益菌、抑制有害菌以调节肠道菌群，改善肠道功能，而本发明的发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)CCFM1037体外代谢能产生乙酸、丙酸、丁酸等多种短链脂肪酸，并且，灌胃本发明的发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)CCFM103715天后，小鼠粪便中短链脂肪酸的含量明显上升；
(3)Parabacteroides属于存在于人体肠道内的一种易对抗生素产生抗性的有害菌，会引起机体阑尾炎、腹腔炎症、菌血症等疾病，而本发明的发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)CCFM1037可显著降低肠道中Parabacteroides的相对丰度，灌胃本发明的发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)CCFM103715天后，小鼠粪便中Parabacteroides的相对丰度明显下降，
因此，本发明的发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)CCFM1037在制备改善肠道健康的产品(如食品、药品或保健品等)中，具有巨大的应用前景。
生物材料保藏
一株发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)CCFM1037，分类学命名为Lactobacillus fermentum，已于2018年11月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60488，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
附图说明
图1：不同株发酵乳杆菌在模拟胃液下培养3h后继续于模拟肠液下培养4h的存活率；其中，横坐标是发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF1、LF2、LF3、LF4、LF5、LF6、LF7、LF8、LF9、LF10、CCFM1037的编号。
图2：不同株发酵乳杆菌在体外培养过程中总短链脂肪酸的产量；其中，横坐标是发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF1、LF2、LF3、LF4、LF5、LF6、LF7、LF8、LF9、LF10、CCFM1037的编号。
图3：不同株发酵乳杆菌在体外培养过程中乙酸的产量；其中，横坐标是发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF1、LF2、LF3、LF4、LF5、LF6、LF7、LF8、LF9、LF10、CCFM1037的编号。
图4：不同株发酵乳杆菌在体外培养过程中丙酸的产量；其中，横坐标是发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF1、LF2、LF3、LF4、LF5、LF6、LF7、LF8、LF9、LF10、CCFM1037的编号。
图5：不同株发酵乳杆菌在体外培养过程中丁酸的产量；其中，横坐标是发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF1、LF2、LF3、LF4、LF5、LF6、LF7、LF8、LF9、LF10、CCFM1037的编号。
图6：实施例9中CCFM1037组小鼠粪便中Parabacteroides的相对丰度，其中，“*”表示与空白组具有显著性差异(P<0.05)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中涉及的胃蛋白酶1:10000U(产品编号：A600688、CAS：[9001-75-6])购自生工生物工程(上海)股份有限公司；下述实施例中涉及的胰蛋白酶1:250(产品编号：64008867、CAS：[9002-07-7])购自国药集团化学试剂有限公司；下述实施例中涉及的胆盐购自上海拜力生物科技有限公司；下述实施例中涉及的葡萄糖购于国药集团化学试剂有限公司；下述实施例中涉及的低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(GOS)购自保龄宝生物股份有限公司；下述实施例中涉及的低聚木糖(XOS)购自上海源叶生物科技有限公司；下述实施例中涉及的脱脂乳粉购自伊利。
下述实施例中涉及的培养基如下：
MRS液体培养基(g/L)：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、葡萄糖20g/L、无水乙酸钠2g/L、柠檬酸氢二胺2g/L、K2HPO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、MnSO4·7H2O 0.25g/L、吐温-801g/L、蒸馏水1000g/L。
MRS固体培养基(g/L)：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、葡萄糖20g/L、无水乙酸钠2g/L、柠檬酸氢二胺2g/L、K2HPO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、MnSO4·7H2O 0.25g/L、吐温-801g/L、琼脂20g/L、蒸馏水1000g/L。
实施例1：发酵乳杆菌的筛选及菌种鉴定
1、筛选
以来源于海南省澄迈县老城镇罗驿村的村民粪便为样本，用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释至10-6，然后分别取100μL稀释梯度为10-4、10-5、10-6的稀释液于MRS固体培养基上进行平板涂布，37℃培养48h，观察并记录菌落形态；挑取MRS固体培养基上不同形态的菌落进行划线分离，经37℃培养48h后，再次挑取MRS固体培养基上不同形态的单菌落进行划线分离，直至得到形态一致的纯的单菌落；挑取MRS固体培养基上的纯菌落接种于5mLMRS液体培养基中，37℃培养18h；取1mL菌液于无菌离心管中，8000r/min离心3min后弃去上层培养基，菌泥重悬于30％甘油溶液中置于-80℃中保藏，得到菌株。
2、鉴定
对分离得到的菌株进行PCR扩增16S rDNA，PCR产物送至华大基因测序有限公司进行测序(CCFM1037的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示)，将测序得到的结果在NCBI中进行核酸序列比对，最终得到11株发酵乳杆菌，分别命名为发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)CCFM1037、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF1、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF2、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF3、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF4、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF5、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF6、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF7、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF8、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF9和发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF10。
实施例2：发酵乳杆菌的培养
将发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)CCFM1037接入MRS固体培养基上于37℃培养48h后，观察其菌落，发现其菌落呈圆形、白色、透明、光滑。
实施例3：不同发酵乳杆菌对模拟胃肠液的耐受性
具体步骤如下：
1、不同发酵乳杆菌对模拟胃液的耐受性
将实施例1获得的发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)CCFM1037、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF1、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF2、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF3、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF4、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF5、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF6、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF7、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF8、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF9以及发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF10分别接入MRS液体培养基中于37℃培养18h后，离心收集细胞，将收集到细胞经生理盐水洗涤，洗涤结束后，再次离心收集细胞，将收集到细胞分别重悬于pH为3(pH由HCl调节)的含有3g/L胃蛋白酶的生理盐水中至菌液OD600为5.0，取1mL菌液进行平板活菌计数作为菌液中发酵乳杆菌的原始活菌数，将剩余菌液置于37℃培养3h后，取1mL菌液进行平板活菌计数作为耐受模拟胃液后菌液中发酵乳杆菌的活菌数。
其中，耐受胃液后的存活率(％)＝(耐受模拟胃液后菌液中发酵乳杆菌的活菌数/菌液中发酵乳杆菌的原始活菌数)100％。
检测结果如下：在pH为3的含有胃蛋白酶的生理盐水中培养3h后，发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)CCFM1037的存活率为110.46±5.66％、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF1的存活率为97.08±2.15％、发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)LF2的存活率为110.84±4.98％、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF3的存活率为97.62±1.46％、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF4的存活率为114.89±16.49％、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF5的存活率为192.95±0.82％、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF6的存活率为140.81±8.97％、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF7的存活率为159.91±5.64％、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF8的存活率为103.91±2.89％、发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)LF9的存活率为81.43±1.22％、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF10的存活率为89.32±0.69％。
可见，发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)CCFM1037、LF2、LF4、LF5、LF6、LF7、LF8对模拟胃液的耐受能力较强。
2、不同发酵乳杆菌对模拟肠液的耐受性
将实施例1获得的发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)CCFM1037、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF1、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF2、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF3、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF4、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF5、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF6、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF7、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF8、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF9以及发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF10分别接入MRS液体培养基中于37℃培养18h后，离心收集细胞，将收集到细胞经生理盐水洗涤，洗涤结束后，再次离心收集细胞，将收集到细胞分别重悬于pH为8(pH由NaOH调节)的含有1g/L胰蛋白酶和0.3％(m/v)胆盐的生理盐水中至菌液OD600为5.0，取1mL菌液进行平板活菌计数作为菌液中发酵乳杆菌的原始活菌数，将剩余菌液置于37℃培养4h后，取1mL菌液进行平板活菌计数作为耐受模拟肠液后菌液中发酵乳杆菌的活菌数。
其中，耐受肠液后的存活率(％)＝(耐受模拟肠液后菌液中发酵乳杆菌的活菌数/菌液中发酵乳杆菌的原始活菌数)100％。
检测结果如下：在pH为8的含有有胰蛋白酶和胆盐的生理盐水中培养4h后，发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)CCFM1037的存活率为14.20±0.35％、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF1的存活率为4.89±0.65％、发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)LF2的存活率为1.56±0.02％、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF3的存活率为1.11±0.03％、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF4的存活率为0.40±0.05％、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF5的存活率为1.56±0.03％、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF6的存活率为8.12±0.04％、发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)LF7的存活率为3.56±0.15％、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF8的存活率为1.15±0.09％、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF9的存活率为2.46±0.05％、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF10的存活率为0.43±0.01％。
可见，发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)CCFM1037、LF1、LF6对模拟肠液的耐受能力较强。
3、不同发酵乳杆菌对模拟胃肠液的耐受性
将实施例1获得的发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)CCFM1037、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF1、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF2、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF3、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF4、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF5、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF6、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF7、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF8、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF9以及发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF10分别接入MRS液体培养基中于37℃培养18h后，离心收集细胞，将收集到细胞经生理盐水洗涤，洗涤结束后，再次离心收集细胞，将收集到细胞分别重悬于pH为3(pH由HCl调节)的含有3g/L胃蛋白酶的生理盐水中至菌液OD600为5.0，取1mL菌液进行平板活菌计数作为菌液中发酵乳杆菌的原始活菌数，将剩余菌液置于37℃培养3h，将培养后的菌液离心收集细胞，将收集到的细胞再次重悬于pH为8(pH由NaOH调节)的含有1g/L胰蛋白酶和0.3％(m/v)胆盐的生理盐水中至菌液OD600为5.0，置于37℃培养4h后，取1mL菌液进行平板活菌计数作为耐受模拟胃肠液后菌液中发酵乳杆菌的活菌数。
其中，耐受胃肠液后的存活率(％)＝(耐受模拟胃肠液后菌液中发酵乳杆菌的活菌数/菌液中发酵乳杆菌的原始活菌数)100％。
检测结果如下：由图1可知，在pH为3的含有胃蛋白酶的生理盐水中培养3h后，继续在pH为8的含有胰蛋白酶和胆盐的生理盐水中培养4h，发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)CCFM1037的存活率为15.69±0.42％、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF1的存活率为4.74±0.52％、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF2的存活率为1.73±0.08％、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF3的存活率为1.08±0.02％、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF4的存活率为0.46±0.00％、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF5的存活率为3.02±0.04％、发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)LF6的存活率为11.43±0.67％、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF7的存活率为5.69±0.05％、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF8的存活率为1.20±0.06％、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF9的存活率为2.01±0.01％、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF10的存活率为0.39±0.01％。
可见，发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)CCFM1037、LF6、LF7对模拟胃肠液的耐受能力更强。
实施例4：不同发酵乳杆菌的低聚糖利用能力
具体步骤如下：
(1)在MRS固体培养基的基础上，去掉配方中的葡萄糖与牛肉膏，以不添加任何糖作为空白对照，分别添加0.5％(m/v)的葡萄糖、低聚果糖、低聚木糖以及低聚半乳糖作为碳源，并加入溴甲酚紫作为酸碱指示剂，得到无糖、含葡萄糖、含低聚果糖、含低聚木糖或含低聚半乳糖的固体培养基平板；
(2)将实施例1获得的发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)CCFM1037、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF1、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF2、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF3、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF4、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF5、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF6、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF7、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF8、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF9以及发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)LF10分别接入MRS液体培养基中于37℃培养18h后，离心收集细胞，经生理盐水洗涤后分别重悬于生理盐水中至OD600为0.5，获得菌液；
(3)吸取10μL菌液分别点在步骤(1)获得的固体培养基平板上，待菌液完全吸收后，于37℃倒置培养，12h后，观察固体培养基平板内的溴甲酚紫指示剂是否变黄，若变黄，则表明碳源被利用，若不变黄，说明碳源没被利用(结果见表1)。
由表1可知，发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)普遍具有良好的利用低聚糖的能力，能广泛利用低聚果糖、低聚木糖和低聚半乳糖产酸，使固体培养基中的溴甲酚紫指示剂变黄。
表1不同发酵乳杆菌利用不同碳源的能力
| 组别 | 无糖 | 葡萄糖 | 低聚果糖 | 低聚木糖 | 低聚半乳糖 |
| CCFM1037 | - | + | + | + | + |
| LF1 | - | + | + | + | + |
| LF2 | - | + | + | + | + |
| LF3 | - | + | + | + | + |
| LF4 | - | + | + | + | + |
| LF5 | - | + | + | + | + |
| LF6 | - | + | + | + | + |
| LF7 | - | + | + | + | + |
| LF8 | - | + | + | + | + |
| LF9 | - | + | + | + | + |
| LF10 | - | + | + | + | + |
其中，+表示乳杆菌能利用该种碳源，-表示不能利用。
实施例5：不同发酵乳杆菌的产短链脂肪酸能力
具体步骤如下：
将实施例1获得的发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)CCFM1037、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF1、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF2、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF3、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF4、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF5、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF6、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF7、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF8、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF9以及发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF10分别接入MRS液体培养基中于37℃培养18h后，离心收集细胞，经生理盐水洗涤后分别重悬于生理盐水中至菌浓度为2×108CFU/mL，获得菌液。
将菌液与10％硫酸以25:1的体积比混合酸化后，加入4倍10％硫酸体积的***振荡混匀以提取脂肪酸，得到提取液；将提取液于18000g的条件下离心15min后分离上层***相，将上层***相通过无水Na2SO4进行干燥后静置30min，继续于18000g的条件下离心5min，用GC-MS分析上层***相中的各种短链脂肪酸(分析结果见图2-5)。
由图2-5可知，发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)CCFM1037的总短链脂肪酸产量高达3.641±0.25μmol/mL，其中，乙酸产量最高，达3.601±0.23μmol/mL，占总短链脂肪酸产量的98.98％，较其余发酵乳杆菌有明显优势。
由实施例3-5可知，发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)CCFM1037、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF6以及发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF7的耐受模拟胃肠液、低聚糖利用以及体外产短链脂肪酸能力均较佳，能够在人体胃肠道环境中生存并发挥作用，因此，下面选择发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)CCFM1037、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF6以及发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF7进行进一步的实验以研究其益生功能。。
实施例8：不同发酵乳杆菌对小鼠健康指标、粪便含水量以及粪便中短链脂肪酸浓度的影响
具体步骤如下：
将实施例1获得的发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)CCFM1037、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF6以及发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF7分别接入MRS液体培养基中于37℃培养18h后，离心收集细胞，经生理盐水洗涤后分别重悬于12％(m/v)的脱脂乳粉溶液中至菌浓度为5×109CFU/mL，获得菌悬液，将菌悬液于-80℃下保存待用。
取体重在20～22g的SPF级BALB/c雄性小鼠40只，随机分为4组，每组10只，分别为：空白组、灌胃发酵乳杆菌CCFM1037菌悬液的CCFM1037组、灌胃发酵乳杆菌LF6菌悬液的LF6组、灌胃发酵乳杆菌LF7菌悬液的LF7组，其中，CCFM1037组、LF6组、LF7组均为实验组。
实验共22天：第一周(7天)为小鼠适应期；第8天开始灌胃直至实验结束，实验组分别灌胃发酵乳杆菌CCFM1037、LF6以及LF7菌悬液，以0.2mL菌悬液/只/天的剂量进行灌胃，空白组仅灌胃等量脱脂乳粉溶液作为对照；共灌胃15天。
15天后，检测每只小鼠粪便中短链脂肪酸的含量(检测结果见表2，短链脂肪酸含量的检测方法见实施例5)。
由表2可知，与空白组相比，灌胃发酵乳杆菌CCFM1037的小鼠粪便中的总短链脂肪酸含量为61.63±17.54μmol/g，其中，丙酸含量为38.99±11.93μmol/g，丙酸含量为14.12±3.85μmol/g，异丁酸含量为0.56±0.18μmol/g，正丁酸含量为7.93±3.90μmol/g，总酸、乙酸、正丁酸含量均显著高于空白组；而灌胃发酵乳杆菌LF6、LF7的小鼠粪便中的各种短链脂肪酸也高于空白组，但无显著差异。
可见，本发明发酵乳杆菌CCFM1037能显著提高粪便中的短链脂肪酸含量，具有明显优势。
表2不同组小鼠粪便中的短链脂肪酸的种类及含量
实施例9：不同发酵乳杆菌对小鼠粪便菌群的影响
具体步骤如下：
将实施例1获得的发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)CCFM1037、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF6以及发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF7分别接入MRS液体培养基中于37℃培养18h后，离心收集细胞，经生理盐水洗涤后分别重悬于12％(m/v)的脱脂乳粉溶液中至菌浓度为5×109CFU/mL，获得菌悬液，将菌悬液于-80℃下保存待用。
取体重在20～22g的SPF级BALB/c雄性小鼠40只，随机分为4组，每组10只，分别为：空白组、灌胃发酵乳杆菌CCFM1037菌悬液的CCFM1037组、灌胃发酵乳杆菌LF6菌悬液的LF6组、灌胃发酵乳杆菌LF7菌悬液的LF7组，其中，CCFM1037组、LF6组、LF7组均为实验组。
实验共22天：第一周(7天)为小鼠适应期；第8天开始灌胃直至实验结束，实验组分别灌胃发酵乳杆菌CCFM1037、LF6以及LF7菌悬液，以0.2mL菌悬液/只/天的剂量进行灌胃，空白组仅灌胃等量脱脂乳粉溶液作为对照；共灌胃15天。
在灌胃第15天的上午收集每只小鼠的粪便，通过购自美国MP公司的粪便样品基因组提取试剂盒提取小鼠粪便样品中细菌基因组，并以此为模板，扩增16S rDNA的V4区，PCR验证后进行切胶回收，回收产物按照购自美国Life Technologies公司的QuantTMdsDNABRAssay Kit试剂盒的说明书进行定量(ng/μL)；根据PicoGreen荧光染料的定量结果，按等质量浓度混合样品，样品之间barcode不重复；按照购自美国Life Technologies公司的Illumina建库试剂盒TurSeq DNALT Sample Preparation Kit的说明书构建文库，主要包括末端修复、3’端加A、接头连接以及PCR扩增等步骤；将文库进行上机测序；根据测序结果进行线下处理，得到不同实验组小鼠粪便中的菌群在门水平上的分布情况、不同实验组小鼠粪便中的菌群在属水平上的分布情况以及不同实验组小鼠粪便中Acinetobacter的相对丰度(检测结果见图6)。
由图6可知，空白组小鼠粪便中Parabacteroides的相对丰度较高，约为1.70±0.35％，小教育空白组，灌胃发酵乳杆菌CCFM1037、LF6、LF7的小鼠粪便中Parabacteroides的相对丰度均显著降低，其中，CCFM1037降幅最为显著，仅为0.018±0.02％，对于降低宿主感染Parabacteroides的效果最为显著。
可见，本发明发酵乳杆菌CCFM1037可显著小鼠肠道中Parabacteroides的相对丰度，具有明显优势。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一株发酵乳杆菌及其在改善肠道健康方面的应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1422
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggttacccca ccgactttgg gtgttacaaa ctctcatggt gtgacgggcg gtgtgtacaa 60
ggcccgggaa cgtattcacc gcggcatgct gatccgcgat tactagcgat tccgacttcg 120
tgcaggcgag ttgcagcctg cagtccgaac tgagaacggt tttaagagat ttgcttgccc 180
tcgcgagttc gcgactcgtt gtaccgtcca ttgtagcacg tgtgtagccc aggtcataag 240
gggcatgatg atctgacgtc gtccccacct tcctccggtt tgtcaccggc agtctcacta 300
gagtgcccaa cttaatgctg gcaactagta acaagggttg cgctcgttgc gggacttaac 360
ccaacatctc acgacacgag ctgacgacga ccatgcacca cctgtcattg cgttcccgaa 420
ggaaacgccc tatctctagg gttggcgcaa gatgtcaaga cctggtaagg ttcttcgcgt 480
agcttcgaat taaaccacat gctccaccgc ttgtgcgggc ccccgtcaat tcctttgagt 540
ttcaaccttg cggtcgtact ccccaggcgg agtgcttaat gcgttagctc cggcactgaa 600
gggcggaaac cctccaacac ctagcactca tcgtttacgg catggactac cagggtatct 660
aatcctgttc gctacccatg ctttcgagtc tcagcgtcag ttgcagacca ggtagccgcc 720
ttcgccactg gtgttcttcc atatatctac gcattccacc gctacacatg gagttccact 780
accctcttct gcactcaagt tatccagttt ccgatgcact tctccggtta agccgaaggc 840
tttcacatca gacttagaaa accgcctgca ctctctttac gcccaataaa tccggataac 900
gcttgccacc tacgtattac cgcggctgct ggcacgtagt tagccgtgac tttctggtta 960
aataccgtca acgtatgaac agttactctc atacgtgttc ttctttaaca acagagcttt 1020
acgagccgaa acccttcttc actcacgcgg tgttgctcca tcaggcttgc gcccattgtg 1080
gaagattccc tactgctgcc tcccgtagga gtatgggccg tgtctcagtc ccattgtggc 1140
cgatcagtct ctcaactcgg ctatgcatca tcgccttggt aggccgttac cccaccaaca 1200
agctaatgca ccgcaggtcc atccagaagt gatagcgaga agccatcttt taagcgttgt 1260
tcatgcgaac aacgctgtta tgcggtatta gcatctgttt ccaaatgttg tcccccgctt 1320
ctgggcaggt tacctacgtg ttactcaccc gtccgccact cgttggcgac caaaatcaat 1380
caggtgcaag caccatcaat caattgggcc aacgcgttcg ac 1422
Claims (10)
1.一株发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)，其特征在于，所述发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)已于2018年11月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60488，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
2.如权利要求1所述的一株发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)在制备改善肠道健康的产品中的应用。
3.如权利要求2所述的一株发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)在制备改善肠道健康的产品中的应用，其特征在于，所述产品中，发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)的活菌数为不低于1×106CFU/mL或1×106CFU/g。
4.如权利要求2或3所述的一株发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)在制备改善肠道健康的产品中的应用，其特征在于，所述产品包含食品、药品或保健品。
5.如权利要求4所述的一株发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)在制备改善肠道健康的产品中的应用，其特征在于，所述药品含有发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)、药物载体和/或药用辅料。
6.一种可改善肠道健康的产品，其特征在于，所述产品含有如权利要求1所述的发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)。
7.如权利要求6所述的一种可改善肠道健康的产品，其特征在于，所述产品中，发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)的活菌数为不低于1×106CFU/mL或1×106CFU/g。
8.如权利要求6或7所述的一种可改善肠道健康的产品，其特征在于，所述产品中，发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)的活菌数为不低于1×108CFU/mL或1×108CFU/g。
9.如权利要求6-8任一所述的一种可改善肠道健康的产品，其特征在于，所述产品包含食品、药品或保健品。
10.如权利要求9所述的一种可改善肠道健康的产品，其特征在于，所述药品含有发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、药物载体和/或药用辅料。
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