CN102337231A

CN102337231A - 一种发酵型健肠乳酪/粉的制造方法及其所应用的干酪乳杆菌

Info

Publication number: CN102337231A
Application number: CN2010102388808A
Authority: CN
Inventors: 赵景阳
Original assignee: TAIZHOU KEXING BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO LTD
Current assignee: TAIZHOU KEXING BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO LTD
Priority date: 2010-07-28
Filing date: 2010-07-28
Publication date: 2012-02-01

Abstract

本发明公开了一种干酪乳杆菌Lc JY68，其保藏号为CGMCC No.3567。本发明还公开了一种发酵型健肠乳酪/粉的制造方法，一，准备干酪乳杆菌Lc JY68和短双歧杆菌BbQQ12菌株；二，将干酪乳杆菌Lc JY68的菌株培养液单独或与干酪乳杆菌干酪亚种一起接种到MRS培养基中在恒温下进行发酵，将短双歧杆菌BbQQ12菌株接种到TOS培养基中发酵；三，然后将步骤二中发酵后的两种菌株冷却，冷却后进行离心分离，收集菌体；四，在菌体内添加冻干保护剂，然后在低温下预冻，然后冷冻干燥制得发酵型健肠乳酪/粉，最后进行包装。

Description

一种发酵型健肠乳酪/粉的制造方法及其所应用的干酪乳杆菌

技术领域

本发明涉及一种发酵型健肠乳酪/粉的制造方法及其所应用的干酪乳杆菌。

背景技术

目前在乳酪/粉中，主要是以单一菌株或以数株乳杆菌发酵为主，还未见同时使用乳杆菌和双歧杆菌进行发酵的产品，这些乳酪/粉中活菌含量太低，再加上含乳饮料国家标准设定的下限值较低，一般均在105个/毫升以下，它所使用菌株的功能性，均以一般益生菌所固有的改善肠内菌群和提高免疫力为主要健康声称，还未见降低牛奶蛋白抗原性的菌株。

发明内容

本发明提供了一种发酵型健肠乳酪/粉的制造方法及其所应用的干酪乳杆菌，它不但可以存活状态到达小肠，这样可以改善肠内菌群和提高免疫力的功效，能够降解牛奶中抗原性以及蛋白质的抗原性，减少牛奶中容易引起过敏性抗原蛋白质含量。

本发明采用了以下技术方案：一种干酪乳杆菌Lactobacillus caseiJY68，其保藏号为CGMCC No：3567。

本发明公开了一种发酵型健肠乳酪/粉的制造方法，它包括以下步骤：步骤一，准备干酪乳杆菌Lactobacillus casei JY68和短双歧杆菌Bifidobacterium breve QQ12菌株；步骤二，将干酪乳杆菌Lactobacilluscasei JY68的菌株培养液单独或与干酪乳杆菌干酪亚种一起接种到MRS培养基中在恒温下进行发酵，将短双歧杆菌Bifidobacterium breve QQ12菌株接种到TOS培养基中发酵；步骤三，然后将步骤二中发酵后的两种菌株冷却，冷却后进行离心分离，收集菌体；步骤四，在菌体内添加冻干保护剂，然后在低温下预冻，然后冷冻干燥制得发酵型健肠乳酪/粉，最后进行包装。

本发明步骤二中的干酪乳杆菌Lactobacillus casei JY68的菌株培养液单独或与干酪乳杆菌干酪亚种一起在MRS培养基中进行发酵的恒定温度为37℃，发酵的时间为24小时。本发明步骤二中的短双歧杆菌Bifidobacteriumbreve QQ12菌株在TOS培养基中发酵的恒定温度为37℃，发酵的时间为24小时。

本发明步骤三中两种菌株的冷却温度小于或等于4℃，离心分离时的离心速度为6000rpm，离心时间为20min。本发明步骤四中冻干保护剂的成分为：脱脂乳40％-50％、乳清粉10％-20％、Vc2％-5％、乳糖2％-5％。。本发明步骤四中预冻的温度为-80℃，预冻的时间为2-4小时。

本发明具有以下有益效果：本发明的发酵型健肠乳酪/粉中含有干酪乳杆菌Lactobacillus casei JY68和干酪乳杆菌干酪亚种，干酪乳杆菌Lactobacillus casei JY68不但可以存活状态到达小肠，这样可以改善肠内菌群和提高免疫力的功效，而且具有很高的耐酸性，强繁殖性，并且能够降解牛奶中抗原性以及蛋白质的抗原性，减少牛奶中容易引起过敏性抗原蛋白质含量，另外热量降低一半，保持爽口不腻的口感，满足了糖尿病患者或渴望低热量食品的消费者的需求，在保质期内的活菌数能维持在108CFU/毫升以上，大大高于现在市场上的商品含量，益生菌在保质期内能保持活菌数在108CFU/毫升以上的高数量级并且能以存活状态到达肠内。

附图说明

图1为本发明的利用MEGA3.1生物学软件构建的***发育树

具体实施方式

本发明为一种干酪乳杆菌，分类名称为干酪乳杆菌Lactobacilluscasei，参据的生物材料(株)：JY68，该菌种保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101，其保藏编号为CGMCC No.3567，保藏日期为2010年1月12日，结果是存活。干酪乳杆菌Lactobacillus caseiJY68的菌株发酵后的产品其抗原价能减低到发酵前的1/1000，它是通过以下实验制得的：

一、乳酸菌株蛋白酶活性和肽酶活性试验：首先从日本购买4个菌株：lactobacillus casei subsp.casei L-14，Streptococcus lactissubsp.cremoris H-61，Streptococcus lactis subsp.lactis 527；Streptococcus thermophilus 510；又从Hansen公司购买的4个菌株：lactobacillus bulgaricus C2，lactobacillus helveticus C1，lactobacilluslactis C1，Streptococcus thermophilus C1；以及分离自新疆传统发酵乳的2个菌株：Lactobacillus casei JY68，Streptococcus diacetylactis F1菌株的蛋白酶活性和肽酶活性使用Forin法进行了测定。以对Glu-pNA等8种合成基质及酪蛋白的分解程度作为活性判断指标，发现Lactobacillus casei JY68和Streptococcus diacetylactis F1菌株有较大的蛋白酶活性和肽酶活性。

二、降低β乳球蛋白抗原性试验：接着将蛋白酶活性和肽酶活性较高的两个菌株接种至10％的灭菌脱脂乳中，对培养液中β乳球蛋白的抗原性利用ELISA法进行测试。酵液脱苦效果的感官评价试验。

三、然后将具有β乳球蛋白抗原性低减效果的2个菌株：Lactobacilluscasei JY68，Streptococcus diacetylactis F1添加到10％脱脂乳蛋白酶水解液中，以0.04％咖啡因的苦度为对照，对其脱苦效果进行了感官评价试验。通过以上试验，优选出不但具有较强的蛋白酶和肽酶活性，而且可以降低β乳球蛋白抗原性以及其发酵液不呈现苦味的干酪乳杆菌Lactobacillus caseiJY68菌株。

干酪乳杆菌Lactobacillus casei JY68的分离方法：以新疆采取的传统发酵乳分离样品，取1mL上述样品放入灭菌小试管中，接种于10mL石蕊牛乳培养基中，置于37℃恒温培养箱中增菌培养至酸化凝固并呈现粉红色时取出，用灭菌接种环挑取划线接种于含有10ppm放线菌酮和10ppm硫酸粘菌素的BL琼脂培养基中，将其放入厌氧培养罐中，置于37℃条件下培养48小时，形成菌落后，用接种环挑取菌落，接种于MRS培养液中，置于37℃条件下培养24小时，待菌株生长好后，再次划线接种于BL琼脂培养集中，37℃下厌氧培养48小时，记录观察菌落形态和革兰氏染色细胞形态特征，并进行过氧化氢酶试验，分离出在所述试验中呈阴性的杆菌，所述杆菌为乳杆菌。将所述乳杆菌进一步纯化培养，并进行低温保存。

干酪乳杆菌Lactobacillus casei JY68的鉴定方法：

一、生理生化鉴定：参照伯爵氏细菌鉴定***，对被试菌体的形态以及生理生化特性进行鉴定，采用梅里埃API 50CHL鉴定试剂盒对其生理生化特性进行鉴定。

二、16S rRNA序列鉴定：

1、采用的试剂：Taq酶、dNTP、DNAmarker、溶菌酶、蛋白酶K、CTAB、SDS(购自北京宝杰罗生物科技有限公司)GoldView(购自北京塞百盛基因技术有限公司)。

2、PCR引物：16S rRNA序列扩增引物由上海生物工程有限公司合成，引物序列如下：L1：5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’

L2：5’-CGGCTACCTTGTTACGACTT-3’

3、菌体培养：将送检样品在平板上划线分离，培养24-30h后挑取单菌落接种到20ml液体培养基中，30℃200rpm培养20-24h。

4、基因组DNA提取：基因组DNA提取参照文献。

用SDS-蛋白酶K裂解，十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)沉淀细胞碎片和多糖，再用异丙醇沉淀来提取总DNA(Wilson，1987)。(1)取单菌落接种于5ml相应的培养基中，在30℃下培养24h；(2)取1.0ml菌液于1.5ml离心管中，13,000rpm离心2min，弃上清；(3)沉淀重悬于1.0ml 0.85％NaCl中。(4)室温13,000rpm离心2min，弃上清；(5)沉淀重悬于550μl 1×TE中；(6)加17μl溶菌酶(35mg/ml)，37℃温育30min；(7)加3μl蛋白酶K(20mg/ml)，37℃温育30min；(8)加30μl 10％SDS，37℃温育30min；(9)加100μl 5M NaCl充分混匀；(10)加80μl CTAB/NaCl溶液，混匀，65℃水浴10min；(11)加等体积(0.7-0.8ml)氯仿/异戊醇(24∶1)，轻轻振荡混匀；(12)室温，13,000rpm离心10min；(13)将上清液转移到一新1.5ml离心管中，加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)轻轻振荡混匀；(14)重复第12)步；(15)将上清液转移到一新1.5ml离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇(24∶1)轻轻振荡混匀；(16)重复第12)步；(17)将上清液转移到一新1.5ml离心管中，加入0.6体积异丙醇，混匀后4℃静置30min；(18)20℃13,000rpm离心7min；(19)弃上清，加500μl 70％乙醇，轻轻颠倒数次(洗盐)；(20)4℃15,000rpm离心7min；(21)重复洗盐两次；(22)倒置离心管，干燥DNA沉淀7min。DNA沉淀溶于100μl 1×TE缓冲液，-20℃保存备用。

5、PCR扩增

反应体系为100μl：

Taq(5U/μl)0.8μl；10×PCR Buffer(Mg²⁺Plus)10μl；dNTP Mixture(2.5mM/each)8μl；模板DNA 2.5ng；引物27F(10μl mol/L)2μl，引物1541R(10μmol/L)2μl；ddH2O补足到100μl。

PCR反应条件：

94℃for4min；94℃for 1min，58℃for 1min，72℃for 1min30sec，30cycles；72℃for 5min；4℃save，end。

6、电泳检测

用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA，用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。显色剂为GoldView。

7、序列测定

纯化后的PCR产物采用ABI3730基因测序仪测序。测序工作由上海生工技术有限公司完成。

8、序列分析与***树的构建

采用序列图谱软件Chromas，参照正、反向序列图谱，对序列入工校对。从GenBank核酸序列数据库中下载戈登氏菌属相关模式菌株的16S rRNA基因序列，与所测的RR和RY菌株序列一起，用Clustal X软件进行序列比对(alignment)；然后利用MEGA3.1生物学软件构建***发育树，MEGA3.1生物学软件构建***发育树见图1，采用Neighbor-Joining法进行***发育分析，并进行1000次重复的Bootstraps统计学检验。

三结果与分析

1生理生化鉴定结果

经生理生化试验初步鉴定，JY68细胞呈杆状，革兰氏染色阳性，接触酶阴性能在15℃和45℃条件下生长，能利用葡萄糖和果糖，初步鉴定为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)其生理生化特性见表1。

表1生理生化特征

注：+表示阳性；-表示阴性；W表示轻微利用

2基于16S rRNA基因的分子生物学鉴定

2.116S rRNA基因测序结果

将JY68菌株的PCR反应产物送至上海生工技术公司测序，测得序列结果见如下序列表：

1 CTATACATGC AAGTCGAACG AGTTCTCGTT GATGATCGGT GCTTGCACCG AGATTCAACA

61 TGGAACGAGT GGCGGACGGG TGAGTAACAC GTGGGTAACC TGCCCTTAAG TGGGGGATAA

121 CATTTGGAAA CAGATGCTAA TACCGCATAG ATCCAAGAAC CGCATGGTTC TTGGCTGAAA

181 GATGGCGTAA GCTATCGCTT TTGGATGGAC CCGCGGCGTA TTAGCTAGTT GGTGAGGTAA

241 TGGCTCACCA AGGCGATGAT ACGTAGCCGA ACTGAGAGGT TGATCGGCCA CATTGGGACT

301 GAGACACGGC CCAAACTCCT ACGGGAGGCA GCAGTAGGGA ATCTTCCACA ATGGACGCAA

361 GTCTGATGGA GCAACGCCGC GTGAGTGAAG AAGGCTTTCG GGTCGTAAAA CTCTGTTGTT

421 GGAGAAGAAT GGTCGGCAGA GTAACTGTTG TCGGCGTGAC GGTATCCAAC CAGAAAGCCA

481 CGGCTAACTA CGTGCCAGCA GCCGCGGTAA TACGTAGGTG GCAAGCGTTA TCCGGATTTA

541 TTGGGCGTAA AGCGAGCGCA GGCGGTTTTT TAAGTCTGAT GTGAAAGCCC TCGGCTTAAC

601 CGAGGAAGCG CATCGGAAAC TGGGAAACTT GAGTGCAGAA GAGGACAGTG GAACTCCATG

661 TGTAGCGGTG AAATGCGTAG ATATATGGAA GAACACCAGT GGCGAAGGCG GCTGTCTGGT

721 CTGTAACTGA CGCTGAGGCT CGAAAGCATG GGTAGCGAAC AGGATTAGAT ACCCTGGTAG

781 TCCATGCCGT AAACGATGAA TGCTAGGTGT TGGAGGGTTT CCGCCCTTCA GTGCCGCAGC

841 TAACGCATTA AGCATTCCGC CTGGGGAGTA CGACCGCAAG GTTGAAACTC AAAGGAATTG

901 ACGGGGGCCC GCACAAGCGG TGGAGCATGT GGTTTAATTC GAAGCAACGC GAAGAACCTT

961 ACCAGGTCTT GACATCTTTT GATCACCTGA GAGATCAGGT TTCCCCTTCG GGGGCAAAAT

1021 GACAGGTGGT GCATGGTTGT CGTCAGCTCG TGTCGTGAGA TGTTGGGTTA AGTCCCGCAA

1081 CGAGCGCAAC CCTTATGACT AGTTGCCAGC ATTTAGTTGG GCACTCTAGT AAGACTGCCG

1141 GTGACAAACC GGAGGAAGGT GGGGATGACG TCAAATCATC ATGCCCCTTA TGACCTGGGC

1201 TACACACGTG CTACAATGGA TGGTACAACG AGTTGCGAGA CCGCGAGGTC AAGCTAATCT

1261 CTTAAAGCCA TTCTCAGTTC GGACTGTAGG CTGCAACTCG CCTACACGAA GTCGGAATCG

1321 CTAGTAATCG CGGATCAGCA CGCCGCGGTG AATACGTTCC CGGGCCTTGT ACACACCGCC

1381 CGTCACACCA TGAGAGTTTG TAACACCCGA AGCCGGTGGC GTAACCCTTT TAGGGAGCGA

1441 GCCGT

2.2BLAST同源性比较结果

将所得16S rRNA测得序列，在NCBI网站中进行同源性搜索，JY68菌株与Lactobacillus casei 16Sr RNA相似度高达100％。

从Genbank中选择了菌株的16S rRNA基因序列，用Clustal X软件进行序列比对(alignment)，然后利用MEGA3.1生物学软件构建***发育树见，所构建的***发育树见图1。JY68与Lactobacillus L.casei Shirota-AB531131亲缘关系最近，因此，进一步证明，JY68菌株为Lactobacillus casei。将其命名为Lactobacillus casei JY68。

本发明还公开了一种发酵型健肠乳酪/粉的制造方法，它包括以下步骤：步骤一，准备干酪乳杆菌Lactobacillus casei JY68和短双歧杆菌Bifidobacterium breve QQ12菌株；步骤二，将干酪乳杆菌Lactobacilluscasei JY68的菌株培养液单独或与干酪乳杆菌干酪亚种一起接种到MRS培养基中在37℃的恒温下进行发酵24小时，将短双歧杆菌Bifidobacterium breveQQ12菌株接种到TOS培养基中在37℃的恒温下发酵24小时；步骤三，然后将步骤二中发酵后的两种菌株在小于或等于4℃的温度下冷却，冷却后进行离心分离，离心分离时的离心速度为6000rpm，离心时间为20min，收集菌体；步骤四，在菌体内添加冻干保护剂，脱脂乳40％-60％、乳清粉10％-30％、Vc2％-5％、乳糖2％-5％。，本实施例为：脱脂乳60％、乳清粉30％、Vc5％、乳糖5％。然后在-80℃的低温下预冻2-4小时，然后冷冻干燥制得发酵型健肠乳酪/粉，最后进行包装。

Claims

1.一种干酪乳杆菌Lactobacillus casei JY68，其保藏号为CGMCCNo：3567。

2.一种发酵型健肠乳酪/粉的制造方法，它包括以下步骤：

步骤一，准备干酪乳杆菌Lactobacillus casei JY68和短双歧杆菌Bifidobacterium breve QQ12菌株；

步骤二，将干酪乳杆菌Lactobacillus casei JY68的菌株培养液单独或与干酪乳杆菌干酪亚种一起接种到MRS培养基中在恒温下进行发酵，将短双歧杆菌Bifidobacterium breve QQ12菌株接种到TOS培养基中发酵；

步骤三，然后将步骤二中发酵后的两种菌株冷却，冷却后进行离心分离，收集菌体；

步骤四，在菌体内添加冻干保护剂，然后在低温下预冻，然后冷冻干燥制得发酵型健肠乳酪/粉，最后进行包装。

3.根据权利要求2所述的发酵型健肠乳酪/粉的制造方法，其特征是步骤二中的干酪乳杆菌Lactobacillus casei JY68的菌株培养液单独或与干酪乳杆菌干酪亚种一起在MRS培养基中进行发酵的恒定温度为37℃，发酵的时间为24小时。

4.根据权利要求2所述的发酵型健肠乳酪/粉的制造方法，其特征是步骤二中的短双歧杆菌Bifidobacterium breve QQ12菌株在TOS培养基中发酵的恒定温度为37℃，发酵的时间为24小时。

5.根据权利要求2所述的发酵型健肠乳酪/粉的制造方法，其特征是步骤三中两种菌株的冷却温度小于或等于4℃，离心分离时的离心速度为6000rpm，离心时间为20min。

6.根据权利要求2所述的发酵型健肠乳酪/粉的制造方法，其特征是步骤四中冻干保护剂的成分为：脱脂乳40％-50％、乳清粉10％-20％、Vc2％-5％、乳糖2％-5％。

7.根据权利要求2所述的发酵型健肠乳酪/粉的制造方法，其特征是步骤四中预冻的温度为-80℃，预冻的时间为2-4小时。