CN116789779A - 过表达转录因子StHB6在改良马铃薯性状中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了过表达转录因子StHB6在改良马铃薯性状中的应用，属于植物分子生物学技术领域，转录因子StHB6的氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示，在马铃薯中过表达转录因子StHB6可以提高马铃薯的单株结薯数、结薯率、总薯重、平均薯重，还能提高对HPV和晚疫病的抗性，研究结果为进一步揭示HD‑Zip家族在马铃薯生长发育中的功能，解析马铃薯PVY和晚疫病抗性分子机制和调控网络提供重要信息。为进一步提高马铃薯的产量、品质和抗病性的分子育种提供基因资源和新的思路。
Description
技术领域
本发明涉及植物分子生物技术领域，具体涉及过表达转录因子StHB6在改良马铃薯性状中的应用。
背景技术
马铃薯是继玉米、水稻、小麦之后的第四大粮食作物，对确保国家粮食安全意义重大。然而马铃薯生长容易受到各种病害的影响，抗病育种一直是重要的育种目标。
转录因子(Transcription factors，TF)是调控基因表达网络中的重要参与者。相关研究表明，TF是基因工程上提高植物抗病性的有希望的生物技术靶点，为了充分利用这些与免疫相关的TF，需要更深入地了解其功能和作用机制。前人在HD-Zip I转录因子对植物的生长发育与非生物胁迫方面进行许多研究，但转录因子HD-Zip I家族成员在马铃薯生长发育及抗病性调控中的机制尚不完全清楚。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供过表达转录因子StHB6在改良马铃薯性状中的应用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、过表达转录因子StHB6在改良马铃薯性状中的应用。
本发明优选的，所述转录因子StHB6的氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示。
本发明优选的，所述转录因子StHB6的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示。
本发明优选的，过表达转录因子StHB6在提高马铃薯的单株结薯数中的应用。
本发明优选的，过表达转录因子StHB6在提高马铃薯的结薯率中的应用。
本发明优选的，过表达转录因子StHB6在提高马铃薯的总薯重中的应用。
本发明优选的，过表达转录因子StHB6在提高马铃薯的平均薯重中的应用。
本发明优选的，过表达转录因子StHB6在提高马铃薯的HPV抗性中的应用。
本发明优选的，过表达转录因子StHB6在提高马铃薯的晚疫病抗性中的应用。
本发明优选的，所述过表达转录因子StHB6的方法为将权利要求3所述的StHB6的核苷酸序列通过EcoR I和Spe I酶切位点连接pRC26B载体骨架获得重组表达载体，然后在农杆菌介导下转化马铃薯，获得过表达转录因子StHB6的转基因植株。
本发明的有益效果在于：
本研究构建了StHB6的过表达、干扰和载体，转化马铃薯，获得过表达、干扰转基因植株，通过对StHB6转基因植株的生理指标测定与表型观察，初步鉴定了StHB6在马铃薯生长发育和PVY、晚疫病抗性中的调控机制，初步解析了StHB6的调控网络和调控生长发育及抗病性的分子机制。StHB6可能通过与StTCTP的启动子结合抑制StTCTP的转录，正向调控植株对PVY和晚疫病的抗性。本研究结果为进一步揭示HD-Zip家族在马铃薯生长发育中的功能，解析马铃薯PVY和晚疫病抗性分子机制和调控网络提供重要信息。为进一步提高马铃薯的产量、品质和抗病性的分子育种提供基因资源和新的思路。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为PCR扩增StHB6基因；
图2为StHB6基因和编码蛋白序列分析(A.基因结构；B.保守结构域；C.马铃薯StHB6与拟南芥β分支同源蛋白序列比对，红色的横线表示HD结构域，黄色的横线表示的是LZ域；D.马铃薯StHB6与拟南芥HD-Zip I亚家族同源序列进化树；)；
图3为StHB6启动子顺式作用元件分析；
图4为StHB6转录活性分析(A.载体转化AH109酵母在SD/-Trp培养基上生长情况；B.载体转化AH109酵母在SD/-Trp/-His/-Ade培养基上生长情况；C.StHB6编码蛋白全长、N端、C端氨基酸结构示意图(StHB6编码区编码325个氨基酸，StHB6-N端编码蛋白149个氨基酸，StHB6-C端编码蛋白176个氨基酸))；
图5为StHB6表达模式分析(A.在马铃薯数据库预测的StHB6在各胁迫和激素诱导下的表达水平；B.在接种PVY后24h、48h、72h接种叶中StHB6的表达水平；C.接种PVY后24h、48h、72h上位叶中StHB6的表达水平，数据表示平均值±SD，星号表示统计显著性，**p<0.01,****p<0.0001，用One-way ANOVA分析；)；
图6为StHB6在马铃薯各组织器官的表达水平(A.StHB6在E3各个组织器官的表达水平，S1、S2、S4、S7代表匍匐茎的各个时期；B.StHB6在AC142各个组织器官的表达水平；)；
图7为pRC26B-HB6载体图谱；
图8为StHB6过表达、干扰载体构建及阳性苗获取(A.过表达载体示意图；B.干扰载体示意图；C.薯块、茎段的抗性芽和阳性苗；)；
图9为StHB6过表达、干扰转基因植株鉴定(A.转基因植株的PCR鉴定；B.RT-qPCR检测转基因株系中StHB6的表达量；C.Western Blot免疫印迹检测；)；
图10为StHB6过表达、干扰植株地下部种植80d的农艺性状统计(A.过表达、干扰植株的地下部表型；B.过表达、干扰植株的单株结薯数；C.过表达、干扰植株的单株薯重；D.过表达、干扰植株的平均单个薯重；E.过表达、干扰植株的薯型(长宽比)；数据表示平均值±SD，星号表示统计显著性，*p<0.05,****p<0.0001，用One-way ANOVA分析；)；
图11为StHB6过表达、干扰植株地下部室外种植90d的农艺性状(A.过表达、干扰植株的地下部表型；B.过表达、干扰植株的单株结薯数；C.过表达、干扰植株的单株薯重；D.过表达、干扰植株的平均单个薯重；E.过表达、干扰植株的薯长；F.过表达、干扰植株的薯宽；G.过表达、干扰植株薯的薯型(长宽比)，数据表示平均值±SD，星号表示统计显著性，*p<0.05,****p<0.0001(用One-way ANOVA分析)；)；
图12为StHB6过表达、干扰转基因植株异养结薯60d(A.过表达、干扰转基因植株异养结薯的表型；B.过表达、干扰转基因植株异养结薯的薯长；C.过表达、干扰转基因植株异养结薯的薯宽；D.过表达、干扰转基因植株异养结薯的薯长宽比值，数据表示平均值±SD，星号表示统计显著性，*p<0.05,****p<0.001(用One-way ANOVA分析)；)；
图13为PVY侵染后StHB6亚细胞定位；
图14为StHB6过表达、干扰转基因植株在PVY侵染21d的表型鉴定(A.StHB6过表达、干扰转基因植株在PVY侵染21d接种叶的表型；B.StHB6过表达、干扰转基因植株在PVY侵染21d上位叶的表型；)；
图15为PVY侵染3d时野生型和转基因植株叶片的DAB染色；
图16为PVY侵染4d、11d时StHB6与PVY-CP在过表达、干扰植株与野生型植株的相对表达量(A.PVY侵染4d时StHB6在各转基因植株接种叶中的相对表达量；B.PVY侵染4d时StHB6在各转基因植株上位叶中的相对表达量；C.PVY侵染11d时StHB6在各转基因植株上位叶中的相对表达量；D.PVY侵染4d时PVY-CP在StHB6各转基因植株接种叶中的相对表达量；E.PVY侵染4d时PVY-CP在StHB6各转基因植株上位叶中的相对表达量；F.PVY侵染11d时PVY-CP在StHB6各转基因植株上位叶中的相对表达量，数据表示平均值±SD，星号表示统计显著性，*p<0.05,****p<0.0001(用One-way ANOVA分析)；)；
图17为PVY侵染21d时StHB6与PVY-CP在过表达、干扰植株与野生型植株的相对表达量(A.PVY侵染21d时StHB6在各转基因植株接种叶中的相对表达量；B.PVY侵染21d时StHB6在各转基因植株上位叶中的相对表达量；C.PVY侵染21d时PVY-CP在StHB6各转基因植株接种叶中的相对表达量；D.PVY侵染21d时PVY-CP在StHB6各转基因植株上位叶中的相对表达量，数据表示平均值±SD，星号表示统计显著性，*p<0.05,****p<0.0001(用One-wayANOVA分析))；；
图18为StHB6过表达株系、干扰株系的叶片接种晚疫病5d后发病情况(A.StHB6过表达株系、干扰株系的叶片接种晚疫病5d的表型；B.StHB6过表达株系、干扰株系的叶片接种晚疫病5d的病斑直径，数据表示平均值±SD，星号表示统计显著性，*p<0.05,****p<0.0001(用One-way ANOVA分析)；)；
图19为StHB6过表达株系、干扰株系叶片接种晚疫病5d后台盼染色结果(A.StHB6过表达株系、干扰株系叶片接种晚疫病5d的台盼蓝染色表型；B.StHB6过表达株系、干扰株系叶片接种晚疫病5d后台盼蓝染色的直径大小，数据表示平均值±SD，星号表示统计显著性，*p<0.05,**p<0.01(用One-way ANOVA分析)；)；
图20为StTCTP启动子具有AtHB6的绑定基序；
图21为本氏烟草中瞬时表达验证StHB6与StTCTP启动子绑定；
图22为StHB6、PVY-CP、StTCTP在接种PVY后的接种叶、上位叶的相对表达量；
A.StHB6在接种PVY 4d后接种叶中的相对表达；B.StHB6在接种PVY 4d后上位叶的相对表达；C.StHB6在接种PVY 11d后上位叶的相对表达；D.StHB6在接种PVY 21d后上位叶的相对表达；E.PCY-CP在接种PVY的4d后接种叶的相对表达；F.PCY-CP在接种PVY的4d后上位叶的相对表达；G.PCY-CP在接种PVY的11d后上位叶的相对表达；H.PCY-CP在接种PVY的21d后上位叶的相对表达；I.StTCTP在接种PVY的4d后接种叶的相对表达；J.StTCTP在接种PVY的4d后上位叶的相对表达；K.StTCTP在接种PVY的11d后上位叶的相对表达；L.StTCTP在接种PVY的21d后上位叶的相对表达，数据表示平均值±SD，星号表示统计显著性，*p<0.05,****p<0.0001(用One-way ANOVA分析)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
本实验研究所用植株材料为野生型脱毒鄂马铃薯3号(E3，四倍体)，二倍体马铃薯AC142，以及本氏烟草(Nicotiana benthamiana)。
所有的马铃薯材料以及后续得到的马铃薯转基因株系均培养于含有4％蔗糖MS固体培养基中，在光周期16h光照，8h黑暗，温度为23℃的马铃薯组培间培养。试管苗生长2周后，将组培苗中的固体培养基洗去，在同等的培养环境中炼苗3天。
本研究所用引物均利用SnapGene 3.2.1软件设计，根据所构建载体的酶切位点不同，在所需要的序列前面添加相应的碱基序列。引物序列以及相应的用途如表所示。
表1.引物序列
实施例1、马铃薯StHB6的克隆及生物信息学分析
依据马铃薯基因组数据库Spud DB的马铃薯DM3-1参考基因组(V4.03)中PGSC0003DMG400016790序列上获取StHB6(Soltu.DM.05G021250)CDS序列，通过SnapGene设计扩增引物StHB6-ORF-F/R(如1表中SEQ ID NO.1～2所示)。以E3的cDNA为模板通过PCR克隆了StHB6基因。如图1所示，大约1000bp处获得目的片段，胶回收目的片段后连接T载体，菌检阳性克隆子并送测序，检测扩增序列是否与登录序列一致。测序结果表明扩增获得的StHB6基因CDS大小为978bp，编码325个氨基酸。NCBI序列编号：LOC102592561，StHB6基因CDS序列如SE Q ID NO.21所示，StHB6基因编码氨基酸序列如SE Q ID NO.22所示。
对StHB6基因的染色体分布分析显示，该基因位于马铃薯5号染色体上。利用GSDS软件分析其基因结构，结果如图2，A所示，有3个外显子，2内含子。
通过对网站Expasy预测的结果进行分析，StHB6基因编码的蛋白由5026个原子组成，分子式为C1575H2449N445O547S10，等电点PI为4.66，分子质量为36691.02，总亲水平均值(GRAVY)为-0.846，属于亲水蛋白，不稳定系数为48.07，属于不稳定蛋白。表明该蛋白没有跨膜结构域，在109-117(氨基酸)处，有一个核定位信号(NLS)，符合StHB6作为转录因子的基本特征。
将StHB6基因的蛋白序列在NCBI数据库和Ensembl Plants数据库进行比对分析，获取了在拟南芥、马铃薯中同源性最高的基因序列AtHB6。从马铃薯数据库中获取马铃薯StHB6基因的蛋白序列，通过NCBI和SMART预测StHB6编码蛋白的保守结构域(图2，B)。在62-115氨基酸处有参与关键发育过程转录调控的DNA结合域Homeodomain(HOX)，在117-149氨基酸处有HALZ(LZ)，表明StHB6属于HD-Zip家族(图2，C)。利用MEGA对在拟南芥中已经报道的HD-Zip I型家族分类蛋白进行多序列比对，HB6与拟南芥具有保守同源盒结构域和LZ结构的β亚类成员表现出高度相似性因此推测StHB6在马铃薯中属于HD-Zip I型家族的β分支(图2，D)。
实施例2、马铃薯StHB6基因启动子序列分析
马铃薯数据库Spud DB中获取马铃薯StHB6基因上游2000bp的启动子序列(NCBI序列编号：CP055238，SEQ ID NO.23)，在马铃薯品种E3中扩增StHB6的启动子，将其构建到PBI121-GUS载体上，经测序比对后，利用在线分析网站PlantCare对所扩增的启动子序列进行顺式作用元件分析，结果如图3，表2所示，该序列中含有低温、干旱、生物胁迫等响应元件以及水杨酸(SA)、脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)等激素响应顺式作用元件，推测StHB6可能参与了生物胁迫、干旱等生物学过程。
表2.StHB6启动子顺式作用元件及相关功能分析
实施例3、StHB6转录激活活性分析
为了验证StHB6是否具有转录活性，我们克隆了该基因的CDS全长序列，重组到pGBKT-7载体上，并按照酵母转化方法与空载pGBKT-7分别转至酵母菌株AH109，涂布于SD/-Trp培养基培养3天结果，如图4，A所示，并挑取阳性克隆在SD/-Trp/-His/-Ade培养基上培养，结果如图4，B所示，该基因的蛋白全长具有转录活性。为了进一步确认是蛋白发挥功能的区域，我们将该编码蛋白从HD-Zip结构域(62-149氨基酸)处截断成两段，分别为HB6-N(含有HD-Zip结构域)、HB6-C(不含HD-Zip结构域)的基因编码序列然后分别构建到pGBKT-7载体上，转化至酵母菌株AH109中。结果如图4，C所示，StHB6的HB6-C区段具有转录活性，含有HD-Zip结构域的HB6-N区段没有转录活性。说明StHB6基因编码一个具有转录活性的转录因子，其C端具有转录激活活性。
实施例4、StHB6基因表达模式分析
通过对马铃薯数据库Spud DB中转录组数据分析发现该基因受到苯并噻二唑(BTH)、β-氨基丁酸(BABA)处理诱导表达，且响应SA信号，结果如图5，A所示，推测StHB6可能参与生物胁迫的应答反应。
为了确定上述结果，我们进一步通过RT-qPCR分析了StHB6在进行PVY处理24h、48h、72h下的表达模式。结果如图5，B所示，在接种PVY处理72h内，StHB6表达量出现变化，其中接种叶在24h表达量最高，结果如图5，C所示，随着时间的延长表达量有下降的趋势，在接种叶的上位叶StHB6表达量急剧升高，在72h之内表达量持续升高并维持较高的表达水平。实验结果进一步表明StHB6受PVY的诱导表达。
通过RT-qPCR对StHB6在马铃薯各组织器官的表达进行分析，结果如图6，A所示，StHB6在四倍体E3的花中表达量最高，其次是匍匐茎，其他组织器官表达量较低。另外为了获得编辑效率较高的植株，我们拟采用二倍体马铃薯AC142进行StHB6基因编辑，因此，我们还检测了StHB6在AC142各组织器官中的表达。结果如图6，B所示，不同于四倍体马铃薯品种E3中的表达模式，StHB6在AC142的块茎和叶片中表达量最高。
实施例5、过表达、干扰转基因株系的获得与鉴定
StHB6表达模式结果暗示马铃薯StHB6可能参与对生物胁迫的应答反应，同时也参与到马铃薯各个器官的发育。为了深入研究StHB6在马铃薯中的具体功能，我们分别构建了StHB6过表达、干扰载体。通过设计含有EcoR I和Spe I酶切位点的引物pRC26B-HB6-F/R(SEQ ID NO.3～4)，对StHB6的全长CDS进行扩增，电泳检测表明在1000bp左右有明亮的条带。通过酶切连接pRC26B载体骨架(pRC26B-HB6载体图谱如图7所示)，转化大肠杆菌DH5α，进行菌落PCR检测和测序，结果如图8，A所示，获得过表达载体pRC26B-3×FLAG-StHB6。转化农杆菌GV3101，用于后续马铃薯遗传转化。选取StHB6基因中特异的382bp作为干扰片段，通过设计带有Xho I和Xba I酶切位点的SEQ ID NO.5～8所示引物，对其进行扩增，在250-500bp之间有明亮条带。对其进行同源重组，转化大肠杆菌DH5α，进行菌落PCR检测和测序，结果如图8，B所示，获得干扰表达载体pHellsGate8-StHB6。转化农杆菌GV3101，用于后续马铃薯遗传转化。
利用农杆菌介导的马铃薯遗传转化法，将StHB6过表达、干扰载体转化至马铃薯中。经过二次生根筛选，如图8，C所示，获得过表达、干扰植株分别为20株、18株转基因株系，将过表达植株命名为OE株系，干扰株系命名为Ri株系。分别利用过表达植株检测引物(35S-F/pRC26B-HB6-R)干扰植株检测引物(gat8-HB6-反向-F/gat8-HB6-反向-R)对转基因株系的gDNA进行检测。结果如图9，A表明，以检测引物在转基因株系的gDNA中可分别扩增获得1000bp/250-500bp左右的特异性条带，过表达植株OE-1、OE-3、OE-4、OE-9检测条带清晰，干扰植株Ri-2、Ri-4、Ri-5、Ri-8、Ri-11、Ri-12检测条带清晰。
RT-qPCR结果如图9，B所示，表明StHB6的过表达转基因株系OE-1、OE-3、OE-4、OE-9基因的表达量均显著高于对照，干扰转基因株系Ri-2、Ri-4、Ri-5、Ri-8、Ri-11、Ri-12中StHB6的表达量均显著低于对照。其中，过表达株系中StHB6的表达量与对照相比，分别为WT的11.31倍、4.14倍、5.12倍、2.85倍，干扰株系中StHB6的表达量与对照相比，分别为WT的0.38倍、0.197倍、0.35倍、0.124倍、0.11倍、0.44倍。挑选了OE-1、OE-4、OE-9植株进行Western Blot免疫印迹检测，进一步确定转基因植株中StHB6蛋白水平的表达。结果如图9，C所示，3个转基因植株中均可检测出目的蛋白大小的条带。
实施例6、转基因株系的生长发育表型鉴定
一、StHB6负调控块茎重量
对转基因植株的块茎农艺性状进行考察，结果如图10所示，观察温室种植80天后的转基因植株块茎的形态及产量。与野生型(E3)相比，结果如图10，A所示，所有的转基因株系(OE-1、OE-3、OE-4、Ri-2、Ri-4、Ri-11)的薯块形态无显著差异，单株薯数如图10，B所示，单株薯数与WT相比无显著差异。单株薯重如图10，C所示，在3个过表达株系和3个干扰株系中，OE-3、Ri-4的单株薯重显著降低；平均单株薯重如图10，D所示，过表达株系OE-3平均单株薯重显著降低，而干扰株系Ri-4平均单株薯重并无显著降低；薯型如图10，E所示，所有转基因植株的薯型无显著差异。因此当马铃薯室内种植80天后，过表达株系中的薯重发生变化，单株薯重降低，平均单个薯重也降低，综上的结果说明StHB6负调节植株块茎重量。
为了验证StHB6转基因植株在自然条件下的生长发育情况，本实验将各个转基因植株种植在自然光照条件下，观察种植90天的转基因植株块茎发育情况。各株系块茎的表型如图11，A所示，所有的转基因株系(OE-1、OE-3、OE-4、OE-9、Ri-2、Ri-5、Ri-8、Ri-12)的块茎形态无明显差异。单株结薯数如图11，B所示，与对照相比，转基因株系OE-3、9；Ri-2、8、12单株薯数均显著升高；单株薯重如图11，C所示，转基因株系OE-1单株薯重显著降低，Ri-12单株薯重显著升高。平均单个薯重如图11，D所示，OE-1、OE-9、Ri-5平均单个薯重显著降低。薯型如图11，E～G所示，各转基因的薯型没有明显差异。这些结果表明，自然光照条件下，StHB6过表达株系和干扰株系的薯数均增多，但过表达株系单株薯重降低，导致平均单个薯重显著降低，这个结果与室内盆栽种植结果一致，进一步说明StHB6负调控马铃薯块茎重量的产生。
二、StHB6转基因植株异养结薯
为了进一步研究马铃薯块茎的生长发育，用含8％蔗糖的MS固体培养基在短日照条件下诱导结薯，将组培苗插到固体培养基里，每个转基因株系各24株，诱导结薯90天，观察试管薯的薯长、薯宽、薯的长宽比、结薯率及平均薯重。如图12，A所示，干扰株系与对照相比，薯数增多。如12，B所示，干扰株系的薯长与对照相比显著增加。如图12，C所示，干扰株系的薯宽与对照相比显著增加。薯型如图12，D所示，各转基因的薯型(长宽比)未发生改变。如表3所示，干扰株系的异养结薯率、平均薯重比对照和过表达植株的结薯率和平均薯重增多，证明干扰株系生长发育要早于对照，说明StHB6负调控马铃薯块茎生长。
表3.StHB6过表达、干扰株系异养结薯的统计情况
实施例7、马铃薯StHB6转基因植株PVY抗性分析
一、PVY侵染前后StHB6亚细胞定位变化
结果如图12所示，StHB6定位于细胞核。在本氏烟草接种PVY病毒7天后，通过农杆菌介导法，将StHB6-GFP在本氏烟草的叶片中进行瞬时表达。结果如图13所示，GFP-EV(空载)的绿色荧光充满整个细胞膜和核；而StHB6-GFP荧光信号充满整个细胞，表明PVY侵染后，StHB6的亚细胞定位发生改变，可能定位于细胞核和细胞质。
二、PVY侵染后StHB6转基因株系表型观察
为了进一步研究StHB6在PVY侵染应答中的功能，本研究采用PVY分别接种野生型对照(WT)和StHB6的过表达、干扰转基因株系。结果显示，在PVY侵染21天之后，相比于植株的接种叶(图14，A)、StHB6过表达株系的上位叶与WT相比，对PVY侵染表现出一定的抗性，叶片受伤害程度较低，病斑数量较少(图14，B)；而干扰植株则表现出明显的易感性，叶片出现较多明显的坏死性斑点，损伤程度明显比对照植株严重。我们推测StHB6在马铃薯中的过表达可能提高了植株对PVY的抗性。
三、PVY侵染后马铃薯StHB6转基因株系叶片DAB染色
马铃薯被PVY侵染后，感染部位在短时间内产生大量的活性氧(ROS)分子从而导致细胞死亡，将病原体的生长限制在一定的范围内，能阻止病菌的扩散，防止产生大范围的损伤。在接种PVY的3天后，如图15所示，StHB6过表达、干扰植转基因植株与野生型对照植株的接种叶和上位叶经DAB染色后，WT和干扰的叶片中观察到较小的范围被染成浅红色的区域，表明PVY在接种后会造成低水平的H2O2积累，不能产生超敏反应，病原体可以继续侵染周围的细胞，并最终使叶片枯萎。与此不同，在StHB6过表达株系叶片上可以观察到一些被染成深红色的部分，表明PVY的侵染可能引起H2O2大量的积累，这些被侵染部分的细胞会在短时间内发生程序性死亡，抑制了病毒的复制，使得PVY不能继续侵染周围的细胞。以上结果表明，StHB6可能正调控马铃薯对PVY的抗性。
四、PVY侵染后StHB6转基因株系病毒积累量的定量检测
为了进一步确定PVY侵染后StHB6转基因植株中病毒积累量的变化，我们采用RT-qPCR分别检测了侵染4天的接种叶和上位叶以及侵染11天的上位叶中PVY外壳蛋白(coatprotein，CP)基因的表达量。如图16，A～C所示，在转基因植株和野生型对照接种PVY 4天、11天时，StHB6在过表达、干扰植株中差异表达。如图16，D所示，可以看出过表达和干扰表达植株叶片中PVY CP基因均有一定的表达量，说明PVY在接种叶中积累。从图16，E所示，接种4天时PVY已在上位叶积累，但StHB6过表达植株上位叶中病毒积累量与WT相比显著降低，StHB6干扰植株上位叶中病毒的积累量与WT相比显著升高。如图16，F所示，接种11天时的上位叶中，StHB6过表达植株中PVY的积累量极显著降低，说明StHB6的表达量升高会延缓病毒的传播和积累速度，而降低StHB6的表达量有助于PVY的传播和积累。
如图17，A，B所示，StHB6过表达、干扰表达植株在接种PVY 21天时，StHB6在接种叶和上位叶的相对表达量。如图17，C所示，在接种病毒21天后，可以看出过表达和干扰表达植株叶片中PVY CP基因均有一定的表达量，说明PVY在接种叶中积累。如图17，D所示，在接种病毒21天时，干扰植株的上位叶中病毒的积累量与WT相比显著升高，相反，过表达植株中上位叶的病毒积累与WT相比显著降低。综上所述，可以表示StHB6参与PVY的传播途径，StHB6表达量降低后，病毒的积累量显著增加，而StHB6的表达量增加后病毒的积累量显著降低，StHB6表达量增加可以延缓PVY病毒的传播和积累速度，正向调控PVY的侵染。
实施例8、StHB6对马铃薯晚疫病的抗性调控
一、病斑测定
按照晚疫病的发病情况分级，如图18，A所示，接种晚疫病致病菌后，StHB6过表达株系的叶片可见少量的黑色病斑且病斑呈现针眼大小，不超过5mm，属于晚疫病发病情况分级的1-2级。StHB6干扰株系叶片呈现大片的黑色枯死的病斑，病斑大小在(8-15mm),在黑色枯死病斑上出现白色的菌丝体，属于晚疫病发病情况分级的3-4级。如图18，B所示，StHB6过表达株系叶片的病斑直径与WT相比显著降低，而StHB6干扰株系的病斑直径与WT相比显著升高，说明StHB6基因表达量增加能抑制晚疫病孢子的繁殖，StHB6的表达量降低加快了晚疫病致病菌孢子的繁殖速度。综上结果表明，StHB6可能参与对晚疫病抗性的正向调控。
二、台盼蓝染色
植物为抵抗病菌的入侵，大多通过细胞程序性死亡来阻止病菌向周围细胞的扩散，如图19，A所示，接种晚疫病5天后StHB6过表达植株的叶片经台盼蓝染色后的蓝色部分比WT叶片的蓝色部分小，而StHB6干扰植株的叶片蓝色部分比WT叶片的蓝色部分大，结果如图19，B所示，StHB6过表达植株叶片经台盼蓝染色后的病斑直径与WT相比显著降低，而StHB6干扰植株叶片经台盼蓝染色后的病斑直径与WT相比显著升高。再次验证接种晚疫病致病菌后的病斑大小结果，StHB6参与对晚疫病的抗性调控，且为正向调控。
实施例9、tHB6转录因子的调控网络分析
一、StHB6结合StTCTP的启动子
在实验室前期通过烟草NtHB6研究以及查阅相关文献后，发现翻译控制肿瘤蛋白(Translationally controlled tumor protein，TCTP)，在人类基因组中也称为P23，是一个可能在茄科植物中帮助PVY进行转运的蛋白。如图20所示，对马铃薯TCTP基因的启动子进行分析，发现StTCTP的启动子中具有拟南芥AtHB6的绑定基序[TAATNATT]。
为了确认转录因子StHB6与StTCTP的启动子绑定，我们进行了双荧光素酶报告基因实验。以E3的gDNA为模板，采用PCR扩增StTCTP包含[TAATAATT]顺式作用元件在内的SEQID NO.24所示TCTP-1(Soltu.DM.01G039490.1)启动子序列、SEQ ID NO.25所示TCTP-2(Soltu.DM.01G039500.1)启动子序列并构建到载体上，然后将pGreenII 0800-LUC载体和空载pCAMBIA1300-eGFP载体、pGreenII 0800-LUC-TCTP载体和空载pCAMBIA1300-eGFP分别热激转入农杆菌GV3101，然后分别一起注射进本氏烟草中，2天后观察荧光并取样，液氮速冻。
检测LUC及REN的荧光值并计算LUC/REN的比值。结果如图21所示，共注射到本氏烟草的LUC/REN比值显著低对照，说明StHB6与StTCTP启动子互作且起抑制作用。
二、StHB6、PVY-CP与StTCTP三者之间的关系
综上所述，StHB6绑定StTCTP启动子并显著抑制StTCTP的转录，推测StHB6通过抑制StTCTP转录，使得TCTP不能参与PVY的转运，从而正向调控植株的PVY抗性。
通过检测接种PVY 4天、11天、21天的接种叶和上位叶中StHB6、StTCTP、PVY-CP的表达，如图22，A～D所示，PVY侵染StHB6各转基因植株4天、11天、21天后的接种叶和上位叶中，StHB6在各转基因植株的相对表达量。图22，F所示，过表达植株的4天上位叶中StHB6表达量增加，PVY-CP和StTCTP的表达量显著降低，干扰株系上位叶StHB6的表达量降低使得PVY-CP和StTCTP的表达量显著高于WT；如图22，G所示，在接种PVY病毒11天时，PVY-CP在过表达株系的表达量显著降低；如图22，H所示，在接种PVY病毒21天时，PVY-CP在StHB6过表达株系中相对表达量与WT相比显著降低，而PVY-CP在StHB6干扰株系中的相对表达量与WT相比显著升高，如图22，L所示，StTCTP的表达与WT相比无显著差异，说明StTCTP可能在PVY的接种前期中表达效果好，后面TCTP表达效果不显著，证明StTCTP的表达是马铃薯感染的早期阶段被马铃薯Y病毒所诱导。综上所述，通过RT-qPCR检测StHB6过表达、干扰转基因植株接种PVY 4天、11天、21天后PVY-CP、StTCTP的相对表达量，推测StHB6通过抑制StTCTP转录，使得StTCTP不能参与PVY的转运，延缓了PVY病毒的传播和积累速度，从而正向调控植株的PVY抗性。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (10)
1.过表达转录因子StHB6在改良马铃薯性状中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述转录因子StHB6的氨基酸序列如SEQID NO.22所示。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述转录因子StHB6的核苷酸序列如SEQID NO.21所示。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：过表达转录因子StHB6在提高马铃薯的单株结薯数中的应用。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：过表达转录因子StHB6在提高马铃薯的结薯率中的应用。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：过表达转录因子StHB6在提高马铃薯的总薯重中的应用。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：过表达转录因子StHB6在提高马铃薯的平均薯重中的应用。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：过表达转录因子StHB6在提高马铃薯的HPV抗性中的应用。
9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：过表达转录因子StHB6在提高马铃薯的晚疫病抗性中的应用。
10.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述过表达转录因子StHB6的方法为将权利要求3所述的StHB6的核苷酸序列通过EcoR I和Spe I酶切位点连接pRC26B载体骨架获得重组表达载体，然后在农杆菌介导下转化马铃薯，获得过表达转录因子StHB6的转基因植株。
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