CN116789771B - 一种抗菌多肽修饰的蛋白衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及新抗菌材料合成技术领域，具体为一种抗菌多肽修饰的蛋白衍生物及其制备方法和应用，所述抗菌多肽修饰的蛋白衍生物为：抗菌肽‑芳醛基吡啶二硫基偶联试剂‑载体蛋白偶联产物；抗菌肽包含有伯氨基官能团；载体蛋白包含有自由巯基官能团；利用芳醛基吡啶二硫基偶联试剂的活化巯基官能团与载体蛋白的自由巯基官能团发生巯基交换反应，形成非对称的二硫键，然后通过芳醛基吡啶二硫基偶联试剂的芳醛基官能团与抗菌肽的伯氨基官能团发生席夫碱反应，形成动态的亚胺键，制备得到抗菌肽‑芳醛基吡啶二硫基偶联试剂‑载体蛋白偶联产物，其通过修饰多重抗菌肽，增强多重抗菌肽分子与细菌细胞间的选择性和结合力，提升抗菌肽的抗菌活性。
Description
技术领域
本发明涉及新抗菌材料合成技术领域，具体为一种抗菌多肽修饰的蛋白衍生物及其制备方法和应用。
背景技术
具有广谱抗菌性和不易产生耐药性的抗菌肽(AMPs)已经发展成为极具潜力的抗生素替代物之一。抗菌肽的主要抑菌机制是多肽分子与菌膜静电相互作用，诱发菌膜破损、细胞内容物外泄，从而杀死细菌。
由于抗菌肽的链长、净正电荷和蛋白酶水解敏感性，使其传输具有极大的挑战性。因此，设计一种良好的传递***至关重要，通过将抗菌肽共价连接到传输***或者非共价封装在传输***中，能够有效地改善抗菌肽的抗菌活性、稳定性和生物毒性。
目前许多材料被发现都可以作为抗菌肽的传输***，其中常见的用于药物递送的材料有蛋白质、聚合物、脂质类、胶束等，以牛血清白蛋白BSA为基础的传输***因其具有生物降解性、非免疫原性、生物相容性和较长的半衰期而受到越来越多的关注。牛血清白蛋白BSA是由581个氨基酸残基组成，其中35个半胱氨酸组成17个二硫键，在肽链的第34位有一自由巯基。
本发明引用参考文献如下：
哈尔滨工业大学在2019年刊出的郝玉秀的硕士学位论文《含羟基POSS的合成及其改性硅树脂耐热性的研究》公开了三硅醇苯基POSS的化学结构和合成方法；
河南工业大学在2021年刊出的贺松林的硕士学位论文《抗菌肽SAMP-A4及衍生物设计合成及成药性初步研究》公开了SAMP-A4的化学结构、合成方法及肽序列。
发明内容
本发明设计合成了一种新型的芳醛基吡啶二硫基偶联试剂，所述偶联试剂上不仅能够修饰多重抗菌肽，而且能够作为桥梁将抗菌肽连接到载体蛋白上，提升抗菌肽的抗菌活性，并且还能够在抗菌药物研发中应用，其技术方案具体如下：
第一方面，本发明提供一种抗菌多肽修饰的蛋白衍生物，所述抗菌多肽修饰的蛋白衍生物为：抗菌肽-芳醛基吡啶二硫基偶联试剂-载体蛋白偶联产物；
其中，抗菌肽包含有伯氨基官能团；
载体蛋白包含有自由巯基官能团；
利用芳醛基吡啶二硫基偶联试剂的活化巯基官能团与载体蛋白的自由巯基官能团发生巯基交换反应，形成非对称的二硫键，然后通过芳醛基吡啶二硫基偶联试剂的芳醛基官能团与抗菌肽的伯氨基官能团发生席夫碱反应，形成动态的亚胺键，制备得到抗菌肽-芳醛基吡啶二硫基偶联试剂-载体蛋白偶联产物。
优选的，所述芳醛基吡啶二硫基偶联试剂包括芳醛基吡啶二硫基偶联试剂Ⅰ或/和芳醛基吡啶二硫基偶联试剂Ⅱ。
优选的，所述芳醛基吡啶二硫基偶联试剂Ⅰ的制备方法为：
步骤S1，通过2,2'-二硫二吡啶与巯丙基三甲氧基硅烷的巯基官能团发生巯基活化交换反应，制备三甲氧基吡啶二硫基硅烷单体；
步骤S2，使用维尔斯迈尔-哈克(Vilsmeier-Haack)反应，以N,N-二甲基甲酰胺DMF为甲酰化试剂、乙腈CH3CN为溶剂，在三氯氧磷POCl3催化剂作用下，对甲氧基二甲基苯硅烷进行甲酰化反应，制备得到芳醛基甲氧基二甲基硅烷单体；
步骤S3，以对苯二酚为阻聚剂、氯化亚锡为助阻聚剂，利用水解缩合法，通过三甲氧基吡啶二硫基硅烷单体与芳醛基甲氧基二甲基硅烷单体直接发生水解缩合反应，制备得到芳醛基吡啶二硫基偶联试剂Ⅰ。
优选的，所述芳醛基吡啶二硫基偶联试剂Ⅱ的制备方法为：
步骤S1，使用维尔斯迈尔-哈克(Vilsmeier-Haack)反应，以N,N-二甲基甲酰胺DMF为甲酰化试剂、乙腈CH3CN为溶剂，在三氯氧磷POCl3催化剂作用下，对三硅醇苯基POSS进行甲酰化反应，制备得到芳醛基三硅醇POSS单体；
步骤S2，使用顶角盖帽法，以芳醛基三硅醇POSS单体为原料、甲苯为溶剂、四乙基氢氧化铵为催化剂，把三甲氧基吡啶二硫基硅烷单体作为盖帽试剂，制备得到芳醛基吡啶二硫基偶联试剂Ⅱ。
另一方面，本发明提供一种抗菌多肽修饰的蛋白衍生物的制备方法，所述制备步骤如下：
步骤S1，利用过滤器把溶解载体蛋白的缓冲液转换为磷酸盐缓冲液，调节蛋白浓度；
步骤S2，利用磷酸盐缓冲液溶解芳醛基吡啶二硫基偶联试剂，溶解之后加入到步骤S1的载体蛋白液中；
步骤S3，缓摇反应之后转换缓冲液到磷酸盐缓冲液中，调节芳醛基吡啶二硫基偶联试剂-载体蛋白浓度；
步骤S4，利用磷酸盐缓冲液溶解抗菌肽，并配制抗菌肽溶液；
步骤S5，向芳醛基吡啶二硫基偶联试剂-载体蛋白中加入过量的抗菌肽溶液，在溶液上覆盖氮气，缓摇反应，之后对溶液充分透析以除去未反应的抗菌肽，得到抗菌肽-芳醛基吡啶二硫基偶联试剂-载体蛋白偶联产物。
优选的，所述步骤S1：磷酸盐缓冲液的pH为4.0~5.0；
优选的，所述步骤S2：磷酸盐缓冲液的pH为4.0~5.0；
优选的，所述步骤S3：磷酸盐缓冲液的pH为8.0~10.0、浓度为0.5M；
优选的，所述步骤S4：磷酸盐缓冲液的pH为8.0~10.0、浓度为0.5M。
优选的，所述载体蛋白选择使用牛血清白蛋白BSA、重组人血清白蛋白HSA中的一种或者两种组合。
优选的，所述抗菌肽选择使用抗菌肽(SAMP-A4)。
第三方面，本发明提供一种抗菌多肽修饰的蛋白衍生物，其能够在抗菌药物研发中应用。
与现有技术相比，本发明具备以下有益的技术效果：
本发明：首先合成芳醛基吡啶二硫基偶联试剂：芳醛基吡啶二硫基偶联试剂Ⅰ、芳醛基吡啶二硫基偶联试剂Ⅱ；
其次使用芳醛基吡啶二硫基偶联试剂把含有自由巯基官能团的载体蛋白与含有伯氨基官能团的抗菌肽连接，制备得到抗菌肽-芳醛基吡啶二硫基偶联试剂-载体蛋白偶联产物，其上能够修饰多重抗菌肽，增强多重抗菌肽分子与细菌细胞间的选择性和结合力，提升抗菌肽的抑菌效率；
本发明提供了一种研发抗菌药物的新方法。
附图说明
图1为三甲氧基吡啶二硫基硅烷单体的化学结构式；
图2为芳醛基甲氧基二甲基硅烷单体的化学结构式；
图3为芳醛基吡啶二硫基偶联试剂Ⅰ的化学结构式；
图4为芳醛基三硅醇POSS单体的化学结构式；
图5为芳醛基吡啶二硫基偶联试剂Ⅱ的化学结构式；
图6为抗菌肽(SAMP-A4)-芳醛基吡啶二硫基偶联试剂Ⅰ-载体蛋白(BSA)偶联产物Ⅰ的化学结构式；
图7为抗菌肽(SAMP-A4)-芳醛基吡啶二硫基偶联试剂Ⅱ-载体蛋白(BSA)偶联产物Ⅱ的化学结构式；
图8为抗菌肽(SAMP-A4)-芳醛基吡啶二硫基偶联试剂-载体蛋白(BSA)偶联产物的抗菌实验结果。
具体实施方式
实验例Ⅰ：
制备芳醛基吡啶二硫基偶联试剂Ⅰ，其具体的制备过程如下：
实验例Ⅰ-1：
制备三甲氧基吡啶二硫基硅烷单体，其制备机理为：通过2,2'-二硫二吡啶与巯丙基三甲氧基硅烷的巯基官能团发生巯基活化交换反应，制备得到三甲氧基吡啶二硫基硅烷单体；
三甲氧基吡啶二硫基硅烷单体的具体制备步骤如下：在氮气保护作用下，把2.2g2,2'-二硫二吡啶、100mL二氯甲烷加入反应器中，搅拌混合0.5h，在机械搅拌速率180rpm下，以2mL/min的速率把溶解有2.94g巯丙基三甲氧基硅烷的100mL二氯甲烷滴加至上述反应体系中，滴加完毕之后，在室温下机械搅拌反应24h，通过旋转蒸发仪除去溶剂，利用硅胶柱层析法(流动相：1体积份乙酸乙酯和9体积份石油醚)分离产物，于60℃下真空干燥至恒重，制备得到三甲氧基吡啶二硫基硅烷单体，其化学结构式如图1所示；
三甲氧基吡啶二硫基硅烷单体的核磁共振氢谱表征结果如下：
1H NMR(400MHz，CDCl3，δ)：0.56(t，2H，-Si-CH2-)，1.55(m，2H，-CH2-)，2.54(t，2H，-CH2-S-)，3.55(s，9H，-O-CH3)，7.21-8.26(m，4H，Ar-H)；
三甲氧基吡啶二硫基硅烷单体(C11H19NO3S2Si)的元素分析结果如下：
检测值：43.28%C，6.23%H，4.59%N，15.74%O，20.98%S，9.18%Si；
理论值：43.25%C，6.27%H，4.59%N，15.71%O，20.99%S，9.19%Si。
实验例Ⅰ-2：
制备芳醛基甲氧基二甲基硅烷单体，其制备机理为：使用维尔斯迈尔-哈克(Vilsmeier-Haack)反应，以N,N-二甲基甲酰胺DMF为甲酰化试剂、乙腈CH3CN为溶剂，在三氯氧磷POCl3催化剂作用下，对甲氧基二甲基苯硅烷进行甲酰化反应，制备得到芳醛基甲氧基二甲基硅烷单体；
芳醛基甲氧基二甲基硅烷单体的具体制备步骤如下：在氮气保护作用下，在-5℃下，把1.5mLN,N-二甲基甲酰胺DMF、2mL三氯氧磷POCl3、100mL乙腈CH3CN加入反应器中，搅拌20min，在机械搅拌作用下，加入3.33g甲氧基二甲基苯硅烷到上述反应体系中，机械搅拌反应4h，过滤分离产物以冷的乙腈洗涤，利用硅胶柱层析法(流动相：1体积份乙腈和10体积份石油醚)分离产物，于40℃下真空干燥至恒重，制备得到芳醛基甲氧基二甲基硅烷单体，其化学结构式如图2所示；
芳醛基甲氧基二甲基硅烷单体的核磁共振氢谱表征结果如下：
1H NMR(400MHz，CDCl3，δ)：0.64(s，6H，Si-CH3)，3.56(s，3H，Si-O-CH3)，7.35-7.84(m，4H，Ar-H)，9.98(s，1H，Ar-CHO)；
芳醛基甲氧基二甲基硅烷单体(C10H14O2Si)的元素分析结果如下：
检测值：61.86%C，7.22%H，16.49%O，14.43%Si；
理论值：61.82%C，7.26%H，16.47%O，14.45%Si。
实验例Ⅰ-3：
制备芳醛基吡啶二硫基偶联试剂Ⅰ，其制备机理为：以对苯二酚为阻聚剂、氯化亚锡为助阻聚剂，利用水解缩合法，通过三甲氧基吡啶二硫基硅烷单体与芳醛基甲氧基二甲基硅烷单体直接发生水解缩合反应，制备得到芳醛基吡啶二硫基偶联试剂Ⅰ；
芳醛基吡啶二硫基偶联试剂Ⅰ的具体制备步骤如下：把3.05g三甲氧基吡啶二硫基硅烷单体、5.94g芳醛基甲氧基二甲基硅烷单体加入到反应器中，搅拌形成均相溶液，在油浴40℃下，加入135mg对苯二酚、180mg氯化亚锡，升温至油浴150℃下搅拌反应6h，加热至200℃下抽真空1h，制备得到芳醛基吡啶二硫基偶联试剂Ⅰ，其化学结构式如图3所示；
芳醛基吡啶二硫基偶联试剂Ⅰ的核磁共振氢谱表征结果如下：
1H NMR(400MHz，CDCl3，δ)：0.55(t，2H，-Si-CH2-)，0.62(s，18H，Si-CH3)，1.54(m，2H，-CH2-)，2.52(t，2H，-CH2-S-)，7.20-8.28(m，16H，Ar-H)，10.01(s，3H，Ar-CHO)；
芳醛基吡啶二硫基偶联试剂Ⅰ(C35H43NO6S2Si4)的元素分析结果如下：
检测值：56.07%C，5.74%H，1.87%N，12.82%O，8.54%S，14.95%Si；
理论值：56.04%C，5.78%H，1.87%N，12.80%O，8.55%S，14.97%Si。
实验例Ⅱ：
制备芳醛基吡啶二硫基偶联试剂Ⅱ，其具体的制备过程如下：
实施例Ⅱ-1：
制备芳醛基三硅醇POSS单体，其制备机理为：使用维尔斯迈尔-哈克(Vilsmeier-Haack)反应，以N,N-二甲基甲酰胺DMF为甲酰化试剂、乙腈CH3CN为溶剂，在三氯氧磷POCl3催化剂作用下，对三硅醇苯基POSS进行甲酰化反应，制备得到芳醛基三硅醇POSS单体；
芳醛基三硅醇POSS单体的具体制备步骤如下：在氮气保护作用下，在-5℃下，把0.375mLN,N-二甲基甲酰胺DMF、0.5mL三氯氧磷POCl3、100mL乙腈CH3CN加入反应器中，搅拌20min，在机械搅拌作用下，加入4.65g甲氧基二甲基苯硅烷到上述反应体系中，机械搅拌反应4h，过滤分离产物以冷的乙腈洗涤，沉淀产物加入30mL去离子水中，加热至55℃水解3h，利用硅胶柱层析法(流动相：1体积份乙腈和10体积份石油醚)分离产物，于40℃下真空干燥至恒重，制备得到芳醛基三硅醇POSS单体，其化学结构式如图4所示；
芳醛基三硅醇POSS单体的核磁共振氢谱表征结果如下：
1H NMR(400MHz，CDCl3，δ)：1.18(s，3H，Si-OH)，7.36-7.87(m，28H，Ar-H)，10.02(s，7H，Ar-CHO)；
芳醛基三硅醇POSS单体(C49H38O19Si7)的元素分析结果如下：
检测值：52.22%C，3.37%H，27.00%O，17.41%Si；
理论值：52.20%C，3.40%H，26.96%O，17.44%Si。
实施例Ⅱ-2：
制备芳醛基吡啶二硫基偶联试剂Ⅱ，其制备机理为：使用顶角盖帽法，以芳醛基三硅醇POSS单体为原料、甲苯为溶剂、四乙基氢氧化铵为催化剂，把三甲氧基吡啶二硫基硅烷单体作为盖帽试剂，制备得到芳醛基吡啶二硫基偶联试剂Ⅱ；
芳醛基吡啶二硫基偶联试剂Ⅱ的具体制备步骤如下：把1.889g芳醛基三硅醇POSS单体溶解在6mL甲苯中，控制反应体系温度为-10℃，加入0.549g三甲氧基吡啶二硫基硅烷单体，50µL35%四乙基氢氧化铵水溶液，室温下搅拌反应12h，产物利用甲醇沉淀、二氯甲烷溶解、于60℃下真空干燥至恒重，制备得到芳醛基吡啶二硫基偶联试剂Ⅱ，其化学结构式如图5所示；
芳醛基吡啶二硫基偶联试剂Ⅱ的核磁共振氢谱表征结果如下：
1H NMR(400MHz，CDCl3，δ)：0.54(t，2H，-Si-CH2-)，1.54(m，2H，-CH2-)，2.55(t，2H，-CH2-S-)，7.19-8.27(m，32H，Ar-H)，10.03(s，7H，Ar-CHO)；
芳醛基吡啶二硫基偶联试剂Ⅱ(C57H45NO19S2Si8)的元素分析结果如下：
检测值：51.24%C，3.37%H，1.05%N，22.77%O，4.79%S，16.78%Si；
理论值：51.21%C，3.39%H，1.05%N，22.74%O，4.80%S，16.81%Si。
实验例Ⅲ：
制备抗菌肽(SAMP-A4)-芳醛基吡啶二硫基偶联试剂-载体蛋白(BSA)偶联产物，其制备机理如下：
利用芳醛基吡啶二硫基偶联试剂的活化巯基官能团与载体蛋白(BSA)的自由巯基官能团发生巯基交换反应，形成非对称的二硫键，然后通过芳醛基吡啶二硫基偶联试剂的芳醛基官能团与抗菌肽(SAMP-A4)的伯氨基官能团发生席夫碱反应，形成动态的亚胺键，制备得到抗菌肽(SAMP-A4)-芳醛基吡啶二硫基偶联试剂-载体蛋白(BSA)偶联产物。
实施例Ⅲ-1：
制备抗菌肽(SAMP-A4)-芳醛基吡啶二硫基偶联试剂Ⅰ-载体蛋白(BSA)偶联产物Ⅰ，其具体步骤如下：
步骤S1，利用孔径大小为Mr5000的过滤器把溶解载体蛋白(牛血清白蛋白BSA)的缓冲液转换为磷酸盐缓冲液(pH5.0)，调节蛋白浓度为5mg/mL；
步骤S2，利用磷酸盐缓冲液(pH5.0)溶解芳醛基吡啶二硫基偶联试剂Ⅰ，溶解之后加入到步骤S1的载体蛋白液中，使芳醛基吡啶二硫基偶联试剂Ⅰ的终浓度为2mmol/L；
步骤S3，在25℃缓摇反应4h，之后转换缓冲液到磷酸盐缓冲液(0.5M，pH8.5)中，调节芳醛基吡啶二硫基偶联试剂Ⅰ-载体蛋白(BSA)浓度为5mg/mL；
步骤S4，利用磷酸盐缓冲液(0.5M，pH8.5)溶解抗菌肽(SAMP-A4)，并配制浓度为1.5mg/mL的抗菌肽(SAMP-A4)溶液；
步骤S5，向芳醛基吡啶二硫基偶联试剂Ⅰ-载体蛋白(BSA)中加入过量的抗菌肽(SAMP-A4)溶液，在溶液上覆盖氮气，在20℃缓摇反应2h，之后对溶液充分透析以除去未反应的抗菌肽(SAMP-A4)，得到抗菌肽(SAMP-A4)-芳醛基吡啶二硫基偶联试剂Ⅰ-载体蛋白(BSA)偶联产物Ⅰ，其化学结构式如图6所示；
抗菌肽(SAMP-A4)-芳醛基吡啶二硫基偶联试剂Ⅰ-载体蛋白(BSA)偶联产物Ⅰ的质谱分析结果如下：
抗菌肽(SAMP-A4)-芳醛基吡啶二硫基偶联试剂Ⅰ-载体蛋白(BSA)偶联产物Ⅰ的相对分子质量为68525，与其所包含的三种单组分的相对分子质量之和68654比较接近，两者之间差值约为偶联过程所生成副产物相对分子质量；
其中，抗菌肽(SAMP-A4)的相对分子质量1080；
芳醛基吡啶二硫基偶联试剂Ⅰ的相对分子质量749；
载体蛋白(BSA)的相对分子质量66825；
据此说明：芳醛基吡啶二硫基偶联试剂Ⅰ已将抗菌肽(SAMP-A4)成功偶联到载体蛋白(BSA)上，形成抗菌肽(SAMP-A4)-芳醛基吡啶二硫基偶联试剂Ⅰ-载体蛋白(BSA)偶联产物Ⅰ。
实施例Ⅲ-2：
制备抗菌肽(SAMP-A4)-芳醛基吡啶二硫基偶联试剂Ⅱ-载体蛋白(BSA)偶联产物Ⅱ，其具体步骤参见实施例Ⅲ-1，其化学结构式如图7所示；
抗菌肽(SAMP-A4)-芳醛基吡啶二硫基偶联试剂Ⅱ-载体蛋白(BSA)偶联产物Ⅱ的质谱分析结果如下：
抗菌肽(SAMP-A4)-芳醛基吡啶二硫基偶联试剂Ⅱ-载体蛋白(BSA)偶联产物Ⅱ的相对分子质量为72297，明显大于其所包含的三种单组分的相对分子质量之和69240；
其中，抗菌肽(SAMP-A4)的相对分子质量1080；
芳醛基吡啶二硫基偶联试剂Ⅱ的相对分子质量1335；
载体蛋白(BSA)的相对分子质量66825；
据此说明：芳醛基吡啶二硫基偶联试剂Ⅱ已将抗菌肽(SAMP-A4)成功偶联到载体蛋白(BSA)上，形成抗菌肽(SAMP-A4)-芳醛基吡啶二硫基偶联试剂Ⅱ-载体蛋白(BSA)偶联产物Ⅱ。
性能测试实验：
抗菌肽(SAMP-A4)-芳醛基吡啶二硫基偶联试剂-载体蛋白(BSA)偶联产物的体外抗菌性能实验，具体实验过程如下：
步骤S1，制备细菌菌悬液，具体实验步骤如下：细菌实验前，所使用实验耗材在高压蒸汽灭菌锅(120℃、120kPa)中灭菌处理0.5h；选取***(金黄色葡萄球菌S.aureus)和革兰氏阴性细菌(大肠杆菌E.coli)为测试菌种，并且细菌菌株与LB和50%的甘油混合冻存于-81℃超低温冰箱中；使用时，解冻菌种接种于LB固体培养基，放置于37℃培养箱中孵育48h至生长出菌落，选择单菌放置于3mL的LB液体培养基中，放置于摇床(37℃，160rpm)培养12h，离心(4000rpm，1min)菌液，利用PBS缓冲液(pH7.2)重悬细菌，利用紫外分光光度计测定菌液浓度，稀释使其OD600=0.1，得到对应细菌浓度1×108CFU/mL的菌悬液；
步骤S2，采用菌落计数法测定抗菌产物的抗菌能力，具体实验步骤如下：
配制抗菌溶液：
含抗菌肽(SAMP-A4)浓度600μM、300μM、100μM、50μM、10μM、5μM的抗菌肽(SAMP-A4)-PBS缓冲液(pH7.2)溶液；
含抗菌肽(SAMP-A4)浓度600μM、300μM、100μM、50μM、10μM、5μM的抗菌肽(SAMP-A4)-芳醛基吡啶二硫基偶联试剂Ⅰ-载体蛋白(BSA)偶联产物Ⅰ-PBS缓冲液(pH7.2)溶液；
含抗菌肽(SAMP-A4)浓度600μM、300μM、100μM、50μM、10μM、5μM的抗菌肽(SAMP-A4)-芳醛基吡啶二硫基偶联试剂Ⅱ-载体蛋白(BSA)偶联产物Ⅱ-PBS缓冲液(pH7.2)溶液；
取1mL的上述抗菌溶液与1mL浓度1×108CFU/mL的菌悬液进行混合，使用PBS缓冲液(pH7.2)作为空白对照组，将混合溶液在37°C、160rpm的恒温摇床培养12h；
取0.1mL培养后的混合菌液稀释到5mLPBS缓冲液(pH7.2)中，充分混合后取0.1mL稀释液均匀涂布到琼脂板上，涂布后的琼脂板在37°C的生物培养箱中培养24h，之后进行计数，计算细菌的存活率，其结果如图8所示；
通过分析图8能够得到如下的结论：
第一：在含抗菌肽(SAMP-A4)浓度相同条件下，抗菌肽(SAMP-A4)-芳醛基吡啶二硫基偶联试剂Ⅰ-载体蛋白(BSA)偶联产物Ⅰ和抗菌肽(SAMP-A4)-芳醛基吡啶二硫基偶联试剂Ⅱ-载体蛋白(BSA)偶联产物Ⅱ的抗菌性能是明显优于游离抗菌肽(SAMP-A4)的；
第二：在含抗菌肽(SAMP-A4)浓度相同条件下，尤其是在浓度高于50μM时，抗菌肽(SAMP-A4)-芳醛基吡啶二硫基偶联试剂Ⅰ-载体蛋白(BSA)偶联产物Ⅰ和抗菌肽(SAMP-A4)-芳醛基吡啶二硫基偶联试剂Ⅱ-载体蛋白(BSA)偶联产物Ⅱ对于革兰氏阴性细菌(大肠杆菌E.coli)的抗菌效果，要明显地优于对***(金黄色葡萄球菌S.aureus)的抗菌效果；
第三：抗菌肽(SAMP-A4)-芳醛基吡啶二硫基偶联试剂Ⅱ-载体蛋白(BSA)偶联产物Ⅱ的抗菌性能整体上优于抗菌肽(SAMP-A4)-芳醛基吡啶二硫基偶联试剂Ⅰ-载体蛋白(BSA)偶联产物Ⅰ。
Claims (7)
1.一种抗菌多肽修饰的蛋白衍生物，其特征在于，所述抗菌多肽修饰的蛋白衍生物为：抗菌肽-芳醛基吡啶二硫基偶联试剂-载体蛋白偶联产物；
其中，抗菌肽包含有伯氨基官能团、其选择使用抗菌肽SAMP-A4；
载体蛋白包含有自由巯基官能团、其选择使用牛血清白蛋白BSA；
所述芳醛基吡啶二硫基偶联试剂为芳醛基吡啶二硫基偶联试剂Ⅰ或芳醛基吡啶二硫基偶联试剂Ⅱ；
其中，芳醛基吡啶二硫基偶联试剂Ⅰ的化学结构式为：
；
芳醛基吡啶二硫基偶联试剂Ⅱ的化学结构式为：
；
所述抗菌多肽修饰的蛋白衍生物的制备方法为：利用芳醛基吡啶二硫基偶联试剂的活化巯基官能团与载体蛋白的自由巯基官能团发生巯基交换反应，形成非对称的二硫键，然后通过芳醛基吡啶二硫基偶联试剂的芳醛基官能团与抗菌肽的伯氨基官能团发生席夫碱反应，形成动态的亚胺键，制备得到抗菌肽-芳醛基吡啶二硫基偶联试剂-载体蛋白偶联产物。
2.根据权利要求1所述的抗菌多肽修饰的蛋白衍生物，其特征在于，所述芳醛基吡啶二硫基偶联试剂Ⅰ的制备方法为：
步骤S1，通过2,2'-二硫二吡啶与巯丙基三甲氧基硅烷的巯基官能团发生巯基活化交换反应，制备三甲氧基吡啶二硫基硅烷单体；
步骤S2，使用维尔斯迈尔-哈克(Vilsmeier-Haack)反应，以N,N-二甲基甲酰胺DMF为甲酰化试剂、乙腈CH3CN为溶剂，在三氯氧磷POCl3催化剂作用下，对甲氧基二甲基苯硅烷进行甲酰化反应，制备得到芳醛基甲氧基二甲基硅烷单体；
步骤S3，以对苯二酚为阻聚剂、氯化亚锡为助阻聚剂，利用水解缩合法，通过三甲氧基吡啶二硫基硅烷单体与芳醛基甲氧基二甲基硅烷单体直接发生水解缩合反应，制备得到芳醛基吡啶二硫基偶联试剂Ⅰ。
3.根据权利要求1所述的抗菌多肽修饰的蛋白衍生物，其特征在于，所述芳醛基吡啶二硫基偶联试剂Ⅱ的制备方法为：
步骤S1，使用维尔斯迈尔-哈克(Vilsmeier-Haack)反应，以N,N-二甲基甲酰胺DMF为甲酰化试剂、乙腈CH3CN为溶剂，在三氯氧磷POCl3催化剂作用下，对三硅醇苯基POSS进行甲酰化反应，制备得到芳醛基三硅醇POSS单体；
步骤S2，使用顶角盖帽法，以芳醛基三硅醇POSS单体为原料、甲苯为溶剂、四乙基氢氧化铵为催化剂，把三甲氧基吡啶二硫基硅烷单体作为盖帽试剂，制备得到芳醛基吡啶二硫基偶联试剂Ⅱ。
4.根据权利要求1所述的抗菌多肽修饰的蛋白衍生物，其特征在于，所述抗菌多肽修饰的蛋白衍生物的制备步骤如下：
步骤S1，利用过滤器把溶解载体蛋白的缓冲液转换为磷酸盐缓冲液，调节蛋白浓度；
步骤S2，利用磷酸盐缓冲液溶解芳醛基吡啶二硫基偶联试剂，溶解之后加入到步骤S1的载体蛋白液中；
步骤S3，缓摇反应之后转换缓冲液到磷酸盐缓冲液中，调节芳醛基吡啶二硫基偶联试剂-载体蛋白浓度；
步骤S4，利用磷酸盐缓冲液溶解抗菌肽，并配制抗菌肽溶液；
步骤S5，向芳醛基吡啶二硫基偶联试剂-载体蛋白中加入过量的抗菌肽溶液，在溶液上覆盖氮气，缓摇反应，之后对溶液充分透析以除去未反应的抗菌肽，得到抗菌肽-芳醛基吡啶二硫基偶联试剂-载体蛋白偶联产物。
5.根据权利要求4所述的抗菌多肽修饰的蛋白衍生物，其特征在于，所述步骤S1：磷酸盐缓冲液的pH为4.0~5.0；
所述步骤S2：磷酸盐缓冲液的pH为4.0~5.0。
6.根据权利要求4所述的抗菌多肽修饰的蛋白衍生物，其特征在于，所述步骤S3：磷酸盐缓冲液的pH为8.0~10.0、浓度为0.5M；
所述步骤S4：磷酸盐缓冲液的pH为8.0~10.0、浓度为0.5M。
7.根据权利要求1所述的抗菌多肽修饰的蛋白衍生物在制备抗菌药物研发中的应用，所述菌为大肠杆菌或金黄色葡萄球菌。
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