CN109627286A

CN109627286A - 一种新型广谱抗菌肽samp1-a4及其制备方法

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Publication number: CN109627286A
Application number: CN201811565178.5A
Authority: CN
Inventors: 李瑞芳; 石薇妮; 常俊朋
Original assignee: Henan University of Technology
Current assignee: Henan University of Technology
Priority date: 2018-12-20
Filing date: 2018-12-20
Publication date: 2019-04-16
Anticipated expiration: 2038-12-20
Also published as: CN109627286B

Abstract

本发明公开了一种新型广谱抗菌肽SAMP1‑A4及其制备方法。该抗菌肽的氨基酸序列为：NH₂‑VRLLRRRI‑COOH。本发明的制备方法是采用氨基酸氮Fmoc保护的固相多肽合成方法。本发明克服了常见抗菌肽生物安全性差、易溶血或对哺乳动物细胞有毒性的缺点，是一种对非丝状真菌和细菌具有广谱抑制作用、不具有溶血性、对正常哺乳动物细胞没有毒性的新型抗菌肽。该多肽为临床抗真菌药物研究提供了一种新型先导物。

Description

一种新型广谱抗菌肽SAMP1-A4及其制备方法

技术领域

本发明属于生物制剂，具体涉及一种新型抗菌肽及其制备方法。

背景技术

近年来，由于抗生素滥用，在感染类疾病中，分离出的耐药菌株，尤其耐药性真菌不断增多。超级耐药菌的出现，对新型、细菌和真菌不易产生耐药性的临床抗生素的需求越来越迫切。因此，尽快研究和开发新型、高效、低毒、病原菌不易对其产生耐药性的抗菌药物具有重要意义。

抗菌肽是动物机体天然免疫***的重要组成部分。与传统抗生素主要是通过抑制某一生物合成途径（如细胞壁、蛋白质）发挥作用不同，大多数抗菌肽通过多途径、多靶点的作用机制抑制或杀死病原菌。抗菌肽独特的作用机制，致使微生物不易产生耐药性（FordeE, et al. Molecules, 2015, 20(1):1210-1227; 王欢，等. 细胞与分子免疫学杂志，2015，31(1): 137-139）。因此，抗菌肽用来治疗人和动物的疾病在临床上有着极大潜力，可能是解决病原菌耐药性、药物毒副作用问题的最佳选择。目前，抗菌肽已成为多个领域的研究热点。

利用基因工程技术表达多肽，表达产物不稳定，易被降解，纯化困难。化学合成30个氨基酸以上多肽，产物产量低、纯度低。因此，采用化学合成抗菌肽，为抗菌肽药物的开发奠定理论基础。

发明内容

本发明的目的是采用固相化学合成技术制备得到抗菌活性高、抗菌谱广、生物安全性高的新型抗菌肽SAMP1-A4。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的。

利用固相化学合成技术，合成多肽SAMP1-A4。采用最小抑菌浓度法测定了SAMP1-A4抗菌谱；采用平板计数法研究了SAMP1-A4杀菌抑菌活性；通过溶血活性实验研究了SAMP1-A4的溶血活性；采用细胞毒性实验方法研究了SAMP1-A4对脐静脉血管内皮细胞生长的抑制作用。抗菌肽SAMP1-A4固相合成目前在国内外均未见报道。用此方法获得的抗菌肽SAMP1-A4有望为临床病原微生物感染提供良好的候选药物。

本发明的抗菌肽SAMP1-A4具有以下优点：

（1）具有广谱抗菌活性；

（2）具有杀真菌和抑制细菌活性。

（3）低溶血活性。

（4）对正常哺乳动物细胞没有毒性。

因此，本发明是一种广谱、高效、安全的杀念珠菌多肽，其制备未见报道。

附图说明

附图1为抗菌肽SAMP1-A4杀菌抑菌活性结果图。图1A为热带念珠菌；图1 B为单增李斯特菌。

附图2为抗菌肽SAMP1-A4溶血实验结果图。

附图3为抗菌肽SAMP1-A4对人脐静脉内皮细胞HUVEC生长的影响图。图3A为对照；图3B SAMP1-A4浓度为78 μg/mL；图3C SAMP1-A4浓度为156 μg/mL；图3D SAMP1-A4浓度为234 μg/mL；图3E SAMP1-A4浓度为312 μg/mL。

具体实施方式

下面结合附图详细说明本发明的具体实施方式。

实施例1 抗菌肽SAMP1-A4的制备

采用固相Fmoc法合成目的肽段，由C端至N端合成。将该多肽C端第一个Fmoc-Ile-OH的羧基活化后与树脂结合，脱去Fmoc-保护基，与第二个羧基活化的Fmoc-Arg(Pbf)-OH结合，再脱去Fmoc-保护基，循环重复，直至添加所有氨基酸。用切割液切割树脂上的肽，收集切割液，于离心管中吹干，冰***洗沉淀2~3次，离心去上清，吹干沉淀。将得到的粗品，HPLC纯化。

实施例2 抗菌肽SAMP1-A4抗菌谱测定

1）称量和溶解蛋白质。配制SAMP1-A4磷酸溶液，设第一列初始浓度500 μg/mL，终浓度为0.975 μg/mL。则需配制2mg/mL的SAMP1-A4母液。用20 mmol/L pH6.0的磷酸钠缓冲液溶解SAMP1-A4，溶液用0.22μm无菌滤膜过滤除菌。

2）使用移液枪，在96孔板的各孔中分别加入100 μL的20 mmol/L pH6.0的磷酸钠缓冲液，用于稀释SAMP1-A4。

3）用移液枪吸取100 μL 2 mg/mL SAMP1-A4母液至96孔板第一列的每个孔中。

4）反复吹吸板中第一列的溶液6~8次，混匀，不要溅起。

5）从第一列吸取100 μL加入到第二列，反复吹吸混合6~8次，然后再吸取100 μL至第三列。重复此步骤至第十列。

6）第十列吸取出的100 μL丢弃，不要加入第11列，第11列为阴性对照孔。

7）分别将100 μL菌悬液按顺序加入96孔板的第1列至11列，并反复吹吸6~8次，混匀。注意不要将菌悬液添加到第12列。第12列为空白对照孔。

8）静置孵育96孔板。如果是真菌需培养在30 ℃条件下48 h；如果是细菌，则需培养在37 ℃条件下16 h。

9）每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT溶液，继续培养4 h。吸弃上清，加入100 μL二甲基亚砜(DMSO)，37 ℃置20 min，并不时摇动，待晶体溶解完全后，用酶标仪于 490 nm 处测OD 值。

抑菌率（%）＝［（OD570(样品)–OD570（空白）］/［OD570(阴性)–OD570（空白）］×100。

MIC₁₀₀定义为：使抑菌率达到99.9%时的SAMP1-A4最低浓度。

每个实验重复三次。

结果见表1。由结果可知，SAMP1-A4对枯草芽孢杆菌、单增李斯特菌活性最强，99.9%抑菌浓度为0.95 μg/mL；对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和热带念珠菌活性次之，99.9%抑制浓度为3.9 μg/mL；对新型隐球菌、克柔念珠菌、***滑念珠菌99.9%抑制浓度为7.8 μg/mL。

表1 SAMP1-A4抗菌活性

菌株	MIC<sub>100</sub> (μg/mL)
		热带念珠菌	3.9
白色念珠菌	15.6
		克柔念珠菌	7.8
光滑念珠菌	62.5
		***滑念珠菌	7.8
新型隐球菌	7.8
		大肠杆菌	3.9
铜绿假单胞菌	7.8
		枯草芽孢杆菌	0.95
单增李斯特菌	0.95
		金黄色葡萄球菌	3.9

结果表明：SAMP1-A4对以枯草芽孢杆菌、单增李斯特氏菌和金黄色葡萄球菌为代表的***具有很强的抑菌作用；对热带念珠菌、克柔念珠菌、***滑念珠菌和新型隐球菌等为代表的真菌，及对以大肠杆菌为代表的革兰氏阴性细菌都有较强抑制作用。

实施例3抗菌肽SAMP1-A4杀菌抑菌活性测定

通过测定抗菌肽作用后细菌/真菌活菌数，检测SAMP1-A4杀菌抑菌活性。以热带念珠菌为真菌代表，以单增李斯特菌为细菌代表菌株。

热带念珠菌：用SD液体培养基在28℃温度下，培养热带念珠菌至 OD₆₀₀≈0.6-0.8。将菌悬液接入含有1×MIC₁₀₀ SAMP1-A4的SD液体培养基中，至菌浓度约为 1×10⁵ CFU/mL。同时设不含SAMP1-A4的空白SD培养基作对照。28℃摇床中恒温培养，培养4h后，吸取 100 µL菌液，稀释后涂布于SD琼脂平板上，28 ℃过夜培养，进行菌落计数。

单增李斯特菌：用TSB-YE液体培养基，在37℃温度下，培养单增李斯特菌至 OD₆₀₀≈0.6-0.8。接种菌悬液至含有 1×MIC₁₀₀ SAMP1-A4的TSB-YE液体培养基中，至菌浓度约为1×10⁵ CFU/mL。同时设不含SAMP1-A4的空白TSB-YE培养基作对照。37℃摇床中恒温培养，培养4h后吸取100 µL 菌液，稀释后涂布于LB琼脂平板上，37℃过夜培养，进行菌落计数。

结果如图1所示。结果表明，SAMP1-A4对热带念珠菌具有杀菌活性，对单增李斯特菌具有抑杀作用。

实施例4抗菌肽SAMP1-A4溶血性测定

取无菌96孔板，吸取100 μl 2％的人红细胞混悬液加入到96孔板中。在各个孔中分别加入100 μl SAMP1-A4溶液，使SAMP1-A4终浓度分别为250、125、62.5、31.25、15.6、7.8、3.9、1.9、0.45和0.23μg/mL，混合均匀，每个浓度重复三次。37℃孵育30 min后，将各孔中的上清液取出转入到新的96孔微量滴定板中，使用微孔板酶标仪在570 nm处测量样品的吸光度A。设未加SAMP1-A4的人红细胞混悬液为阴性对照（0%溶血），加入1% Triton X-100的人红细胞悬液为阳性对照(100%溶血)。计算溶血率。

溶血率计算公式：

溶血百分率(%)=[(样品A570–阴性对照A570)/(阳性对照A570–阴性对照 A570)]×100%

结果见图2。由结果可知， 5%溶血率时，SAMP1-A4浓度为87 μg/mL，远高于所测其对热带念珠菌、克柔念珠菌、***滑念珠菌、新型隐球菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和单增李斯特杆菌的MIC₁₀₀，最高为91.6倍，低的为11.2。结果表明，SAMP1-A4生物安全性高。

实施例5抗菌肽SAMP1-A4对正常哺乳动物细胞毒性测定

将人脐静脉内皮细胞HUVEC以5×10⁴/孔传代至24孔板中，在5% CO₂和37℃的培养条件下，用含有10%FBS的MCDB培养液在恒温恒湿细胞培养箱中培养HUVEC细胞。待细胞长至融合状态后使用不同浓度（78 μg/mL，156 μg/mL，234 μg/mL，312 μg/mL）的SAMP1-A4处理细胞，24h后取出，将旧培养基吸出，用 1×PBS 洗一次，在倒置显微镜下观察细胞形态及死细胞数量变化。

结果如图3所示。结果表明，在80倍的热带念珠菌MIC₁₀₀浓度条件下，SAMP1-A4浓度下（312 μg/mL），仍测不出SAMP1-A4对脐静脉内皮细胞生长的影响。SAMP1-A4对哺乳动物细胞没有毒性作用。

序列表

<110> 河南工业大学

<120> 一种新型广谱抗菌肽SAMP1-A4及其制备方法

<141> 2018-12-20

<160> 0

<170> SIPOSequenceListing 1.0

Claims

1.一种新型广谱抗菌肽，其特征在于：该抗菌肽氨基酸序列为NH₂- VRLLRRRI -COOH。

2.权利要求1中所述抗菌肽的制备方法，其特征在于：采用常规固相多肽合成技术制备。

3.权利要求2中的抗菌肽制备方法，其特征在于：在Fmoc保护***的固相合成中，首先将Rink Amide-AM Resin装在反应器中，20%哌啶溶液去保护；将C端第一个氨基酸Fmoc-Ile-OH与反应器中的去保护Rink Amide-AM Resin混合，在HOBt/DIC催化下，结合到固相载体上；按照给定的氨基酸序列，Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、 Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH依次偶联，由C端逐个向N端延伸，最后用切割液（87.5% TFA, 2.5% 1,3-dimethoxybenzene, 2.5%triisopropylsilane, 2.5% H₂O, 5% thioanisole）将多肽从固相载体上切下来。

4.根据权利要求2所述的抗菌肽制备方法，其特征在于：可使用肽化学合成领域内已知的各种偶联剂和偶联方法偶联各种氨基酸残基，偶联剂可使用二异丙基碳二亚胺（DIC），二环己基碳二亚胺（DCC）进行直接偶联，或使用羟基苯骈三氮唑（HOBt）或7-氮杂羟基苯骈***（HOAt）活化氨基酸。