CN116769759A - 一种改性硅胶提取尿激酶的工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种改性硅胶提取尿激酶的工艺，实现了从尿液中分离尿激酶的工业目标。该改性硅胶由氯化硅胶和羟基化硅胶构成。公开的改性硅胶纯化工艺不仅能将尿激酶从尿液中进行分离，还能实现HUK和LUK的初步分离，LUK粗溶液中LUK占总UK的百分比普遍高于85％，HUK粗溶液中HUK占总UK的百分比普遍高于83％。同时该方法对尿激酶的损耗极小，可以实现至少95％的回收。本发明公开的改性硅胶吸附步骤+亲和层析吸附步骤能够基本实现HUK和LUK的完全分离，可以获得纯度高达99％以上的高品质LUK纯品和HUK纯品。
Description
技术领域
本发明涉及纯化分离领域，更具体的是涉及一种改性硅胶提取尿激酶的工艺。
背景技术
尿激酶(UK)是指从健康人尿中分离的，或从人肾组织培养中获得的一种酶蛋白，尿激酶能催化纤溶酶原生成纤溶酶。尿激酶适用于各种血栓病及心肌梗死等疾病的临床治疗。而且由于尿激酶来源于人尿或肾细胞的组织培养液，因此相比于纤维蛋白溶解酶，尿激酶具有无抗原性、无热源、毒副作用小等优点。
人尿源尿激酶主要有天然高分子量尿激酶(HUK,54000Dal)和低分子量尿激酶(LUK,33000Dal)两种。尽管体外血浆存在时，HUK和LUK的酶活性几乎相同，但HUK对原生动物体内的纤溶酶原的亲和力更高，而且在血液中的半衰期长，溶栓效果是LUK的2-3倍，因此HUK的活性被认为比LUK更为重要。
正常男性一昼夜排出的尿量约在1～2L之间，尿液pH介于5.0～7.0之间，比重介于1.015～1.025之间。尿液中水分含量约95～97％，固体物质含量约3～5％，后者又可分为有机物和无机物两大类。有机物中主要是尿素，其余为肌酐、尿酸、尿色素、维生素等。无机物主要是硫酸盐、磷酸盐和钾、铵等盐类，尿激酶含量约5～7IU/mL。目前从人尿中提取尿激酶的方法主要有吸附法、超滤法、离子交换法等，但以上方法存在消耗大、酶活性回收低等问题，导致不适于大规模推广及工业化生产。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种硅胶吸附与亲和层析相结合的尿激酶纯化工艺。本发明公开的改性硅胶纯化工艺不仅能将尿激酶从尿液中进行分离，还能实现HUK和LUK的初步分离，LUK粗溶液中LUK占总UK的百分比普遍高于85％，HUK粗溶液中HUK占总UK的百分比普遍高于83％。同时该方法对尿激酶的损耗极小，可以实现至少95％的回收。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种改性硅胶提取尿激酶的工艺，包括以下步骤：
1)发泡浓缩：收集新鲜男性尿液，往尿液中通气发泡，使泡沫从上口溢出，收集泡液，在收集到的泡液中加入消泡剂，得到尿激酶原液；
2)改性硅胶吸附：平衡好改性硅胶柱后，用所述尿激酶原液上样，用第一吸附液进行过柱，吸附完成后，用第一洗脱液进行洗脱，收集不同时间的流出液并浓缩得到LUK粗溶液和HUK粗溶液；
所述改性硅胶柱中填充有氯化硅胶和羧基化硅胶；
所述第一吸附液为0.4～0.55mol/L NaCl、pH4.0～4.8的PBS缓冲液；
所述第一洗脱液为pH7.5～8.5的胺-氯化铵缓冲液。
作为优选，所述氯化硅胶的制备方法包括以下步骤：将硅胶放入0.5～1.0％HF水溶液中，反应完成后过滤，然后用水洗涤至中性，得到氟化硅胶；然后将所述氟化硅胶放入10％的盐酸中，反应完成后过滤，然后用水洗涤至中性，干燥得到氯化硅胶。
作为优选，所述羧基化硅胶的制备方法包括以下步骤：将硅胶放入乙醇溶液中，然后加入60～70％的羧酸钠乙基硅酸钠溶液，反应完成后过滤，干燥得到羧基化硅胶。
作为优选，所述氯化硅胶和所述羧基化硅胶的添加比例为(1:2)～(2:3)。
作为优选，所述氯化硅胶所选用的硅胶的比表面积为200～300m3/g，粒径范围为200～300μm。
作为优选，所述羧基化硅胶所选用的硅胶的比表面积为1000～1200m3/g，粒径范围为400～500μm。
作为优选，所述第一吸附液为0.5mol/L NaCl、pH4.5的PBS缓冲液；所述第一洗脱液为pH8.0的胺-氯化铵缓冲液。
作为优选，还包括3)亲和层析吸附：将所述LUK粗溶液在亲和层析柱上进行上样，用第二吸附液进行过柱，吸附完成后，用第二洗脱液进行洗脱，收集不同时间的流出液并浓缩得到第一LUK纯溶液和第一HUK纯溶液；将所述LUK粗溶液在亲和层析柱上进行上样，用第二吸附液进行过柱，吸附完成后，用第二洗脱液进行洗脱，收集不同时间的流出液并浓缩得到第二LUK纯溶液和第二HUK纯溶液，合并所述第一LUK纯溶液和所述第二LUK纯溶液并低温干燥得到LUK纯品，合并所述第一HUK纯溶液和所述第二HUK纯溶液并低温干燥得到HUK纯品；
所述第二吸附液为：0.5mol/L NaCl和0.1mol/L AlCl3、pH4.5的0.1mol/L NaAc～HAc缓冲液；
所述第二洗脱液为：pH7.0含0.5mol/L NaCl的0.05mol/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液。
作为优选，所述亲和层析柱的材料结构为：NH2-C6H5-NH-CH2-CH(OH)-CH2-O-Sepharose-O-CH2-CH(OH)-CH2-NH-C6H5-NH-R其中，R＝CO-CH2-N(CH3)-C(NH)NH2；Sepharose＝葡聚糖凝胶。
作为优选，所述葡聚糖凝胶是Sepharose 6B或Sepharose 6FF。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明公开了一种由氯化硅胶和羟基化硅胶混合制得的硅胶柱。并利用其开发了一种尿激酶的纯化工艺，实现了从尿液中分离尿激酶的工业目标。公开的改性硅胶纯化工艺不仅能将尿激酶从尿液中进行分离，还能实现HUK和LUK的初步分离，LUK粗溶液中LUK占总UK的百分比普遍高于85％，HUK粗溶液中HUK占总UK的百分比普遍高于83％。同时该方法对尿激酶的损耗极小，可以实现至少95％的回收。本发明公开的改性硅胶吸附步骤+亲和层析吸附步骤能够基本实现HUK和LUK的完全分离，可以获得纯度高达99％以上的高品质LUK纯品和HUK纯品。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步详细说明。
实施例1：
一种改性硅胶提取尿激酶的工艺，包括以下步骤：
1)发泡浓缩：收集新鲜男性尿液，往尿液中通气发泡，使泡沫从上口溢出，收集泡液，在收集到的泡液中加入消泡剂，得到尿激酶原液；
2)改性硅胶吸附：平衡好改性硅胶柱后，用所述尿激酶原液上样，用第一吸附液进行过柱，吸附完成后，用第一洗脱液进行洗脱，收集不同时间的流出液并浓缩得到LUK粗溶液和HUK粗溶液；
所述改性硅胶柱中填充有氯化硅胶和羧基化硅胶，氯化硅胶和羧基化硅胶的比例为3:5；
所述第一吸附液为0.5mol/L NaCl、pH4.5的PBS缓冲液；
所述第一洗脱液为pH8.0的胺-氯化铵缓冲液。
所述氯化硅胶的制备方法包括以下步骤：将硅胶放入0.7％HF水溶液中，反应完成后过滤，然后用水洗涤至中性，得到氟化硅胶；然后将所述氟化硅胶放入10％的盐酸中，反应完成后过滤，然后用水洗涤至中性，干燥得到氯化硅胶。
所述羧基化硅胶的制备方法包括以下步骤：将硅胶放入乙醇溶液中，然后加入60～70％的羧酸钠乙基硅酸钠溶液，反应完成后过滤，干燥得到羧基化硅胶。
所述氯化硅胶所选用的硅胶的比表面积为1000m3/g，粒径范围为500μm。所述羧基化硅胶所选用的硅胶的比表面积为500m3/g，粒径范围为300μm。
实施例2：
与实施例1的不同之处在于：氯化硅胶和羧基化硅胶的比例为1:2。
实施例3：
与实施例1的不同之处在于：氯化硅胶和羧基化硅胶的比例为2:3。
实施例4：
与实施例1的不同之处在于：所述第一吸附液为0.4mol/L NaCl、pH4.0的PBS缓冲液；
所述第一洗脱液为pH7.5的胺-氯化铵缓冲液。
实施例5：
与实施例1的不同之处在于：所述第一吸附液为0.55mol/L NaCl、pH4.8的PBS缓冲液；
所述第一洗脱液为pH8.5的胺-氯化铵缓冲液。
实施例6：
与实施例1的不同之处在于：所述氯化硅胶所选用的硅胶的比表面积为200m3/g，粒径范围为200μm。所述羧基化硅胶所选用的硅胶的比表面积为1200m3/g，粒径范围为500μm。
实施例7：
与实施例1的不同之处在于：所述氯化硅胶所选用的硅胶的比表面积为260m3/g，粒径范围为250μm。所述羧基化硅胶所选用的硅胶的比表面积为1100m3/g，粒径范围为450μm。
实施例8：
与实施例1的不同之处在于：所述氯化硅胶所选用的硅胶的比表面积为300m3/g，粒径范围为300μm。所述羧基化硅胶所选用的硅胶的比表面积为1000m3/g，粒径范围为400μm。
实施例9：
与实施例1的不同之处在于：一种改性硅胶提取尿激酶的工艺，还包括3)亲和层析吸附：将所述LUK粗溶液在亲和层析柱上进行上样，用第二吸附液进行过柱，吸附完成后，用第二洗脱液进行洗脱，收集不同时间的流出液并浓缩得到第一LUK纯溶液和第一HUK纯溶液；将所述LUK粗溶液在亲和层析柱上进行上样，用第二吸附液进行过柱，吸附完成后，用第二洗脱液进行洗脱，收集不同时间的流出液并浓缩得到第二LUK纯溶液和第二HUK纯溶液，合并所述第一LUK纯溶液和所述第二LUK纯溶液并低温干燥得到LUK纯品，合并所述第一HUK纯溶液和所述第二HUK纯溶液并低温干燥得到HUK纯品；
所述第二吸附液为：0.5mol/L NaCl和0.1mol/L AlCl3、pH4.5的0.1mol/L NaAc～HAc缓冲液；
所述第二洗脱液为：pH7.0含0.5mol/L NaCl的0.05mol/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液。
所述亲和层析柱的材料结构为：NH2-C6H5-NH-CH2-CH(OH)-CH2-O-Sepharose-O-CH2-CH(OH)-CH2-NH-C6H5-NH-R其中，R＝CO-CH2-N(CH3)-C(NH)NH2；Sepharose＝Sepharose 6B。
亲和层析柱的制备方法包括以下步骤：
取10g滤去水的Sepharose 6B，加入7.5mL 0.8mol/L NaOH、3mL环氧氯丙烷以及11mg NaBH4。常温搅拌，反应8h后滤干，然后用大量的水洗涤，得到活化凝胶。Sepharose 6B的颗粒粒径范围为：5～10μm，所述尿激酶层析柱的颗粒具有凝胶相分布系数，分子量为100～150kDa的活化葡聚糖凝胶的凝胶相分布系数为0.5-0.6。
将活化凝胶置于20mL的20g/L对苯二胺DMSO溶液中，然后加入7.5mL0.8mol/LNaOH，得到悬浮液。常温搅拌，反应24h后滤干，然后用10％乙醇溶液洗涤10L后再用纯水洗涤10L后，得到对苯二胺-Sepharose 6B。
将上述对苯二胺-Sepharose 6B悬浮于50mL水中、搅拌，然后加入18mg一水肌酸和1.0g EDC˙HCl，加入20mL pH为4.5的0.1mol/L HAc-NaAc缓冲液。室温搅拌，反应10h后滤干，然后用0.5mol/L NaCl洗涤10L后再用纯水洗涤10L，得到Sepharose 6B-对苯二胺-Creatine。将Sepharose 6B-对苯二胺-Creatine转移至锥形瓶，然后加入5mL乙酸酐，常温搅拌，反应1h后滤干，然后用纯水洗涤得到最终的亲和层析柱。
实施例10：
与实施例9不同之处在于：所述葡聚糖凝胶是Sepharose 6FF。
对比例1：
与实施例1的不同之处在于：氯化硅胶替换为磺基化硅胶。对应磺基化硅胶的制备方法：将氟化硅胶放入10％的硫酸中，反应完成后过滤，然后用水洗涤至中性，干燥得到磺基化硅胶。
实施例11：
模拟尿样：模拟尿样：LUK含量6IU/mL,HUK含量6IU/mL，尿素含量5mmol/L，肌酐含量150mmol/L，尿酸200umol/L，剩余为水。
蛋白含量测定：取20μL样品溶液加5μL loading buffer，100℃水浴5min,取1μL上样，130V电泳大约70min(时间可适当延长)，随后进行考马斯亮蓝染色，并通过软件BandScan 5.0分析蛋白胶中LUK和HUK的量。
按照实施例1～8以及对比例1的工艺分别纯化1000L模拟尿样，分别得到对应的浓缩到10mL的LUK粗溶液和HUK粗溶液。按照上述蛋白含量测定方法分别测定上述LUK粗溶液和HUK粗溶液中各自LUK和HUK的量。LUK粗溶液中LUK、HUK的含量以及HUK粗溶液中LUK、HUK的含量具体数值如表1和表2所示。
表1
表2
按照实施例1的工艺对尿样进行分离纯化得到LUK粗溶液中LUK含量为5.13×104IU/mL，HUK粗溶液中LUK含量为8.35×103IU/mL，HUK粗溶液中HUK含量为5.02×104IU/mL，LUK粗溶液中HUK含量为8.19×103IU/mL，由此可知，LUK粗溶液中LUK占总UK的百分比为86.00％，HUK粗溶液中HUK占总UK的百分比为85.97％，说明改性硅胶吸附步骤不仅将尿激酶进行分离纯化，还实现了HUK和LUK的初步分离。同时LUK的总回收率达到99.45％，HUK的总回收率达到97.32％，说明实施例1公开的纯化工艺对尿激酶的损耗极小。实施例6的工艺对尿样进行分离纯化得到LUK粗溶液中LUK含量为5.43×104IU/mL，HUK粗溶液中LUK含量为5.14×103IU/mL，HUK粗溶液中HUK含量为5.38×104IU/mL，LUK粗溶液中HUK含量为5.19×103IU/mL，由此可知，LUK粗溶液中LUK占总UK的百分比为91.35％，HUK粗溶液中HUK占总UK的百分比为91.20％。说明氯化硅胶所选用的硅胶的比表面积和粒径范围以及羧基化硅胶所选用的硅胶的比表面积和粒径范围对HUK和LUK的初步分离效果影响较大。发明人目前尚未发现硅胶规格(具体指氯化硅胶所选用的硅胶的比表面积和粒径范围以及羧基化硅胶所选用的硅胶的比表面积和粒径范围)与HUK和LUK分离纯化效果之间的规律，本发明限定的硅胶规格为实验过程中偶然发现，具体规律还需进一步研究。
按照对比例1的工艺对尿样进行分离纯化得到LUK粗溶液中LUK含量为3.67×104IU/mL，HUK粗溶液中LUK含量为1.91×104IU/mL，HUK粗溶液中HUK含量为3.73×104IU/mL，LUK粗溶液中HUK含量为1.86×104IU/mL，由此可知，LUK粗溶液中LUK占总UK的百分比为65.77％，HUK粗溶液中HUK占总UK的百分比为66.73％。说明磺基化硅胶和羟基化硅胶混合制成的纯化柱不能很好地将HUK和LUK进行分离。
按照实施例9和10的工艺分别纯化1000L模拟尿样，分别得到对应的LUK纯品和HUK纯品。用少量的第二吸附液溶解LUK纯品和HUK纯品，得到对因的纯品溶液。然后用上述蛋白含量测定方法测定上述溶液中各自LUK和HUK的量。LUK纯品溶液中LUK、HUK的含量以及HUK纯品溶液中LUK、HUK的含量具体数值如表3所示。
表3
| 含量 | 实施例9 | 实施例10 |
| LUK纯品溶液中LUK含量 | 5.85×104IU/mL | 5.85×104IU/mL |
| LUK纯品溶液中HUK含量 | 4.03×102IU/mL | 4.11×102IU/mL |
| HUK纯品溶液中HUK含量 | 5.79×104IU/mL | 5.80×104IU/mL |
| HUK纯品溶液中LUK含量 | 4.62×102IU/mL | 4.04×102IU/mL |
由表3可知，按照实施例9的工艺对尿样进行分离纯化得到LUK纯品中LUK含量为5.85×104IU/mL，HUK纯品中LUK含量为4.62×102IU/mL，HUK纯品中HUK含量为5.79×104IU/mL，LUK纯品中HUK含量为4.03×102IU/mL，由此可知，LUK纯品中LUK占总UK的百分比为99.23％，HUK纯品中HUK占总UK的百分比为99.31％，说明改性硅胶吸附步骤+亲和层析吸附步骤基本实现了HUK和LUK的完全分离，可以获得高品质的LUK纯品和HUK纯品。同时LUK的总回收率达到98.27％，HUK的总回收率达到97.17％，说明实施例9公开的纯化工艺对尿激酶的损耗极小。
综上所述，本发明公开的改性硅胶纯化工艺不仅能将尿激酶从尿液中进行分离，还能实现HUK和LUK的初步分离，LUK粗溶液中LUK占总UK的百分比普遍高于85％，HUK粗溶液中HUK占总UK的百分比普遍高于83％。同时该方法对尿激酶的损耗极小，可以实现至少95％的回收。本发明公开的改性硅胶吸附步骤+亲和层析吸附步骤能够基本实现HUK和LUK的完全分离，可以获得纯度高达99％以上的高品质LUK纯品和HUK纯品。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通研究人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种改性硅胶提取尿激酶的工艺，包括以下步骤：
1)发泡浓缩：收集新鲜男性尿液，往尿液中通气发泡，使泡沫从上口溢出，收集泡液，在收集到的泡液中加入消泡剂，得到尿激酶原液；
2)改性硅胶吸附：平衡好改性硅胶柱后，用所述尿激酶原液上样，用第一吸附液进行过柱，吸附完成后，用第一洗脱液进行洗脱，收集不同时间的流出液并浓缩得到LUK粗溶液和HUK粗溶液；
所述改性硅胶柱中填充有氯化硅胶和羧基化硅胶；
所述第一吸附液为0.4～0.55mol/L NaCl、pH4.0～4.8的PBS缓冲液；
所述第一洗脱液为pH7.5～8.5的胺-氯化铵缓冲液。
2.根据权利要求1所述的一种改性硅胶提取尿激酶的工艺，其特征在于所述氯化硅胶的制备方法包括以下步骤：将硅胶放入0.5～1.0％HF水溶液中，反应完成后过滤，然后用水洗涤至中性，得到氟化硅胶；然后将所述氟化硅胶放入10％的盐酸中，反应完成后过滤，然后用水洗涤至中性，干燥得到氯化硅胶。
3.根据权利要求1所述的一种改性硅胶提取尿激酶的工艺，其特征在于所述羧基化硅胶的制备方法包括以下步骤：将硅胶放入乙醇溶液中，然后加入60～70％的羧酸钠乙基硅酸钠溶液，反应完成后过滤，干燥得到羧基化硅胶。
4.根据权利要求1所述的一种改性硅胶提取尿激酶的工艺，其特征在于所述氯化硅胶和所述羧基化硅胶的添加比例为(1:2)～(2:3)。
5.根据权利要求2所述的一种改性硅胶提取尿激酶的工艺，其特征在于所述氯化硅胶所选用的硅胶的比表面积为200～300m3/g，粒径范围为200～300μm。
6.根据权利要求3所述的一种改性硅胶提取尿激酶的工艺，其特征在于所述羧基化硅胶所选用的硅胶的比表面积为1000～1200m3/g，粒径范围为400～500μm。
7.根据权利要求1所述的一种改性硅胶提取尿激酶的工艺，其特征在于所述第一吸附液为0.5mol/L NaCl、pH4.5的PBS缓冲液；所述第一洗脱液为pH8.0的胺-氯化铵缓冲液。
8.根据权利要求1所述的一种改性硅胶提取尿激酶的工艺，其特征在于还包括：
3)亲和层析吸附：将所述LUK粗溶液在亲和层析柱上进行上样，用第二吸附液进行过柱，吸附完成后，用第二洗脱液进行洗脱，收集不同时间的流出液并浓缩得到第一LUK纯溶液和第一HUK纯溶液；将所述LUK粗溶液在亲和层析柱上进行上样，用第二吸附液进行过柱，吸附完成后，用第二洗脱液进行洗脱，收集不同时间的流出液并浓缩得到第二LUK纯溶液和第二HUK纯溶液，合并所述第一LUK纯溶液和所述第二LUK纯溶液并低温干燥得到LUK纯品，合并所述第一HUK纯溶液和所述第二HUK纯溶液并低温干燥得到HUK纯品；
所述第二吸附液为：0.5mol/L NaCl和0.1mol/L AlCl 3、pH4.5的0.1mol/LNaAc～HAc缓冲液；
所述第二洗脱液为：pH7.0含0.5mol/L NaCl的0.05mol/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液。
9.根据权利要求8所述的一种改性硅胶提取尿激酶的工艺，其特征在于所述亲和层析柱的材料结构为：NH2-C6H5-NH-CH2-CH(OH)-CH2-O-Sepharose-O-CH2-CH(OH)-CH2-NH-C6H5-NH-R其中，R＝CO-CH2-N(CH3)-C(NH)NH2；Sepharose＝葡聚糖凝胶。
10.根据权利要求9所述的一种改性硅胶提取尿激酶的工艺，其特征在于所述葡聚糖凝胶是Sepharose 6B或Sepharose 6FF。
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