JPS6154450A - 群特異性を有するアフイニテイクロマトグラフイ用ゲルおよびその製造法 - Google Patents
群特異性を有するアフイニテイクロマトグラフイ用ゲルおよびその製造法Info
- Publication number
- JPS6154450A JPS6154450A JP59177347A JP17734784A JPS6154450A JP S6154450 A JPS6154450 A JP S6154450A JP 59177347 A JP59177347 A JP 59177347A JP 17734784 A JP17734784 A JP 17734784A JP S6154450 A JPS6154450 A JP S6154450A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gel
- cellulose
- buffer
- sulfuric acid
- chromatography
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
- B01J20/291—Gel sorbents
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2220/00—Aspects relating to sorbent materials
- B01J2220/50—Aspects relating to the use of sorbent or filter aid materials
- B01J2220/54—Sorbents specially adapted for analytical or investigative chromatography
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、各種の蛋白質、ウィルスなどの精製に有用な
アフイニティクロマトグラフィ用ゲル、さらに詳しくは
、固体粒状非架橋セルロースの硫酸エステルゲルからな
る群特異性を有するアフィニテイクロマトグラフイ用ゲ
ルおよびその製造法に関する。
アフイニティクロマトグラフィ用ゲル、さらに詳しくは
、固体粒状非架橋セルロースの硫酸エステルゲルからな
る群特異性を有するアフィニテイクロマトグラフイ用ゲ
ルおよびその製造法に関する。
従来技術
特定の蛋白質、ウィルスなどを精製取得するには、従来
、遠心分離法、イオン交換法、ケ゛ル濾過法などが採用
されており、これらの方法を適宜組合せたり、また反覆
して用いられる。ところで、これらの方法を組合せある
いは反覆して実施する場合、各工程ごとに複雑な操作を
必要とし、また長時間を要するうえ、それらの工程を経
るにしたがって目的物の損失減量が生じる不利益がある
。
、遠心分離法、イオン交換法、ケ゛ル濾過法などが採用
されており、これらの方法を適宜組合せたり、また反覆
して用いられる。ところで、これらの方法を組合せある
いは反覆して実施する場合、各工程ごとに複雑な操作を
必要とし、また長時間を要するうえ、それらの工程を経
るにしたがって目的物の損失減量が生じる不利益がある
。
別の精製法として、生物学的親和性を有する物質を用い
てクロマトグラフィにより生体物質を分離精製する、い
わゆるアフイニティクロマトグラフイ法も知られている
。そのような生物学的親和性を有する物質として強酸性
のムコ多糖類であるヘパリンがあり、これは生体内で種
々の重要な生理活性を有する蛋白質と結合する特性を有
し、例えばアンチトロンビンIII と結合して血液凝
固阻止作用を促進したり、リボ蛋白リパーゼと結合して
脂血清澄作用を示すなど重要な生理作用、薬理作用を示
す。
てクロマトグラフィにより生体物質を分離精製する、い
わゆるアフイニティクロマトグラフイ法も知られている
。そのような生物学的親和性を有する物質として強酸性
のムコ多糖類であるヘパリンがあり、これは生体内で種
々の重要な生理活性を有する蛋白質と結合する特性を有
し、例えばアンチトロンビンIII と結合して血液凝
固阻止作用を促進したり、リボ蛋白リパーゼと結合して
脂血清澄作用を示すなど重要な生理作用、薬理作用を示
す。
かかるヘパリンの生理活性を利用して、これをセファ0
−スCL−4,8(ファルマシア社製)などのクロマト
グラフィ用ゲル担体にCNBrなどを用いて結合させて
アフィニティクロマトグラフィ用ゲルを調製し、それを
用いてアンチトロンビンIII 、凝固因子、リポ蛋白
リパーゼなどの重要な生理活性を有する蛋白質を精製す
ることが提案されている。しカルなが呟ヘパリンは動物
の肺臓、腎臓、肝臓などから抽出精製されるものである
ため、その操作が煩雑であり、しかも原料が違えばヘパ
リンの性状も異なるため、同一性状のヘパリンを大量に
入手することが困難でかつきわめて高価である。したが
って、ヘパリ、ンを結合させたアフィニティクロマトグ
ラフィ用ゲルを用いる方法は現段階では工業的規模で採
用することば外わめて難り化い。
−スCL−4,8(ファルマシア社製)などのクロマト
グラフィ用ゲル担体にCNBrなどを用いて結合させて
アフィニティクロマトグラフィ用ゲルを調製し、それを
用いてアンチトロンビンIII 、凝固因子、リポ蛋白
リパーゼなどの重要な生理活性を有する蛋白質を精製す
ることが提案されている。しカルなが呟ヘパリンは動物
の肺臓、腎臓、肝臓などから抽出精製されるものである
ため、その操作が煩雑であり、しかも原料が違えばヘパ
リンの性状も異なるため、同一性状のヘパリンを大量に
入手することが困難でかつきわめて高価である。したが
って、ヘパリ、ンを結合させたアフィニティクロマトグ
ラフィ用ゲルを用いる方法は現段階では工業的規模で採
用することば外わめて難り化い。
1935年ジョルベスら(Jorpes et al)
によりヘパリンの血液凝固阻止作用は分子中の硫酸基の
存在に基づくことか明らかにされて以来、ヘパリンに代
る高分子硫酸エステルを合成してアフイニテイクロマト
グラフイ用ゲルを調製する試みがされている。そのよう
な物質として、例えば、セルロース硫酸、デキ又トラン
硫酸、フンドロイチンボリ硫酸などがあり、これらはヘ
パリンと同様に血液凝固阻止作用、脂血清澄作用などを
有しまた塩基性有機物と結合して複合体を形成する性質
を示す。これら高分子硫酸エステル類はへパリ・ ンの
有する主要な性質をすべて具備しているのでそれらを総
称して「ヘパリフイド」と呼んでいる。
によりヘパリンの血液凝固阻止作用は分子中の硫酸基の
存在に基づくことか明らかにされて以来、ヘパリンに代
る高分子硫酸エステルを合成してアフイニテイクロマト
グラフイ用ゲルを調製する試みがされている。そのよう
な物質として、例えば、セルロース硫酸、デキ又トラン
硫酸、フンドロイチンボリ硫酸などがあり、これらはヘ
パリンと同様に血液凝固阻止作用、脂血清澄作用などを
有しまた塩基性有機物と結合して複合体を形成する性質
を示す。これら高分子硫酸エステル類はへパリ・ ンの
有する主要な性質をすべて具備しているのでそれらを総
称して「ヘパリフイド」と呼んでいる。
このヘパリノイドをCNBr等でクロマトグラフィ用ゲ
ルに結合させてアフイニテイクロマトグラフイ用ゲルを
調製し、これを用いて凝固因子などを精製する方法が報
告されている(1例えば、米国特許第4,139.28
7号、特開昭5’2−114018号)。
ルに結合させてアフイニテイクロマトグラフイ用ゲルを
調製し、これを用いて凝固因子などを精製する方法が報
告されている(1例えば、米国特許第4,139.28
7号、特開昭5’2−114018号)。
しかしなが呟このような方法でも、ヘパリフイド自体が
高価であり、しかもヘバリノイドをゲル担体に結合させ
る方法が煩雑で、かつその結合が比較的弱く、しばしば
結合されたヘパリノイドが脱離するという難点がある。
高価であり、しかもヘバリノイドをゲル担体に結合させ
る方法が煩雑で、かつその結合が比較的弱く、しばしば
結合されたヘパリノイドが脱離するという難点がある。
2皿り1伯
本発明者らは、アフイニテイクロマトグラフイ用として
すぐれた特性を有する改良されたゲルを見出すべく種々
研究を重ねた結果、非架橋セルロースの固体粒状粒子を
その固体粒状状態を保持しなから硫酸エステル化したの
ちアルカリで中和して得られるゲルがヘパリン様の親和
性を有しアフイニテイクロマトグラフイ用ゲルとしてき
わめてすぐれた特性を示すことを知り、本発明を完成す
るに至った。すなわち、本発明は群特異性を有し、各種
蛋白質、ウィルスなどの精製に有用な新規なアフィニテ
ィクロマトグラフィ用ゲルおよびその製造法を提供する
ものである。
すぐれた特性を有する改良されたゲルを見出すべく種々
研究を重ねた結果、非架橋セルロースの固体粒状粒子を
その固体粒状状態を保持しなから硫酸エステル化したの
ちアルカリで中和して得られるゲルがヘパリン様の親和
性を有しアフイニテイクロマトグラフイ用ゲルとしてき
わめてすぐれた特性を示すことを知り、本発明を完成す
るに至った。すなわち、本発明は群特異性を有し、各種
蛋白質、ウィルスなどの精製に有用な新規なアフィニテ
ィクロマトグラフィ用ゲルおよびその製造法を提供する
ものである。
発明の構成および効果
本発明の7フイニテイクロマトグラフイ用ゲルは、非架
橋セルロースを硫酸エステル化して得られるものであっ
て、好ましくは結晶セルロースあるいは結晶領域および
非結晶領域からなるセルロースを硫酸エステル化したも
のである。この場合、得られたセルロース硫酸エステル
は原料の形状を保持し、水性溶媒に不溶性であり、物理
的安定性にすぐれ、クロマトグラフィ用ゲルとして好適
である。これらの原料セルロース類はすでに市販されて
おり、例えばセルロファインGC−15、同GH−25
、同GO−100、同GC−200(チッソ社製)、ア
ビセル(旭化成工業社製)などがある。
橋セルロースを硫酸エステル化して得られるものであっ
て、好ましくは結晶セルロースあるいは結晶領域および
非結晶領域からなるセルロースを硫酸エステル化したも
のである。この場合、得られたセルロース硫酸エステル
は原料の形状を保持し、水性溶媒に不溶性であり、物理
的安定性にすぐれ、クロマトグラフィ用ゲルとして好適
である。これらの原料セルロース類はすでに市販されて
おり、例えばセルロファインGC−15、同GH−25
、同GO−100、同GC−200(チッソ社製)、ア
ビセル(旭化成工業社製)などがある。
本発明の7フイニテイクロマトグラフイ用ゲルを製造す
るには、硫酸エステル化剤をアミンまたはアミドに溶解
し、これに非架橋セルロースの粒状物を反応させ、つい
でアルカリで中和することにより行なわれる。
るには、硫酸エステル化剤をアミンまたはアミドに溶解
し、これに非架橋セルロースの粒状物を反応させ、つい
でアルカリで中和することにより行なわれる。
硫酸エステル化剤としては無水硫酸またはクロルスルホ
ン酸が好ましいが、その他、硫酸、濃硫酸、発煙硫酸、
ピロ硫酸、スルファミン酸などら用いられる。しかし、
条件によっては、セルロースの加水分解を進行させるt
こめ、少なくとも原料セルロースの粒状状態を保持する
限度内で硫酸エステル化を行なう必要がある。そのため
、硫酸エステル化剤は過剰に加えず、通常原料セルロー
ス100部(重量部、以下固し)に対して1〜150部
程度で用い、反応温度は一10〜ioo’c程度で、反
応時間は30分〜6時間程度とする。
ン酸が好ましいが、その他、硫酸、濃硫酸、発煙硫酸、
ピロ硫酸、スルファミン酸などら用いられる。しかし、
条件によっては、セルロースの加水分解を進行させるt
こめ、少なくとも原料セルロースの粒状状態を保持する
限度内で硫酸エステル化を行なう必要がある。そのため
、硫酸エステル化剤は過剰に加えず、通常原料セルロー
ス100部(重量部、以下固し)に対して1〜150部
程度で用い、反応温度は一10〜ioo’c程度で、反
応時間は30分〜6時間程度とする。
溶媒として用いるアミンまたはアミドとしてはピリジン
、トリエチルアミン、ジメチルホルムアミドなどが挙げ
られる。これに添加反応させる原料セルロースはカラム
クロマトグラフィ用として市販の粒径的15〜150μ
Inの粒状物を含水率1%程度まで乾燥して用いる。
、トリエチルアミン、ジメチルホルムアミドなどが挙げ
られる。これに添加反応させる原料セルロースはカラム
クロマトグラフィ用として市販の粒径的15〜150μ
Inの粒状物を含水率1%程度まで乾燥して用いる。
アルカリによる中和は、水酸化ナトリウム、水酸化カリ
ウム、水酸化マグネシウムなどの適当な濃度の水溶液ま
たはメタノール性水溶液を用いて行なわれる。この中和
反応は通常発熱を伴なうため、氷水やドライアイスエタ
ノール冷媒などで充分に冷却し、反応温度を50°C以
上に上昇させないように留意する。
ウム、水酸化マグネシウムなどの適当な濃度の水溶液ま
たはメタノール性水溶液を用いて行なわれる。この中和
反応は通常発熱を伴なうため、氷水やドライアイスエタ
ノール冷媒などで充分に冷却し、反応温度を50°C以
上に上昇させないように留意する。
本発明によるセルロースの硫酸エステル化は、例えば下
記式 で示されるようにセロビオース基の6位の水酸基が最も
反応性が高いため、この水酸基が硫酸化されるものと考
えられる。しかし、実際に硫酸化される割合は外わめて
僅かで、後記実施例における元素分析値からも明らかな
ようにSまたはNaとして理論量の約1%程度が硫酸化
される。したがって、本発明のセルロース硫酸エステル
は、セルロースモノ硫酸エステル(それは水溶性)とな
っているのではなく、セルロースの非結晶領域部分のみ
が、しかもその大部分はきわめて表面の薄い層のみが、
モノエステル化されたものと考えられ、このような硫酸
エステル化さ1れた非結晶領域セルロースと結晶領域セ
ルロースとの分子間相互作用により水不溶性を保つもの
と思われる。なお、蛋白質などとの親和性に関与するの
は粒状セルロースのきわめて薄い表面層のみで充分であ
る。
記式 で示されるようにセロビオース基の6位の水酸基が最も
反応性が高いため、この水酸基が硫酸化されるものと考
えられる。しかし、実際に硫酸化される割合は外わめて
僅かで、後記実施例における元素分析値からも明らかな
ようにSまたはNaとして理論量の約1%程度が硫酸化
される。したがって、本発明のセルロース硫酸エステル
は、セルロースモノ硫酸エステル(それは水溶性)とな
っているのではなく、セルロースの非結晶領域部分のみ
が、しかもその大部分はきわめて表面の薄い層のみが、
モノエステル化されたものと考えられ、このような硫酸
エステル化さ1れた非結晶領域セルロースと結晶領域セ
ルロースとの分子間相互作用により水不溶性を保つもの
と思われる。なお、蛋白質などとの親和性に関与するの
は粒状セルロースのきわめて薄い表面層のみで充分であ
る。
上記の方法で、得られる本発明の7フイニテイクロマト
グラフイ用ゲルは、粒径的15〜150μIIIの非架
橋セルロース硫酸エステルの水不溶性固体粒状粒子から
なる。
グラフイ用ゲルは、粒径的15〜150μIIIの非架
橋セルロース硫酸エステルの水不溶性固体粒状粒子から
なる。
本発明の群特異性アフイニテイクロマトグラフイ用ゲル
は、各種蛋白質、ウィルス類の精製にきわめて有用であ
る。効果的に適用される蛋白質、ウィルス類としては、
例えば、下記のような特異性をする群がある。
は、各種蛋白質、ウィルス類の精製にきわめて有用であ
る。効果的に適用される蛋白質、ウィルス類としては、
例えば、下記のような特異性をする群がある。
百日せき菌などの産生する蛋白質F−HA(F ila
mentous He+naHglutinin)およ
び/またはLPF HA(Leucocytos
ispro+noLingfacLor1+e+oag
glutinin) B型肝炎ウィルス(HBV)およびその抗原 (HBc
AFl、HBsAg)、またはこれらの形質転換動物細
胞由来または形質転換微生物由来の発現抗原または蛋白
質 単純ヘルペスウィルス蛋白質(H8VgB)、 よたけ
その形質転換動物細胞由来または形質転換微生物由来の
発現抗原または蛋白質 インフルエンザウィルス(ヒト、ウマ、ブタ、トリ)、
日本脳炎ウィルス、狂犬病ウィルス、イバラキウイル
ス、ウシ流行熱ウィルス、ブタパルボウイルス、イヌバ
ルボウイルス、オーエスキーウィルス、ニューカッスル
ウィルス、ガンポロ病つィルスなど、および/またはこ
れらの形質転換動物細胞または形質転換微生物に由来す
る産生物質 アンチトロンビンIII、血液凝固因子、血小板第4因
子、リボ蛋白リパーゼ、または補体成分などの生理活性
を有する蛋白質 ウロキナーゼ、インベルターゼなどの動物、植物、微生
物などの生物体由来の酵素 本発明の7フイニテイクロマトグラフイ用ケ゛ルを用い
て上記各種蛋白質、ウィルスなとの吸着、;5出を行な
うには通常のカラムクロマトグラフィで採用される操作
か適用されるが、その条件は吸着または溶出すべき蛋白
質またはウィルスの種類によって異なる。しかし、一般
的な繰作条件としては、該ゲルをカラムに充填し、p)
(s、o〜9゜0、比電導度0,5〜25 、0 +n
s/ c+++の緩衝液であらかじめ平衡化し、これに
pH5,0〜980、温度O〜60°C1比電導度0.
5〜25.0+晶Is/ C111の条件下で処理すべ
き蛋白質またはウィルスを吸着せしめ、ついで前記平衡
化に用いたものと同じ緩衝液またはそれより比電導度の
大きい緩衝液で洗浄し、最後に、イオン強度が上記平衡
化および洗浄に用いた緩衝液よりも大きい、pH5,0
〜10゜0、比電導度5.0〜130+ns/cmの緩
衝液を用いて溶出することにより、高度に精製された蛋
白質またはウィルスを得ることができる。なお、該精製
操作はバッチ法、カラム法のいずれでも行なうことかで
きる。
mentous He+naHglutinin)およ
び/またはLPF HA(Leucocytos
ispro+noLingfacLor1+e+oag
glutinin) B型肝炎ウィルス(HBV)およびその抗原 (HBc
AFl、HBsAg)、またはこれらの形質転換動物細
胞由来または形質転換微生物由来の発現抗原または蛋白
質 単純ヘルペスウィルス蛋白質(H8VgB)、 よたけ
その形質転換動物細胞由来または形質転換微生物由来の
発現抗原または蛋白質 インフルエンザウィルス(ヒト、ウマ、ブタ、トリ)、
日本脳炎ウィルス、狂犬病ウィルス、イバラキウイル
ス、ウシ流行熱ウィルス、ブタパルボウイルス、イヌバ
ルボウイルス、オーエスキーウィルス、ニューカッスル
ウィルス、ガンポロ病つィルスなど、および/またはこ
れらの形質転換動物細胞または形質転換微生物に由来す
る産生物質 アンチトロンビンIII、血液凝固因子、血小板第4因
子、リボ蛋白リパーゼ、または補体成分などの生理活性
を有する蛋白質 ウロキナーゼ、インベルターゼなどの動物、植物、微生
物などの生物体由来の酵素 本発明の7フイニテイクロマトグラフイ用ケ゛ルを用い
て上記各種蛋白質、ウィルスなとの吸着、;5出を行な
うには通常のカラムクロマトグラフィで採用される操作
か適用されるが、その条件は吸着または溶出すべき蛋白
質またはウィルスの種類によって異なる。しかし、一般
的な繰作条件としては、該ゲルをカラムに充填し、p)
(s、o〜9゜0、比電導度0,5〜25 、0 +n
s/ c+++の緩衝液であらかじめ平衡化し、これに
pH5,0〜980、温度O〜60°C1比電導度0.
5〜25.0+晶Is/ C111の条件下で処理すべ
き蛋白質またはウィルスを吸着せしめ、ついで前記平衡
化に用いたものと同じ緩衝液またはそれより比電導度の
大きい緩衝液で洗浄し、最後に、イオン強度が上記平衡
化および洗浄に用いた緩衝液よりも大きい、pH5,0
〜10゜0、比電導度5.0〜130+ns/cmの緩
衝液を用いて溶出することにより、高度に精製された蛋
白質またはウィルスを得ることができる。なお、該精製
操作はバッチ法、カラム法のいずれでも行なうことかで
きる。
上記精製操作について、百日せき菌の産生する蛋白質で
あるF−HAおよびLPF−HAの単離精製の場合を例
にとってさらに具体的に説明すれば下記のとおりである
。
あるF−HAおよびLPF−HAの単離精製の場合を例
にとってさらに具体的に説明すれば下記のとおりである
。
(1) F−HAの単離精製
後記実施例1で得られるセルロース硫酸エステルゲルは
、あらカルめ例えば0.2M塩化ナトリウム添加0.0
1M’Jン酸緩衝液等の、中性側近のpH値(p’86
〜9)であり、比電導度5〜25m5 / c m程度
の適当な緩衝液を用いて平衡化を行なった後に、F−H
Aの吸着操作に供する。
、あらカルめ例えば0.2M塩化ナトリウム添加0.0
1M’Jン酸緩衝液等の、中性側近のpH値(p’86
〜9)であり、比電導度5〜25m5 / c m程度
の適当な緩衝液を用いて平衡化を行なった後に、F−H
Aの吸着操作に供する。
セルロース硫酸エステルゲルへのF−HAの吸着、ゲル
の洗浄、F−HAの溶出等一連の精製操作は、バッチ法
お上びカラム法等の工業的に通常よく用いられる操作方
法で行なう。バッチ法で行なう場合は、百日せき菌培養
物中にセルロース硫酸エステルゲルを投入し、pH6,
0〜9.0程度の範囲において0〜30 ’C程度の温
度にて10〜60分程度緩く撹拌してF−HAを吸着さ
せる。
の洗浄、F−HAの溶出等一連の精製操作は、バッチ法
お上びカラム法等の工業的に通常よく用いられる操作方
法で行なう。バッチ法で行なう場合は、百日せき菌培養
物中にセルロース硫酸エステルゲルを投入し、pH6,
0〜9.0程度の範囲において0〜30 ’C程度の温
度にて10〜60分程度緩く撹拌してF−HAを吸着さ
せる。
この際、百日せき菌培養物の比電導度が5.0〜25
、0 ms/c+o程度となるように、適宜濃縮または
希釈して吸着繰作に付す。
、0 ms/c+o程度となるように、適宜濃縮または
希釈して吸着繰作に付す。
吸着終了後、培養物−ゲル混合欣を濾過器上に充」眞し
、吸引シ濾過してゲルとろ液を分離する。分離したゲル
を、比電導度5〜25+ns/eta程度で、pHが5
.0〜10.0程度である適当な緩衝液例えば、0.2
M塩化ナトリウム添加0.02Mマツキルベン(Me
I 1vaine’s)緩衝液、0.3M塩化ナトリウ
ム添加0.01Mリン酸緩衝液あるいは0.3M塩化ナ
トリウム添加0.OIM)リス塩酸緩衝液等を注ぎ吸引
して洗浄する。
、吸引シ濾過してゲルとろ液を分離する。分離したゲル
を、比電導度5〜25+ns/eta程度で、pHが5
.0〜10.0程度である適当な緩衝液例えば、0.2
M塩化ナトリウム添加0.02Mマツキルベン(Me
I 1vaine’s)緩衝液、0.3M塩化ナトリウ
ム添加0.01Mリン酸緩衝液あるいは0.3M塩化ナ
トリウム添加0.OIM)リス塩酸緩衝液等を注ぎ吸引
して洗浄する。
この後、l)Hが5.0〜10.0程度で、比電導度か
25〜130ms/c+n程度である(上記洗浄用緩衝
液の比電導度より大)適当な緩衝液、例えば1.5M塩
化ナトリウム添加マツキルベン緩衝液、1.5M塩化す
) IJウム添加リン酸緩衝液等を注ぎ、吸着している
F−HAを溶出する。
25〜130ms/c+n程度である(上記洗浄用緩衝
液の比電導度より大)適当な緩衝液、例えば1.5M塩
化ナトリウム添加マツキルベン緩衝液、1.5M塩化す
) IJウム添加リン酸緩衝液等を注ぎ、吸着している
F−HAを溶出する。
カラム法にて実施する場合は、原材料液、洗浄用緩衝液
、溶出用緩衝液の条件はバッチ法の場合と同様でよく、
これらの通液速度は10+IIl/era2/ Hr−
500+ol/cm2/ Hr程度に調整して行なうと
よい。
、溶出用緩衝液の条件はバッチ法の場合と同様でよく、
これらの通液速度は10+IIl/era2/ Hr−
500+ol/cm2/ Hr程度に調整して行なうと
よい。
上記方法によれば、セルロース硫酸エステルゲルの百日
せき菌培養物中のF −HAの特異的吸着能にすぐれ、
F−HAの精製度は従来法に比し数十倍に達し、しかも
F−HAの回収率は90%以上100%近くに達する。
せき菌培養物中のF −HAの特異的吸着能にすぐれ、
F−HAの精製度は従来法に比し数十倍に達し、しかも
F−HAの回収率は90%以上100%近くに達する。
得られる精製F−HAの比活性は4〜8X10’HAユ
ニツ)/B蛋白質ときわめて高く、ポリアクリルアミド
ディスク電気泳動(pH4,5)分析において単一のバ
ンドを形成し、百日せ5菌内毒素がほぼ完全に除去され
る。
ニツ)/B蛋白質ときわめて高く、ポリアクリルアミド
ディスク電気泳動(pH4,5)分析において単一のバ
ンドを形成し、百日せ5菌内毒素がほぼ完全に除去され
る。
(2)LPF−)(Aの単離精製
原材料液であるLPF−HA含有液は、百日せき菌培養
物の遠心上清を、蒸留水または緩iΦj液で比電導度が
0.5〜5.Oms/c+oとなるように希釈した後、
吸着操作に付すこともできるが、この上清中にはセルロ
ース硫酸エステルゲルに対して同じく親和性を有するF
−HAが含まれているため、あらかじめ、L P F
−HAは吸着せずF−HAを吸着する条件にて、セルロ
ース硫酸エステルゲルによるクロマトグラフィを行ない
、その素通り画分であるところのF−HAを含まずLP
F−HAを大量に含んだ両分を吸着操作に付す。
物の遠心上清を、蒸留水または緩iΦj液で比電導度が
0.5〜5.Oms/c+oとなるように希釈した後、
吸着操作に付すこともできるが、この上清中にはセルロ
ース硫酸エステルゲルに対して同じく親和性を有するF
−HAが含まれているため、あらかじめ、L P F
−HAは吸着せずF−HAを吸着する条件にて、セルロ
ース硫酸エステルゲルによるクロマトグラフィを行ない
、その素通り画分であるところのF−HAを含まずLP
F−HAを大量に含んだ両分を吸着操作に付す。
セルロース硫酸エステルゲルへのLPF−HAの吸着、
ゲルの洗浄、LPF−HAの溶出部一連の精製繰作は、
バッチ法およびカラム法等の工業的に通常よく用いられ
る操作方法で行なうことができるが、カラム法の方が操
作が簡単であり好都合である。カラム法の場合、セルロ
ース硫酸エステルゲルをカラムに充填し、あらかじめ例
えば0゜02Mマツキルベン緩衝液(pH5,2)等の
比電導度0,5−5.0ms/cmでpHが5.0−9
.0程度である適当な緩衝液を通液して平衡化を行った
後に、LPF−HAの吸着操作に移る。
ゲルの洗浄、LPF−HAの溶出部一連の精製繰作は、
バッチ法およびカラム法等の工業的に通常よく用いられ
る操作方法で行なうことができるが、カラム法の方が操
作が簡単であり好都合である。カラム法の場合、セルロ
ース硫酸エステルゲルをカラムに充填し、あらかじめ例
えば0゜02Mマツキルベン緩衝液(pH5,2)等の
比電導度0,5−5.0ms/cmでpHが5.0−9
.0程度である適当な緩衝液を通液して平衡化を行った
後に、LPF−HAの吸着操作に移る。
吸着に際しては、LPF−HAの含有液をl)Hが5.
0〜9.0、比電導度が0.5〜5.0になるように適
宜調整して、セルロース硫酸エステルゲル充填カラムに
通渡し、LPF−HAを吸着させる。この後、前述の平
衡化に用いたのと同様の緩衝液を通液し、ゲルを洗浄し
、夾雑物質を洗い出す。
0〜9.0、比電導度が0.5〜5.0になるように適
宜調整して、セルロース硫酸エステルゲル充填カラムに
通渡し、LPF−HAを吸着させる。この後、前述の平
衡化に用いたのと同様の緩衝液を通液し、ゲルを洗浄し
、夾雑物質を洗い出す。
LPF−14Aの溶出に際しては、l)Hか5.()〜
9.0、比電導度か5 、0 +ns/can以上であ
る適当な緩衝液を通渡し溶出を行なうが、好ましくは段
階溶出または塩濃度勾配溶出を行なう。すなわち、原材
料液として百日せき菌培養液の遠心上清の希釈したもの
をそのまま用いる場合は、前述の吸着条件下において、
LPF−HAと同時にF−)(Aも吸着されてくるので
、L P F −HAが溶出さJt、かつF−HAが溶
出されない条件下で溶出する必要がある。この条件とし
ては1)H5〜9において比電導度5〜100 ms/
am、’好ましくは50〜60 ms/canである
適当な緩衝液(例えばl)、7M塩化ナトリウム添加0
.02Mマツキルベン緩衝液)を最初に通液し、LPF
−HAを含む両分を回収する。この後に上述の溶出用緩
衝液より比電導度の大なる( 100−300+++s
/cm)緩衝液を通液し、F−HAその地の不純成分を
溶出させ、セルロース硫酸エステルゲルを平衡化再使用
に供する。
9.0、比電導度か5 、0 +ns/can以上であ
る適当な緩衝液を通渡し溶出を行なうが、好ましくは段
階溶出または塩濃度勾配溶出を行なう。すなわち、原材
料液として百日せき菌培養液の遠心上清の希釈したもの
をそのまま用いる場合は、前述の吸着条件下において、
LPF−HAと同時にF−)(Aも吸着されてくるので
、L P F −HAが溶出さJt、かつF−HAが溶
出されない条件下で溶出する必要がある。この条件とし
ては1)H5〜9において比電導度5〜100 ms/
am、’好ましくは50〜60 ms/canである
適当な緩衝液(例えばl)、7M塩化ナトリウム添加0
.02Mマツキルベン緩衝液)を最初に通液し、LPF
−HAを含む両分を回収する。この後に上述の溶出用緩
衝液より比電導度の大なる( 100−300+++s
/cm)緩衝液を通液し、F−HAその地の不純成分を
溶出させ、セルロース硫酸エステルゲルを平衡化再使用
に供する。
最も好ましくは、塩濃度勾配溶出を実施する。
原材料液として、あらかじめF7HAを分離したLPF
−HA含有液を用いる場合においても、比電導度が0.
5→300m5/cmとなるような塩濃度勾配緩衝液(
例えば塩化ナトリウムO→4.OM塩濃度勾配・0.0
2Mマツキルベン緩衝液(pH5,2)を用いて溶出を
行ない、LPF−HA含有画分を分取すれば、きわめて
高純度のLPF−HAを得ることができる。
−HA含有液を用いる場合においても、比電導度が0.
5→300m5/cmとなるような塩濃度勾配緩衝液(
例えば塩化ナトリウムO→4.OM塩濃度勾配・0.0
2Mマツキルベン緩衝液(pH5,2)を用いて溶出を
行ない、LPF−HA含有画分を分取すれば、きわめて
高純度のLPF−HAを得ることができる。
上記の精製法によれば、L P F −HAの精製度は
従来法に比し数十倍に達し、しかもLPF−HAの回収
率は90%以上100%近くに達する。
従来法に比し数十倍に達し、しかもLPF−HAの回収
率は90%以上100%近くに達する。
得られる精製LPF−HAの比活性は9X10’LPE
U/ll1g蛋白質ときわめて高く、ポリアクリルアミ
ドディスク電気泳動(pH4,5)分析において単一の
バンドを形成し、百日せき菌内毒素がほぼ完全に除去さ
れる。
U/ll1g蛋白質ときわめて高く、ポリアクリルアミ
ドディスク電気泳動(pH4,5)分析において単一の
バンドを形成し、百日せき菌内毒素がほぼ完全に除去さ
れる。
つぎに、本発明の7フイニテイクロマトグラフイ用ゲル
の製造に関する実施例およびそのゲルを用いた各種蛋白
質またはウィルスの精製に関する実験例を挙げて本発明
をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定さ
れない。
の製造に関する実施例およびそのゲルを用いた各種蛋白
質またはウィルスの精製に関する実験例を挙げて本発明
をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定さ
れない。
実施例1
0℃以下の温度にてピリジン600−に無水硫酸20g
を滴下し、混合する。滴下終了後、混液を30℃に保つ
。この中に含水率1%以下に乾燥したセルロファインG
C−15(チッソ社製)80gを加え、撹拌下30℃に
て3時間反応させる。
を滴下し、混合する。滴下終了後、混液を30℃に保つ
。この中に含水率1%以下に乾燥したセルロファインG
C−15(チッソ社製)80gを加え、撹拌下30℃に
て3時間反応させる。
反応終了後、冷却し、5%水酸化ナトリウム水溶液を加
えて中和する。ゲルをシ濾過分離し、0.01Mリン酸
緩衝食塩液で充分に洗浄してセルロース硫酸エステルゲ
ルを得る。
えて中和する。ゲルをシ濾過分離し、0.01Mリン酸
緩衝食塩液で充分に洗浄してセルロース硫酸エステルゲ
ルを得る。
元素分析値(測定値):C,40,4%、0,45゜8
%、H,6,3%、S、0.15% またナトリウム含量は1 + 400 mg/kgであ
る。
%、H,6,3%、S、0.15% またナトリウム含量は1 + 400 mg/kgであ
る。
実施例2
0℃以下の温度にてピリ°ジン60(h、Q にクロル
スルホン酸117gを滴下し、混合する。滴下終了後、
混液を加熱し、65〜70°Cに昇温する。
スルホン酸117gを滴下し、混合する。滴下終了後、
混液を加熱し、65〜70°Cに昇温する。
この中に結晶セルロースであるクロマトグラフィ用アビ
セル(旭化成工業社製)80gを加え、撹拌下65〜7
0 ’Cにて4時間保持する。反応終了後、冷却し 1
0%水酸化す) +7ウム水溶液を加えて中和する。ゲ
ルを濾過分離し、0.OIMリン酸緩衝食塩液で充分に
洗浄してセルロース硫酸エステルゲルを得る。
セル(旭化成工業社製)80gを加え、撹拌下65〜7
0 ’Cにて4時間保持する。反応終了後、冷却し 1
0%水酸化す) +7ウム水溶液を加えて中和する。ゲ
ルを濾過分離し、0.OIMリン酸緩衝食塩液で充分に
洗浄してセルロース硫酸エステルゲルを得る。
実験例1 (HBs抗原の精製)
前記実施例1で得られたセルロース硫酸エステルゲルを
充填したカラム(26,4+面φX 1 (’) 5
m+Jに、0.05M塩化ナトリウムを含む0.027
Mマノキルベン緩衝液(p)(7,20)を通し平衡化
する。このカラムにHBs抗原陽性人血清20mlを上
記緩衝液で3倍量に希釈したものを通液する。
充填したカラム(26,4+面φX 1 (’) 5
m+Jに、0.05M塩化ナトリウムを含む0.027
Mマノキルベン緩衝液(p)(7,20)を通し平衡化
する。このカラムにHBs抗原陽性人血清20mlを上
記緩衝液で3倍量に希釈したものを通液する。
その後、上記緩衝液で充分に洗浄する。ついで、0.6
M塩化ナトリウムを含む0.027Mマツキルベン緩衝
液(pH7,20)で溶出する。この結果を第1表に示
す。第1表に示すように、)(Bs抗原は溶出画分にほ
ぼ回収され、精製度は約16倍に達した。
M塩化ナトリウムを含む0.027Mマツキルベン緩衝
液(pH7,20)で溶出する。この結果を第1表に示
す。第1表に示すように、)(Bs抗原は溶出画分にほ
ぼ回収され、精製度は約16倍に達した。
第 1 表
*1) ラノオイム/アッセイ(グイナボット社製、
オーセリアll−125)で測定。
オーセリアll−125)で測定。
(黒用正身、斉藤晴−: Japan−J、Med。
Sci、Biol、、32・47−52(1979)を
参照) 木2)流出液と洗浄液を含む。
参照) 木2)流出液と洗浄液を含む。
実験例2 (F −HAの精製)
前記実施例1と同様にして調製したセルロース硫酸エス
テルゲルをカラム(16+n+oφX100m+Il)
に充填し、これに0.2 M塩化ナトリウム添加0.0
1Mリン酸緩衝液(pH8,0、比電導度的17 、5
ms/cm)を通液して平衡化する。このカラムに百
日ぜきI相菌東浜株ファーメンタ−培養上清800Jを
希釈して、比電導度的17.5Qlξ/am 、 l
)88 、0に合わせた液を通液する。通液後、上記緩
衝液にて洗浄し、夾雑物質を洗い出す。
テルゲルをカラム(16+n+oφX100m+Il)
に充填し、これに0.2 M塩化ナトリウム添加0.0
1Mリン酸緩衝液(pH8,0、比電導度的17 、5
ms/cm)を通液して平衡化する。このカラムに百
日ぜきI相菌東浜株ファーメンタ−培養上清800Jを
希釈して、比電導度的17.5Qlξ/am 、 l
)88 、0に合わせた液を通液する。通液後、上記緩
衝液にて洗浄し、夾雑物質を洗い出す。
ついで、1.5M塩化ナトリウム添加リン酸緩衝液(p
H7,6)で溶出し、F−HAを含む両分30mj2を
得る。
H7,6)で溶出し、F−HAを含む両分30mj2を
得る。
培養上清液および、素通り画分、精製F−)(A画分の
分析結果を第2表に記す。
分析結果を第2表に記す。
F−HAの回収率は93.8%で、精製度(精製F−H
A画分の比活性/培養上清の比活性)は34倍に達した
。精製F−HA画分のLPF−HA活性は、ハブ)EL
ISA法[佐藤呟第28回毒素シンポジウム予稿集14
1(1981)]による分析でl0ELISAユニツ)
/mj2以下であった。
A画分の比活性/培養上清の比活性)は34倍に達した
。精製F−HA画分のLPF−HA活性は、ハブ)EL
ISA法[佐藤呟第28回毒素シンポジウム予稿集14
1(1981)]による分析でl0ELISAユニツ)
/mj2以下であった。
第2表
J)F−HA血球凝集試験[5ato、 Y、eL a
l+ I訂ecL。
l+ I訂ecL。
Immun、、 7,929−999(1973)]2
)キルブール法蛋白窒素測定値X6,25により蛋白質
含量として表示 3)HA価/蛋白質含量 4)5)6.25μg蛋白質/m lの含量に希釈後、
生物学的製剤基準(薬発287号、1981)に循ヒて
実施した。
)キルブール法蛋白窒素測定値X6,25により蛋白質
含量として表示 3)HA価/蛋白質含量 4)5)6.25μg蛋白質/m lの含量に希釈後、
生物学的製剤基準(薬発287号、1981)に循ヒて
実施した。
実験例3(LPF−HAの精製)
前記実施例1と同様にして調製したセルロース硫酸エス
テルゲル に充填し、これに蒸留水1.Ol を通液する。このカ
ラムに百日せき■相菌束浜株静置培養液の遠心上清50
0Jを蒸留水で10倍希釈しだ液(比電導度的1 、
5 ms/cm)を通液する。約5 0 0Jの0、0
2Mマツキルベン緩衝液(pH5.2)をカラムに通液
し、ゲルを洗浄した後、0.02M塩化ナトリウム添加
マツキルベン緩衝液(比電導度的2、0+ns/c++
+.pH5.2)2000−を用ν1、塩化ナトリウム
O→4.OMの塩濃度勾配にて溶出を行ない、約20m
lずつ分画して分取した後、LPF−HAを含有する両
分的130Jをプールする。
テルゲル に充填し、これに蒸留水1.Ol を通液する。このカ
ラムに百日せき■相菌束浜株静置培養液の遠心上清50
0Jを蒸留水で10倍希釈しだ液(比電導度的1 、
5 ms/cm)を通液する。約5 0 0Jの0、0
2Mマツキルベン緩衝液(pH5.2)をカラムに通液
し、ゲルを洗浄した後、0.02M塩化ナトリウム添加
マツキルベン緩衝液(比電導度的2、0+ns/c++
+.pH5.2)2000−を用ν1、塩化ナトリウム
O→4.OMの塩濃度勾配にて溶出を行ない、約20m
lずつ分画して分取した後、LPF−HAを含有する両
分的130Jをプールする。
原材料液および精製LPF−HA画分の分析結果および
実験成績を第3表に示す。
実験成績を第3表に示す。
第3表
1)LPF−HAのin viLroテスト:ハプト−
ELISA法[佐藤呟第28回毒素シンポジウム予稿集
141−144(1981)を参照]によるLPF−H
Aの単位 2)キルタール法蛋白窒素測定値X6.25により蛋白
質含量として表示 3) 6.25μg蛋白質/mlの含量に希釈後、生
物学的製剤基準(薬発287号、1981)に準じて不
活化して実施した。
ELISA法[佐藤呟第28回毒素シンポジウム予稿集
141−144(1981)を参照]によるLPF−H
Aの単位 2)キルタール法蛋白窒素測定値X6.25により蛋白
質含量として表示 3) 6.25μg蛋白質/mlの含量に希釈後、生
物学的製剤基準(薬発287号、1981)に準じて不
活化して実施した。
1例4(インフルエンザウィルスの精製)前記実施例1
で得られたセルロース硫酸エステルゲルをカラム(5c
mφX17c+n)に充填し、これにo.14M塩化ナ
トリウムを含む0.010Mリン酸緩衝液(pH7.4
)を通液し平衡化する。このカラムに11日令のふ化鶏
卵に接種培養(34℃、48時間ルだA/フィリピン(
83N2)タイプインフルエンザウィルス感染尿膜膣液
[ウィルス量77CCA、蛋白質窒素量377μg/m
ffi (o −ソー法)、比活性(OCA/TCA−
N)0.2014、200Inf!.を通液する。その
後に0.19M塩化ナトリウムを含む0,01Mリン酸
緩衝液2500+Jを通して洗浄する。ついで、1.4
9M塩化ナトリウムを含む0.0 10Mりン酸緩衝液
で溶出し、溶出画分17(h,9を得る。その後、4。
で得られたセルロース硫酸エステルゲルをカラム(5c
mφX17c+n)に充填し、これにo.14M塩化ナ
トリウムを含む0.010Mリン酸緩衝液(pH7.4
)を通液し平衡化する。このカラムに11日令のふ化鶏
卵に接種培養(34℃、48時間ルだA/フィリピン(
83N2)タイプインフルエンザウィルス感染尿膜膣液
[ウィルス量77CCA、蛋白質窒素量377μg/m
ffi (o −ソー法)、比活性(OCA/TCA−
N)0.2014、200Inf!.を通液する。その
後に0.19M塩化ナトリウムを含む0,01Mリン酸
緩衝液2500+Jを通して洗浄する。ついで、1.4
9M塩化ナトリウムを含む0.0 10Mりン酸緩衝液
で溶出し、溶出画分17(h,9を得る。その後、4。
99M塩化ナトリウムを含む0,OIMリン酸緩+11
j液でゲルを溶出洗浄する。
j液でゲルを溶出洗浄する。
この結果を第4表に示す。
第4表
*) CCA(cl+ick cell a
gglutination) =鶏赤血球凝集反応に
より測定したウィルス量の単位、比活性とは、トリクロ
ル酢酸を用いて沈殿させた蛋白質窒素量を比色定量し、
その値(TCA−N)とウィルス量(CCA)との比で
蛋白質窒素量当りのウィルス(抗原)量を示す。
gglutination) =鶏赤血球凝集反応に
より測定したウィルス量の単位、比活性とは、トリクロ
ル酢酸を用いて沈殿させた蛋白質窒素量を比色定量し、
その値(TCA−N)とウィルス量(CCA)との比で
蛋白質窒素量当りのウィルス(抗原)量を示す。
第4表に示すように、インフルエンザ゛ウィルス。 は
溶出画分にはパ回収され、精製度は約20倍に達した。
溶出画分にはパ回収され、精製度は約20倍に達した。
実験例5(日本脳炎ウィルスの精製)
前記実施例1と同様にして調製したセルロース硫酸エス
テルゲル37.5Jをカラム(25mmφX 400m
n+)に充填し、これに蒸留水375Jを通液する。次
に、0.14MNaC,(添加0.01Mリン酸緩衝液
375Jにてゲルを平衡化したのちこのカラムにプロタ
ミン−歳末処理して得られる不活化日本脳炎ウィルス浮
遊液50+Jを通液する。0.14M NaC1添加0
,01Mリン酸緩衝液にて、ゲルを十分洗浄した後、1
.5MNaC1添加100MIJン酸緩衝液(比電導度
的120m5/etQ、pH7,2)100Jを用いて
溶出を行ない、約5−ずつ分画して分取した後、日本脳
炎ウィルスを含有する両分的10J をプールする。
テルゲル37.5Jをカラム(25mmφX 400m
n+)に充填し、これに蒸留水375Jを通液する。次
に、0.14MNaC,(添加0.01Mリン酸緩衝液
375Jにてゲルを平衡化したのちこのカラムにプロタ
ミン−歳末処理して得られる不活化日本脳炎ウィルス浮
遊液50+Jを通液する。0.14M NaC1添加0
,01Mリン酸緩衝液にて、ゲルを十分洗浄した後、1
.5MNaC1添加100MIJン酸緩衝液(比電導度
的120m5/etQ、pH7,2)100Jを用いて
溶出を行ない、約5−ずつ分画して分取した後、日本脳
炎ウィルスを含有する両分的10J をプールする。
原材料液および精製日本脳炎ウィルス画分の分析結果お
よび実験成績を第5表に示す。
よび実験成績を第5表に示す。
第5表
実験例6(狂犬病ウィルスの精製)
前記実施例1と同様にして調製したセルロース硫酸エス
テルゲル0,141をカラム(2、5n++nφX 4
00 +nm)に充填し、これに蒸留水1400Jを通
液する。次に、0.14MNaCf添加0.OIMIJ
ン酸緩衝液1400+njgにてゲルを平衡化したのち
、このカラムにニワトリ胚初代培養細胞に接種増殖して
得られる不活性狂犬病ウィルス浮遊液2.9!を流速5
00m1/時間で通液する。
テルゲル0,141をカラム(2、5n++nφX 4
00 +nm)に充填し、これに蒸留水1400Jを通
液する。次に、0.14MNaCf添加0.OIMIJ
ン酸緩衝液1400+njgにてゲルを平衡化したのち
、このカラムにニワトリ胚初代培養細胞に接種増殖して
得られる不活性狂犬病ウィルス浮遊液2.9!を流速5
00m1/時間で通液する。
0.14M NaC1添加0.01Mリン酸緩衝液にて
、ゲルを十分洗浄した後、IMNaC,g添加0゜01
Mリン酸緩衝液(比電導度87 、6 ms/ can
、pH7,26)500mj2を用いて流速1 to
l /分で溶出を行ない、約10Jづつ分画して分取し
た後、狂犬病ウィルスを含有する両分的30Jをプール
する。
、ゲルを十分洗浄した後、IMNaC,g添加0゜01
Mリン酸緩衝液(比電導度87 、6 ms/ can
、pH7,26)500mj2を用いて流速1 to
l /分で溶出を行ない、約10Jづつ分画して分取し
た後、狂犬病ウィルスを含有する両分的30Jをプール
する。
原材料液および精製狂犬病ウィルス画分の分析結果およ
び実験成績を第6表に示す。
び実験成績を第6表に示す。
第6表
実験例7(アンチトロンビンIIIの精製)処理原料と
して新鮮凍結血漿を用い、これを解凍し、8000rp
mで30分間遠心分離し、その上清に分子14oooの
ポリエチレングリフール10%を加えて1時間撹拌し、
8000rpmで60分間遠心する。ついでこの上清を
、0.02Mリンera衝液(Na2HPO4・12H
20(0,2M、76%)とNaH2PO4・2H20
(0,2M、24%)の混合液)にて透析する。
して新鮮凍結血漿を用い、これを解凍し、8000rp
mで30分間遠心分離し、その上清に分子14oooの
ポリエチレングリフール10%を加えて1時間撹拌し、
8000rpmで60分間遠心する。ついでこの上清を
、0.02Mリンera衝液(Na2HPO4・12H
20(0,2M、76%)とNaH2PO4・2H20
(0,2M、24%)の混合液)にて透析する。
前記実施例1と同様にして調製したセルロース硫酸エス
テルゲル0.521を充填したカラム(1゜5canφ
X30cm)に、上記と同じ0 、02 Mリン酸緩衝
液を通してゲルを平衡化したのち、これに上記透析した
血漿上清20mff1(pH5,0)を通液する。つい
で、流出液の吸光度が充分に下るまで上記と同じ緩衝液
を流してカラムを洗浄したのち、溶出緩衝液(0,02
Mリン酸緩衝液+2 、 OM塩化ナトリウム)にて溶
出する。約10−づつ分画し、吸光度280nm(OD
2.。)での吸収ピークを示す2つの7ラクシヨンを得
る。この7ラクシヨンについて分析した結果を第7表に
示す。
テルゲル0.521を充填したカラム(1゜5canφ
X30cm)に、上記と同じ0 、02 Mリン酸緩衝
液を通してゲルを平衡化したのち、これに上記透析した
血漿上清20mff1(pH5,0)を通液する。つい
で、流出液の吸光度が充分に下るまで上記と同じ緩衝液
を流してカラムを洗浄したのち、溶出緩衝液(0,02
Mリン酸緩衝液+2 、 OM塩化ナトリウム)にて溶
出する。約10−づつ分画し、吸光度280nm(OD
2.。)での吸収ピークを示す2つの7ラクシヨンを得
る。この7ラクシヨンについて分析した結果を第7表に
示す。
第7表
Claims (4)
- (1)非架橋セルロースの固体粒状物を固体粒状状態を
保持しながら硫酸エステル化したのちアルカリで中和し
て得られる群特異性を有するアフィニティクロマトグラ
フィ用ゲル。 - (2)該非架橋セルロースが結晶セルロースまたま結晶
領域および非結晶領域からなるセルロースである前記第
(1)項記載のゲル。 - (3)硫酸エステル化剤をアミンまたはアミドに溶解さ
せ、これに非架橋セルロースの固体粒状物を反応させ、
ついでアルカリで中和することを特徴とする群特異性を
有するアフィニティクロマトグラフィ用ゲルの製造法。 - (4)硫酸エステル化剤が無水硫酸またはクロルスルホ
ン酸である前記第(3)項記載の方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP59177347A JPS6154450A (ja) | 1984-08-24 | 1984-08-24 | 群特異性を有するアフイニテイクロマトグラフイ用ゲルおよびその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP59177347A JPS6154450A (ja) | 1984-08-24 | 1984-08-24 | 群特異性を有するアフイニテイクロマトグラフイ用ゲルおよびその製造法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6154450A true JPS6154450A (ja) | 1986-03-18 |
JPH0423751B2 JPH0423751B2 (ja) | 1992-04-23 |
Family
ID=16029377
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP59177347A Granted JPS6154450A (ja) | 1984-08-24 | 1984-08-24 | 群特異性を有するアフイニテイクロマトグラフイ用ゲルおよびその製造法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS6154450A (ja) |
Cited By (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS63209750A (ja) * | 1987-02-25 | 1988-08-31 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | 血液凝固第8因子精製用吸着体およびそれを用いた血液凝固第8因子の精製法 |
JPH02195877A (ja) * | 1989-01-23 | 1990-08-02 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | レトロウイルスの精製方法 |
WO1991013976A1 (en) * | 1990-03-14 | 1991-09-19 | Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd. | Process for producing purified tissue plasminogen activator or its derivative |
GB2429708A (en) * | 2005-09-01 | 2007-03-07 | Chisso Corp | Spherical sulphated cellulose |
JP2008222604A (ja) * | 2007-03-09 | 2008-09-25 | Chisso Corp | 化粧料配合剤及びそれを含む化粧料組成物 |
GB2465301A (en) * | 2005-09-01 | 2010-05-19 | Chisso Corp | Spherical sulphated cellulose |
JP4751558B2 (ja) * | 2000-04-07 | 2011-08-17 | 一般財団法人化学及血清療法研究所 | 日本脳炎不活化ワクチン及びその製造方法 |
JP2020124680A (ja) * | 2019-02-05 | 2020-08-20 | 国立大学法人福井大学 | タンパク質吸着剤及びその製造方法 |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP5332090B2 (ja) * | 2005-09-01 | 2013-11-06 | Jnc株式会社 | 球状硫酸化セルロース及びその製造方法 |
-
1984
- 1984-08-24 JP JP59177347A patent/JPS6154450A/ja active Granted
Cited By (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS63209750A (ja) * | 1987-02-25 | 1988-08-31 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | 血液凝固第8因子精製用吸着体およびそれを用いた血液凝固第8因子の精製法 |
JPH02195877A (ja) * | 1989-01-23 | 1990-08-02 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | レトロウイルスの精製方法 |
WO1991013976A1 (en) * | 1990-03-14 | 1991-09-19 | Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd. | Process for producing purified tissue plasminogen activator or its derivative |
JP4751558B2 (ja) * | 2000-04-07 | 2011-08-17 | 一般財団法人化学及血清療法研究所 | 日本脳炎不活化ワクチン及びその製造方法 |
GB2429708A (en) * | 2005-09-01 | 2007-03-07 | Chisso Corp | Spherical sulphated cellulose |
GB2465301A (en) * | 2005-09-01 | 2010-05-19 | Chisso Corp | Spherical sulphated cellulose |
GB2429708B (en) * | 2005-09-01 | 2010-06-02 | Chisso Corp | Spherical sulfated cellulose |
GB2465301B (en) * | 2005-09-01 | 2010-06-30 | Chisso Corp | Spherical sulfated cellulose |
JP2008222604A (ja) * | 2007-03-09 | 2008-09-25 | Chisso Corp | 化粧料配合剤及びそれを含む化粧料組成物 |
JP2020124680A (ja) * | 2019-02-05 | 2020-08-20 | 国立大学法人福井大学 | タンパク質吸着剤及びその製造方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0423751B2 (ja) | 1992-04-23 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR920009733B1 (ko) | 인플루엔자 바이러스의 정제방법 | |
US3920625A (en) | Isolation of coagulation factors from biological material using cross linked sulfated, sulfonated carbohydrates | |
EP0208215B1 (en) | Purification of blood clotting factors and other blood proteins on non-carbohydrate sulfated matrices | |
KR890001927B1 (ko) | 섬유질 헤마글루티닌의 정제방법 | |
KR880002586B1 (ko) | B형 간염 바이러스 표면 항원의 정제방법 | |
JPS6154450A (ja) | 群特異性を有するアフイニテイクロマトグラフイ用ゲルおよびその製造法 | |
JPS6356501A (ja) | アフイニテイークロマトグラフイー用カラム充填剤及びその製造方法 | |
KR920009730B1 (ko) | 백일해 성분 백신 및 백일해 항원, 디프테리아 톡소이드 및 파상풍 톡소이드의 혼합백신의 제조방법 | |
JPS6154451A (ja) | 群特異性を有するアフイニテイクロマトグラフイ用ゲルおよびその製法 | |
JPH07126183A (ja) | ビタミンk依存性タンパク質を含有する治療用途に適した薬剤的組成物 | |
EP0170162B1 (en) | Method for the purification of leukocytosis-promoting factor haemagglutinin | |
US7365173B2 (en) | Method for the production of pure virally inactivated butyrylcholinesterase | |
JPH07508989A (ja) | 第9因子の精製 | |
JP2722140B2 (ja) | ヒト尿性トリプシンインヒビターの製造方法 | |
JPS6156133A (ja) | 発熱物質の除去方法 | |
JPS6130528A (ja) | Lpf−haの精製方法 | |
JPS63146898A (ja) | トロンビン結合性物質およびその製法 | |
JPH04365481A (ja) | トロンビンの製造法 | |
JPS641446B2 (ja) | ||
CS196349B2 (en) | Process for preparing heparine | |
JPS59164727A (ja) | B型肝炎ウイルス表面抗原の精製方法 | |
JPS641447B2 (ja) | ||
JPS60218326A (ja) | 線維状赤血球凝集素の精製方法 | |
JPS5810522A (ja) | 不活化トロンビンゲルによるアンチトロンビン3の精製法 | |
JPS5838150B2 (ja) | カリクレインの精製法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
EXPY | Cancellation because of completion of term |