JPS6154450A - 群特異性を有するアフイニテイクロマトグラフイ用ゲルおよびその製造法 - Google Patents
群特異性を有するアフイニテイクロマトグラフイ用ゲルおよびその製造法Info
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- JPS6154450A JPS6154450A JP59177347A JP17734784A JPS6154450A JP S6154450 A JPS6154450 A JP S6154450A JP 59177347 A JP59177347 A JP 59177347A JP 17734784 A JP17734784 A JP 17734784A JP S6154450 A JPS6154450 A JP S6154450A
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- Japan
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- gel
- cellulose
- buffer
- sulfuric acid
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- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
- B01J20/291—Gel sorbents
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2220/00—Aspects relating to sorbent materials
- B01J2220/50—Aspects relating to the use of sorbent or filter aid materials
- B01J2220/54—Sorbents specially adapted for analytical or investigative chromatography
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- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、各種の蛋白質、ウィルスなどの精製に有用な
アフイニティクロマトグラフィ用ゲル、さらに詳しくは
、固体粒状非架橋セルロースの硫酸エステルゲルからな
る群特異性を有するアフィニテイクロマトグラフイ用ゲ
ルおよびその製造法に関する。
アフイニティクロマトグラフィ用ゲル、さらに詳しくは
、固体粒状非架橋セルロースの硫酸エステルゲルからな
る群特異性を有するアフィニテイクロマトグラフイ用ゲ
ルおよびその製造法に関する。
従来技術
特定の蛋白質、ウィルスなどを精製取得するには、従来
、遠心分離法、イオン交換法、ケ゛ル濾過法などが採用
されており、これらの方法を適宜組合せたり、また反覆
して用いられる。ところで、これらの方法を組合せある
いは反覆して実施する場合、各工程ごとに複雑な操作を
必要とし、また長時間を要するうえ、それらの工程を経
るにしたがって目的物の損失減量が生じる不利益がある
。
、遠心分離法、イオン交換法、ケ゛ル濾過法などが採用
されており、これらの方法を適宜組合せたり、また反覆
して用いられる。ところで、これらの方法を組合せある
いは反覆して実施する場合、各工程ごとに複雑な操作を
必要とし、また長時間を要するうえ、それらの工程を経
るにしたがって目的物の損失減量が生じる不利益がある
。
別の精製法として、生物学的親和性を有する物質を用い
てクロマトグラフィにより生体物質を分離精製する、い
わゆるアフイニティクロマトグラフイ法も知られている
。そのような生物学的親和性を有する物質として強酸性
のムコ多糖類であるヘパリンがあり、これは生体内で種
々の重要な生理活性を有する蛋白質と結合する特性を有
し、例えばアンチトロンビンＩＩＩ と結合して血液凝
固阻止作用を促進したり、リボ蛋白リパーゼと結合して
脂血清澄作用を示すなど重要な生理作用、薬理作用を示
す。
てクロマトグラフィにより生体物質を分離精製する、い
わゆるアフイニティクロマトグラフイ法も知られている
。そのような生物学的親和性を有する物質として強酸性
のムコ多糖類であるヘパリンがあり、これは生体内で種
々の重要な生理活性を有する蛋白質と結合する特性を有
し、例えばアンチトロンビンＩＩＩ と結合して血液凝
固阻止作用を促進したり、リボ蛋白リパーゼと結合して
脂血清澄作用を示すなど重要な生理作用、薬理作用を示
す。
かかるヘパリンの生理活性を利用して、これをセファ０
−スＣＬ−４，８（ファルマシア社製）などのクロマト
グラフィ用ゲル担体にＣＮＢｒなどを用いて結合させて
アフィニティクロマトグラフィ用ゲルを調製し、それを
用いてアンチトロンビンＩＩＩ 、凝固因子、リポ蛋白
リパーゼなどの重要な生理活性を有する蛋白質を精製す
ることが提案されている。しカルなが呟ヘパリンは動物
の肺臓、腎臓、肝臓などから抽出精製されるものである
ため、その操作が煩雑であり、しかも原料が違えばヘパ
リンの性状も異なるため、同一性状のヘパリンを大量に
入手することが困難でかつきわめて高価である。したが
って、ヘパリ、ンを結合させたアフィニティクロマトグ
ラフィ用ゲルを用いる方法は現段階では工業的規模で採
用することば外わめて難り化い。
−スＣＬ−４，８（ファルマシア社製）などのクロマト
グラフィ用ゲル担体にＣＮＢｒなどを用いて結合させて
アフィニティクロマトグラフィ用ゲルを調製し、それを
用いてアンチトロンビンＩＩＩ 、凝固因子、リポ蛋白
リパーゼなどの重要な生理活性を有する蛋白質を精製す
ることが提案されている。しカルなが呟ヘパリンは動物
の肺臓、腎臓、肝臓などから抽出精製されるものである
ため、その操作が煩雑であり、しかも原料が違えばヘパ
リンの性状も異なるため、同一性状のヘパリンを大量に
入手することが困難でかつきわめて高価である。したが
って、ヘパリ、ンを結合させたアフィニティクロマトグ
ラフィ用ゲルを用いる方法は現段階では工業的規模で採
用することば外わめて難り化い。
１９３５年ジョルベスら（Ｊｏｒｐｅｓ ｅｔ ａｌ）
によりヘパリンの血液凝固阻止作用は分子中の硫酸基の
存在に基づくことか明らかにされて以来、ヘパリンに代
る高分子硫酸エステルを合成してアフイニテイクロマト
グラフイ用ゲルを調製する試みがされている。そのよう
な物質として、例えば、セルロース硫酸、デキ又トラン
硫酸、フンドロイチンボリ硫酸などがあり、これらはヘ
パリンと同様に血液凝固阻止作用、脂血清澄作用などを
有しまた塩基性有機物と結合して複合体を形成する性質
を示す。これら高分子硫酸エステル類はへパリ・ ンの
有する主要な性質をすべて具備しているのでそれらを総
称して「ヘパリフイド」と呼んでいる。
によりヘパリンの血液凝固阻止作用は分子中の硫酸基の
存在に基づくことか明らかにされて以来、ヘパリンに代
る高分子硫酸エステルを合成してアフイニテイクロマト
グラフイ用ゲルを調製する試みがされている。そのよう
な物質として、例えば、セルロース硫酸、デキ又トラン
硫酸、フンドロイチンボリ硫酸などがあり、これらはヘ
パリンと同様に血液凝固阻止作用、脂血清澄作用などを
有しまた塩基性有機物と結合して複合体を形成する性質
を示す。これら高分子硫酸エステル類はへパリ・ ンの
有する主要な性質をすべて具備しているのでそれらを総
称して「ヘパリフイド」と呼んでいる。
このヘパリノイドをＣＮＢｒ等でクロマトグラフィ用ゲ
ルに結合させてアフイニテイクロマトグラフイ用ゲルを
調製し、これを用いて凝固因子などを精製する方法が報
告されている（１例えば、米国特許第４，１３９．２８
７号、特開昭５’２−１１４０１８号）。
ルに結合させてアフイニテイクロマトグラフイ用ゲルを
調製し、これを用いて凝固因子などを精製する方法が報
告されている（１例えば、米国特許第４，１３９．２８
７号、特開昭５’２−１１４０１８号）。
しかしなが呟このような方法でも、ヘパリフイド自体が
高価であり、しかもヘバリノイドをゲル担体に結合させ
る方法が煩雑で、かつその結合が比較的弱く、しばしば
結合されたヘパリノイドが脱離するという難点がある。
高価であり、しかもヘバリノイドをゲル担体に結合させ
る方法が煩雑で、かつその結合が比較的弱く、しばしば
結合されたヘパリノイドが脱離するという難点がある。
２皿り１伯
本発明者らは、アフイニテイクロマトグラフイ用として
すぐれた特性を有する改良されたゲルを見出すべく種々
研究を重ねた結果、非架橋セルロースの固体粒状粒子を
その固体粒状状態を保持しなから硫酸エステル化したの
ちアルカリで中和して得られるゲルがヘパリン様の親和
性を有しアフイニテイクロマトグラフイ用ゲルとしてき
わめてすぐれた特性を示すことを知り、本発明を完成す
るに至った。すなわち、本発明は群特異性を有し、各種
蛋白質、ウィルスなどの精製に有用な新規なアフィニテ
ィクロマトグラフィ用ゲルおよびその製造法を提供する
ものである。
すぐれた特性を有する改良されたゲルを見出すべく種々
研究を重ねた結果、非架橋セルロースの固体粒状粒子を
その固体粒状状態を保持しなから硫酸エステル化したの
ちアルカリで中和して得られるゲルがヘパリン様の親和
性を有しアフイニテイクロマトグラフイ用ゲルとしてき
わめてすぐれた特性を示すことを知り、本発明を完成す
るに至った。すなわち、本発明は群特異性を有し、各種
蛋白質、ウィルスなどの精製に有用な新規なアフィニテ
ィクロマトグラフィ用ゲルおよびその製造法を提供する
ものである。
発明の構成および効果
本発明の７フイニテイクロマトグラフイ用ゲルは、非架
橋セルロースを硫酸エステル化して得られるものであっ
て、好ましくは結晶セルロースあるいは結晶領域および
非結晶領域からなるセルロースを硫酸エステル化したも
のである。この場合、得られたセルロース硫酸エステル
は原料の形状を保持し、水性溶媒に不溶性であり、物理
的安定性にすぐれ、クロマトグラフィ用ゲルとして好適
である。これらの原料セルロース類はすでに市販されて
おり、例えばセルロファインＧＣ−１５、同ＧＨ−２５
、同ＧＯ−１００、同ＧＣ−２００（チッソ社製）、ア
ビセル（旭化成工業社製）などがある。
橋セルロースを硫酸エステル化して得られるものであっ
て、好ましくは結晶セルロースあるいは結晶領域および
非結晶領域からなるセルロースを硫酸エステル化したも
のである。この場合、得られたセルロース硫酸エステル
は原料の形状を保持し、水性溶媒に不溶性であり、物理
的安定性にすぐれ、クロマトグラフィ用ゲルとして好適
である。これらの原料セルロース類はすでに市販されて
おり、例えばセルロファインＧＣ−１５、同ＧＨ−２５
、同ＧＯ−１００、同ＧＣ−２００（チッソ社製）、ア
ビセル（旭化成工業社製）などがある。
本発明の７フイニテイクロマトグラフイ用ゲルを製造す
るには、硫酸エステル化剤をアミンまたはアミドに溶解
し、これに非架橋セルロースの粒状物を反応させ、つい
でアルカリで中和することにより行なわれる。
るには、硫酸エステル化剤をアミンまたはアミドに溶解
し、これに非架橋セルロースの粒状物を反応させ、つい
でアルカリで中和することにより行なわれる。
硫酸エステル化剤としては無水硫酸またはクロルスルホ
ン酸が好ましいが、その他、硫酸、濃硫酸、発煙硫酸、
ピロ硫酸、スルファミン酸などら用いられる。しかし、
条件によっては、セルロースの加水分解を進行させるｔ
こめ、少なくとも原料セルロースの粒状状態を保持する
限度内で硫酸エステル化を行なう必要がある。そのため
、硫酸エステル化剤は過剰に加えず、通常原料セルロー
ス１００部（重量部、以下固し）に対して１〜１５０部
程度で用い、反応温度は一１０〜ｉｏｏ’ｃ程度で、反
応時間は３０分〜６時間程度とする。
ン酸が好ましいが、その他、硫酸、濃硫酸、発煙硫酸、
ピロ硫酸、スルファミン酸などら用いられる。しかし、
条件によっては、セルロースの加水分解を進行させるｔ
こめ、少なくとも原料セルロースの粒状状態を保持する
限度内で硫酸エステル化を行なう必要がある。そのため
、硫酸エステル化剤は過剰に加えず、通常原料セルロー
ス１００部（重量部、以下固し）に対して１〜１５０部
程度で用い、反応温度は一１０〜ｉｏｏ’ｃ程度で、反
応時間は３０分〜６時間程度とする。
溶媒として用いるアミンまたはアミドとしてはピリジン
、トリエチルアミン、ジメチルホルムアミドなどが挙げ
られる。これに添加反応させる原料セルロースはカラム
クロマトグラフィ用として市販の粒径的１５〜１５０μ
Ｉｎの粒状物を含水率１％程度まで乾燥して用いる。
、トリエチルアミン、ジメチルホルムアミドなどが挙げ
られる。これに添加反応させる原料セルロースはカラム
クロマトグラフィ用として市販の粒径的１５〜１５０μ
Ｉｎの粒状物を含水率１％程度まで乾燥して用いる。
アルカリによる中和は、水酸化ナトリウム、水酸化カリ
ウム、水酸化マグネシウムなどの適当な濃度の水溶液ま
たはメタノール性水溶液を用いて行なわれる。この中和
反応は通常発熱を伴なうため、氷水やドライアイスエタ
ノール冷媒などで充分に冷却し、反応温度を５０°Ｃ以
上に上昇させないように留意する。
ウム、水酸化マグネシウムなどの適当な濃度の水溶液ま
たはメタノール性水溶液を用いて行なわれる。この中和
反応は通常発熱を伴なうため、氷水やドライアイスエタ
ノール冷媒などで充分に冷却し、反応温度を５０°Ｃ以
上に上昇させないように留意する。
本発明によるセルロースの硫酸エステル化は、例えば下
記式 で示されるようにセロビオース基の６位の水酸基が最も
反応性が高いため、この水酸基が硫酸化されるものと考
えられる。しかし、実際に硫酸化される割合は外わめて
僅かで、後記実施例における元素分析値からも明らかな
ようにＳまたはＮａとして理論量の約１％程度が硫酸化
される。したがって、本発明のセルロース硫酸エステル
は、セルロースモノ硫酸エステル（それは水溶性）とな
っているのではなく、セルロースの非結晶領域部分のみ
が、しかもその大部分はきわめて表面の薄い層のみが、
モノエステル化されたものと考えられ、このような硫酸
エステル化さ１れた非結晶領域セルロースと結晶領域セ
ルロースとの分子間相互作用により水不溶性を保つもの
と思われる。なお、蛋白質などとの親和性に関与するの
は粒状セルロースのきわめて薄い表面層のみで充分であ
る。
記式 で示されるようにセロビオース基の６位の水酸基が最も
反応性が高いため、この水酸基が硫酸化されるものと考
えられる。しかし、実際に硫酸化される割合は外わめて
僅かで、後記実施例における元素分析値からも明らかな
ようにＳまたはＮａとして理論量の約１％程度が硫酸化
される。したがって、本発明のセルロース硫酸エステル
は、セルロースモノ硫酸エステル（それは水溶性）とな
っているのではなく、セルロースの非結晶領域部分のみ
が、しかもその大部分はきわめて表面の薄い層のみが、
モノエステル化されたものと考えられ、このような硫酸
エステル化さ１れた非結晶領域セルロースと結晶領域セ
ルロースとの分子間相互作用により水不溶性を保つもの
と思われる。なお、蛋白質などとの親和性に関与するの
は粒状セルロースのきわめて薄い表面層のみで充分であ
る。
上記の方法で、得られる本発明の７フイニテイクロマト
グラフイ用ゲルは、粒径的１５〜１５０μＩＩＩの非架
橋セルロース硫酸エステルの水不溶性固体粒状粒子から
なる。
グラフイ用ゲルは、粒径的１５〜１５０μＩＩＩの非架
橋セルロース硫酸エステルの水不溶性固体粒状粒子から
なる。
本発明の群特異性アフイニテイクロマトグラフイ用ゲル
は、各種蛋白質、ウィルス類の精製にきわめて有用であ
る。効果的に適用される蛋白質、ウィルス類としては、
例えば、下記のような特異性をする群がある。
は、各種蛋白質、ウィルス類の精製にきわめて有用であ
る。効果的に適用される蛋白質、ウィルス類としては、
例えば、下記のような特異性をする群がある。
百日せき菌などの産生する蛋白質Ｆ−ＨＡ（Ｆ ｉｌａ
ｍｅｎｔｏｕｓ Ｈｅ＋ｎａＨｇｌｕｔｉｎｉｎ）およ
び／またはＬＰＦ ＨＡ（Ｌｅｕｃｏｃｙｔｏｓ
ｉｓｐｒｏ＋ｎｏＬｉｎｇｆａｃＬｏｒ１＋ｅ＋ｏａｇ
ｇｌｕｔｉｎｉｎ） Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）およびその抗原 （ＨＢｃ
ＡＦｌ、ＨＢｓＡｇ）、またはこれらの形質転換動物細
胞由来または形質転換微生物由来の発現抗原または蛋白
質 単純ヘルペスウィルス蛋白質（Ｈ８ＶｇＢ）、 よたけ
その形質転換動物細胞由来または形質転換微生物由来の
発現抗原または蛋白質 インフルエンザウィルス（ヒト、ウマ、ブタ、トリ）、
日本脳炎ウィルス、狂犬病ウィルス、イバラキウイル
ス、ウシ流行熱ウィルス、ブタパルボウイルス、イヌバ
ルボウイルス、オーエスキーウィルス、ニューカッスル
ウィルス、ガンポロ病つィルスなど、および／またはこ
れらの形質転換動物細胞または形質転換微生物に由来す
る産生物質 アンチトロンビンＩＩＩ、血液凝固因子、血小板第４因
子、リボ蛋白リパーゼ、または補体成分などの生理活性
を有する蛋白質 ウロキナーゼ、インベルターゼなどの動物、植物、微生
物などの生物体由来の酵素 本発明の７フイニテイクロマトグラフイ用ケ゛ルを用い
て上記各種蛋白質、ウィルスなとの吸着、；５出を行な
うには通常のカラムクロマトグラフィで採用される操作
か適用されるが、その条件は吸着または溶出すべき蛋白
質またはウィルスの種類によって異なる。しかし、一般
的な繰作条件としては、該ゲルをカラムに充填し、ｐ）
（ｓ、ｏ〜９゜０、比電導度０，５〜２５ 、０ ＋ｎ
ｓ／ ｃ＋＋＋の緩衝液であらかじめ平衡化し、これに
ｐＨ５，０〜９８０、温度Ｏ〜６０°Ｃ１比電導度０．
５〜２５．０＋晶Ｉｓ／ Ｃ１１１の条件下で処理すべ
き蛋白質またはウィルスを吸着せしめ、ついで前記平衡
化に用いたものと同じ緩衝液またはそれより比電導度の
大きい緩衝液で洗浄し、最後に、イオン強度が上記平衡
化および洗浄に用いた緩衝液よりも大きい、ｐＨ５，０
〜１０゜０、比電導度５．０〜１３０＋ｎｓ／ｃｍの緩
衝液を用いて溶出することにより、高度に精製された蛋
白質またはウィルスを得ることができる。なお、該精製
操作はバッチ法、カラム法のいずれでも行なうことかで
きる。
ｍｅｎｔｏｕｓ Ｈｅ＋ｎａＨｇｌｕｔｉｎｉｎ）およ
び／またはＬＰＦ ＨＡ（Ｌｅｕｃｏｃｙｔｏｓ
ｉｓｐｒｏ＋ｎｏＬｉｎｇｆａｃＬｏｒ１＋ｅ＋ｏａｇ
ｇｌｕｔｉｎｉｎ） Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）およびその抗原 （ＨＢｃ
ＡＦｌ、ＨＢｓＡｇ）、またはこれらの形質転換動物細
胞由来または形質転換微生物由来の発現抗原または蛋白
質 単純ヘルペスウィルス蛋白質（Ｈ８ＶｇＢ）、 よたけ
その形質転換動物細胞由来または形質転換微生物由来の
発現抗原または蛋白質 インフルエンザウィルス（ヒト、ウマ、ブタ、トリ）、
日本脳炎ウィルス、狂犬病ウィルス、イバラキウイル
ス、ウシ流行熱ウィルス、ブタパルボウイルス、イヌバ
ルボウイルス、オーエスキーウィルス、ニューカッスル
ウィルス、ガンポロ病つィルスなど、および／またはこ
れらの形質転換動物細胞または形質転換微生物に由来す
る産生物質 アンチトロンビンＩＩＩ、血液凝固因子、血小板第４因
子、リボ蛋白リパーゼ、または補体成分などの生理活性
を有する蛋白質 ウロキナーゼ、インベルターゼなどの動物、植物、微生
物などの生物体由来の酵素 本発明の７フイニテイクロマトグラフイ用ケ゛ルを用い
て上記各種蛋白質、ウィルスなとの吸着、；５出を行な
うには通常のカラムクロマトグラフィで採用される操作
か適用されるが、その条件は吸着または溶出すべき蛋白
質またはウィルスの種類によって異なる。しかし、一般
的な繰作条件としては、該ゲルをカラムに充填し、ｐ）
（ｓ、ｏ〜９゜０、比電導度０，５〜２５ 、０ ＋ｎ
ｓ／ ｃ＋＋＋の緩衝液であらかじめ平衡化し、これに
ｐＨ５，０〜９８０、温度Ｏ〜６０°Ｃ１比電導度０．
５〜２５．０＋晶Ｉｓ／ Ｃ１１１の条件下で処理すべ
き蛋白質またはウィルスを吸着せしめ、ついで前記平衡
化に用いたものと同じ緩衝液またはそれより比電導度の
大きい緩衝液で洗浄し、最後に、イオン強度が上記平衡
化および洗浄に用いた緩衝液よりも大きい、ｐＨ５，０
〜１０゜０、比電導度５．０〜１３０＋ｎｓ／ｃｍの緩
衝液を用いて溶出することにより、高度に精製された蛋
白質またはウィルスを得ることができる。なお、該精製
操作はバッチ法、カラム法のいずれでも行なうことかで
きる。
上記精製操作について、百日せき菌の産生する蛋白質で
あるＦ−ＨＡおよびＬＰＦ−ＨＡの単離精製の場合を例
にとってさらに具体的に説明すれば下記のとおりである
。
あるＦ−ＨＡおよびＬＰＦ−ＨＡの単離精製の場合を例
にとってさらに具体的に説明すれば下記のとおりである
。
（１） Ｆ−ＨＡの単離精製
後記実施例１で得られるセルロース硫酸エステルゲルは
、あらカルめ例えば０．２Ｍ塩化ナトリウム添加０．０
１Ｍ’Ｊン酸緩衝液等の、中性側近のｐＨ値（ｐ’８６
〜９）であり、比電導度５〜２５ｍ５ ／ ｃ ｍ程度
の適当な緩衝液を用いて平衡化を行なった後に、Ｆ−Ｈ
Ａの吸着操作に供する。
、あらカルめ例えば０．２Ｍ塩化ナトリウム添加０．０
１Ｍ’Ｊン酸緩衝液等の、中性側近のｐＨ値（ｐ’８６
〜９）であり、比電導度５〜２５ｍ５ ／ ｃ ｍ程度
の適当な緩衝液を用いて平衡化を行なった後に、Ｆ−Ｈ
Ａの吸着操作に供する。
セルロース硫酸エステルゲルへのＦ−ＨＡの吸着、ゲル
の洗浄、Ｆ−ＨＡの溶出等一連の精製操作は、バッチ法
お上びカラム法等の工業的に通常よく用いられる操作方
法で行なう。バッチ法で行なう場合は、百日せき菌培養
物中にセルロース硫酸エステルゲルを投入し、ｐＨ６，
０〜９．０程度の範囲において０〜３０ ’Ｃ程度の温
度にて１０〜６０分程度緩く撹拌してＦ−ＨＡを吸着さ
せる。
の洗浄、Ｆ−ＨＡの溶出等一連の精製操作は、バッチ法
お上びカラム法等の工業的に通常よく用いられる操作方
法で行なう。バッチ法で行なう場合は、百日せき菌培養
物中にセルロース硫酸エステルゲルを投入し、ｐＨ６，
０〜９．０程度の範囲において０〜３０ ’Ｃ程度の温
度にて１０〜６０分程度緩く撹拌してＦ−ＨＡを吸着さ
せる。
この際、百日せき菌培養物の比電導度が５．０〜２５
、０ ｍｓ／ｃ＋ｏ程度となるように、適宜濃縮または
希釈して吸着繰作に付す。
、０ ｍｓ／ｃ＋ｏ程度となるように、適宜濃縮または
希釈して吸着繰作に付す。
吸着終了後、培養物−ゲル混合欣を濾過器上に充」眞し
、吸引シ濾過してゲルとろ液を分離する。分離したゲル
を、比電導度５〜２５＋ｎｓ／ｅｔａ程度で、ｐＨが５
．０〜１０．０程度である適当な緩衝液例えば、０．２
Ｍ塩化ナトリウム添加０．０２Ｍマツキルベン（Ｍｅ
Ｉ １ｖａｉｎｅ’ｓ）緩衝液、０．３Ｍ塩化ナトリウ
ム添加０．０１Ｍリン酸緩衝液あるいは０．３Ｍ塩化ナ
トリウム添加０．ＯＩＭ）リス塩酸緩衝液等を注ぎ吸引
して洗浄する。
、吸引シ濾過してゲルとろ液を分離する。分離したゲル
を、比電導度５〜２５＋ｎｓ／ｅｔａ程度で、ｐＨが５
．０〜１０．０程度である適当な緩衝液例えば、０．２
Ｍ塩化ナトリウム添加０．０２Ｍマツキルベン（Ｍｅ
Ｉ １ｖａｉｎｅ’ｓ）緩衝液、０．３Ｍ塩化ナトリウ
ム添加０．０１Ｍリン酸緩衝液あるいは０．３Ｍ塩化ナ
トリウム添加０．ＯＩＭ）リス塩酸緩衝液等を注ぎ吸引
して洗浄する。
この後、ｌ）Ｈが５．０〜１０．０程度で、比電導度か
２５〜１３０ｍｓ／ｃ＋ｎ程度である（上記洗浄用緩衝
液の比電導度より大）適当な緩衝液、例えば１．５Ｍ塩
化ナトリウム添加マツキルベン緩衝液、１．５Ｍ塩化す
） ＩＪウム添加リン酸緩衝液等を注ぎ、吸着している
Ｆ−ＨＡを溶出する。
２５〜１３０ｍｓ／ｃ＋ｎ程度である（上記洗浄用緩衝
液の比電導度より大）適当な緩衝液、例えば１．５Ｍ塩
化ナトリウム添加マツキルベン緩衝液、１．５Ｍ塩化す
） ＩＪウム添加リン酸緩衝液等を注ぎ、吸着している
Ｆ−ＨＡを溶出する。
カラム法にて実施する場合は、原材料液、洗浄用緩衝液
、溶出用緩衝液の条件はバッチ法の場合と同様でよく、
これらの通液速度は１０＋ＩＩｌ／ｅｒａ２／ Ｈｒ−
５００＋ｏｌ／ｃｍ２／ Ｈｒ程度に調整して行なうと
よい。
、溶出用緩衝液の条件はバッチ法の場合と同様でよく、
これらの通液速度は１０＋ＩＩｌ／ｅｒａ２／ Ｈｒ−
５００＋ｏｌ／ｃｍ２／ Ｈｒ程度に調整して行なうと
よい。
上記方法によれば、セルロース硫酸エステルゲルの百日
せき菌培養物中のＦ −ＨＡの特異的吸着能にすぐれ、
Ｆ−ＨＡの精製度は従来法に比し数十倍に達し、しかも
Ｆ−ＨＡの回収率は９０％以上１００％近くに達する。
せき菌培養物中のＦ −ＨＡの特異的吸着能にすぐれ、
Ｆ−ＨＡの精製度は従来法に比し数十倍に達し、しかも
Ｆ−ＨＡの回収率は９０％以上１００％近くに達する。
得られる精製Ｆ−ＨＡの比活性は４〜８Ｘ１０’ＨＡユ
ニツ）／Ｂ蛋白質ときわめて高く、ポリアクリルアミド
ディスク電気泳動（ｐＨ４，５）分析において単一のバ
ンドを形成し、百日せ５菌内毒素がほぼ完全に除去され
る。
ニツ）／Ｂ蛋白質ときわめて高く、ポリアクリルアミド
ディスク電気泳動（ｐＨ４，５）分析において単一のバ
ンドを形成し、百日せ５菌内毒素がほぼ完全に除去され
る。
（２）ＬＰＦ−）（Ａの単離精製
原材料液であるＬＰＦ−ＨＡ含有液は、百日せき菌培養
物の遠心上清を、蒸留水または緩ｉΦｊ液で比電導度が
０．５〜５．Ｏｍｓ／ｃ＋ｏとなるように希釈した後、
吸着操作に付すこともできるが、この上清中にはセルロ
ース硫酸エステルゲルに対して同じく親和性を有するＦ
−ＨＡが含まれているため、あらかじめ、Ｌ Ｐ Ｆ
−ＨＡは吸着せずＦ−ＨＡを吸着する条件にて、セルロ
ース硫酸エステルゲルによるクロマトグラフィを行ない
、その素通り画分であるところのＦ−ＨＡを含まずＬＰ
Ｆ−ＨＡを大量に含んだ両分を吸着操作に付す。
物の遠心上清を、蒸留水または緩ｉΦｊ液で比電導度が
０．５〜５．Ｏｍｓ／ｃ＋ｏとなるように希釈した後、
吸着操作に付すこともできるが、この上清中にはセルロ
ース硫酸エステルゲルに対して同じく親和性を有するＦ
−ＨＡが含まれているため、あらかじめ、Ｌ Ｐ Ｆ
−ＨＡは吸着せずＦ−ＨＡを吸着する条件にて、セルロ
ース硫酸エステルゲルによるクロマトグラフィを行ない
、その素通り画分であるところのＦ−ＨＡを含まずＬＰ
Ｆ−ＨＡを大量に含んだ両分を吸着操作に付す。
セルロース硫酸エステルゲルへのＬＰＦ−ＨＡの吸着、
ゲルの洗浄、ＬＰＦ−ＨＡの溶出部一連の精製繰作は、
バッチ法およびカラム法等の工業的に通常よく用いられ
る操作方法で行なうことができるが、カラム法の方が操
作が簡単であり好都合である。カラム法の場合、セルロ
ース硫酸エステルゲルをカラムに充填し、あらかじめ例
えば０゜０２Ｍマツキルベン緩衝液（ｐＨ５，２）等の
比電導度０，５−５．０ｍｓ／ｃｍでｐＨが５．０−９
．０程度である適当な緩衝液を通液して平衡化を行った
後に、ＬＰＦ−ＨＡの吸着操作に移る。
ゲルの洗浄、ＬＰＦ−ＨＡの溶出部一連の精製繰作は、
バッチ法およびカラム法等の工業的に通常よく用いられ
る操作方法で行なうことができるが、カラム法の方が操
作が簡単であり好都合である。カラム法の場合、セルロ
ース硫酸エステルゲルをカラムに充填し、あらかじめ例
えば０゜０２Ｍマツキルベン緩衝液（ｐＨ５，２）等の
比電導度０，５−５．０ｍｓ／ｃｍでｐＨが５．０−９
．０程度である適当な緩衝液を通液して平衡化を行った
後に、ＬＰＦ−ＨＡの吸着操作に移る。
吸着に際しては、ＬＰＦ−ＨＡの含有液をｌ）Ｈが５．
０〜９．０、比電導度が０．５〜５．０になるように適
宜調整して、セルロース硫酸エステルゲル充填カラムに
通渡し、ＬＰＦ−ＨＡを吸着させる。この後、前述の平
衡化に用いたのと同様の緩衝液を通液し、ゲルを洗浄し
、夾雑物質を洗い出す。
０〜９．０、比電導度が０．５〜５．０になるように適
宜調整して、セルロース硫酸エステルゲル充填カラムに
通渡し、ＬＰＦ−ＨＡを吸着させる。この後、前述の平
衡化に用いたのと同様の緩衝液を通液し、ゲルを洗浄し
、夾雑物質を洗い出す。
ＬＰＦ−１４Ａの溶出に際しては、ｌ）Ｈか５．（）〜
９．０、比電導度か５ 、０ ＋ｎｓ／ｃａｎ以上であ
る適当な緩衝液を通渡し溶出を行なうが、好ましくは段
階溶出または塩濃度勾配溶出を行なう。すなわち、原材
料液として百日せき菌培養液の遠心上清の希釈したもの
をそのまま用いる場合は、前述の吸着条件下において、
ＬＰＦ−ＨＡと同時にＦ−）（Ａも吸着されてくるので
、Ｌ Ｐ Ｆ −ＨＡが溶出さＪｔ、かつＦ−ＨＡが溶
出されない条件下で溶出する必要がある。この条件とし
ては１）Ｈ５〜９において比電導度５〜１００ ｍｓ／
ａｍ、’好ましくは５０〜６０ ｍｓ／ｃａｎである
適当な緩衝液（例えばｌ）、７Ｍ塩化ナトリウム添加０
．０２Ｍマツキルベン緩衝液）を最初に通液し、ＬＰＦ
−ＨＡを含む両分を回収する。この後に上述の溶出用緩
衝液より比電導度の大なる（ １００−３００＋＋＋ｓ
／ｃｍ）緩衝液を通液し、Ｆ−ＨＡその地の不純成分を
溶出させ、セルロース硫酸エステルゲルを平衡化再使用
に供する。
９．０、比電導度か５ 、０ ＋ｎｓ／ｃａｎ以上であ
る適当な緩衝液を通渡し溶出を行なうが、好ましくは段
階溶出または塩濃度勾配溶出を行なう。すなわち、原材
料液として百日せき菌培養液の遠心上清の希釈したもの
をそのまま用いる場合は、前述の吸着条件下において、
ＬＰＦ−ＨＡと同時にＦ−）（Ａも吸着されてくるので
、Ｌ Ｐ Ｆ −ＨＡが溶出さＪｔ、かつＦ−ＨＡが溶
出されない条件下で溶出する必要がある。この条件とし
ては１）Ｈ５〜９において比電導度５〜１００ ｍｓ／
ａｍ、’好ましくは５０〜６０ ｍｓ／ｃａｎである
適当な緩衝液（例えばｌ）、７Ｍ塩化ナトリウム添加０
．０２Ｍマツキルベン緩衝液）を最初に通液し、ＬＰＦ
−ＨＡを含む両分を回収する。この後に上述の溶出用緩
衝液より比電導度の大なる（ １００−３００＋＋＋ｓ
／ｃｍ）緩衝液を通液し、Ｆ−ＨＡその地の不純成分を
溶出させ、セルロース硫酸エステルゲルを平衡化再使用
に供する。
最も好ましくは、塩濃度勾配溶出を実施する。
原材料液として、あらかじめＦ７ＨＡを分離したＬＰＦ
−ＨＡ含有液を用いる場合においても、比電導度が０．
５→３００ｍ５／ｃｍとなるような塩濃度勾配緩衝液（
例えば塩化ナトリウムＯ→４．ＯＭ塩濃度勾配・０．０
２Ｍマツキルベン緩衝液（ｐＨ５，２）を用いて溶出を
行ない、ＬＰＦ−ＨＡ含有画分を分取すれば、きわめて
高純度のＬＰＦ−ＨＡを得ることができる。
−ＨＡ含有液を用いる場合においても、比電導度が０．
５→３００ｍ５／ｃｍとなるような塩濃度勾配緩衝液（
例えば塩化ナトリウムＯ→４．ＯＭ塩濃度勾配・０．０
２Ｍマツキルベン緩衝液（ｐＨ５，２）を用いて溶出を
行ない、ＬＰＦ−ＨＡ含有画分を分取すれば、きわめて
高純度のＬＰＦ−ＨＡを得ることができる。
上記の精製法によれば、Ｌ Ｐ Ｆ −ＨＡの精製度は
従来法に比し数十倍に達し、しかもＬＰＦ−ＨＡの回収
率は９０％以上１００％近くに達する。
従来法に比し数十倍に達し、しかもＬＰＦ−ＨＡの回収
率は９０％以上１００％近くに達する。
得られる精製ＬＰＦ−ＨＡの比活性は９Ｘ１０’ＬＰＥ
Ｕ／ｌｌ１ｇ蛋白質ときわめて高く、ポリアクリルアミ
ドディスク電気泳動（ｐＨ４，５）分析において単一の
バンドを形成し、百日せき菌内毒素がほぼ完全に除去さ
れる。
Ｕ／ｌｌ１ｇ蛋白質ときわめて高く、ポリアクリルアミ
ドディスク電気泳動（ｐＨ４，５）分析において単一の
バンドを形成し、百日せき菌内毒素がほぼ完全に除去さ
れる。
つぎに、本発明の７フイニテイクロマトグラフイ用ゲル
の製造に関する実施例およびそのゲルを用いた各種蛋白
質またはウィルスの精製に関する実験例を挙げて本発明
をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定さ
れない。
の製造に関する実施例およびそのゲルを用いた各種蛋白
質またはウィルスの精製に関する実験例を挙げて本発明
をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定さ
れない。
実施例１
０℃以下の温度にてピリジン６００−に無水硫酸２０ｇ
を滴下し、混合する。滴下終了後、混液を３０℃に保つ
。この中に含水率１％以下に乾燥したセルロファインＧ
Ｃ−１５（チッソ社製）８０ｇを加え、撹拌下３０℃に
て３時間反応させる。
を滴下し、混合する。滴下終了後、混液を３０℃に保つ
。この中に含水率１％以下に乾燥したセルロファインＧ
Ｃ−１５（チッソ社製）８０ｇを加え、撹拌下３０℃に
て３時間反応させる。
反応終了後、冷却し、５％水酸化ナトリウム水溶液を加
えて中和する。ゲルをシ濾過分離し、０．０１Ｍリン酸
緩衝食塩液で充分に洗浄してセルロース硫酸エステルゲ
ルを得る。
えて中和する。ゲルをシ濾過分離し、０．０１Ｍリン酸
緩衝食塩液で充分に洗浄してセルロース硫酸エステルゲ
ルを得る。
元素分析値（測定値）：Ｃ，４０，４％、０，４５゜８
％、Ｈ，６，３％、Ｓ、０．１５％ またナトリウム含量は１ ＋ ４００ ｍｇ／ｋｇであ
る。
％、Ｈ，６，３％、Ｓ、０．１５％ またナトリウム含量は１ ＋ ４００ ｍｇ／ｋｇであ
る。
実施例２
０℃以下の温度にてピリ°ジン６０（ｈ、Ｑ にクロル
スルホン酸１１７ｇを滴下し、混合する。滴下終了後、
混液を加熱し、６５〜７０°Ｃに昇温する。
スルホン酸１１７ｇを滴下し、混合する。滴下終了後、
混液を加熱し、６５〜７０°Ｃに昇温する。
この中に結晶セルロースであるクロマトグラフィ用アビ
セル（旭化成工業社製）８０ｇを加え、撹拌下６５〜７
０ ’Ｃにて４時間保持する。反応終了後、冷却し １
０％水酸化す） ＋７ウム水溶液を加えて中和する。ゲ
ルを濾過分離し、０．ＯＩＭリン酸緩衝食塩液で充分に
洗浄してセルロース硫酸エステルゲルを得る。
セル（旭化成工業社製）８０ｇを加え、撹拌下６５〜７
０ ’Ｃにて４時間保持する。反応終了後、冷却し １
０％水酸化す） ＋７ウム水溶液を加えて中和する。ゲ
ルを濾過分離し、０．ＯＩＭリン酸緩衝食塩液で充分に
洗浄してセルロース硫酸エステルゲルを得る。
実験例１ （ＨＢｓ抗原の精製）
前記実施例１で得られたセルロース硫酸エステルゲルを
充填したカラム（２６，４＋面φＸ １ （’） ５
ｍ＋Ｊに、０．０５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０２７
Ｍマノキルベン緩衝液（ｐ）（７，２０）を通し平衡化
する。このカラムにＨＢｓ抗原陽性人血清２０ｍｌを上
記緩衝液で３倍量に希釈したものを通液する。
充填したカラム（２６，４＋面φＸ １ （’） ５
ｍ＋Ｊに、０．０５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０２７
Ｍマノキルベン緩衝液（ｐ）（７，２０）を通し平衡化
する。このカラムにＨＢｓ抗原陽性人血清２０ｍｌを上
記緩衝液で３倍量に希釈したものを通液する。
その後、上記緩衝液で充分に洗浄する。ついで、０．６
Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０２７Ｍマツキルベン緩衝
液（ｐＨ７，２０）で溶出する。この結果を第１表に示
す。第１表に示すように、）（Ｂｓ抗原は溶出画分にほ
ぼ回収され、精製度は約１６倍に達した。
Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０２７Ｍマツキルベン緩衝
液（ｐＨ７，２０）で溶出する。この結果を第１表に示
す。第１表に示すように、）（Ｂｓ抗原は溶出画分にほ
ぼ回収され、精製度は約１６倍に達した。
第 １ 表
＊１） ラノオイム／アッセイ（グイナボット社製、
オーセリアｌｌ−１２５）で測定。
オーセリアｌｌ−１２５）で測定。
（黒用正身、斉藤晴−： Ｊａｐａｎ−Ｊ、Ｍｅｄ。
Ｓｃｉ、Ｂｉｏｌ、、３２・４７−５２（１９７９）を
参照） 木２）流出液と洗浄液を含む。
参照） 木２）流出液と洗浄液を含む。
実験例２ （Ｆ −ＨＡの精製）
前記実施例１と同様にして調製したセルロース硫酸エス
テルゲルをカラム（１６＋ｎ＋ｏφＸ１００ｍ＋Ｉｌ）
に充填し、これに０．２ Ｍ塩化ナトリウム添加０．０
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８，０、比電導度的１７ 、５
ｍｓ／ｃｍ）を通液して平衡化する。このカラムに百
日ぜきＩ相菌東浜株ファーメンタ−培養上清８００Ｊを
希釈して、比電導度的１７．５Ｑｌξ／ａｍ 、 ｌ
）８８ 、０に合わせた液を通液する。通液後、上記緩
衝液にて洗浄し、夾雑物質を洗い出す。
テルゲルをカラム（１６＋ｎ＋ｏφＸ１００ｍ＋Ｉｌ）
に充填し、これに０．２ Ｍ塩化ナトリウム添加０．０
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８，０、比電導度的１７ 、５
ｍｓ／ｃｍ）を通液して平衡化する。このカラムに百
日ぜきＩ相菌東浜株ファーメンタ−培養上清８００Ｊを
希釈して、比電導度的１７．５Ｑｌξ／ａｍ 、 ｌ
）８８ 、０に合わせた液を通液する。通液後、上記緩
衝液にて洗浄し、夾雑物質を洗い出す。
ついで、１．５Ｍ塩化ナトリウム添加リン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，６）で溶出し、Ｆ−ＨＡを含む両分３０ｍｊ２を
得る。
Ｈ７，６）で溶出し、Ｆ−ＨＡを含む両分３０ｍｊ２を
得る。
培養上清液および、素通り画分、精製Ｆ−）（Ａ画分の
分析結果を第２表に記す。
分析結果を第２表に記す。
Ｆ−ＨＡの回収率は９３．８％で、精製度（精製Ｆ−Ｈ
Ａ画分の比活性／培養上清の比活性）は３４倍に達した
。精製Ｆ−ＨＡ画分のＬＰＦ−ＨＡ活性は、ハブ）ＥＬ
ＩＳＡ法［佐藤呟第２８回毒素シンポジウム予稿集１４
１（１９８１）］による分析でｌ０ＥＬＩＳＡユニツ）
／ｍｊ２以下であった。
Ａ画分の比活性／培養上清の比活性）は３４倍に達した
。精製Ｆ−ＨＡ画分のＬＰＦ−ＨＡ活性は、ハブ）ＥＬ
ＩＳＡ法［佐藤呟第２８回毒素シンポジウム予稿集１４
１（１９８１）］による分析でｌ０ＥＬＩＳＡユニツ）
／ｍｊ２以下であった。
第２表
Ｊ）Ｆ−ＨＡ血球凝集試験［５ａｔｏ、 Ｙ、ｅＬ ａ
ｌ＋ Ｉ訂ｅｃＬ。
ｌ＋ Ｉ訂ｅｃＬ。
Ｉｍｍｕｎ、、 ７，９２９−９９９（１９７３）］２
）キルブール法蛋白窒素測定値Ｘ６，２５により蛋白質
含量として表示 ３）ＨＡ価／蛋白質含量 ４）５）６．２５μｇ蛋白質／ｍ ｌの含量に希釈後、
生物学的製剤基準（薬発２８７号、１９８１）に循ヒて
実施した。
）キルブール法蛋白窒素測定値Ｘ６，２５により蛋白質
含量として表示 ３）ＨＡ価／蛋白質含量 ４）５）６．２５μｇ蛋白質／ｍ ｌの含量に希釈後、
生物学的製剤基準（薬発２８７号、１９８１）に循ヒて
実施した。
実験例３（ＬＰＦ−ＨＡの精製）
前記実施例１と同様にして調製したセルロース硫酸エス
テルゲル に充填し、これに蒸留水１．Ｏｌ を通液する。このカ
ラムに百日せき■相菌束浜株静置培養液の遠心上清５０
０Ｊを蒸留水で１０倍希釈しだ液（比電導度的１ 、
５ ｍｓ／ｃｍ）を通液する。約５ ０ ０Ｊの０、０
２Ｍマツキルベン緩衝液（ｐＨ５．２）をカラムに通液
し、ゲルを洗浄した後、０．０２Ｍ塩化ナトリウム添加
マツキルベン緩衝液（比電導度的２、０＋ｎｓ／ｃ＋＋
＋．ｐＨ５．２）２０００−を用ν１、塩化ナトリウム
Ｏ→４．ＯＭの塩濃度勾配にて溶出を行ない、約２０ｍ
ｌずつ分画して分取した後、ＬＰＦ−ＨＡを含有する両
分的１３０Ｊをプールする。
テルゲル に充填し、これに蒸留水１．Ｏｌ を通液する。このカ
ラムに百日せき■相菌束浜株静置培養液の遠心上清５０
０Ｊを蒸留水で１０倍希釈しだ液（比電導度的１ 、
５ ｍｓ／ｃｍ）を通液する。約５ ０ ０Ｊの０、０
２Ｍマツキルベン緩衝液（ｐＨ５．２）をカラムに通液
し、ゲルを洗浄した後、０．０２Ｍ塩化ナトリウム添加
マツキルベン緩衝液（比電導度的２、０＋ｎｓ／ｃ＋＋
＋．ｐＨ５．２）２０００−を用ν１、塩化ナトリウム
Ｏ→４．ＯＭの塩濃度勾配にて溶出を行ない、約２０ｍ
ｌずつ分画して分取した後、ＬＰＦ−ＨＡを含有する両
分的１３０Ｊをプールする。
原材料液および精製ＬＰＦ−ＨＡ画分の分析結果および
実験成績を第３表に示す。
実験成績を第３表に示す。
第３表
１）ＬＰＦ−ＨＡのｉｎ ｖｉＬｒｏテスト：ハプト−
ＥＬＩＳＡ法［佐藤呟第２８回毒素シンポジウム予稿集
１４１−１４４（１９８１）を参照］によるＬＰＦ−Ｈ
Ａの単位 ２）キルタール法蛋白窒素測定値Ｘ６．２５により蛋白
質含量として表示 ３） ６．２５μｇ蛋白質／ｍｌの含量に希釈後、生
物学的製剤基準（薬発２８７号、１９８１）に準じて不
活化して実施した。
ＥＬＩＳＡ法［佐藤呟第２８回毒素シンポジウム予稿集
１４１−１４４（１９８１）を参照］によるＬＰＦ−Ｈ
Ａの単位 ２）キルタール法蛋白窒素測定値Ｘ６．２５により蛋白
質含量として表示 ３） ６．２５μｇ蛋白質／ｍｌの含量に希釈後、生
物学的製剤基準（薬発２８７号、１９８１）に準じて不
活化して実施した。
１例４（インフルエンザウィルスの精製）前記実施例１
で得られたセルロース硫酸エステルゲルをカラム（５ｃ
ｍφＸ１７ｃ＋ｎ）に充填し、これにｏ．１４Ｍ塩化ナ
トリウムを含む０．０１０Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４
）を通液し平衡化する。このカラムに１１日令のふ化鶏
卵に接種培養（３４℃、４８時間ルだＡ／フィリピン（
８３Ｎ２）タイプインフルエンザウィルス感染尿膜膣液
［ウィルス量７７ＣＣＡ、蛋白質窒素量３７７μｇ／ｍ
ｆｆｉ （ｏ −ソー法）、比活性（ＯＣＡ／ＴＣＡ−
Ｎ）０．２０１４、２００Ｉｎｆ！．を通液する。その
後に０．１９Ｍ塩化ナトリウムを含む０，０１Ｍリン酸
緩衝液２５００＋Ｊを通して洗浄する。ついで、１．４
９Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０ １０Ｍりン酸緩衝液
で溶出し、溶出画分１７（ｈ，９を得る。その後、４。
で得られたセルロース硫酸エステルゲルをカラム（５ｃ
ｍφＸ１７ｃ＋ｎ）に充填し、これにｏ．１４Ｍ塩化ナ
トリウムを含む０．０１０Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４
）を通液し平衡化する。このカラムに１１日令のふ化鶏
卵に接種培養（３４℃、４８時間ルだＡ／フィリピン（
８３Ｎ２）タイプインフルエンザウィルス感染尿膜膣液
［ウィルス量７７ＣＣＡ、蛋白質窒素量３７７μｇ／ｍ
ｆｆｉ （ｏ −ソー法）、比活性（ＯＣＡ／ＴＣＡ−
Ｎ）０．２０１４、２００Ｉｎｆ！．を通液する。その
後に０．１９Ｍ塩化ナトリウムを含む０，０１Ｍリン酸
緩衝液２５００＋Ｊを通して洗浄する。ついで、１．４
９Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０ １０Ｍりン酸緩衝液
で溶出し、溶出画分１７（ｈ，９を得る。その後、４。
９９Ｍ塩化ナトリウムを含む０，ＯＩＭリン酸緩＋１１
ｊ液でゲルを溶出洗浄する。
ｊ液でゲルを溶出洗浄する。
この結果を第４表に示す。
第４表
＊） ＣＣＡ（ｃｌ＋ｉｃｋ ｃｅｌｌ ａ
ｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ） ＝鶏赤血球凝集反応に
より測定したウィルス量の単位、比活性とは、トリクロ
ル酢酸を用いて沈殿させた蛋白質窒素量を比色定量し、
その値（ＴＣＡ−Ｎ）とウィルス量（ＣＣＡ）との比で
蛋白質窒素量当りのウィルス（抗原）量を示す。
ｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ） ＝鶏赤血球凝集反応に
より測定したウィルス量の単位、比活性とは、トリクロ
ル酢酸を用いて沈殿させた蛋白質窒素量を比色定量し、
その値（ＴＣＡ−Ｎ）とウィルス量（ＣＣＡ）との比で
蛋白質窒素量当りのウィルス（抗原）量を示す。
第４表に示すように、インフルエンザ゛ウィルス。 は
溶出画分にはパ回収され、精製度は約２０倍に達した。
溶出画分にはパ回収され、精製度は約２０倍に達した。
実験例５（日本脳炎ウィルスの精製）
前記実施例１と同様にして調製したセルロース硫酸エス
テルゲル３７．５Ｊをカラム（２５ｍｍφＸ ４００ｍ
ｎ＋）に充填し、これに蒸留水３７５Ｊを通液する。次
に、０．１４ＭＮａＣ，（添加０．０１Ｍリン酸緩衝液
３７５Ｊにてゲルを平衡化したのちこのカラムにプロタ
ミン−歳末処理して得られる不活化日本脳炎ウィルス浮
遊液５０＋Ｊを通液する。０．１４Ｍ ＮａＣ１添加０
，０１Ｍリン酸緩衝液にて、ゲルを十分洗浄した後、１
．５ＭＮａＣ１添加１００ＭＩＪン酸緩衝液（比電導度
的１２０ｍ５／ｅｔＱ、ｐＨ７，２）１００Ｊを用いて
溶出を行ない、約５−ずつ分画して分取した後、日本脳
炎ウィルスを含有する両分的１０Ｊ をプールする。
テルゲル３７．５Ｊをカラム（２５ｍｍφＸ ４００ｍ
ｎ＋）に充填し、これに蒸留水３７５Ｊを通液する。次
に、０．１４ＭＮａＣ，（添加０．０１Ｍリン酸緩衝液
３７５Ｊにてゲルを平衡化したのちこのカラムにプロタ
ミン−歳末処理して得られる不活化日本脳炎ウィルス浮
遊液５０＋Ｊを通液する。０．１４Ｍ ＮａＣ１添加０
，０１Ｍリン酸緩衝液にて、ゲルを十分洗浄した後、１
．５ＭＮａＣ１添加１００ＭＩＪン酸緩衝液（比電導度
的１２０ｍ５／ｅｔＱ、ｐＨ７，２）１００Ｊを用いて
溶出を行ない、約５−ずつ分画して分取した後、日本脳
炎ウィルスを含有する両分的１０Ｊ をプールする。
原材料液および精製日本脳炎ウィルス画分の分析結果お
よび実験成績を第５表に示す。
よび実験成績を第５表に示す。
第５表
実験例６（狂犬病ウィルスの精製）
前記実施例１と同様にして調製したセルロース硫酸エス
テルゲル０，１４１をカラム（２、５ｎ＋＋ｎφＸ ４
００ ＋ｎｍ）に充填し、これに蒸留水１４００Ｊを通
液する。次に、０．１４ＭＮａＣｆ添加０．ＯＩＭＩＪ
ン酸緩衝液１４００＋ｎｊｇにてゲルを平衡化したのち
、このカラムにニワトリ胚初代培養細胞に接種増殖して
得られる不活性狂犬病ウィルス浮遊液２．９！を流速５
００ｍ１／時間で通液する。
テルゲル０，１４１をカラム（２、５ｎ＋＋ｎφＸ ４
００ ＋ｎｍ）に充填し、これに蒸留水１４００Ｊを通
液する。次に、０．１４ＭＮａＣｆ添加０．ＯＩＭＩＪ
ン酸緩衝液１４００＋ｎｊｇにてゲルを平衡化したのち
、このカラムにニワトリ胚初代培養細胞に接種増殖して
得られる不活性狂犬病ウィルス浮遊液２．９！を流速５
００ｍ１／時間で通液する。
０．１４Ｍ ＮａＣ１添加０．０１Ｍリン酸緩衝液にて
、ゲルを十分洗浄した後、ＩＭＮａＣ，ｇ添加０゜０１
Ｍリン酸緩衝液（比電導度８７ 、６ ｍｓ／ ｃａｎ
、ｐＨ７，２６）５００ｍｊ２を用いて流速１ ｔｏ
ｌ ／分で溶出を行ない、約１０Ｊづつ分画して分取し
た後、狂犬病ウィルスを含有する両分的３０Ｊをプール
する。
、ゲルを十分洗浄した後、ＩＭＮａＣ，ｇ添加０゜０１
Ｍリン酸緩衝液（比電導度８７ 、６ ｍｓ／ ｃａｎ
、ｐＨ７，２６）５００ｍｊ２を用いて流速１ ｔｏ
ｌ ／分で溶出を行ない、約１０Ｊづつ分画して分取し
た後、狂犬病ウィルスを含有する両分的３０Ｊをプール
する。
原材料液および精製狂犬病ウィルス画分の分析結果およ
び実験成績を第６表に示す。
び実験成績を第６表に示す。
第６表
実験例７（アンチトロンビンＩＩＩの精製）処理原料と
して新鮮凍結血漿を用い、これを解凍し、８０００ｒｐ
ｍで３０分間遠心分離し、その上清に分子１４ｏｏｏの
ポリエチレングリフール１０％を加えて１時間撹拌し、
８０００ｒｐｍで６０分間遠心する。ついでこの上清を
、０．０２Ｍリンｅｒａ衝液（Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ
２０（０，２Ｍ、７６％）とＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２０
（０，２Ｍ、２４％）の混合液）にて透析する。
して新鮮凍結血漿を用い、これを解凍し、８０００ｒｐ
ｍで３０分間遠心分離し、その上清に分子１４ｏｏｏの
ポリエチレングリフール１０％を加えて１時間撹拌し、
８０００ｒｐｍで６０分間遠心する。ついでこの上清を
、０．０２Ｍリンｅｒａ衝液（Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ
２０（０，２Ｍ、７６％）とＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２０
（０，２Ｍ、２４％）の混合液）にて透析する。
前記実施例１と同様にして調製したセルロース硫酸エス
テルゲル０．５２１を充填したカラム（１゜５ｃａｎφ
Ｘ３０ｃｍ）に、上記と同じ０ 、０２ Ｍリン酸緩衝
液を通してゲルを平衡化したのち、これに上記透析した
血漿上清２０ｍｆｆ１（ｐＨ５，０）を通液する。つい
で、流出液の吸光度が充分に下るまで上記と同じ緩衝液
を流してカラムを洗浄したのち、溶出緩衝液（０，０２
Ｍリン酸緩衝液＋２ 、 ＯＭ塩化ナトリウム）にて溶
出する。約１０−づつ分画し、吸光度２８０ｎｍ（ＯＤ
２．。）での吸収ピークを示す２つの７ラクシヨンを得
る。この７ラクシヨンについて分析した結果を第７表に
示す。
テルゲル０．５２１を充填したカラム（１゜５ｃａｎφ
Ｘ３０ｃｍ）に、上記と同じ０ 、０２ Ｍリン酸緩衝
液を通してゲルを平衡化したのち、これに上記透析した
血漿上清２０ｍｆｆ１（ｐＨ５，０）を通液する。つい
で、流出液の吸光度が充分に下るまで上記と同じ緩衝液
を流してカラムを洗浄したのち、溶出緩衝液（０，０２
Ｍリン酸緩衝液＋２ 、 ＯＭ塩化ナトリウム）にて溶
出する。約１０−づつ分画し、吸光度２８０ｎｍ（ＯＤ
２．。）での吸収ピークを示す２つの７ラクシヨンを得
る。この７ラクシヨンについて分析した結果を第７表に
示す。
第７表
Claims (4)
- （１）非架橋セルロースの固体粒状物を固体粒状状態を
保持しながら硫酸エステル化したのちアルカリで中和し
て得られる群特異性を有するアフィニティクロマトグラ
フィ用ゲル。 - （２）該非架橋セルロースが結晶セルロースまたま結晶
領域および非結晶領域からなるセルロースである前記第
（１）項記載のゲル。 - （３）硫酸エステル化剤をアミンまたはアミドに溶解さ
せ、これに非架橋セルロースの固体粒状物を反応させ、
ついでアルカリで中和することを特徴とする群特異性を
有するアフィニティクロマトグラフィ用ゲルの製造法。 - （４）硫酸エステル化剤が無水硫酸またはクロルスルホ
ン酸である前記第（３）項記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59177347A JPS6154450A (ja) | 1984-08-24 | 1984-08-24 | 群特異性を有するアフイニテイクロマトグラフイ用ゲルおよびその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59177347A JPS6154450A (ja) | 1984-08-24 | 1984-08-24 | 群特異性を有するアフイニテイクロマトグラフイ用ゲルおよびその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6154450A true JPS6154450A (ja) | 1986-03-18 |
| JPH0423751B2 JPH0423751B2 (ja) | 1992-04-23 |
Family
ID=16029377
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59177347A Granted JPS6154450A (ja) | 1984-08-24 | 1984-08-24 | 群特異性を有するアフイニテイクロマトグラフイ用ゲルおよびその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6154450A (ja) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63209750A (ja) * | 1987-02-25 | 1988-08-31 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | 血液凝固第８因子精製用吸着体およびそれを用いた血液凝固第８因子の精製法 |
| JPH02195877A (ja) * | 1989-01-23 | 1990-08-02 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | レトロウイルスの精製方法 |
| WO1991013976A1 (en) * | 1990-03-14 | 1991-09-19 | Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd. | Process for producing purified tissue plasminogen activator or its derivative |
| GB2429708A (en) * | 2005-09-01 | 2007-03-07 | Chisso Corp | Spherical sulphated cellulose |
| JP2008222604A (ja) * | 2007-03-09 | 2008-09-25 | Chisso Corp | 化粧料配合剤及びそれを含む化粧料組成物 |
| GB2465301A (en) * | 2005-09-01 | 2010-05-19 | Chisso Corp | Spherical sulphated cellulose |
| JP4751558B2 (ja) * | 2000-04-07 | 2011-08-17 | 一般財団法人化学及血清療法研究所 | 日本脳炎不活化ワクチン及びその製造方法 |
| JP2020124680A (ja) * | 2019-02-05 | 2020-08-20 | 国立大学法人福井大学 | タンパク質吸着剤及びその製造方法 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5332090B2 (ja) * | 2005-09-01 | 2013-11-06 | Ｊｎｃ株式会社 | 球状硫酸化セルロース及びその製造方法 |
-
1984
- 1984-08-24 JP JP59177347A patent/JPS6154450A/ja active Granted
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63209750A (ja) * | 1987-02-25 | 1988-08-31 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | 血液凝固第８因子精製用吸着体およびそれを用いた血液凝固第８因子の精製法 |
| JPH02195877A (ja) * | 1989-01-23 | 1990-08-02 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | レトロウイルスの精製方法 |
| WO1991013976A1 (en) * | 1990-03-14 | 1991-09-19 | Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd. | Process for producing purified tissue plasminogen activator or its derivative |
| JP4751558B2 (ja) * | 2000-04-07 | 2011-08-17 | 一般財団法人化学及血清療法研究所 | 日本脳炎不活化ワクチン及びその製造方法 |
| GB2429708A (en) * | 2005-09-01 | 2007-03-07 | Chisso Corp | Spherical sulphated cellulose |
| GB2465301A (en) * | 2005-09-01 | 2010-05-19 | Chisso Corp | Spherical sulphated cellulose |
| GB2429708B (en) * | 2005-09-01 | 2010-06-02 | Chisso Corp | Spherical sulfated cellulose |
| GB2465301B (en) * | 2005-09-01 | 2010-06-30 | Chisso Corp | Spherical sulfated cellulose |
| JP2008222604A (ja) * | 2007-03-09 | 2008-09-25 | Chisso Corp | 化粧料配合剤及びそれを含む化粧料組成物 |
| JP2020124680A (ja) * | 2019-02-05 | 2020-08-20 | 国立大学法人福井大学 | タンパク質吸着剤及びその製造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0423751B2 (ja) | 1992-04-23 |
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