CN116769621A - 一株酿酒酵母msl、包含酿酒酵母msl的发酵菌剂及应用 - Google Patents

一株酿酒酵母msl、包含酿酒酵母msl的发酵菌剂及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116769621A
CN116769621A CN202310774900.0A CN202310774900A CN116769621A CN 116769621 A CN116769621 A CN 116769621A CN 202310774900 A CN202310774900 A CN 202310774900A CN 116769621 A CN116769621 A CN 116769621A
Authority
CN
China
Prior art keywords
msl
saccharomyces cerevisiae
wine
grape
strain
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310774900.0A
Other languages
English (en)
Inventor
刘亚琼
王颉
葛晓欣
党超
王美琪
锁然
孙剑锋
牟建楼
王文秀
马倩云
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hebei Agricultural University
Original Assignee
Hebei Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hebei Agricultural University filed Critical Hebei Agricultural University
Priority to CN202310774900.0A priority Critical patent/CN116769621A/zh
Publication of CN116769621A publication Critical patent/CN116769621A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C12N1/18—Baker's yeast; Brewer's yeast
    • C12N1/185—Saccharomyces isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12G—WINE; PREPARATION THEREOF; ALCOHOLIC BEVERAGES; PREPARATION OF ALCOHOLIC BEVERAGES NOT PROVIDED FOR IN SUBCLASSES C12C OR C12H
    • C12G1/00—Preparation of wine or sparkling wine
    • C12G1/02—Preparation of must from grapes; Must treatment and fermentation
    • C12G1/0203—Preparation of must from grapes; Must treatment and fermentation by microbiological or enzymatic treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C12N1/18—Baker's yeast; Brewer's yeast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12G—WINE; PREPARATION THEREOF; ALCOHOLIC BEVERAGES; PREPARATION OF ALCOHOLIC BEVERAGES NOT PROVIDED FOR IN SUBCLASSES C12C OR C12H
    • C12G2200/00—Special features
    • C12G2200/05—Use of particular microorganisms in the preparation of wine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/85—Saccharomyces
    • C12R2001/865—Saccharomyces cerevisiae

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及工业微生物技术领域，具体公开一株酿酒酵母MSL、包含酿酒酵母MSL的发酵菌剂及应用。所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)MSL的保藏编号为CGMCC No.25347。本发明提供的酿酒酵母MSL不但具有高产β‑葡萄糖苷酶的优良特性，而且在10％的葡萄糖，12％的乙醇，100mg/L的SO2和部分的金属离子条件下也可保持85％以上的相对酶活，可促进萜烯类物质释放，提高葡萄酒中挥发性化合物的含量，从而增加葡萄酒的风味复杂度。用其酿造的葡萄酒具有本土地域生化特性，能产生更突出丰富的地域香气成分，对于酿造特色优质干白葡萄酒具有重要意义。

Description

一株酿酒酵母MSL、包含酿酒酵母MSL的发酵菌剂及应用
技术领域
本发明涉及工业微生物技术领域，尤其涉及一株酿酒酵母MSL、包含酿酒酵母MSL的发酵菌剂及应用。
背景技术
葡萄酒是世界上仅次于啤酒的第二大酒精饮料，在世界区域经济和国际贸易中占有重要地位。酿酒酵母是葡萄酒工业发酵最主要的酵母菌，在葡萄酒酿造过程中发挥着重要作用，其可将葡萄糖大部分转化为乙醇和二氧化碳，同时通过一系列反应产生甘油、氨基酸、酯和高级醇等代谢产物，进而从色泽香气和口感等方面影响葡萄酒的质量。葡萄酒的酿造主要是在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的作用下，采用自然发酵或接种发酵，将葡萄原料中的各种潜在品质和优势在酒中充分表现出来。酿造过程中，酿酒酵母性能的优劣对葡萄酒的品质形成至关重要，因为酵母的发酵特性不仅直接影响着葡萄酒的酒精积累和感官品质，同时也决定着发酵工艺流程和运转周期及费用。葡萄酒是极具个性的饮品，不同产区的酒风格特征各不相同，这种差异性也正是葡萄酒的魅力所在。
随着葡萄酒行业的发展，消费者对葡萄酒的品质要求提出了更高的要求。优质葡萄酒的生产迫切需要具有产区特征、能体现葡萄酒特色和风格的优良酵母菌种。而目前我国的葡萄酒产品同质化严重，缺乏能够代表产区特色的优质产品，其中最突出的就是香气较单一、缺乏产区特征，这也成为制约我国葡萄和葡萄酒产业发展的主要因素之一。且发酵过程中的其他因素，如糖度、酒精度、pH值和二氧化硫等因素也会影响酵母菌的繁殖，进而影响葡萄酒的品质。因此，筛选耐受性能优良的本土葡萄酒酿酒酵母对葡萄酒生产意义重大。
发明内容
针对现有酿酒酵母主要依赖进口以及葡萄酒产品的产区风格特征不明显的问题，本发明提供一株酿酒酵母MSL、包含酿酒酵母MSL的发酵菌剂及应用。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：
第一方面，本发明提供一株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)MSL，其保藏编号为CGMCC No.25347。
所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)MSL，分类命名为Saccharomyces，已于2022年07月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，菌种保藏号为CGMCC No.25347，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明提供的酿酒酵母MSL的生物学特征为：在YPD培养基上呈奶白色，圆形，边界整齐，菌落球形突起，不透明。
优选的，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)MSL是由河北省张家口市怀来县葡萄产区的马瑟兰葡萄果实表层筛选出来的。
β-葡萄糖苷酶作为一种纤维素类水解酶能够水解糖苷结合态物质中的糖苷键释放香气物质，促进一些萜烯类和C13-降异戊二烯类物质的产生，从而增加葡萄酒的花香、果香和坚果香，对于改善或增强葡萄酒的风味复杂性有重要作用。然而，酿酒过程中的一些条件(如高糖、高酒精度、高浓度SO2和低pH值)可能会抑制发酵体系中β-葡萄糖苷酶活力，导致其无法充分水解糖苷键。本发明提供的酿酒酵母MSL在传统的酿酒条件下依然可以高产β-葡萄糖苷酶，β-葡萄糖苷酶在传统酿酒条件下具有较高的酶活力，可促进萜烯类物质释放，提高葡萄酒中的挥发性化合物的含量，有助于增加葡萄酒的风味复杂度。
进一步地，本发明提供的酿酒酵母MSL的β-葡萄糖苷酶的酶活力为36.80±0.39U/mL。
第二方面，本发明还提供了一种发酵菌剂，包含所述的酿酒酵母MSL。
进一步地，所述发酵菌剂为液体菌剂、半液体菌剂或固体菌剂。
示例性的，将酿酒酵母MSL接种至YPD液体培养基中，发酵至活菌数达到108cfu/mL以上，得到液体菌剂。
将上述液体菌剂进行浓缩，得到半液体菌剂。
上述浓缩可以采用本领域常规的浓缩方法，如离心，过滤等，本发明不做特殊要求。
向上述半液体菌剂中加入缓冲液，加入冻干保护剂，调整活菌数达到1010cfu/mL～1012cfu/mL，冻干，得到固体菌剂。
上述缓冲液可采用本领域常规的缓冲液，如PBS缓冲液或生理盐水。冻干保护剂也可以采用本领域常用的冻干保护剂，如脱脂乳粉、麦芽糊精、葡聚糖或甘油中至少一种。
进一步地，所述发酵菌剂中酿酒酵母MSL的活菌浓度为108cfu/mL～1012cfu/mL。
第三方面，本发明还提供了上述酿酒酵母MSL或发酵菌剂在酿造葡萄酒中的应用，尤其是在酿造龙眼干白葡萄酒中的应用。
本发明提供的酿酒酵母可广泛应用于中国产区各葡萄品种的葡萄酒的酿制，尤其是适用于河北省张家口怀来县产区的葡萄酒酿造。在干白葡萄酒的典型性方面，都显著优于商业菌株，说明筛选的菌株能体现产地葡萄酒典型性，具备现实的应用价值。
本发明还提供了一种生产葡萄酒的方法，利用上述的酿酒酵母MSL或上述任一项所述的发酵菌剂发酵葡萄原料得到葡萄酒。
具体地，上述生产葡萄酒的方法具体步骤如下：以破碎除梗压榨后的葡萄汁为原料，将上述酿酒酵母MSL或所述的发酵菌剂接种至葡萄汁中，混合均匀，在pH3～4、12℃～16℃条件下进行发酵，得葡萄酒。
进一步地，所述酿酒酵母MSL的接种量为1×106cfu/mL～1×107cfu/mL。
通过酿酒酵母的发酵产生一系列的代谢产物，可赋予葡萄酒令人愉悦的独特的风味，代谢产物中高级醇和酯类直接受酿酒酵母细胞的繁殖密度影响。优选的接种量可使葡萄酒中的风味物质高级醇和酯含量适当，且可以使葡萄酒具有适当的酒精度和发酵度，使得葡萄酒的口感更好。
进一步地，所述葡萄汁原料由河北省张家口市怀来县的龙眼葡萄破碎除梗压榨得到。
需要说明的是，在发酵之前需要对酿酒酵母MSL进行活化。可采用本领域常规的活化方法，如，将酿酒酵母MSL接种至YPD液体培养基中，28℃摇床培养过夜。
本发明提供的酿酒酵母MSL可高产β-葡萄糖苷酶(36.80±0.39U/mL)，且在耐受性方面表现优良，与商业酿酒酵母VL2相比，本发明提供的酿酒酵母MSL可使酿造的葡萄酒中具有更高的酯类含量(1145.78±14.28mg/L)和高级醇含量(355.37±5.38mg/L)，还增加了萜烯类物质的含量，具有浓郁的花香和水果香，香气优雅协调，入口圆润，具有明显的地域性的香气和风味特点，对促进葡萄酒的产业发展具有十分重要的意义。
附图说明
图1为酿酒酵母MSL在YPD固体培养基上的菌落形态；
图2为酿酒酵母MSL和商业酵母VL2发酵葡萄酒的感官评价蛛网图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例所用培养基：
YPD液体培养基(1L)：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母浸粉10g，水1000mL，自然pH值，121℃灭菌20min后待用。
YPD固体培养基(1L)：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母浸粉10g，琼脂15g，氯霉素100mg(预先溶于少量乙醇中)，水1000mL，自然pH值，121℃灭菌20min后待用。
筛选培养基(1L)：酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，琼脂20g，硫酸铵3g，磷酸二氢钾4g，p-NPG 1g，水1000mL，自然pH值，121℃灭菌20min后待用。
七叶苷培养基配方(1L)：七叶苷3g，柠檬酸铁0.5g，氯化钠2g，七水硫酸镁0.5g，磷酸二氢钾0.1g，琼脂20g，水1000mL，自然pH值，121℃灭菌20min后待用。
产酶培养基配方(1L)：酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，硫酸3g，磷酸4g，水1000mL，自然pH值，121℃灭菌20min后待用。
实施例1
1.出发菌株的选育
1.1果表酵母的分离筛选
无菌称量5g张家口市怀来县成熟的马瑟兰葡萄，放入盛有45mL已灭菌的0.9％氯化钠溶液中，振荡摇匀，制成菌悬液，吸取1mL菌悬液放入高温灭菌的YPD液体培养基中，于恒温摇床中，28℃振荡培养2d(180r/min)，吸取1mL菌液加入9mL已灭菌的0.9％氯化钠溶液中，轻柔振荡，重复上述操作，依次梯度稀释102～107倍。用微量移液器吸取不同浓度梯度的菌液0.1mL加入YPD固体培养基中，使用涂布器均匀涂布，将YPD固体培养基置于恒温培养箱中，28℃倒置培养，每个浓度梯度设置三个平行。挑取YPD固体培养基中外观形态及颜色有差异的单菌落使用四区划线法进行纯化，将得到的纯培养物编号记录，将制得的纯培养物与40％甘油溶液等比例混合，振荡均匀，于-20℃保藏。
1.2产β-葡萄糖苷酶酵母菌株的筛选
初筛：将上述筛选得到的酵母菌接种至YPD液体培养基上，于28℃振荡培养24h(180r/min)，将活化液稀释至104cfu/mL，接种至筛选培养基中，28℃恒温培养72h后，在培养基上喷洒1mol/L碳酸钠溶液。产霉菌株会分解p-NPG得到对硝基苯酚(p-NP)，p-NP和碳酸钠发生显色反应生成黄色物质从而在菌落周围形成透明圈，透明圈直径越大和颜色越深说明酶活性越高。挑取目标单菌落富集培养48h，将菌液与40％甘油溶液等比例混合，振荡均匀，于-20℃保藏。
复筛：将上一步筛选得到的目标菌株接种至YPD液体培养基上，于28℃振荡培养24h(180r/min)，将活化后的菌液接种至含有七叶苷的培养基中，利用96孔板进行观察，每个菌株重复接种三次，覆盖封板膜，于28℃静置培养1d，观察培养基颜色是否有颜色变化以及颜色深浅的变化程度。七叶苷在β-葡萄糖苷酶的作用下可以得到产物七叶苷元，而七叶苷元与三价铁离子发生化学反应会呈现棕黑色。因此，可以根据培养基颜色的深浅来判断菌株产酶活性的高低。
1.3β-葡萄糖苷酶的活性测定
将上步复筛得到的高产β-葡萄糖苷酶的菌株接种至YPD液体培养基上，于28℃振荡培养24h(180r/min)进行活化，将活化液稀释至106cfu/mL，接种至产酶培养基中，于28℃振荡培养3d，将培养得到的菌液置于离心管中在4℃低温条件下8000r/min离心10min，吸取上清液，即粗酶液，用于下一步分析检测。
使用微量移液器准确吸取0.5mL粗酶液于15mL离心管中，之后加入1mL提前使用柠檬酸-磷酸盐缓冲液作为溶剂配制好的35mM p-NPG溶液(pH5.0)，轻柔震荡混匀，使用水浴50℃反应10min，加入8mL 1mol/L碳酸钠溶液用以终止反应，等待5min显色稳定后，于400nm波长的紫外光下测定吸光值。空白为相同处理下未接菌的YPD液体培养基。
酶活力单位(U)定义为pH5.0，50℃反应条件下1min水解p-NPG产生1nmol p-NP所需要的酶量。
测定酶活力为36.80±0.39U/mL。
实施例2
产酶菌株的鉴定
1.1生态学观察
将菌株MSL接种至YPD固体培养基上，放入28℃恒温培养箱中培养48h左右，观察培养基上的菌落形态、菌落边缘、颜色和透明度等。
菌株MSL在YPD固体培养基上呈奶白色，圆形，边界整齐，菌落球形突起，不透明，如图1所示。
1.2分子生物学鉴定
DNA提取：根据PlantZol基因组提取试剂盒说明书操作。
PCR扩增：采用ITS rDNA通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCG G-3')和ITS4R(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')进行PCR扩增。
PCR扩增使用50μL反应体系，包括：10×Ex Taq buffer 5.0μL，2.5mM dNTP Mix4.0μL，10p引物1 2.0μL，10p引物2 2.0μL，5U Ex Taq 0.5μL(5U/μL)，DNA模板2.0μL(20μg/μL)和ddH2O 34.5μL。
PCR反应条件：首先94℃预变性3min；然后94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1.5min，共进行24次循环，最后72℃延伸10min。PCR扩增产物检测及胶回收：产物在0.8％凝胶中电泳，电压150V，电泳20min。切胶回收PCR产物。PCR扩增和测序工作由睿博兴科生物技术有限公司完成，测序方法为sanger法，ITS rDNA的测序结果为：
TTATAATTTTGAAATGGATTTTTTTGTTTTGGCAAGAGCATGAGAGCTTTTACTGGGCAAGAAGACAAGAGATGGAGAGTCCAGCCGGGCCTGCGCTTAAGTGCGCGGTCTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACGGTGAGAGATTTCTGTGCTTTTGTTATAGGACAATTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTTTTCATATCTTTGCAACTTTTTCTTTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAACAAACACAAACAATTTTATCTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAGAATTTTCGTAACTGGAAATTTTAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGTGAGTGATACTCTTTGGAGTTAACTTGAAATTGCTGGCCTTTTCATTGGATGTTTTTTTTCCAAAGAGAGGTTTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAAGACCGGCCGTTTAAGGTTTACCCACTGGCGGTTATCCTTTTTTTATTCTGGACGGTATGGGACGTTAATCCAAAAGAAGAGAACCTCCTAGGCGAACCATGGTTCTTAAAGTTTGGACTCCAAATCAAGGTAAGAAGTACCCGCCTGAACTTAAGCATATCTTAAGAGACGCGCGGGAAAGAA。
将酿酒酵母MSL菌株的ITS rDNA序列与GenBank数据库中序列进行比较，确定MSL菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
该酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)MSL，已于2022年07月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，菌种保藏号为CGMCC No.25347，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
实施例3
复筛得到酵母菌株产的β-葡萄糖苷酶的耐高糖、耐乙醇、耐酸、耐SO2等抗逆性评价
1.1耐葡萄糖评价
配制不同浓度葡萄糖浓度(5％、10％、15％、20％)的YPD液体培养基，将酿酒酵母MSL分别接种至不同葡萄糖浓度的YPD液体培养基中，接种量为106cfu/mL，在恒温箱中28℃条件下振荡培养72h。以加菌液的常规YPD培养基为对照组。按照实施例1(1.3)的方法进行酶活测定。
1.2耐乙醇评价
配制不同乙醇浓度(3％、6％、9％、12％)的YPD液体培养基，将酿酒酵母MSL分别接种至不同乙醇浓度的YPD液体培养基中，接种量为106cfu/mL，在恒温箱中28℃条件下振荡培养72h。并以加菌液的常规YPD培养基为对照组。按照实施例1(1.3)的方法进行酶活测定。
1.3金属离子
在YPD液体培养基中分别加入5mmol/L的不同金属离子(Zn2+，Mg2+，Cu2+，Ca2+，Fe2+，Mn2+)，将酿酒酵母MSL分别接种至不同金属离子的YPD液体培养基中，接种量为106cfu/mL，在恒温箱中28℃条件下振荡培养72h。以加菌液的常规YPD培养基为对照组。按照实施例1(1.3)的方法进行酶活测定。
1.4pH
调节YPD液体培养基的pH值分别为2.0、2.5、3.0、3.5，将酿酒酵母MSL分别接种至不同pH值的YPD液体培养基中，接种量为106cfu/mL，在恒温箱中28℃条件下振荡培养72h。以加菌液的常规YPD培养基为对照组。按照实施例1(1.3)的方法进行酶活测定。
3.5二氧化硫
向YPD液体培养基中加入偏重亚硫酸钾，调节SO2浓度分别为40mg/L、60mg/L、80mg/L、100mg/L，将酿酒酵母MSL分别接种至不同SO2浓度的YPD液体培养基中，接种量为106cfu/mL，在恒温箱中28℃条件下振荡培养72h。以加菌液的常规YPD培养基为对照组。按照实施例1(1.3)的方法进行酶活测定。结果如表1所示。
表1
从表中可以看出，随着葡萄糖的浓度增加，MSL菌株的相对酶活会逐渐降低。其中，相对酶活在葡萄糖浓度为5％时达到最大值(100.17％)，说明酵母MSL分泌的β-葡萄糖苷酶最适宜在葡萄糖浓度为50g/L条件下产生作用，在葡萄糖浓度为20％时β-葡萄糖苷酶的相对酶活为45.24％，说明菌株具有良好的高糖耐受性。
市售葡萄酒的酒精浓度大多为12％左右，当乙醇浓度为6％时，MSL菌株的酶活有一定的激活作用，表明在一定低浓度乙醇范围内，乙醇可以有效地提高细胞膜通透性使酵母细胞释放出更多的胞外酶。高乙醇浓度下，酵母菌的相对酶活受到了不同程度的抑制，MSL菌株能在12％的乙醇浓度下保持较高的β-葡萄糖苷酶活性(85.50％)，说明MSL菌株所产的β-葡萄糖苷酶具有良好的乙醇耐受性。
Cu2+对MSL菌株的相对酶活均起到了抑制作用，Mg2+和Fe2+对MSL菌株产酶的活力几乎没有影响，Zn2+和Ca2+对其酶活有一定的激活作用，Mn2+则有轻微的抑制作用，综上，酿酒酵母MSL的产酶活力受金属离子的影响较小。
在pH 2时，酵母菌MSL的相对酶活均降至15％以下，过低的酸碱度会改变酶蛋白的空间结构，从而影响酶的活性。随着培养基环境pH值不断升高，酶活都有不同程度的增长，当pH为3.5时，相对酶活达到了对照组的50％以上，大多数葡萄汁和市售葡萄酒的pH在3-4之间，在此范围内菌株MSL的酶活表现较好，说明其比较适合葡萄酒的低酸碱度发酵环境。
当SO2添加量为60mg/L时，MSL菌株的酶活高于对照组，当SO2添加量为80mg/L时，MSL菌株的酶活受到的影响较小；当SO2添加量为100mg/L时，相对酶活均保持在85％以上，说明该酵母菌株MSL所分泌的β-葡萄糖苷酶对二氧化硫具有良好的耐受性。
实施例4
酿酒酵母MSL用于干白葡萄酒酿造
1.发酵试验
以张家口市怀来县多年生优质葡萄园为采样地点，选择健康且表皮无破损的新鲜龙眼葡萄进行采摘，以破碎除梗压榨后的龙眼葡萄汁为原料，采用酿酒酵母MSL为发酵剂，取250mL龙眼葡萄汁置于高温灭菌后的500mL锥形瓶中，70℃灭菌20min，冷却至室温，接种活化后的酿酒酵母MSL菌悬液5mL，商业活性干酵母VL2作为对照(200g/100mL)，当酵母混合液添加进发酵容器后，要尽量使酵母液在发酵罐中混合均匀。在14℃进行静置发酵，发酵至连续三天恒重，发酵结束。
2.挥发性化合物检测
挥发性香气成分提取：吸取7.5mL酒液置于20mL玻璃顶空瓶中，加入10μL 3-辛醇水溶液(300mg/L)作为内标和2g NaCl有助于香气挥发，采用半定量内标法测定香气。之后放入40℃水浴锅中平衡15min，SPME纤维顶空恒温萃取40min，最后采取手动进样法于GC进样口解析6min。
采用全扫描模式(SCAN)进行定性，离子扫描模式(SIM)进行定量。将质谱图谱与NIST 14谱库进行比对，对匹配度80％以上的组分进行分析。采用内标法对挥发性化合物进行半定量分析。结果如表2所示。
表2
酯类和醇类在酒中是主要的挥发性呈香化合物。酯类物质主要包括乙酸酯类和乙酯类，与葡萄酒的花香和果香密切相关，MSL菌株酿造的葡萄酒中总酯含量明显高于对照葡萄酒，MSL菌株酿造的葡萄酒中含有商业对照菌株VL2没有的酯类物质，包括9-癸烯酸乙酯(36.19±0.11mg/L)和乙酸苯乙酯(19.42±0.91mg/L)，这些物质对葡萄酒的花香和果香具有积极的贡献作用。MSL菌株酿造的葡萄酒中，一些与花香和果香有关的酯类，如甲酸异戊酯也高于对照葡萄酒，。
萜烯类物质能够为葡萄酒提供花香和果香，其阈值较低，因此较低水平的萜烯也能影响葡萄酒的香气。此前的研究表明向酒液中添加β-葡萄糖苷酶会显著增加高级醇的含量，酿酒酵母MSL可高产β-葡萄糖苷酶，因此其高级醇含量(355.37±5.38mg/L)显著高于对照组(98.83±3.66mg/L)。同时，两个样品中共检测出4种萜烯类物质：月桂醇、4-萜烯醇、香茅醇和橙花叔醇，其中月桂醇、香茅醇和橙花叔醇是MSL菌株酿造的葡萄酒中独有的物质。这些挥发性芳香化合物为葡萄酒提供了浓郁的花香和果香。此外，MSL葡萄酒中还检测出了大马士酮(11.34±0.05mg/L)，大马士酮来源于葡萄糖苷酶水解的葡萄糖苷前体，对葡萄酒的花香和甜味都有积极贡献。
3.感官评价
按照上述方法发酵结束后，参照GB15037-2006《葡萄酒》中对葡萄酒感官指标的规定和龙眼葡萄酒的风味特点，召集10名从事葡萄酒研究多年的专家组成，对发酵得到的葡萄酒进行感官品评，评审专家组给出的评分结果见图2所示，专家一致认为，本发明的酿酒酵母MSL菌株酿造的干白葡萄酒的酒体澄清透明，口感柔和细腻，果香、花香更浓郁，尤其是绿色水果和花香，香气强度更加丰富，酸甜适中，整体风味协调，风格独特，比商业菌株VL2更能突出本土龙眼葡萄的的特色，使其酿造特性得到更好的展现，提高葡萄酒的感官品质，符合优质干白葡萄酒的典型风格。
由上述结果可以看出，本发明筛选出的保藏号为CGMCC No.25347的菌株具有良好的耐酸、耐二氧化硫、耐高糖和耐酒精性能，且具有高产β-葡萄糖苷酶的优良特性，用其酿造的葡萄酒具有本土地域生化特性，能产生更突出丰富的地域香气成分，对于酿造特色优质干白葡萄酒具有重要意义。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)MSL，其特征在于，其保藏编号为CGMCCNo.25347。
2.一种发酵菌剂，其特征在于，包含权利要求1所述的酿酒酵母MSL。
3.如权利要求2所述的发酵菌剂，其特征在于，所述发酵菌剂为液体菌剂、半液体菌剂或固体菌剂。
4.如权利要求2或3所述的发酵菌剂，其特征在于，所述发酵菌剂中酿酒酵母MSL的活菌浓度为108cfu/mL～1012cfu/mL。
5.权利要求1所述的酿酒酵母MSL或权利要求2～4任一项所述的发酵菌剂在酿造葡萄酒中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述葡萄酒为干白葡萄酒。
7.一种生产葡萄酒的方法，其特征在于，利用权利要求1所述的酿酒酵母MSL或权利要求2～4任一项所述的发酵菌剂发酵葡萄原料得到葡萄酒。
8.如权利要求7所述的生产葡萄酒的方法，其特征在于，具体步骤如下：将权利要求1所述的酿酒酵母MSL或权利要求2～4任一项所述的发酵菌剂接种至葡萄汁中，混合均匀，在pH3～4、12℃～16℃条件下进行发酵，得葡萄酒。
9.如权利要求8所述的生产葡萄酒的方法，其特征在于，所述酿酒酵母MSL的接种量为1×106cfu/mL～1×107cfu/mL。
10.如权利要求8或9所述的生产葡萄酒的方法，其特征在于，所述葡萄汁由河北省张家口市怀来县的龙眼葡萄破碎除梗压榨得到。
CN202310774900.0A 2023-06-28 2023-06-28 一株酿酒酵母msl、包含酿酒酵母msl的发酵菌剂及应用 Pending CN116769621A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310774900.0A CN116769621A (zh) 2023-06-28 2023-06-28 一株酿酒酵母msl、包含酿酒酵母msl的发酵菌剂及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310774900.0A CN116769621A (zh) 2023-06-28 2023-06-28 一株酿酒酵母msl、包含酿酒酵母msl的发酵菌剂及应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116769621A true CN116769621A (zh) 2023-09-19

Family

ID=87989249

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310774900.0A Pending CN116769621A (zh) 2023-06-28 2023-06-28 一株酿酒酵母msl、包含酿酒酵母msl的发酵菌剂及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116769621A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101792719B (zh) 一株酿酒酵母及其在酿造葡萄酒中的应用
CN108239608B (zh) 一株戴尔凯氏有孢圆酵母菌株及其在葡萄酒酿造中的应用
CN111961603B (zh) 酿酒酵母和菌剂以及它们在制备发酵产品特别是怀涿盆地葡萄酒酿造中的应用
CN113388533B (zh) 一株发酵性能良好且具有产香功能的汉逊德巴利酵母菌及其筛选方法
CN113717870B (zh) 酿酒酵母、发酵剂及它们在酿造葡萄酒中的应用
CN109988685A (zh) 一种提高葡萄酒中果香和花香香气的生产方法
CN113717867B (zh) 一种不产乙醇的产香库德里阿兹威毕赤酵母及其应用
CN103013755A (zh) 一种降低米香型白酒中苦味的方法
CN108410745B (zh) 一株酿酒酵母及其在葡萄酒酿造中的应用
CN109182156B (zh) 一株适于酿造红芯火龙果酒的酿酒酵母及其应用
CN112553091A (zh) 一种非酿酒酵母及用该酵母增加蓝莓果酒香味的发酵方法
CN114606152B (zh) 一株贝莱斯芽孢杆菌、微生物菌剂及其应用
CN113388474A (zh) 一种基于异常威克汉逊酵母的混菌发酵桑葚酒及其制备方法
CN113564061A (zh) 酿酒酵母sg35、包含酿酒酵母sg35的发酵菌剂及其应用
CN117448182A (zh) 一种产香酵母及其培养方法和应用
CN111053195B (zh) 基于前发酵紫红曲霉为优势共生菌系的大豆酱及制作方法
CN116515654B (zh) 酿酒酵母及其在龙眼葡萄酒酿造中的应用
CN113773977B (zh) 一种低产乙醇高产香的酵母菌株及其应用
CN112522120B (zh) 一株非酿酒酵母hsmt-1及其应用
CN116376729A (zh) 异常威克汉姆酵母、微生物制剂和枸杞西打酒及其酿造方法
CN116769621A (zh) 一株酿酒酵母msl、包含酿酒酵母msl的发酵菌剂及应用
CN114854609A (zh) 一株能增加红枣乳酸菌饮料发酵香气的葡萄汁有孢汉逊酵母及其应用
CN113502233A (zh) 一株美极梅奇酵母及其在葡萄酒酿造中的应用
JPWO2003087290A1 (ja) 葡萄を原料とする酒の風味改善用組成物
CN116855396A (zh) 一株葡萄酒有孢汉逊酵母g2、包含葡萄酒有孢汉逊酵母g2的发酵菌剂及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination