CN114164160A - 一种高效生产质粒dna的发酵培养基和发酵生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种高效生产质粒DNA的发酵培养基和发酵生产方法，涉及质粒生产技术领域。本发明所述发酵培养基包括独立包装的发酵基础培养基和补料培养基，两者结合可满足高密度发酵的需要，并提高质粒DNA的产量。利用所述发酵培养基对大肠杆菌进行发酵生产时，质粒平均产量可达181mg/L，能够缩小生物反应器的体积，提高下游纯化的质粒DNA纯度，还可以缩短生产周期、减少设备投资，从而减低生产成本，达到提高生产效率的目的。

Description

一种高效生产质粒DNA的发酵培养基和发酵生产方法
技术领域
本发明属于质粒生产技术领域，具体涉及一种高效生产质粒DNA的发酵培养基和发酵生产方法。
背景技术
随着DNA疫苗、细胞治疗和基因治疗的进一步发展，质粒DNA需求量增加，对工业化生产提出了更高的要求，质粒DNA生产变的越来越重要，利用大肠杆菌大规模制备临床级质粒DNA受到越来越多的关注。迄今为止，质粒DNA生产工艺开发的大部分努力都集中在下游加工上。然而，产品的质量和产量最终取决于发酵策略。通过优化重组菌的生长环境，可以提高菌体产量、质粒产量和质粒质量。因此，为了能够提供足量的质粒DNA满足临床试验和未来市场的需求，需要高效的质粒DNA发酵生产工艺以提供大量的质粒DNA。
质粒DNA的生产过程，除了受到载体设计、宿主菌、纯化方法的影响，同样依赖培养条件及培养基组成。培养基组成显著地影响质粒产量，进而对生产成本造成影响，因此培养基的优化也是提高质粒产量的重要方法之一，但是目前并没有一种可满足细胞高密度发酵并生产质粒DNA的适配培养基和方法。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种高效生产质粒DNA的发酵培养基和发酵生产方法，通过对基础培养基和补料培养基进行优化，确定了新的发酵基础培养基和补料培养基，并最终显著提高质粒产量。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种高效生产质粒DNA的发酵培养基，所述发酵培养基包括独立包装的发酵基础培养基和补料培养基；
每4000mL所述发酵基础培养基包括以下原料：酵母提取物48g、大豆蛋白胨96g、甘油32g、氯化钠16g、七水合硫酸镁2.5g、氯化钙2g、硫酸铵2.5g、硫胺素2g、亮氨酸5g、脯氨酸3g、微量元素液10mL和磷酸盐溶液200mL；
每500mL所述补料培养基包括以下原料：甘油94g、酵母提取物56g、大豆蛋白胨32g、氯化铵20g、亮氨酸8g、脯氨酸8g和七水合硫酸镁2g。
优选的，所述微量元素液包括以下浓度的原料：七水合硫酸亚铁20g/L、七水合硫酸锌2g/L、六水合氯化钴2g/L、二水钼酸钠2g/L、无水氯化钙0.76g/L、无水硫酸铜1.27g/L、一水合硫酸锰1.6g/L、硼酸0.5g/L和体积百分含量为36％～38％的盐酸3mL/L。
本发明还提供了上述发酵培养基的制备方法，每4000mL所述发酵基础培养基的制备方法，包括：将所述酵母提取物、大豆蛋白胨、甘油、氯化钠、七水合硫酸镁、氯化钙、硫酸铵与水混合至3700mL进行灭菌，与10mL微量元素液、200mL磷酸盐溶液和90mL预混溶液混合，得发酵基础培养基；所述预混溶液的溶质包括硫胺素、亮氨酸和脯氨酸；
每500mL所述补料培养基的制备方法，包括将甘油、酵母提取物、大豆蛋白胨、氯化铵、七水合硫酸镁和水按比例混合至450mL，灭菌后与50mL经0.22μm过滤的亮氨酸和脯氨酸混合溶液混合，得所述补料培养基。
优选的，所述预混溶液的制备方法包括：将硫胺素、亮氨酸和脯氨酸单独或混合溶解后，利用0.22μm滤膜过滤，收集滤液，得所述预混溶液。
本发明还提供了上述发酵培养基在高效发酵生产质粒DNA中的应用。
优选的，所述质粒DNA来源于重组大肠杆菌。
本发明还提供了一种高效发酵生产质粒DNA的方法，包括以下步骤：(1)将大肠杆菌的二级种子液接种到发酵基础培养基上，进行有氧发酵，控制发酵过程中pH值为6.9～7.0；
(2)待发酵至OD600为11～13时，添加补料培养基；
(3)待发酵至OD600为15～20时，提高培养温度至42℃，培养至发酵结束。
优选的，步骤(1)所述有氧发酵时，控制溶氧的体积含量30％～40％。
优选的，步骤(2)所述补料培养基的添加速度为2～2.8mL/min。
优选的，步骤(3)所述发酵结束后还包括收集菌体和提取质粒。
有益效果：本发明提供了一种高效生产质粒DNA的发酵培养基，所述发酵培养基可满足高密度发酵的需要，并提高质粒DNA的产量。利用所述发酵培养基对大肠杆菌进行发酵生产时，质粒平均产量可达181mg/L，能够缩小生物反应器的体积，提高下游纯化的质粒DNA纯度，还可以缩短生产周期、减少设备投资，从而减低生产成本，达到提高生产效率的目的。
附图说明
图1为基础培养基配方1菌种生长及质粒增长曲线图；
图2为基础培养基配方2菌种生长及质粒增长曲线图；
图3为补料培养基配方A菌种生长及质粒增长曲线图；
图4为补料培养基配方B菌种生长及质粒增长曲线图。
具体实施方式
本发明提供了一种高效生产质粒DNA的发酵培养基，所述发酵培养基包括独立包装的发酵基础培养基和补料培养基；
每4000mL所述发酵基础培养基包括以下原料：酵母提取物48g、大豆蛋白胨96g、甘油32g、氯化钠16g、七水合硫酸镁2.5g、氯化钙2g、硫酸铵2.5g、硫胺素2g、亮氨酸5g、脯氨酸3g、微量元素液10mL和磷酸盐溶液200mL；
每500mL所述补料培养基包括以下原料：甘油94g、酵母提取物56g、大豆蛋白胨32g、氯化铵20g、亮氨酸8g、脯氨酸8g和七水合硫酸镁2g。
本发明所述发酵培养基通过对基础培养基和补料培养基的配方的改进，优化了培养基中试剂的用量及成分，使菌体能够进行高密度发酵。
本发明所述微量元素液优选包括以下浓度的原料：七水合硫酸亚铁20g/L、七水合硫酸锌2g/L、六水合氯化钴2g/L、二水钼酸钠2g/L、无水氯化钙0.76g/L、无水硫酸铜1.27g/L、一水合硫酸锰1.6g/L、硼酸0.5g/L和36％～38％(v/v)的盐酸3mL/L。
本发明还提供了上述发酵培养基的制备方法，每4000mL所述发酵基础培养基的制备方法，包括：将所述酵母提取物、大豆蛋白胨、甘油、氯化钠、七水合硫酸镁、氯化钙、硫酸铵、硫胺素、亮氨酸和脯氨酸与水混合至3700mL进行灭菌，与10mL微量元素液、200mL磷酸盐溶液和90mL预混溶液混合，得发酵基础培养基；所述预混溶液的溶质包括硫胺素、亮氨酸和脯氨酸；
每500mL所述补料培养基的制备方法，包括将甘油、酵母提取物、大豆蛋白胨、氯化铵、七水合硫酸镁和水按比例混合至450mL，灭菌后与50mL经0.22μm过滤的亮氨酸和脯氨酸混合溶液混合，得所述补料培养基。
本发明所述预混溶液的制备方法，优选包括：将硫胺素、亮氨酸和脯氨酸单独或混合溶解后，利用0.22μm滤膜过滤，收集滤液，得所述预混溶液。本发明所述灭菌优选为121℃高压灭菌，所述灭菌的时间优选为30min。
本发明在制备所述补料培养基时，所述灭菌优选与上述相同，在此不再赘述。
本发明还提供了上述发酵培养基在高效发酵生产质粒DNA中的应用。
本发明所述质粒DNA优选来源于大肠杆菌，包括大肠杆菌的野生菌株、变异菌株或重组菌株。
本发明还提供了一种高效发酵生产质粒DNA的方法，包括以下步骤：
(1)将大肠杆菌的二级种子液接种到发酵基础培养基上，进行有氧发酵，控制发酵过程中pH值为6.9～7.0；
(2)待发酵至OD600为11～13时，添加补料培养基；
(3)待发酵至OD600为15～20时，提高培养温度至42℃，培养至发酵结束。
本发明将大肠杆菌的二级种子液接种到发酵基础培养基上，进行有氧发酵，控制发酵过程中pH值为6.9～7.0。本发明所述二级种子液的制备方法优选包括将冻存的菌液活化、活化后的菌液接种含有氨苄的LB液体培养基中得一级种子液，一级种子液接种到含有氨苄的LB液体培养基中得二级种子液。
本发明所述菌液活化优选包括将冻存的菌液在含有氨苄的LB培养基上划线，倒置于培养箱中，37℃培养过夜。本发明优选挑取LB固体平板上的单克隆，接种于5mL具有氨苄抗性的LB液体培养基，37℃220rpm振荡培养6～10h，得到一级种子液。本发明在得到所述一级种子液后，优选取一级种子液400μL接种于400mL具有氨苄抗性的LB液体培养基，37℃220rpm振荡培养14～18h，得所述二级种子液。在本发明中，所述LB培养基中氨苄的浓度优选为50μg/mL。
本发明将所述二级种子液接种接种到发酵基础培养基上，进行有氧发酵，所述接种的接种量(v/v)优选为5～10％。本发明所述有氧发酵时，优选控制溶氧的体积含量为30～40％，如在本发明实施例中，所述有氧发酵在发酵罐中进行，并设置如下发酵初始参数：罐内压力：≤0.02Mpa；温度设定：37.0℃±1℃，pH控制范围：6.90～7.10；转速：300～900rpm；空气通气量：1～8L/min。本发明在进行所述有氧发酵过程中，当转速和通气量不足以维持溶氧在40％时，可通入氧气。
本发明进行所述有氧发酵后，待发酵至OD600为11～13时，添加补料培养基。本发明所述补料培养基的添加速度优选为2～2.8mL/min，直至补料培养基耗尽。在本发明中，当所述发酵基础培养基为4000mL时，对应的补料培养基的体积优选为500mL。
待发酵培养至0D600为15～20时，本发明提高培养温度至42℃，培养至发酵结束。本发明在所述发酵结束后优选还包括收集菌体和提取质粒，且本发明对所述菌体的收集和质粒的提取方法并没有特殊限定，利用本领域的常规方法进行即可。
下面结合实施例对本发明提供的种高效生产质粒DNA的发酵培养基和发酵生产方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1、菌种活化：取5μL冻存的stbl3重组菌株菌液(本实验中所用的菌为重组菌，是将目的质粒转化到stbl3感受态细胞中)划线氨苄抗性的LB固体平板，倒置于培养箱中，37℃培养过夜。
2、一级种子液制备：挑取LB固体平板上的单克隆，接种于5mL具有氨苄抗性的LB液体培养基，37℃220rpm振荡培养7.5h。
3、二级种子液制备：取一级种子液400μL接种于400mL具有氨苄抗性的LB液体培养基，37℃220rpm振荡培养16h，用于后续发酵。
4、发酵pH调控溶液
磷酸溶液稀释到15％(wt)；氨水溶液稀释到浓度为5％(v/v)，使用0.22μm过滤除菌。用于发酵过程中的pH的调控。
5、微量元素溶液：
七水合硫酸亚铁20g/L，七水合硫酸锌2g/L，六水合氯化钴2g/L，二水钼酸钠2g/L，无水氯化钙0.76g/L，无水硫酸铜1.27g/L，一水合硫酸锰1.6g/L，硼酸0.5g/L，36％～38％(v/v)的盐酸3mL/L，0.22μm过滤除菌。
6、发酵培养
(1)将发酵培养基使用氨水或磷酸调节pH至7.0，将二级种子液按照5％的接种比例接种到发酵罐中，开始发酵培养。
(2)发酵初始参数设置：罐内压力：≤0.02Mpa；温度设定：37.0℃，pH控制：7.0；转速：300rpm；空气通气量：3L/min；以接种完毕为培养开始时间，监测发酵过程中的温度、pH、转速、溶氧。
7、不同发酵基础培养基的对比
(1)磷酸盐溶液：
磷酸氢二钾28g，磷酸二氢钾8g，用适量纯化水溶解后定容至200mL，121℃、30min进行高压灭菌。
(2)发酵基础培养基配方：
基础培养基配方1：酵母提取物48g，大豆蛋白胨72g，甘油16g，氯化钠8g，七水硫酸镁2.5g，氯化钙2g，硫酸铵2.5g，硫胺素2g。上述除硫胺素外的成分用纯化水溶解，定容至3700mL，121℃、30min进行高压灭菌；硫胺素需溶解在90mL水中后经0.22μm滤膜过滤，与200mL磷酸盐和10mL微量元素依次加入。
基础培养基配方2：酵母提取物48g，大豆蛋白胨96g，甘油32g，氯化钠16g，七水硫酸镁2.5g，氯化钙2g，硫酸铵2.5g，硫胺素2g，亮氨酸5g，脯氨酸3g。上述除硫氨酸、亮氨酸和脯氨酸外的所有成分用纯化水溶解，定容至3700mL，121℃、30min进行高压灭菌；
硫胺素、亮氨酸和脯氨酸配制成90mL溶液后经0.22μm滤膜过滤后，与200mL磷酸盐和10mL微量元素依次加入。
(3)发酵过程控制
发酵过程中溶氧控制在40％左右；发酵过程中使用稀释的磷酸和氨水调节pH在6.9～7.0；当发酵OD600至9.2时，培养温度由37℃调整至42℃，培养至发酵结束。
低温条件下10000rpm离心30min收集菌体并使用天根质粒小提试剂盒提取质粒，菌种生长及质粒增长曲线图如图1～2和表1所示，利用配方2的基础培养基可在相同时间内获得更高的质粒产量。
表1不同基础培养基对重组菌发酵结果比对
/ 基础培养基1实验 基础培养基2实验
OD<sub>600</sub>值 16.9 20.7
收获菌体量(湿重) 155g 201g
质粒总产量 173mg 241mg
质粒平均产量 43.3mg/L 60.3mg/L
8、不同补料培养基对比
(1)发酵基础培养基：基础培养基配方2。
(2)补料培养基：
补料培养基A：甘油94g，酵母提取物56g，大豆蛋白胨32g，氯化铵20g，七水硫酸镁2g，定容至450mL，121℃、30min进行高压灭菌；
亮氨酸8g和脯氨酸8g溶解于50mL水中，经0.22μm滤膜过滤，加入灭菌后的发酵基础培养基中。
补料培养基B：甘油94g/L，酵母提取物56g，大豆蛋白胨64g，定容至500mL，121℃、30min进行高压灭菌。
(4)发酵过程控制
发酵过程中溶氧控制在40％左右，当转速和通气量不足以维持溶氧在40％左右时，可通入氧气；发酵过程中使用稀释的磷酸和氨水调节pH在6.9～7.0；当OD600处于11～13开始以2.8mL/min的速度流加补料培养基，直至500mL补料培养基用尽；当发酵OD600至15～20时，培养温度由37℃调整至42℃，培养至发酵结束。
利用与发酵基础培养基对比中相同的方法，收集菌体并提取质粒。结果如图3～4和表2所示，补料培养基A可显著提高菌体量和质粒提取量。
表2不同补料培养基对重组菌发酵结果比对
Figure BDA0003393969020000071
Figure BDA0003393969020000081
实施例2
1、发酵培养
(1)基础培养基：酵母提取物48g，大豆蛋白胨96g，甘油32g，氯化钠16g，七水硫酸镁2.5g，氯化钙2g，硫酸铵2.5g，硫胺素2g，亮氨酸5g，脯氨酸3g。上述成分用纯化水溶解，定容至3700mL，121℃、30min进行高压灭菌；
硫胺素、亮氨酸和脯氨酸配制成90mL溶液后经0.22μm滤膜过滤，而后与200mL磷酸盐溶液和10mL微量元素溶液依次加入。
(2)补料培养基：甘油94g，酵母提取物56g，大豆蛋白胨32g，氯化铵20g，亮氨酸8g，脯氨酸8g，七水硫酸镁2g，定容至450mL，121℃、30min进行高压灭菌；
亮氨酸8g和脯氨酸8g溶解于50mL水中，经0.22μm滤膜过滤，加入灭菌后的发酵基础培养基中。
(3)发酵过程控制
菌种活化、一级种子液制备、二级种子液制备和发酵条件同实施例1。发酵过程中溶氧控制在40％左右，当转速和通气量不足以维持溶氧在40％左右时，可通入氧气；发酵过程中使用稀释的磷酸和氨水调节pH在6.9～7.0；当OD600处于11.9开始以2.8mL/min的速度流加补料培养基，直至500mL补料培养基用尽；当发酵OD600至15.6时，培养温度由37℃调整至42℃，培养至发酵结束。
(4)结果：发酵结束后，收获菌体(湿重)429g，质粒总产量为813mg，质粒平均产量181mg/L。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种高效生产质粒DNA的发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基包括独立包装的发酵基础培养基和补料培养基；
每4000mL所述发酵基础培养基包括以下原料：酵母提取物48g、大豆蛋白胨96g、甘油32g、氯化钠16g、七水合硫酸镁2.5g、氯化钙2g、硫酸铵2.5g、硫胺素2g、亮氨酸5g、脯氨酸3g、微量元素液10mL和磷酸盐溶液200mL；
每500mL所述补料培养基包括以下原料：甘油94g、酵母提取物56g、大豆蛋白胨32g、氯化铵20g、亮氨酸8g、脯氨酸8g和七水合硫酸镁2g。
2.根据权利要求1所述发酵培养基，其特征在于，所述微量元素液包括以下浓度的原料：七水合硫酸亚铁20g/L、七水合硫酸锌2g/L、六水合氯化钴2g/L、二水钼酸钠2g/L、无水氯化钙0.76g/L、无水硫酸铜1.27g/L、一水合硫酸锰1.6g/L、硼酸0.5g/L和体积百分含量为36％～38％的盐酸3mL/L。
3.权利要求1或2所述发酵培养基的制备方法，其特征在于，每4000mL所述发酵基础培养基的制备方法，包括：将所述酵母提取物、大豆蛋白胨、甘油、氯化钠、七水合硫酸镁、氯化钙、硫酸铵与水混合至3700mL进行灭菌，与10mL微量元素液、200mL磷酸盐溶液和90mL预混溶液混合，得发酵基础培养基；所述预混溶液的溶质包括硫胺素、亮氨酸和脯氨酸；
每500mL所述补料培养基的制备方法，包括将甘油、酵母提取物、大豆蛋白胨、氯化铵、七水合硫酸镁和水按比例混合至450mL，灭菌后与50mL经0.22μm过滤的亮氨酸和脯氨酸混合溶液混合，得所述补料培养基。
4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述预混溶液的制备方法包括：将硫胺素、亮氨酸和脯氨酸单独或混合溶解后，利用0.22μm滤膜过滤，收集滤液，得所述预混溶液。
5.权利要求1或2所述发酵培养基在高效发酵生产质粒DNA中的应用。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述质粒DNA来源于重组大肠杆菌。
7.一种高效发酵生产质粒DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将大肠杆菌的二级种子液接种到权利要求1或2中的发酵基础培养基上，进行有氧发酵，控制发酵过程中pH值为6.9～7.0；
(2)待发酵至OD600为11～13时，添加权利要求1或2中的补料培养基；
(3)待发酵至OD600为15～20时，提高培养温度至42℃，培养至发酵结束。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，步骤(1)所述有氧发酵时，控制溶氧的体积含量为30～40％。
9.根据权利要求7所述方法，其特征在于，步骤(2)所述补料培养基的添加速度为2～2.8mL/min。
10.根据权利要求7所述方法，其特征在于，步骤(3)所述发酵结束后还包括收集菌体和提取质粒。
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