JP2024088949A

JP2024088949A - 生体高分子溶液のろ過方法

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Publication number: JP2024088949A
Application number: JP2022204010A
Authority: JP
Inventors: 裕一朗森; 英高吉本; 賢司小田
Original assignee: KM Biologics Co Ltd
Current assignee: KM Biologics Co Ltd
Priority date: 2022-12-21
Filing date: 2022-12-21
Publication date: 2024-07-03

Abstract

【課題】本発明は、生体高分子溶液を１５ｎｍウイルス除去膜でろ過する際に、効率よくウイルス除去膜でろ過する方法を提供することを目的とする。【解決手段】生体高分子溶液を孔径約２０ｎｍのウイルス除去フィルターで処理する工程と、得られたろ液を孔径約１５ｎｍのウイルス除去フィルターで処理する工程を含む、生体高分子のろ過方法であって、ここで該生体高分子のろ過量が孔径約２０ｎｍまたは孔径約１５ｎｍのフィルター膜面積当たり２０ｋｇ／ｍ２以上である、ろ過方法を提供する。【選択図】図１

Description

本発明は、生体高分子溶液を孔径約２０ｎｍのウイルス除去フィルターで処理する工程と、得られたろ液を孔径約１５ｎｍのウイルス除去フィルターで処理する工程を含む、生体高分子のろ過方法であって、ここで該生体高分子のろ過量が孔径約２０ｎｍまたは孔径約１５ｎｍのフィルター膜面積当たり２０ｋｇ／ｍ^２以上である、ろ過方法に関する。

生物由来原料は、医薬品、医薬部外品、化粧品、医療機器および再生医療等製品に使用されるヒトおよびその他の生物（植物を除く）に由来する原料である。これらが医薬品等の製造に使用される場合には、医薬品等の品質、有効性、安全性を確保するために構ずべき必要な措置が日本では「生物由来原料基準」（非特許文献１：厚生労働省告示第３７号／平成３０年２月２８日制定）で定められている。

生物由来原料は、主に生物の細胞が作り出す天然の高分子であり、生体高分子である。生体高分子は、モノマー単位が共有結合して構成された大きな分子である。構成するモノマーと形成される生体高分子の構造によって、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、および多糖の３つの主要なクラスに分類される。ＲＮＡやＤＮＡなどのポリヌクレオチドは、１３個以上のヌクレオチドモノマーで構成される長い高分子である。ポリペプチドはアミノ酸の重合体であり、インスリンなどの小さな分子からコラーゲン、アクチン、フィブリノーゲンなど大きなタンパク質まで多様である。多糖は直鎖状または分岐状の高分子炭水化物のことで、たとえばデンプン、セルロース、アルギン酸が含まれる。生体高分子の別の例としては、天然ゴム（イソプレンの高分子）、スベリンとリグニン（ポリフェノールの複合高分子）、クチンやクタン（長鎖脂肪酸の複合高分子）、メラニンなどがある。

これら生物由来原料は、生物に由来する生体高分子であるため、ウイルス等病原体感染のリスクを有している。このため、ヒト血漿からタンパク質が精製されて使用される血漿分画製剤や、ウシ血清等を添加して培養発現された生体高分子を有効成分とする生物学的製剤においては、原料由来または製造工程由来のウイルス等の感染性因子の混入が懸念され、製造過程においてウイルスを不活化または除去する工程、すなわちウイルス不活化・除去工程がその安全性の観点から非常に重要である。またウイルス不活化・除去の対象となる感染性因子はウイルスに限定されない。タンパク質性の感染性因子プリオンの伝播によるクロイツフェルトヤコブ病などの例も知られている。以上のように、生物由来の高分子溶液は種々のウイルス等の感染性因子を含む可能性がある。したがって、これらを原料とした製品の製造に際しては、ウイルス等を十分に不活化・除去する工程を組み込むことが必須である。

これらウイルスを不活化する方法としては、熱処理法、有機溶媒／界面活性剤処理（Ｓ／Ｄ処理）法、化学物質処理法、ｐＨ処理法、照射法、光増感剤＋ＵＶ処理法がある（非特許文献２：バイオ医薬品ハンドブック第４版、２０２０年、株式会社じほう）。しかし、これらいずれの方法も一長一短があり、単独の方法での各種ウイルスの完全不活化または完全除去は難しく、またこれらの方法では製品中の生体高分子そのものを変質させる可能性もある。ゆえに、複数のウイルス不活化・除去の方法を組み合わせて用いることが有効であると考えられている。

これらウイルスを除去する方法は、生体高分子の化学的な変質を伴わずに物理的にウイルスを除去するものであり、沈殿法、クロマトグラフィー法、ろ過法によるウイルスの除去／分離方法がある（非特許文献２：バイオ医薬品ハンドブック第４版、２０２０年、株式会社じほう）。この中で、近年最も堅牢なウイルス除去技術とされているのが、ウイルス除去膜によるろ過法である。ウイルス除去膜は、ろ過膜の素材として、セルロースのような天然素材よりなる膜、あるいはポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリスルホン（ＰＳＵ）またはポリエチレン（ＰＥ）のような合成高分子素材よりなる膜が知られている。

ウイルス除去膜によるろ過法では、生体高分子溶液中の生体高分子の分子量が小さい場合、ウイルスは透過できないが、その生体高分子は透過できるようなサイズの孔径を有するウイルス除去膜が用いられる。ウイルス除去膜ろ過は、除去膜の孔径よりも大きなサイズを有するウイルス等病原体を製造工程で製品から排除するものである。しかしながら、生体高分子溶液からの膜によるウイルス等の病原体除去における大きな問題の一つは、ウイルス除去膜が目詰まりを起こして、ろ過が困難になるか、不能になる点である。ウイルス除去膜の孔径はメーカーや規格毎に異なり、１０～７０ｎｍの大きさを有する。一方、ろ過において除去膜の孔を通液させたい生体高分子の例として、タンパク質を対象とする場合は、その分子量は１０～数１０００ｋＤａであり、生体高分子の大きさとしてはウイルス除去膜の孔径と同レベルにある。ウイルス除去膜の孔径は小さければ小さい程より小さいウイルスまでを捕捉して除去できるため、ウイルス除去工程方法としての期待される効果は大であるが、通過させる生体高分子の大きさ次第では、生体高分子とウイルスとの分離は不可能となる。したがって、生体高分子溶液のウイルス除去膜ろ過においては、通過させたい生体高分子の大きさを考慮して、使用する除去膜の孔径を選択する必要がある。また、適切な孔径の除去膜を選定したとしても、その目的とする生体高分子溶液中に存在する微量の凝集体や夾雑する別の生体高分子がウイルス除去膜の孔を通過できずに孔を塞いでしまい、ウイルス除去膜の目詰まり、ひいてはろ過の障害を引き起こす。特に、小孔径（１０～２０ｎｍ）のウイルス除去膜のろ過においては、孔を通過できる生体高分子の大きさは小さくなり、ろ過液中に含まれる生体高分子の種類と量次第では、この目詰まり防止が課題となる。

ウイルス除去膜を装填したウイルス除去フィルター装置によるウイルス含有溶液のろ過は、短時間でより多くの量の生体高分子溶液をろ過でき、かつ十分に高いウイルス除去性能を発揮できることが望ましい。短時間でより多くの量の生体高分子溶液を処理するためには、一般にウイルス含有溶液のろ過をできるかぎり高流速下または高圧力下で行うことになる。このような高圧力下でのろ過を続けると、膜の内部にろ液に含まれるべき生体高分子が残留して除去膜細孔の閉塞に向かう場合がある。また、近年では生体高分子の一種であるタンパク質性の製品である、タンパク質を有効成分とした医薬品中のタンパク質濃度は高くなる傾向にあり、それに伴いウイルスを除去するためのウイルス除去膜ろ過工程においてはウイルス除去膜ろ過に供するタンパク質の濃度を高くする方が製造工程上は有利である。高濃度のタンパク質溶液を小孔径ウイルス除去膜でろ過する場合、特に膜の内部へのタンパク質残留によるウイルス除去膜の目詰まりの発生が顕著となるため、高い圧力でのろ過は不都合となる場合がある。

近年最も堅牢な技術と位置付けられているこのウイルス除去膜ろ過において、極端な圧力条件がウイルス除去膜ろ過後のウイルスの検出性、すなわち、ウイルスの漏出に影響を与えうる例が報告されている。上述のように、ウイルス除去膜ろ過における膜間差圧（ＴＭＰ）が高い場合はウイルス除去膜ろ過におけるワーストケースの一つとして例示されている（非特許文献２：バイオ医薬品ハンドブック第４版、２０２０年、株式会社じほう）。

別の知見として、このＴＭＰが低い場合や一時的な圧力開放に続く再加圧直後のろ液に、一過性にウイルス粒子が検出されることが、特に小型のパルボウイルスやバクテリオファージを負荷したろ過実験系で観察されることが示されている。この現象の原因はろ過液流によりブラウン運動が抑制されウイルス除去膜内に捕捉されていたウイルス粒子が、圧力がなくなることでブラウン運動を再開してウイルス除去膜壁から離れ、次の加圧時に粒子径より大きな穴を通り膜外部に流れ出るためと考えられている。本現象は特定のウイルス除去膜に特有の現象ではなく、一般的なものである。（非特許文献２：バイオ医薬品ハンドブック第４版、２０２０年、株式会社じほう）

さらに別の知見として、マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）のような非エンベロープウイルスを一例とする小径ウイルスまたは小径ウイルス様粒子は、ウイルス除去膜への負荷量が多くなるとウイルス除去膜は目詰まりすることなく、当該ウイルスを漏出しうることが報告されている（非特許文献３：ＫａｙｕｋａｗａＴ, ＹａｎａｇｉｂａｓｈｉＡ, Ｈｏｎｇｏ－ＨｉｒａｓａｋｉＴ, ＹａｎａｇｉｄａＫ. Ｐａｒｔｉｃｌｅ－ｂａｓｅｄａｎａｌｙｓｉｓｅｌｕｃｉｄａｔｅｓｔｈｅｒｅａｌｒｅｔｅｎｔｉｏｎｃａｐａｃｉｔｉｅｓｏｆｖｉｒｕｓｆｉｌｔｅｒｓａｎｄｅｎａｂｌｅｓｏｐｔｉｍａｌｖｉｒｕｓｃｌｅａｒａｎｃｅｓｔｕｄｙｄｅｓｉｇｎｗｉｔｈｅｖａｌｕａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｓｏｆｄｉｖｅｒｓｅｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ. ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＰｒｏｇ. ２０２２Ｍａｒ;３８（２）:ｅ３２３７．）。

したがって、ウイルスと同程度の大きさの分子がウイルス除去膜によってろ過される生体高分子試料溶液中にどれだけ存在するかにより、小径ウイルスの漏出に影響することが考えられる。ゆえに、このウイルスと同程度の大きさの分子はウイルスに限定されるものでなく、生体高分子やその凝集物、あるいはその他の種類の生体高分子の共存とその量がウイルスの漏出に影響する可能性がある。

そのため、ウイルス除去膜によるろ過は、ろ過する生体高分子の大きさ、特性および供試量並びに夾雑しうる感染性物質の大きさ、特性および存在量等を踏まえた事前の適正なウイルス除去膜ろ過の条件設定が必要である。

ウイルス除去膜ろ過工程によるウイルス除去能への影響は、実際の工程を模したウイルスクリアランス試験を行うことで予想可能である。

ウイルスクリアランス試験は、例えばバイオテクノロジーを応用した医薬品の安全性を管理するためにプロセス開発時や医薬品の承認申請時に必要なウイルス不活化・除去能力を評価する試験であり、「ヒト又は動物細胞株を用いて製造されるバイオテクノロジー応用医薬品のウイルス安全性評価（ＩＣＨ－Ｑ５Ａ）」（非特許文献４）に示されているように、ウイルス不活化・除去工程におけるウイルスの不活化・除去能力を製造システムのスケールダウン系において定量的に評価するものである。

また、日本においては、血漿分画製剤に対して「血漿分画製剤のウイルスに対する安全性確保に関するガイドライン」（非特許文献５）があり、原料血漿に存在する可能性のある既知のウイルスおよび未知のウイルスを、製造工程で効果的に除去および不活化できることを検証または推測するためにウイルス・プロセスバリデーション試験と称するウイルクリアランス試験が求められている。

ウイルス不活化・除去工程のウイルスクリアランス試験により得られるウイルスクリアランス指数は、ウイルス不活化・除去工程によるウイルス減少値を一般的には対数値で表示される。例えば、「血漿分画製剤のウイルスに対する安全性確保に関するガイドライン」（非特許文献５）において、ウイルスクリアランス指数Ｒは次式で示される。
Ｒ＝ｌｏｇ（（Ｖ１×Ｔ１）／（Ｖ２×Ｔ２））
ここで、Ｒは対数で表される減少度、Ｖ１は工程処理前の試料の容量、Ｔ１は工程処理前の試料のウイルス力価、Ｖ２は工程処理後の試料の容量、Ｔ２は工程処理後の試料のウイルス力価である。
対数除去率であるウイルスクリアランス指数は、ＲＦ（リダクションファクター）やＬＲＶ（ｌｏｇｒｅｄｕｃｔｉｏｎｖａｌｕｅ、対数減少値）とも称される。
本明細書において、ウイルスクリアランス指数は数値で示すが、原文からの引用では数字とｌｏｇを合わせた表記（例えば、「４ｌｏｇ」）を用いることがある。

この「血漿分画製剤のウイルスに対する安全性確保に関するガイドライン」の改正案（非特許文献６）には、「頑健性の高い工程」として、４ｌｏｇ以上のウイルスクリアランス能のあるウイルス不活化・除去工程を想定し、非常に高いウイルスクリアランス能のある工程を意味する目標値であることがその「用語」の項に記載されている。また、非特許文献７（小田昌宏、寺野剛、岡村元義、川俣治、新井健史、小澤貞雄、小杉公彦、洪苑起、高橋英晴、築山美奈、佐藤哲男、大場徹也、ウイルスクリアランス試験の課題と事例検討―総ウイルスクリアランス指数（ＬＲＶ）をどこまで追求するかー、ＰＤＡＪｏｕｒｎａｌｏｆＧＭＰａｎｄＶａｌｉｄａｔｉｏｎｉｎＪａｐａｎ、２００５７（１）：４４－５４）には２００５年の時点において、「目標値としての達成すべきＬＲＶを４程度」と示されており、ウイルス不活化・除去の一工程におけるウイルスクリアランス指数の目標値としては長年にわたってコンセンサスが得られているものと考えられる。

ウイルス除去膜の中で、非エンベロープウイルスのような小径ウイルスまでを除去対象としたウイルス除去フィルターとしては、例えば、プラノバ（商標）１５Ｎ（旭化成）、プラノバ（商標）２０Ｎ（旭化成）、プラノバ（商標）Ｂｉｏ－ＥＸ（旭化成）、ウルチポアＶＦ－ＤＶ２０（ポール）、バイアソルブＮＦＰ（ミリポア）等の製品名で市販されている。ウイルス除去フィルターの型としては中空糸型やプリーツ型、平膜型などがある。

このうち、中空糸膜フィルターとして市販されているプラノバ（商標）では、タンパク質溶液がこの中空糸内部に導入され、大きな空洞状のボイド孔や細長いキャピラリー孔が三次元的に結合した網目状の構造をした膜中を通過してろ過される。中空糸の膜厚が数十マイクロメーターの重層した孔構造を有し、ウイルスは膜内で段階的に効率よく捕捉・除去されるが、タンパク質は吸着や失活を最小限に抑えたまま膜を通過することが説明されている。そして、フィルターカートリッジ容器の基本構造は変わらず、サイズによって中空糸の本数が増減されるだけなので、開発段階の実験から製造まで安定したスケールアップが可能とされる。（プラノバフィルターカタログ、旭化成メディカル株式会社バイオプロセス事業部、ＴＡＥ３１００２Ｊ－４．１：非特許文献８）

ウイルス除去膜であるプラノバ（商標）のウイルスクリアランス指数はウイルス粒子の大きさに比例して高くなる。小径の非エンベロープウイルスの一つとして知られているＰＰＶ（ブタパルボウイルス、サイズ１８～２４ｎｍ）のウイルスクリアランス指数は、プラノバ（商標）３５Ｎ（平均孔径３５±２ｎｍ）では１．０未満であるが、プラノバ（商標）２０Ｎ（平均孔径１９±２ｎｍ）やプラノバ（商標）１５Ｎ（平均孔径１５±２ｎｍ）では４．０以上である。これは、このウイルス除去膜ろ過が吸着などの物理化学的な性質に左右されず、サイズ排除（大きさによる篩い分け）のろ過原理によってウイルスを除去分離するためであることが示されている。さらに、ウイルスの大きさがウイルス除去膜の孔の条件を満たす限り、未知のウイルスが混入していようとも除去することが可能であることが示されている。（プラノバフィルターカタログ、旭化成メディカル株式会社バイオプロセス事業部、ＴＡＥ３１００２Ｊ－４．１：非特許文献８）
そして、ウイルス除去膜の価格は一般的に孔径の大きさに反比例して高くなっている。

非特許文献９（モダンメディア．２０１３５９（９）：２３１－２３７）には、孔径１５ｎｍのウイルス除去膜を用いたプリオンタンパク質溶液のろ過により、微粒子となった異常型プリオンタンパク質に対して、一定の除去効果（３．５ｌｏｇ以上のクリアランス指数）を発揮し、感染リスクの低減に有用であることが示されている。

したがって、生体高分子溶液のウイルス除去膜ろ過においては、その生体高分子のろ過性を確認しつつ、できるだけ孔径の小さいウイルス除去膜でろ過することがパルボウイルスのような既知の非エンベロープウイルスのような小径ウイルスの除去のみならず、未知のウイルス等の病原体除去の観点からも有用と考えられる。

生体高分子の一種である血清アルブミンは分子量６．６万Ｄａのタンパク質で、５８５個のアミノ酸からなる分子である。血清アルブミンは全タンパク質中の約６割を占める血漿中に最も多く含まれるタンパク質であって、生体内では肝臓で合成される。そして、血液中で血漿膠質浸透圧の維持、毒物の中和や酸塩基平衡の維持に関与しており、また多くの薬物や化合物と非特異的に結合し、それらを運搬する役割を担う。上記アルブミンを製剤化したアルブミン製剤は、火傷、ネフローゼ症候群等によるアルブミン喪失およびアルブミン合成能低下による低アルブミン血症、出血性ショックなどの治療に用いられている。アルブミン製剤は、タンパク質濃度が４．４～２５％という高濃度のタンパク質製剤である。また、製剤１本あたりの容量も２０～２５０ｍＬと大量であり、その製造においては大容量かつ大量のタンパク質を短時間で処理することが求められる。

アルブミン製剤の製造工程は他の血漿タンパク質製剤に比べて、処理すベきタンパク質量が膨大であることから、ウイルス除去膜ろ過を導入する場合には、製造工程中のどの工程段階でろ過するか、いかなる組成、性状のアルブミン含有水溶液をろ過するかがウイルス除去膜導入のポイントとして考慮され得る。また、ウイルス除去膜の使用数量、ろ過面積およびそれに要するコストの面も条件設定のポイントとして挙げられる。つまり、ウイルス除去膜ろ過工程導入にあたっては、高価なウイルス除去膜の使用数量をできるだけ少なく抑えることができる条件を見出すことが、工業的な応用には重要である。通常、アルブミン製剤の製造工程で導入されるウイルス除去膜の孔径は、その分子量の大きさに基づくろ過性から、約１５ｎｍまたは約２０ｎｍである。

アルブミン製剤のウイルス除去膜ろ過に関しては、いくつかの報告がある。特許文献１（特開平０６－２７９２９６）では、ヒト血清アルブミンを１５ｎｍ、３５ｎｍ、４０ｎｍ、７５ｎｍの４種ウイルス除去膜でろ過した例が記載されている。また、特許文献２（ＷＯ２００４／０８９４０２）では、ヒト血清アルブミン含有水溶液を１５ｎｍのウイルス除去膜でろ過する前に、陰イオン交換体およびプレフィルターにより処理することから成る前処理に関する報告がある。さらに、特許文献３（特表２００７－５３５４９５）では、１５ｇ／Ｌ～８０ｇ／Ｌの濃度および９～１１．５の範囲のｐＨを有するアルブミン水溶液を１５℃～５５℃の温度範囲におけるウイルス除去膜に供する工程を含むアルブミンを精製するための方法が開示されている。その実施例２には、ウイルス除去膜として、孔径１５ｎｍのフィルターを用い、膜面積当たりのろ過量が０．５および１ｋｇ／ｍ^２のろ過例が示されている。次に、実施例３および実施例４では膜面積当たりの同ろ過量が４ｋｇ／ｍ^２のろ過例が示されている。さらに、実施例５および実施例６では最大の膜面積当たりのろ過量として８ｋｇ／ｍ^２のろ過例が示されている。このようなアルブミン製剤におけるウイルス除去膜ろ過において、孔径１５ｎｍのウイルス除去膜ろ過にプレフィルターを設けることも試みられている。しかしながら、孔径２０ｎｍ以下のフィルターをプレフィルターのように使用した例はない。

他方で、非特許文献１０（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ．２０１２．４０（６）：４７３－４８１）では、タンパク質であるホロトランスフェリンのウイルス除去膜ろ過において、孔径１５ｎｍまたは孔径２０ｎｍをそれぞれ単独で使用、あるいは、孔径１５ｎｍまたは孔径２０ｎｍをそれぞれ膜面積比を変えて連結した場合のウイルスクリアランス指数が示されており、同孔径のフィルターを連結してろ過することによってウイルスクリアランス指数が増加する例が示されている。また、タンパク質アポトランスフェリンやＣ１－インヒビターを連結したウイルス除去膜フィルターによってろ過した例も示されている。さらに、タンパク質プロトロンビン複合体濃縮（ＰＣＣ）製剤では、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ，１８－２６ｎｍ）を用いた孔径１５ｎｍまたは孔径２０ｎｍのウイルス除去膜を連結した例も示されている。しかしながら、そのフィルター膜面積当たりの負荷量は明らかではないが、使用した孔径１５ｎｍまたは孔径２０ｎｍのウイルス除去膜は、膜面積が０．００１ｍ^２または０．０１ｍ^２と示されており、ＰＣＣ製剤は２０ｇ／Ｌを２００ｍＬまたは４０ｇ／Ｌを１００ｍＬろ過している。したがって、これらのフィルター膜面積当たりのタンパク質負荷量は、最大４ｋｇ／ｍ^２と見積もることができる。

このように生体高分子を孔径１５ｎｍのウイルス除去膜でろ過する先行例はあるものの、十分な生体高分子の負荷量と小径ウイルスの除去能を達成するには、なお課題が存在していた。

特開平０６－２７９２９６ＷＯ２００４／０８９４０２特表２００７－５３５４９５

平成３０年２月２８日制定厚生労働省告示第３７号、生物由来原料基準バイオ医薬品ハンドブック第４版、２０２０年、株式会社じほうＫａｙｕｋａｗａＴ, ＹａｎａｇｉｂａｓｈｉＡ, Ｈｏｎｇｏ－ＨｉｒａｓａｋｉＴ, ＹａｎａｇｉｄａＫ. Ｐａｒｔｉｃｌｅ－ｂａｓｅｄａｎａｌｙｓｉｓｅｌｕｃｉｄａｔｅｓｔｈｅｒｅａｌｒｅｔｅｎｔｉｏｎｃａｐａｃｉｔｉｅｓｏｆｖｉｒｕｓｆｉｌｔｅｒｓａｎｄｅｎａｂｌｅｓｏｐｔｉｍａｌｖｉｒｕｓｃｌｅａｒａｎｃｅｓｔｕｄｙｄｅｓｉｇｎｗｉｔｈｅｖａｌｕａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｓｏｆｄｉｖｅｒｓｅｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ. ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＰｒｏｇ. ２０２２Ｍａｒ;３８（２）:ｅ３２３７. ヒト又は動物細胞株を用いて製造されるバイオテクノロジー応用医薬品のウイルス安全性評価（ＩＣＨ－Ｑ５Ａ）平成１１年８月３０日付医薬発第１０４７号、血漿分画製剤のウイルスに対する安全性確保に関するガイドライン令和４年３月厚生労働省医薬・生活衛生局血液対策課「血漿分画製剤のウイルスに対する安全性確保に関するガイドラインについて」の一部改正案について小田昌宏、寺野剛、岡村元義、川俣治、新井健史、小澤貞雄、小杉公彦、洪苑起、高橋英晴、築山美奈、佐藤哲男、大場徹也、ウイルスクリアランス試験の課題と事例検討―総ウイルスクリアランス指数（ＬＲＶ）をどこまで追求するかー、ＰＤＡＪｏｕｒｎａｌｏｆＧＭＰａｎｄＶａｌｉｄａｔｉｏｎｉｎＪａｐａｎ、２００５７（１）：４４－５４プラノバフィルターカタログ、旭化成メディカル株式会社バイオプロセス事業部、ＴＡＥ３１００２Ｊ－４．１加藤（森）ゆうこ、柚木幹弘、生田知良、萩原克郎、血液製剤の安全対策―プリオン除去の現状―、モダンメディア．２０１３５９（９）：２３１－２３７ＫｏｅｎｄｅｒｍａｎＡＨ, ｔｅｒＨａｒｔＨＧ, Ｐｒｉｎｓ－ｄｅＮｉｊｓＩＭ, ＢｌｏｅｍＪ, ＳｔｏｆｆｅｒｓＳ, ＫｅｍｐｅｒｓＡ, ＤｅｒｋｓｅｎＧＪ, ＡｌＢ, ＤｅｋｋｅｒＬ, ＯｖｅｒＪ. Ｖｉｒｕｓｓａｆｅｔｙｏｆｐｌａｓｍａｐｒｏｄｕｃｔｓｕｓｉｎｇ２０ｎｍｉｎｓｔｅａｄｏｆ１５ｎｍｆｉｌｔｒａｔｉｏｎａｓｖｉｒｕｓｒｅｍｏｖｉｎｇｓｔｅｐ. Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ. ２０１２Ｎｏｖ;４０（６）:４７３－８１.

本発明は、生体高分子溶液を１５ｎｍウイルス除去膜でろ過する際に、効率よくウイルス除去膜でろ過する方法を提供することを目的とする。

本発明者等は、上記の目的を達成するために検討を重ねた結果、生体高分子溶液を孔径約２０ｎｍのウイルス除去フィルターで処理する工程と、得られたろ液を孔径約１５ｎｍのウイルス除去フィルターで処理する工程を含む、生体高分子のろ過方法であって、ここで該生体高分子のろ過量が孔径約２０ｎｍまたは孔径約１５ｎｍのフィルター膜面積当たり２０ｋｇ／ｍ^２以上である、ろ過方法を見出し、本発明を完成させるに至った。

したがって、本発明には以下の発明が含まれる：
［１］
生体高分子溶液を孔径約２０ｎｍのウイルス除去フィルターで処理する工程と、得られたろ液を孔径約１５ｎｍのウイルス除去フィルターで処理する工程を含む、生体高分子のろ過方法であって、ここで該生体高分子のろ過量が孔径約２０ｎｍまたは孔径約１５ｎｍのフィルター膜面積当たり２０ｋｇ／ｍ^２以上である、ろ過方法。
［２］
前記生体高分子がタンパク質である、［１］に記載のろ過方法。
［３］
前記タンパク質がヒト血清アルブミンである、［２］に記載のろ過方法。
［４］
ウイルスのクリアランス指数が３．５またはそれ以上である、［１］に記載のろ過方法。
［５］
生体高分子のろ過量が孔径約２０ｎｍまたは孔径約１５ｎｍフィルター膜面積当たり４０ｋｇ／ｍ^２以上、または６０ｋｇ／ｍ^２以上である、［１］に記載のろ過方法。
［６］
生体高分子溶液を孔径約２０ｎｍのウイルス除去フィルターで処理する工程と、得られたろ液を孔径約１５ｎｍのウイルス除去フィルターで処理する工程を含む、生体高分子をろ過する工程、および得られた生体高分子を製剤化する工程を含み、ここで該生体高分子のろ過量が孔径約２０ｎｍまたは孔径約１５ｎｍのフィルター膜面積当たり２０ｋｇ／ｍ^２以上である、生体高分子を含む製剤の製造方法。

本発明によれば、生体高分子溶液を孔径約１５ｎｍのウイルス除去フィルターでろ過する際に、効率よくウイルス除去膜でろ過する方法を提供できる。

図１は、ヒト血清アルブミン溶液の小孔径ウイルス除去フィルターによるろ過性を示す。左図はろ過タンパク質の量（ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ、ｋｇ／ｍ^２）の経時変化を示し、右図はろ過タンパク質の流速（ｆｌｕｘ、ｋｇ／ｍ^２／ｈ）の経時変化を示す。Ａは、圧力０．３ｂａｒでプラノバ（商標）１５Ｎにてろ過した結果であり、Ｂは、圧力０．９ｂａｒでプラノバ（商標）１５Ｎにてろ過した結果であり、Ｃは、圧力０．９ｂａｒでプラノバ（商標）２０Ｎにてろ過した結果である。

以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。

１つの態様において、本発明は、生体高分子溶液を孔径約２０ｎｍのウイルス除去膜で処理する工程と、得られたろ液を孔径約１５ｎｍのウイルス除去膜で処理する工程を含む、生体高分子のろ過方法であって、ここで該生体高分子のろ過量が孔径約２０ｎｍまたは孔径約１５ｎｍのウイルス除去膜面積当たり２０ｋｇ／ｍ^２以上である、ろ過方法に関する。

本発明において、生体高分子溶液は、生体高分子を含む水溶液を指す。好ましくは、生体高分子溶液は、孔径約１５ｎｍを通過しうる生体高分子を含む。ろ過において除去膜の孔を通液させたい生体高分子の例として、タンパク質を対象とする場合は、その分子量は、１０ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、４０ｋＤａ、５０ｋＤａ、６０ｋＤａ、７０ｋＤａ、８０ｋＤａ、９０ｋＤａ、１００ｋＤａ、２００ｋＤａ、２５０ｋＤａ、５００ｋＤａ、７５０ｋＤａ、１０００ｋＤａ、１５００ｋＤａ、２０００ｋＤａ、２５００ｋＤａ、３０００ｋＤａ、４０００ｋＤａ、５０００ｋＤａ、６０００ｋＤａ、７０００ｋＤａ、８０００ｋＤａ、９０００ｋＤａ、１００００ｋＤａ以下である。好ましくは、１０～数１０００ｋＤａの間の任意の分子量であり、生体高分子の大きさとしてはウイルス除去膜の孔径と同レベルにある。生体高分子として、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、および多糖を含んでもよい。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡやＤＮＡが挙げられる。ポリペプチドはアミノ酸の重合体であり、インスリンなどの小さな分子からコラーゲン、アクチン、フィブリノーゲンなど大きなタンパク質までを含むがこれらに限定されない。本発明において、好ましくは、生体高分子は、タンパク質である。タンパク質として、顆粒球コロニー刺激因子、インターフェロン、インターロイキン、マクロファージコロニー刺激因子、トロンビン、エリスロポエチン、血液凝固第ＶＩＩ因子、ウロキナーゼ、α１プロテアーゼインヒビター、血液凝固第ＩＸ因子、プロテインＣ、アンチトロンビンＩＩＩ、ヘモグロビン、アルブミン、オステオポンチン、組織プラスミノーゲン活性化因子、Ｃ１インヒビター、セルロプラスミン、モノクローナルｌｇＧ、血液凝固第ＸＩ因子、血漿由来マンノース結合レクチン、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、ヒト免疫グロブリンＧ、フィブリノーゲン、フォンビルブランド因子、または免疫グロブリンＭを含むがこれらに限定されない。さらに好ましくは、タンパク質はアルブミンである。より好ましくは、タンパク質はヒト血清アルブミンである。

本発明において使用されるウイルス除去膜は、サイズ排除（大きさによるふるい分け）のろ過原理によってウイルスを除去分離するためのフィルターを指す。ウイルス除去膜またはウイルス除去フィルターとして、セルロース（例えば、銅アンモニア法再生セルロース）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリスルホン（ＰＳＵ）またはポリエチレン（ＰＥ）等から形成された膜を含み得る。ウイルス除去フィルターとして、例えば、プラノバ（商標）１５Ｎ（旭化成）、プラノバ（商標）２０Ｎ（旭化成）、プラノバ（商標）Ｂｉｏ－ＥＸ（旭化成）、ウルチポアＶＦ－ＤＶ２０（ポール）、バイアソルブＮＦＰ（ミリポア）などが挙げられ、当業者は適宜該当する製品を選択できる。ウイルス除去フィルターの型としては中空糸型やプリーツ型、平膜型などが挙げられる。ウイルス除去フィルターの非限定的な例としては、銅アンモニア再生法セルロース中空糸膜を含む、旭化成メディカル株式会社製プラノバ（商標）の１５Ｎまたは２０Ｎフィルターが挙げられる。例えば、容器内には、中空糸の束が収められており、生体高分子溶液が、中空糸の内部に導かれ、大きな空洞状のボイド孔または細長いキャピラリー孔が三次元的に結合した網目状の構造をした膜中を通過して外に出ていくことにより、ろ過が行われる。このウイルス除去フィルタープラノバ（商標）Ｎシリーズの推奨操作圧力は０．９８ｂａｒ以下である。

本発明において使用されるウイルス除去フィルターは、孔径約１５ｎｍ、または約２０ｎｍを有するフィルターが使用される。フィルターの孔径は平均孔径で示され、「約」という用語の記載により続く数値の±１ｎｍ、±２ｎｍ、または±３ｎｍが孔径の指す範囲内にある。例えば、本発明において、孔径約１５ｎｍのフィルターとしてはプラノバ（商標）の１５Ｎのフィルターを使用でき、孔径約２０ｎｍのフィルターとしてはプラノバ（商標）の２０Ｎのフィルターを使用できる。

ウイルス除去フィルターは、例えば中空糸の本数の増加により、スケールアップが可能となる。ウイルス除去フィルターの膜面積は、約０．０００１、０．０００２、０．０００３、０．０００４、０．０００５、０．０００６、０．０００７、０．０００８、０．０００９、０．００１、０．００２、０．００３、０．００４、０．００５、０．００６、０．００７、０．００８、０．００９、０．０１、０．０１１、０．０１２、０．０１３、０．０１４、０．０１５、０．０１６、０．０１７、０．０１８、０．０１９、０．０２、０．０５、０．１０、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０ｍ^２またはそれ以上であってもよい。好ましくは、ウイルス除去フィルターの膜面積は、約０．０００３、０．００１、０．０１、０．１２、０．３、１．０、４．０ｍ^２である。膜面積を増加させることにより、ろ過の効率が増加し得る。例えば、膜面積を増加させることにより、膜面積当たりの生体高分子溶液の負荷量が減少し、ろ過にかかる時間が短縮し得る。

本発明において、「ろ過量」とは、膜面積当たりのウイルス除去フィルターを通過する生体高分子溶液中の生体高分子の溶質量を指し、ｋｇ／ｍ^２で表される。一実施形態では、ろ過量は、膜面積当たり１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０ｋｇ／ｍ^２またはそれ以上である。ろ過量は、好ましくは、膜面積当たり２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０ｋｇ／ｍ^２またはそれ以上である。

本発明において、ウイルス除去膜ろ過工程によるウイルス除去能への影響は、実際の工程を模したウイルスクリアランス試験を行うことで予想可能である。本発明において、「ウイルスクリアランス指数」とは、ウイルス除去率の対数値である。クリアランス指数は、本明細書において「ＲＦ（リダクションファクター）」としても使用されている場合がある。ウイルスクリアランス指数は、ｌｏｇ（（Ｖ１×Ｔ１）／（Ｖ２×Ｔ２））で表される。ここで、Ｖ１は工程処理前の試料の容量、Ｔ１は工程処理前の試料のウイルス力価、Ｖ２は工程処理後の試料の容量、Ｔ２は工程処理後の試料のウイルス力価である。一実施形態では、ウイルスクリアランス指数は、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０またはそれ以上である。別の実施形態では、クリアランス指数は、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０またはそれ以上である。

本発明において、ウイルスは、エンベロープウイルスであっても非エンベロープウイルスであってもよい。本発明において、ウイルスは、アベルソンマウス白血病ウイルス（Ａ－ＭｕＬＶ）、ヒトパルボウイルスＢ１９（Ｂ１９）、ウシ下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ－１）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）、ポリオウイルス１型（Ｐｏｌｉｏ－１）、ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）、レオウイルス３型（Ｒｅｏ－３）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、または異種指向性マウス白血病ウイルス（ＸＭｕＬＶ）が挙げられる、がこれらに限定されない。

本発明では、ウイルス除去フィルターを用いたろ過工程に先立って前処理工程が行われてもよい。前処理には、イオン交換体による前処理、プレろ過による前処理またはそれらの組み合わせが含まれてもよい。一態様では、プレろ過による前処理が実施されてもよく、本発明の方法の前に、生体高分子溶液を、プレフィルター（除去サイズ３５－２００ｎｍ）に通液し、目詰まりの原因と考えられる３５－２００ｎｍ以上の大きさの粒子をこれに捕捉させることにより除去してもよい。

本発明において、孔径約２０ｎｍのウイルス除去フィルターと、孔径約１５ｎｍのウイルス除去フィルターが連結されていてもよいし、別々に分離されていてもよい。例えば、孔径約２０ｎｍのウイルス除去フィルターで処理する工程と、得られたろ液を孔径約１５ｎｍのウイルス除去フィルターで処理する工程が一連に行われてもよいし、孔径約２０ｎｍのウイルス除去フィルターで処理する工程のあとにろ液が回収され、得られたろ液を孔径約１５ｎｍのウイルス除去フィルターで処理してもよい。一実施形態では、生体高分子溶液を孔径約１５ｎｍのウイルス除去フィルターでろ過する場合に、孔径約１５ｎｍのウイルス除去フィルターの上流に孔径約２０ｎｍのフィルターを設けてもよい。

一実施形態では、ろ過によるウイルスの漏れは、低減されている、または生じない。ウイルスの漏れが低減または生じないことにより、生体高分子溶液のろ液の安全性が高まり、当該ろ液に由来する製品の製造や安全性に有利である場合がある。ウイルスの漏れや除去能は例えば、ウイルスクリアランス指数により確認することができる。

一実施形態では、ろ過フィルターに供する生体高分子溶液中の生体高分子の量は、約２０、３０、４０、５０、６０、７０ｋｇ／ｍ^２以上であるが、これらに限定されない。好ましくは、５０ｋｇ／ｍ^２以上である。

一実施形態では、ろ過フィルターに供する生体高分子溶液中に含まれる生体高分子の濃度は、約０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、８％、１０％であるが、これらに限定されない。好ましくは、１％以上である。

一実施形態では、ろ過フィルターで処理する工程において、圧力は使用するウイルス除去フィルターの膜間差圧（ＴＭＰ）を指し、このＴＭＰは、約０．１０、０．１５、０．２０、０．２５、０．３０、０．３５、０．４０、０．４５、０．５０．０．５５．０．６０、０．６５、０．７０、０．７５、０．８０、０．８５、０．９０、または０．９８ｂａｒである。好ましくは、そのＴＭＰは使用するウイルス除去フィルターの推奨操作圧力の範囲内で実施される。

一実施形態では、ろ過フィルターで処理する工程は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、３７、４０、４５、５０℃またはそれ以上で行われるが、これらに限定されない。好ましくは、室温（１℃～３０℃）である。

一実施形態では、ろ過フィルターで処理する工程において、生体高分子溶液のｐＨは、当業者が目的に応じて適宜設定できる。ろ過フィルターで処理する工程において、生体高分子溶液は、生体高分子の他に種々の物質を含むことができ、当業者が目的に応じて適宜設定できる。例えば、生体高分子溶液は、安定化剤または緩衝剤を含む。

ウイルス除去フィルターでろ過する工程において、ウイルス除去フィルターの目詰まりによりろ過が困難になる場合がある。そのため、一実施形態では、ウイルス除去フィルターによるろ過は、ろ過終期の流速（ｆｌｕｘ）がろ過初期の流速（ｆｌｕｘ）の１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上の範囲で行うことができ、当業者が目的に応じて適宜設定できる。

ウイルス除去膜ろ過工程のウイルスクリアランス試験において、ウイルスの漏出が生じる場合がある。そのため、一実施形態では、ウイルス除去フィルターによるろ過は、ウイルスクリアランス指数が３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０またはそれ以上である。好ましくは、クリアランス指数は、３．５またはそれ以上の範囲で行うことができる。

本発明の一態様では、生体高分子溶液を孔径約２０ｎｍのウイルス除去フィルターで処理する工程と、得られたろ液を孔径約１５ｎｍのウイルス除去フィルターで処理する工程を含む、生体高分子のろ過方法であって、ここで該生体高分子のろ過量が孔径約２０ｎｍまたは孔径約１５ｎｍのフィルター膜面積当たり２０ｋｇ／ｍ^２以上である、ろ過方法、ならびに得られた生体高分子を製剤化する工程を含む、生体高分子を含む製剤の製造方法が提供される。

本発明において、「除去膜」および「除去フィルター」は相互互換的に使用される。特に指示がない限り、本明細書において「約」とは±１０％、好ましくは±５％の範囲を意味する。

本発明者等は、より少量のフィルターによる効果的なウイルス除去膜ろ過方法を検討し、以下の知見を得た。孔径１５ｎｍのウイルス除去フィルターに供することができる生体高分子溶液であれば本発明のろ過方法を適用することができる。また、生体高分子の例としてタンパク質が挙げられる。その例として、アルブミン溶液を用いた実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。

実施例１：ヒト血清アルブミン含有水溶液の調製
特許文献２（ＷＯ２００４／０８９４０２）に記載の方法に従い、コーンのアルコール分画によって得られた第Ｖ画分ペーストに、注射用水（日局）をペースト重量の２倍以上加え撹拌溶解し、限外ろ過法により脱アルコールしたアルブミン画分を、ｐＨ４．５、ＥＣ１．５ｍＳ／ｃｍ以下、タンパク質濃度１２ｗ／ｖ％に調整した。その後、ｐＨ４．５、ＥＣ５ｍＳ／ｃｍ以下の酢酸バッファーで平衡化した陰イオン交換体（Ｑセファロース（登録商標）ＦａｓｔＦｌｏｗ（Ｃｙｔｉｖａ））にアルブミン含有水溶液を展開し、素通り画分を回収した。タンパク質濃度８ｗ／ｖ％、ｐＨ７．０に調整し、孔径０．１μｍのフィルターでろ過したものを試験材料とした。

実施例２：ヒト血清アルブミン溶液の小孔径ウイルス除去膜によるろ過
ウイルス除去膜の孔径の違いによるろ過流量を比較確認するために、上記アルブミン含有水溶液（タンパク質濃度８％）を加圧容器に入れ、圧力調整器を備えた窒素ガスボンベにより一定の圧力を加えて、ウイルス除去膜（旭化成メディカル製）、プラノバ（商標）１５Ｎ（孔径１５±２ｎｍ）または２０Ｎ（孔径１９±２ｎｍ）（それぞれの膜面積は０．００１ｍ^２）に通液して、ウイルス除去膜ろ過を行った。プラノバ（商標）１５Ｎは０．３ｂａｒおよび０．９ｂａｒの一定圧力下でろ過した。プラノバ（商標）２０Ｎは０．９ｂａｒの一定圧力下でろ過した。結果を図１に示す。左図はろ過量（ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ、ｋｇ／ｍ^２）の経時変化を示し、右図は流速（ｆｌｕｘ、ｋｇ／ｍ^２／ｈ）の経時変化を示す。曲線Ａはプラノバ（商標）１５Ｎの０．３ｂａｒ加圧ろ過、曲線Ｂはプラノバ（商標）１５Ｎの０．９ｂａｒ加圧ろ過、曲線Ｃはプラノバ（商標）２０Ｎの０．９ｂａｒ加圧ろ過の結果である。

プラノバ（商標）１５Ｎを用いたＡ（圧力０．３ｂａｒ）とＢ（圧力０．９ｂａｒ）の曲線の比較から、ろ過圧力が大きくなるとろ過量が短時間で増加すること、および、ろ過圧力が大きくなると流速が大きくなることが確認された。同一圧力０．９ｂａｒでのプラノバ（商標）１５Ｎのろ過（曲線Ｂ）とプラノバ（商標）２０Ｎのろ過（曲線Ｃ）の比較からは、ウイルス除去フィルターの孔径が大きくなるとろ過量が短時間で増加すること、及び、ウイルス除去フィルターの孔径が大きくなると流速が大きくなることが確認された。また、曲線Ｃの流速の低下傾向よりも曲線Ｂの流速の低下傾向の方が大きく、ウイルス除去膜の孔径の小ささによる目詰まり傾向が示された。

実施例３：同一ろ過量条件下でのヒト血清アルブミン溶液のろ過性
実施例２と同様のアルブミン含有水溶液を調製し、同一ろ過量（５６ｋｇ／ｍ^２）のときのウイルス除去膜ろ過に要する時間を比較した。結果を下表に示す。

プラノバ（商標）１５Ｎによるアルブミン水溶液のろ過について、０．８ｂａｒの一定圧力の条件下、ろ過温度を１０℃、２３℃、３０℃および３７℃と変化させると、ろ過時間（ｈ）は１０１／９７、６４／５５、５２／４８／５５および４４と、温度の上昇とともに短縮した（試験Ｎｏ．１～８）。これに対して、プラノバ（商標）１５Ｎの前に同一膜面積のプラノバ（商標）２０Ｎを加えて連結してろ過し、プラノバ（商標）１５Ｎを８０ｋＰａの一定圧力でろ過した結果、そのろ過時間は５２ｈとなり（試験Ｎｏ．９）、前段にプラノバ２０Ｎをプレフィルターのように設けても、このようなプレフィルターがない試験Ｎｏ．５～７と同等のろ過時間であることがわかった。なお、プラノバ（商標）１５Ｎ＋プラノバ（商標）１５Ｎの構成による連結した連続ろ過の挙動については、前段のプラノバ１５Ｎろ過によるろ過性に主として支配されると考えられ、そのろ過時間は試験Ｎｏ．１～８の試験結果から予見することができると考えられる。

実施例４：モデルウイルスを添加したヒト血清アルブミン溶液のろ過性とウイルス捕捉能
ウイルス除去膜（旭化成メディカル製）プラノバ（商標）１５Ｎのろ過条件を変えてろ過量（タンパク質負荷量）を比較した。また、上記アルブミン含有水溶液に対し、モデルウイルスとしてブタパルボウイルス（ＰＰＶ、サイズ１８～２４ｎｍ）液を１ｖ／ｖ％または０．１ｖ／ｖ％の量で加え、これをプラノバ（商標）１５Ｎに対してろ過し、ろ過前後でのウイルス混合溶液のウイルス感染価を測定して、ウイルスクリアランス指数（ＲＦ）を確認した。プラノバ（商標）１５Nの前段にプラノバ（商標）２０Nを設けた試験Ｎｏ．１６では両ウイルス除去フィルターは同一の膜面積のものを連結してろ過し、プラノバ（商標）１５ＮのＴＭＰを０．８ｂａｒに調節してろ過した。結果を下表に示す。

頑健性の高いウイルス不活化・除去工程としてウイルスクリアランス指数４以上の工程が想定されている。試験Ｎｏ．１１の結果から、ＰＰＶを１ｖ／ｖ％量負荷したアルブミン溶液をプラノバ（商標）１５Ｎのろ過に供したとき、約半分のろ過を経た時点でウイルス除去フィルターは目詰まりし、ウイルスクリアランス指数は評価できなかった。次に、試験Ｎｏ．１２～１５の結果から、プラノバ（商標）１５Ｎのみによるろ過において、タンパク質の負荷量を６２ｋｇ／ｍ^２から５６ｋｇ／ｍ^２、４５ｋｇ／ｍ^２や２３ｋｇ／ｍ^２に減らしてもろ液からＰＰＶが検出され、そのウイルスクリアランス指数は約３のままであり、頑健性の高いウイルス除去工程にはならず、ろ過温度の影響もなかった。このことは、孔径約１５ｎｍのフィルター量を単純に数倍増やしたとしても数十ｋｇ／ｍ^２レベルのタンパク質負荷では頑健性の高いウイルス除去工程とすることは困難であることがわかった。また、これら試験Ｎｏ．１２～１５のＰＰＶの負荷総量は、試験Ｎｏ．１１のＰＰＶ負荷総量よりも少ないにもかかわらず、顕著なウイルス除去フィルターの目詰まりによる閉塞を生じることもなく、ウイルスの漏出が認められた。試験Ｎｏ．１６では、プラノバ（商標）１５Ｎの前段に同膜面積のプラノバ（商標）２０Ｎを設けてろ過すると、ろ液からはＰＰＶは検出されず、そのウイルスクリアランス指数は３．７以上となり、頑健性の高いウイルス除去工程となった。

実施例５：ウイルス除去膜ろ過前後の凝集体含量の比較
実施例２のろ過前後のアルブミン溶液をサイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ－ＨＰＬＣ）にて分析した。ＳＥ－ＨＰＬＣの分析条件は以下の通りである。
カラム：ＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷＸＬ、７．８ｍｍ×３０ｃｍ
移動相：０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム+ ０．１ｍｏｌ／Ｌ硫酸ナトリウム、０．０５％アジ化ナトリウム、ｐＨ６．７
カラム温度：２５℃付近の一定温度
流速：毎分０．５ｍＬ
検出：２８０ｎｍ
各試料に含まれる凝集体の量を比較した結果を下表に示す。

ＳＥ－ＨＰＬＣは、サイズ排除の原理により、大きな分子から順に溶出される。本ＳＥ－ＨＰＬＣ分析では保持時間１０分から２０分の間に分画されて溶出する。分析の結果、人血清アルブミンの単量体は保持時間約１８分に溶出し、二量体は保持時間約１６分に溶出した。微小なピークは少なくとも０．１％の含量を検出できるが、保持時間約10分～１６分の間にピークはなく、人血清アルブミンの二量体よりも大きな凝集物は検出されなかった。そして、表３より、ウイルス除去膜ろ過の前後で凝集体、人血清アルブミンの二量体及び単量体の含量に大きな変化はなかった。ウイルスと同程度の大きさの分子がウイルス除去膜によってろ過される生体高分子試料溶液中にどれだけ存在するかにより、小径ウイルスの漏出に影響することが考えられる。したがって、タンパク質の凝集体は少ない方が好ましい。分子量６．６万Ｄａの人血清アルブミン８％溶液のモル濃度は約１．２ｍｍｏｌ／Ｌである。そして、凝集体の量はＳＥ－ＨＰＬＣによりその１／１０００レベルの量で評価できる。しかしながら、実施例４におけるろ過前の液に加えたＰＰＶの量は１０^７レベルである。このウイルス量はａｍｏｌからｆｍｏｌレベルの量となり、非常に微量である。高濃度タンパク質溶液のウイルス除去膜ろ過において、ＳＥ－ＨＰＬＣ等の分析方法によって凝集物を評価してもウイルス除去膜ろ過のろ過性への影響を推測することは困難であることがわかる。

例えば、プラノバ（商標）１５Ｎの上流に孔径３５ｎｍ以上のプレフィルターを設けることがこれまでに当業者において実施されている。しかしながら、ＰＰＶ（ブタパルボウイルス、サイズ１８～２４ｎｍ）のような小径の非エンベロープウイルスに対し、このような孔径のプレフィルターの適用においては、ＰＰＶはプレフィルターを容易に通過する。したがって、プラノバ（商標）１５Ｎへの既知のプレフィルターの追加により非エンベロープウイルスのような小径ウイルスのウイルスクリアランス能の増強効果は期待できない。そこで、例えば、孔径約１５ｎｍのウイルス除去フィルターでろ過した後にさらに孔径約１５ｎｍのウイルス除去フィルターで繰り返しろ過すること、あるいは、孔径約１５ｎｍのウイルス除去フィルターを連結してろ過することにより、頑健性の高いウイルス除去工程とすることは当業者において容易に実施することができる。しかしながら、このときの前段の孔径約１５ｎｍのウイルス除去フィルター側へのタンパク質及びウイルスの負荷が大きくなり、連続する両フィルターへのタンパク質及びウイルスの効果的な負荷の分散は期待できず、前段の孔径約１５ｎｍのウイルス除去フィルター側の目詰まりのリスクが潜在的に存在する。そして、ウイルス除去フィルターのコストは孔径約１５ｎｍのウイルス除去フィルターの２倍となる。これまでに、数十ｋｇ／ｍ^２の生体高分子溶液のウイルス除去膜ろ過において、孔径２０ｎｍ以下のフィルターをプレフィルターのように使用した例はなく、本発明者等は、孔径約２０ｎｍと孔径約１５ｎｍのフィルターとの生体高分子の目詰まりの特性の違いを実施例１により明らかにし、本願発明において孔径２０ｎｍ以下のフィルターを孔径１５ｎｍのウイルス除去フィルターの前段に新規に使用し、孔径約２０ｎｍのウイルス除去フィルターおよび孔径約１５ｎｍのウイルス除去フィルターの両フィルターに生体高分子及びウイルスの負荷を分散させ、２０ｋｇ／ｍ^２以上の生体高分子を効率よく低コストでウイルス除去膜ろ過する方法となることを新規に見出した。生体高分子のろ過量として２０ｋｇ／ｍ^２以上のアルブミン含有水溶液を例にして孔径約１５ｎｍのウイルス除去膜でろ過するとき、孔径約１５ｎｍのウイルス除去膜の上流に孔径約２０ｎｍの膜を設けることが有効であり、生体高分子のろ過量が孔径約２０ｎｍまたは孔径約１５ｎｍの膜面積当たり数十ｋｇ／ｍ^２のレベル、さらには６０ｋｇ／ｍ^２以上においても頑健性のあるウイルス除去膜ろ過の方法となる。

本発明によれば、生体高分子溶液を孔径約１５ｎｍのウイルス除去膜でろ過する際に、効率よくウイルス除去膜でろ過する方法を提供できる。

Claims

生体高分子溶液を孔径約２０ｎｍのウイルス除去フィルターで処理する工程と、得られたろ液を孔径約１５ｎｍのウイルス除去フィルターで処理する工程を含む、生体高分子のろ過方法であって、ここで該生体高分子のろ過量が孔径約２０ｎｍまたは孔径約１５ｎｍのフィルター膜面積当たり２０ｋｇ／ｍ^２以上である、ろ過方法。
前記生体高分子がタンパク質である、請求項１に記載のろ過方法。
前記タンパク質がヒト血清アルブミンである、請求項２に記載のろ過方法。
ウイルスのクリアランス指数が３．５またはそれ以上である、請求項１に記載のろ過方法。
生体高分子のろ過量が孔径約２０ｎｍまたは孔径約１５ｎｍフィルター膜面積当たり４０ｋｇ／ｍ^２以上、または６０ｋｇ／ｍ^２以上である、請求項１に記載のろ過方法。
生体高分子溶液を孔径約２０ｎｍのウイルス除去フィルターで処理する工程と、得られたろ液を孔径約１５ｎｍのウイルス除去フィルターで処理する工程を含む、生体高分子をろ過する工程、および得られた生体高分子を製剤化する工程を含み、ここで該生体高分子のろ過量が孔径約２０ｎｍまたは孔径約１５ｎｍのフィルター膜面積当たり２０ｋｇ／ｍ^２以上である、生体高分子を含む製剤の製造方法。