CN116656502A - 一种出芽短梗霉变种h026及其应用 - Google Patents
一种出芽短梗霉变种h026及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116656502A CN116656502A CN202310400612.9A CN202310400612A CN116656502A CN 116656502 A CN116656502 A CN 116656502A CN 202310400612 A CN202310400612 A CN 202310400612A CN 116656502 A CN116656502 A CN 116656502A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- aureobasidium pullulans
- strain
- fermentation
- pullulans strain
- pullulan
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000223678 Aureobasidium pullulans Species 0.000 title claims abstract description 49
- 229920001218 Pullulan Polymers 0.000 claims abstract description 31
- 239000004373 Pullulan Substances 0.000 claims abstract description 31
- 235000019423 pullulan Nutrition 0.000 claims abstract description 31
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims abstract description 27
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 28
- XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N Melanin Chemical compound O=C1C(=O)C(C2=CNC3=C(C(C(=O)C4=C32)=O)C)=C2C4=CNC2=C1C XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 7
- 239000002689 soil Substances 0.000 claims description 5
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000012262 fermentative production Methods 0.000 claims 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 abstract description 71
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 abstract description 71
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 26
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 23
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 17
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 17
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 17
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N (S)-malic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N 0.000 description 15
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxysuccinic acid Natural products OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000001630 malic acid Substances 0.000 description 15
- 235000011090 malic acid Nutrition 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 235000010633 broth Nutrition 0.000 description 11
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 10
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 8
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 8
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 8
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 8
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 5
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 5
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 5
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 5
- WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L magnesium sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[O-]S([O-])(=O)=O WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 229940061634 magnesium sulfate heptahydrate Drugs 0.000 description 5
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 4
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 4
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 4
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 4
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 4
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 4
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 4
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 4
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 4
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 4
- VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N sodium nitrate Chemical compound [Na+].[O-][N+]([O-])=O VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 4
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 3
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000002481 ethanol extraction Methods 0.000 description 3
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 3
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 3
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 3
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 3
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 3
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 3
- XKZQKPRCPNGNFR-UHFFFAOYSA-N 2-(3-hydroxyphenyl)phenol Chemical compound OC1=CC=CC(C=2C(=CC=CC=2)O)=C1 XKZQKPRCPNGNFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZMPYMKAWMBVPQE-UHFFFAOYSA-N 2-[(6-chloropyridin-3-yl)methyl-ethylamino]-2-methyliminoacetic acid Chemical compound CCN(CC1=CN=C(C=C1)Cl)C(=NC)C(=O)O ZMPYMKAWMBVPQE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241001480003 Chaetothyriales Species 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-SOOFDHNKSA-N D-ribopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N L-rhamnopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N 0.000 description 2
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 235000013877 carbamide Nutrition 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 description 2
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 101150044508 key gene Proteins 0.000 description 2
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 2
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 2
- 230000008099 melanin synthesis Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 2
- 239000004317 sodium nitrate Substances 0.000 description 2
- 235000010344 sodium nitrate Nutrition 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 239000013585 weight reducing agent Substances 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MYKOKMFESWKQRX-UHFFFAOYSA-N 10h-anthracen-9-one;sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O.C1=CC=C2C(=O)C3=CC=CC=C3CC2=C1 MYKOKMFESWKQRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 241000223651 Aureobasidium Species 0.000 description 1
- 241000561907 Aureobasidium namibiae Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- QWIZNVHXZXRPDR-UHFFFAOYSA-N D-melezitose Natural products O1C(CO)C(O)C(O)C(O)C1OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O QWIZNVHXZXRPDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 229920001202 Inulin Polymers 0.000 description 1
- AYRXSINWFIIFAE-SCLMCMATSA-N Isomaltose Natural products OC[C@H]1O[C@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O AYRXSINWFIIFAE-SCLMCMATSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-OWMBCFKOSA-N L-ribopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-OWMBCFKOSA-N 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- NGFMICBWJRZIBI-JZRPKSSGSA-N Salicin Natural products O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1)c1c(CO)cccc1 NGFMICBWJRZIBI-JZRPKSSGSA-N 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 101000693967 Trachemys scripta 67 kDa serum albumin Proteins 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NGFMICBWJRZIBI-UHFFFAOYSA-N alpha-salicin Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1=CC=CC=C1CO NGFMICBWJRZIBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 1
- DLRVVLDZNNYCBX-ZZFZYMBESA-N beta-melibiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O1 DLRVVLDZNNYCBX-ZZFZYMBESA-N 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000004186 food analysis Methods 0.000 description 1
- 239000005003 food packaging material Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 150000002402 hexoses Chemical class 0.000 description 1
- 239000003864 humus Substances 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000009655 industrial fermentation Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- JYJIGFIDKWBXDU-MNNPPOADSA-N inulin Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)OC[C@]1(OC[C@]2(OC[C@]3(OC[C@]4(OC[C@]5(OC[C@]6(OC[C@]7(OC[C@]8(OC[C@]9(OC[C@]%10(OC[C@]%11(OC[C@]%12(OC[C@]%13(OC[C@]%14(OC[C@]%15(OC[C@]%16(OC[C@]%17(OC[C@]%18(OC[C@]%19(OC[C@]%20(OC[C@]%21(OC[C@]%22(OC[C@]%23(OC[C@]%24(OC[C@]%25(OC[C@]%26(OC[C@]%27(OC[C@]%28(OC[C@]%29(OC[C@]%30(OC[C@]%31(OC[C@]%32(OC[C@]%33(OC[C@]%34(OC[C@]%35(OC[C@]%36(O[C@@H]%37[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O%37)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%36)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%35)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%34)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%33)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%32)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%31)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%30)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%29)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%28)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%27)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%26)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%25)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%24)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%23)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%22)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%21)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%20)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%19)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%18)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%17)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%16)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%15)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%14)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%13)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%12)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%11)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%10)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O9)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O8)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O7)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O6)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 JYJIGFIDKWBXDU-MNNPPOADSA-N 0.000 description 1
- 229940029339 inulin Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- DLRVVLDZNNYCBX-RTPHMHGBSA-N isomaltose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O1 DLRVVLDZNNYCBX-RTPHMHGBSA-N 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- QWIZNVHXZXRPDR-WSCXOGSTSA-N melezitose Chemical compound O([C@@]1(O[C@@H]([C@H]([C@@H]1O[C@@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)O)CO)CO)[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O QWIZNVHXZXRPDR-WSCXOGSTSA-N 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 150000002972 pentoses Chemical class 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 description 1
- 238000007670 refining Methods 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- NGFMICBWJRZIBI-UJPOAAIJSA-N salicin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC=CC=C1CO NGFMICBWJRZIBI-UJPOAAIJSA-N 0.000 description 1
- 229940120668 salicin Drugs 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- 229930195727 α-lactose Natural products 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/145—Fungal isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
- C12P19/10—Pullulan
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Mycology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Botany (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种出芽短梗霉变种H026及其应用。所述出芽短梗霉变种H026已被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏编号：CGMCC No.40469；保藏日期：2022年12月27日；保藏地点：中国科学院微生物研究所。以该菌株出发，通过发酵培养工艺的控制可以产生聚苹果酸和普鲁兰多糖。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种出芽短梗霉变种H026及其应用。
背景技术
出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)是属于短柄霉属(Aureobasidium)的一种子囊真菌，在培养过程易形成与酵母细胞相似的细胞形态(yeast-like)且由于黑色素的产生而使菌落或发酵液呈黑色，因此出芽短梗霉又被俗称为黑酵母。出芽短梗霉是一种自然界中普遍存在的真菌，如土壤、腐殖质、落叶、树皮、叶面、深海等处均有发现。
出芽短梗霉又称普鲁兰短梗霉，主要应该类菌株可以合成并分泌大量胞外普鲁兰多糖，因此出芽短梗霉可以用于工业用普鲁兰多糖的发酵生产菌种(中国专利CN107641634A，一种出芽短梗霉发酵生产普鲁兰多糖的生产工艺)。普鲁兰多糖是一种新型可降解生物材料，由于良好的成纤维性、可塑性和成膜性等物理性能而在食品、医药和化工等领域具有广泛应用。
出芽短梗霉是利用发酵法生产制备聚苹果酸的主要菌种，具有发酵产量高、成本低、聚合度适中等特点。聚苹果酸由于具有良好的水溶性、吸水性、可降解性以及无免疫原性等特点而在药物输送载体、化妆品、食品包材等领域中具有良好的市场前景和应用开发价值。
出芽短梗霉之所以被称为“黑酵母”，主要因为该菌种可以大量合成黑色素，使发酵液成深黑色。Liu等(Liu F et al.Correlation between the synthesis of pullulanand melanin in Aureobasidium pullulans.2021,International Journal ofBiological Macromolecules 177:252–260)报道了利用基因突变方式证明了普鲁兰多糖合成和黑色素合成之间具有相关性，当黑色素合成关键基因(alb1)被突变后，普鲁兰多糖合成量下降了41％，当普鲁兰多糖合成关键基因(pul)被突变后既没有普鲁兰多糖的生成，也没有黑色素的形成。
但是在发酵制备聚苹果酸、普鲁兰多糖或liamocin等代谢产物时，发酵过程中合成黑色素不仅会降低目的产物的碳源转化率，发酵液中的黑色素也将对目的产物的纯化和提取带来极大的困难。
发明内容
根据现有技术的不足，本发明提供了一种出芽短梗霉变种H026及其应用，目的是提供一种可以产生胞外多聚物的真菌菌株并利用该菌株发酵生产苹果酸、普鲁兰多糖。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
本发明提供了一株出芽短梗霉变种(Aureobasidium pullulans var.namibiae)H026。
所述出芽短梗霉变种H026已被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏编号：CGMCC No.40469；保藏日期：2022年12月27日；保藏地点：中国科学院微生物研究所(北京市朝阳区北辰西路1号院3号)。
所述出芽短梗霉变种H026自安徽工程大学校园内土壤中分离获得。
所述出芽短梗霉变种H026最适生长温度为20～32℃，最适生长pH为3.0～8.5，在YEPD培养基中生长时无明显的基内菌丝，有较短的类菌丝呈匍匐状向四周扩散，培养初期(1～2d)菌落呈淡黄色，培养后期(3～5d)菌落表面成灰黄色，无明显黑色素产生，显微镜下可以观察到大量类似酵母形态的椭圆形单细胞体存在。
本发明还提供了一种出芽短梗霉H026变种在聚苹果酸发酵生产中的应用。
实验研究表明出芽短梗霉变种H026利用发酵培养基发酵至5～8d后，聚苹果酸产量可以达到20g/L以上。
所述发酵为液态发酵。
所述液态发酵，具体实施方式为：
A种子培养
将出芽短梗霉变种H026在YEPD培养基中进行划线培养，培养3～4天后使用接种环划取一环菌体接种于40mL YEPD液体培养基(250ml三角瓶)，于30℃、200r/min振荡培养48h制得菌体悬液，即为发酵用种子液。
所述YEPD培养基，组分为葡萄糖20g/L，胰蛋白胨20g/L，酵母浸出粉10g/L，琼脂粉15g/L，pH6.5～7.5。
所述YEPD液体培养基，组分为葡萄糖20g/L，胰蛋白胨20g/L，酵母浸出粉10g/L，pH6.5～7.5。
B液态发酵
取5～10mL种子液接种于20～45mL发酵培养基(250ml三角瓶)中，于20～32℃、150～220r/min条件下培养5～8d。发酵结束后，菌体和发酵液通过离心方式进行分离。发酵液中的聚苹果酸利用乙醇沉淀法获得，所得聚苹果酸进一步采用硫酸溶液水解，水解物中的苹果酸含量采用Goodban法测定，然后按照苹果酸浓度计算发酵液中聚苹果酸的单位产量。
所述离心条件为8000r/min，10min。
所述乙醇提取条件为：取一定体积的发酵液，加入2.5～3.5倍的95％～98％无乙醇，4～20℃条件下沉淀4～12h后于8000r/min离心20min，在80℃干燥箱烘干至恒重，加入原体积的去离子水溶解沉淀。
所述硫酸溶液水解条件条件为：取1mL上述溶解液加入等体积1mol/L硫酸，在90℃水解9h，然后取水解液并利用Goodban法测定其中的苹果酸浓度。
所述Goodban法参照文献进行(Goodban A E,Stark J B J a C.Rapid methodfor determination of malic acid.1957,29(2):283-7)。具体为：取1mL样品溶液(其中苹果酸含量控制在5～80μg)放在25mL具塞比色管中，沿壁缓慢加入6mL98％硫酸，然后加入0.1mL 2,7-萘二酚溶液，100℃沸水浴20min，冷却到室温后，在390nm处测定吸光值，同时以水做空白对照。
所述聚苹果酸的单位产量，计算公式为：聚苹果酸的单位产量CPMA(g/L)＝0.864×CMA，其中0.864为苹果酸与聚苹果酸的换算系数，CMA为酸水解前后的苹果酸浓度差。
所述发酵培养基，其组分为碳源60～160g/L，氮源0.5～1.5g/L，玉米浆1～10g/L，NaCl 0.5～1g/L，K2HPO4 0.2～0.5g/L，MgSO4 0.3～0.6g/L，FeSO40.005～0.015g/L，碳酸钙5-40g/L，121℃灭菌20min，冷却后使用。
所述碳源，包括葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、木糖或淀粉水解糖，但不仅限于此。
所述氮源，包括硝酸铵、蛋白胨、酵母粉、尿素、硝酸钠或氯化铵，但不仅限于此。
在上述发酵条件下，聚苹果酸单位产量可以达到20g/L以上。
本发明还提供了一种芽短梗霉变种在普鲁兰多糖发酵生产中的应用。
实验研究表明芽短梗霉变种H026利用发酵培养基发酵至5～8天后，普鲁兰多糖产量达到50g/L以上。
所述普鲁兰多糖得率指发酵液中普鲁兰多糖总重量与发酵液中原始总糖重量的百分比。
所述总糖指发酵液中配方中所有糖份重量的总和。
所述发酵为液态发酵。
所述液态发酵，具体实施方式为：
A种子培养
将出芽短梗霉变种在YEPD培养基中进行划线培养，培养3～4天后使用接种环划取一环菌体接种于40mL YEPD液体培养基(250ml三角瓶)，于30℃、200r/min振荡培养48h制得菌体悬液，即为发酵用种子液。
所述YEPD培养基，组分为葡萄糖20g/L，胰蛋白胨20g/L，酵母浸出粉10g/L，琼脂粉15g/L，pH6.5～7.5。
所述YEPD液体培养基，组分为葡萄糖20g/L，胰蛋白胨20g/L，酵母浸出粉10g/L，pH6.5～7.5。
B液态发酵
取5～10mL种子液接种于20～45mL发酵培养基(250ml三角瓶)中，于20～32℃、150～220r/min条件下培养5～8d。发酵结束后，菌体和发酵液通过离心方式进行分离。发酵液中的普鲁兰多糖利用乙醇沉淀和减重法获得。
所述发酵培养基，组分为碳源50～160g/L、氮源1～8g/L、氯化钾0.2～1g/L、磷酸二氢钾0.02～1g/L、七水硫酸镁0.1～1g/L，玉米浆5～20g/L，pH3.0～8.5
所述碳源，包括葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、木糖或淀粉水解糖，但不仅限于此。
所述氮源，包括硝酸铵、蛋白胨、酵母粉、尿素、硝酸钠或氯化铵，但不仅限于此。
所述离心条件为8000r/min，10min。
所述乙醇提取条件为：取一定体积的发酵液，加入2.5～3.5倍的95％～98％无乙醇，4～20℃条件下沉淀4～12h后于8000r/min离心20min，在80℃干燥箱烘干至恒重，重量计为H1(g)。
所述减重法，具体为：取一定重量的上述烘干至恒重样品，加入适当体积的去离子水溶解沉淀，并按照本发明所述聚苹果酸测定方法测定并计算总样品中聚苹果酸的重量，计为H2(g)。
所述普鲁兰多糖产量计算方法为：普鲁兰多糖产量CPLU(g/L)＝(H1-H2)/V，其中V指乙醇沉淀时所取的发酵液体积(L)。
在上述发酵条件下，普鲁兰多糖产量达到50g/L。
本发明的有益技术效果：
1.本发明提供的出芽短梗霉H026为野生菌，生长速度快，生命力旺盛，发酵培养过程中不易污染杂菌，易于纯培养。
2.本发明提供的出芽短梗霉H026在正常的生长和发酵温度(20～32℃)下可高效地代谢合成聚苹果酸，是一种聚苹果酸的潜在产生菌种，具有良好的开发应用价值。
3.本发明提供的出芽短梗霉H026在正常的生长和发酵温度(20～32℃)下可高效地代谢合成普鲁兰多糖，是一种普鲁兰多糖的潜在产生菌种，具有良好的开发应用价值。
4.本发明提供的出芽短梗霉变种H026正常的生长和发酵温度(20～32℃)下不产生黑色素，在发酵生产聚苹果酸、普鲁兰多糖时，有益于提高目标产物的得率和目标产物的分离、提取和精制，有助于降低目标产物的生产成本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为30℃条件下本发明的出芽短梗霉变种H026在PDA培养基培养10天菌落照片；
图2为本发明的出芽短梗霉变种H026细胞1600倍显微形态；
图3为本发明的出芽短梗霉变种H026液态发酵至第15天时发酵液照片；
图4为本发明的出芽短梗霉变种H026的***进化树。
具体实施方式
本发明提供了一种出芽短梗霉H026及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试剂、耗材和仪器均为普通市售品，皆可通过市场交易获得。
下面通过对实施例的描述，对本发明作进一步详细的说明，以帮助本领域技术人员对本发明的发明构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解。
实施例1菌株筛选、分离、鉴定和保藏
菌株筛选和分离，具体为：取0.5g采自安徽工程工程大学校园内的土壤并使用5mL无菌水进行悬浮并震荡混匀，稀释100倍后涂布于筛选培养基，于30℃静置培养4～7天。对可以产生少量黄色或黑色色素、菌落表面有亮泽、基内菌丝不发达、气生菌丝呈匍匐状的真菌菌落进一步在筛选培养基中进行划线分离，直至获得目的菌株的纯培养物。
本专利从土壤分离得到一株菌株H026。H026最适生长温度为20～32℃，最适生长pH为3.0～8.5，在PDA或YEPD培养基培养基中生长时基内菌丝不发达，气生菌丝呈匍匐状向四周扩散。培养初期(1～2d)菌落呈淡黄色，培养后期(10d)菌落表面成灰黄色，无明显黑色素产生(图1)。培养细胞在显微镜下开以观察到大量类似酵母形态的椭圆形单细胞体存在(图2)。液态培养至15d，发酵液呈淡红色，没有黑色素产生(图3)。
通过接种斜面和制备甘油冻结管法分别将所得菌株H026在4℃和超低温(-80℃)条件下进行保藏。
所述筛选培养基含有马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，氨苄青霉素0.3g/L，卡那霉素0.1g/L，琼脂粉15g/L，去离子水1000mL，pH6.7～7.2。其中，氨苄青霉素和卡那霉素在培养基灭菌并冷却至50℃左右再加入。
利用分子生物学方法对筛选菌株进行鉴定，具体为：采用常规DNA克隆技术(萨姆布鲁克J,弗里奇E F.分子克隆实验指南(第二版).金冬雁,黎孟枫,侯云德,等译.北京:科学出版社,1998)提取菌株H026的染色体DNA，以该染色体DNA为模板、以5.8S rDNA-ITS区域通用引物(ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')为扩增引物，使用PCR方法获得菌株5.8S rDNA-ITS基因片段。反应体系(50μL)如下：染色体DNA0.5μL，dNTPs混合物4μL，rTaq DNA聚合酶0.5μL，ITS1 0.3μL，ITS4 0.3μL，DNA聚合酶缓冲液5μL，双蒸水39.4μL。PCR扩增程序：95℃变性4min，94℃变性30s，55℃复性45s，72℃延伸90s，30个循环，72℃延伸10min。
将PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测确认后与质粒pMD18-T相连接并转化大肠杆菌(Escherichia coli)JM109感受态细胞，抽提重组质粒并委托通用生物(安徽)股份有限公司完成目的基因的序列测定。结果表明，菌株H026rDNA-ITS区域DNA有效测定序列长度为577bp，具体如SEQ ID NO:1所示。
将菌株H026 rDNA-ITSDNA序列通过在线数据库Blast/blastp(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)对测定序列进行比对，选取相近序列并使用BioEdit软件进行多重比对，比对结果通过软件MEGA 5.1利用Neighbor-Joining(NJ)法构建***发育树(图4)，结合形态学观察结果将该分离菌株鉴定为一种出芽短梗霉的变种，并命名为出芽短梗霉变种H026。
该出芽短梗霉变种H026已被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏编号：CGMCC No.40469；保藏日期：2022年12月27日；保藏地点：中国科学院微生物研究所。
实施例2出芽短梗霉变种H026在聚苹果酸发酵产生中的应用
种子液培养：将出芽短梗霉变种在YEPD培养基中进行划线培养，培养3天后使用接种环划取一环菌体接种于40mL种子液体培养基(250ml三角瓶)，于28℃、200r/min振荡培养48h制得菌体悬液，即为发酵用种子液。
所述YEPD培养基，组分为葡萄糖20g/L，胰蛋白胨20g/L，酵母浸出粉10g/L，琼脂粉15g/L，pH6.0。
所述YEPD液体培养基，组分为葡萄糖20g/L，胰蛋白胨20g/L，酵母浸出粉10g/L，pH6.0。
所述种子培养基，组分为葡萄糖50g/L、蛋白胨1g/L、酵母粉1g/L、磷酸二氢钾0.1g/L、七水硫酸镁0.2g/L、氯化钠1g/L
液态发酵：取5mL种子液接种于45mL发酵培养基(250ml三角瓶)中，于28℃、200r/min条件下培养6d。发酵结束后，菌体和发酵液通过离心方式进行分离。发酵液中的聚苹果酸利用乙醇沉淀法获得，所得聚苹果酸进一步采用硫酸溶液水解，水解物中的苹果酸含量采用Goodban法测定，然后按照苹果酸浓度计算发酵液中聚苹果酸的单位产量。
发酵培养基，组分为葡萄糖100g/L、硝酸铵5g/L、氯化钾0.5g/L、磷酸二氢钾0.1g/L、七水硫酸镁0.2g/L、玉米浆1g/L、碳酸钙30g/L(单独灭菌)，pH6.0。
所述单独灭菌指将固体碳酸钙与其他成分分开灭菌，接种前混合在一起。
所述离心条件为8000r/min，10min。
所述乙醇提取条件为：取一定体积的发酵液，加入2.5倍的95％乙醇，4℃条件下沉淀12h后于8000r/min离心20min，在80℃干燥箱烘干至恒重，加入原体积的去离子水溶解沉淀。
所述硫酸溶液水解条件条件为：取1mL上述溶解液加入等体积1mol/L硫酸，在90℃水解9h，然后取水解液并利用Goodban法测定其中的苹果酸浓度。
所述Goodban法参照文献进行(Goodban A E,Stark J B J a C.Rapid methodfor determination of malic acid.1957,29(2):283-7)。具体为：取1mL样品溶液(其中苹果酸含量控制在5～80μg)放在25mL具塞比色管中，沿壁缓慢加入6mL 98％硫酸，然后加入0.1mL 2,7-萘二酚溶液，100℃沸水浴20min，冷却到室温后，在390nm处测定吸光值，同时以水做空白对照。
所述聚苹果酸的单位产量，计算公式为：聚苹果酸的单位产量CPMA(g/L)＝0.864×CMA，其中0.864为苹果酸与聚苹果酸的换算系数，CMA为酸水解前后的苹果酸浓度差。
在上述发酵条件下，发酵至第6d时，所得聚苹果酸产量为为21.9g/L。
实施例3出芽短梗霉变种H026在普鲁兰多糖发酵产生中的应用
种子液培养：将出芽短梗霉变种在YEPD培养基中进行划线培养，培养3天后使用接种环划取一环菌体接种于40mL种子液体培养基(250ml三角瓶)，于28℃、200r/min振荡培养48h制得菌体悬液，即为发酵用种子液。
所述YEPD培养基，组分为葡萄糖20g/L，胰蛋白胨20g/L，酵母浸出粉10g/L，琼脂粉15g/L，pH6.0。
所述YEPD液体培养基，组分为葡萄糖20g/L，胰蛋白胨20g/L，酵母浸出粉10g/L，pH6.0。
所述种子培养基，组分为葡萄糖50g/L、蛋白胨1g/L、酵母粉1g/L、磷酸二氢钾0.1g/L、七水硫酸镁0.2g/L、氯化钠1g/L
发酵培养基，组分为葡萄糖120g/L、硝酸铵2g/L、氯化钾0.5g/L、磷酸二氢钾0.1g/L、七水硫酸镁0.2g/L，吐温80 0.3g/L，玉米浆5g/L，pH6.0
液态发酵：取5种子液接种于45mL发酵培养基(250ml三角瓶)中，于28℃、200r/min条件下培养6d。发酵结束后，菌体和发酵液通过离心方式进行分离。
发酵液中的普鲁兰多糖利用醇沉淀法提取获得，所得普鲁兰多糖的量以总糖计算，总糖测定采用硫酸﹣蒽酮法，具体参照文献(张水华.食品分析.北京:中国轻工业出版社,2004)进行。
所述离心条件为8000r/min，10min。
所述醇提取条件为：取一定体积的发酵液，加入2.5倍的95％乙醇，4℃条件下沉淀2h后于8000r/min离心20min，在80℃干燥箱烘干至恒重，加入原体积的去离子水溶解沉淀。
在上述发酵条件下，发酵至第7d时，普鲁兰多糖发酵产量为51.4g/L。
实施例4出芽短梗霉变种H026对不同碳源的利用
碳源利用实验参照文献(沈萍,陈向东.微生物学实验(第5版)[M].北京:高等教育出版社,2018)所述的方法和步骤进行。实验结果表明出芽短梗霉变种H026可以利用多种碳源进行生长，利用葡萄糖、蔗糖、木糖和可溶性淀粉时生长速度较快(如下表所示)，表明该菌株对六碳糖和五碳糖均有较好的代谢能力。
| 糖类水解 | 生长情况 | 糖类水解 | 生长情况 |
| 葡萄糖 | +++ | 海藻糖 | + |
| 木糖 | +++ | α-乳糖 | + |
| 麦芽糖 | + | 棉子糖 | + |
| 甘露糖 | ++ | 菊糖 | + |
| 松三糖 | ++ | 山梨醇 | + |
| 异麦芽糖 | ++ | 可溶性淀粉 | +++ |
| 鼠李糖 | + | 蜜二糖 | + |
| L-***糖 | + | D-***糖 | + |
| 核糖 | + | 水杨苷 | + |
| 甘露醇 | + | 半乳糖 | + |
| 蔗糖 | +++ |
注：“+”表示相对生长速度。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本发明的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。
本发明旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种出芽短梗霉变种H026，其特征在于，所述出芽短梗霉变种H026已被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏编号：CGMCC No.40469；保藏日期：2022年12月27日；保藏地点：中国科学院微生物研究所。
2.根据权利要求1所述的出芽短梗霉变种H026，其特征在于，所述出芽短梗霉变种H026最适生长温度为20～32℃，最适生长pH为3.0～8.5，在YEPD培养基中生长时无明显的基内菌丝，有较短的类菌丝呈匍匐状向四周扩散，培养初期(1～2d)菌落呈淡黄色，培养后期(3～5d)菌落表面成灰黄色，无明显黑色素产生，显微镜下可以观察到大量类似酵母形态的椭圆形单细胞体存在。
3.根据权利要求1所述的出芽短梗霉变种H026，其特征在于，所述出芽短梗霉变种H026自安徽工程大学校园内土壤中分离获得。
4.一种根据权利要求1-3任一项所述的出芽短梗霉变种H026的应用，其特征在于，所述出芽短梗霉变种H026应用于聚苹果酸和普鲁兰多糖的发酵生产。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310400612.9A CN116656502A (zh) | 2023-04-14 | 2023-04-14 | 一种出芽短梗霉变种h026及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310400612.9A CN116656502A (zh) | 2023-04-14 | 2023-04-14 | 一种出芽短梗霉变种h026及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116656502A true CN116656502A (zh) | 2023-08-29 |
Family
ID=87725014
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310400612.9A Pending CN116656502A (zh) | 2023-04-14 | 2023-04-14 | 一种出芽短梗霉变种h026及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116656502A (zh) |
-
2023
- 2023-04-14 CN CN202310400612.9A patent/CN116656502A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN114214251B (zh) | 一种生产d-阿洛酮糖用枯草芽孢杆菌及其培养方法和应用 | |
| CN102586151B (zh) | 一株高产多糖的菌株及利用该菌株发酵生产多糖的方法 | |
| CN103937691B (zh) | 一株产β‑果糖苷酶的米曲霉菌株及其培养方法与应用 | |
| CN102676406B (zh) | 一种用于发酵生产核糖核酸的热带假丝酵母菌及其应用 | |
| CN110885772B (zh) | 一株产海藻糖酶的分散泛菌及其分离筛选和应用 | |
| CN105296392A (zh) | 防治十字花科根肿病解淀粉芽孢杆菌Bam22的发酵方法 | |
| CN110616150B (zh) | 一株高产多糖华泽兰内生真菌及其应用 | |
| CN109439599B (zh) | 一株海藻糖酶生产菌及其应用 | |
| CN109136313B (zh) | 利用密西根克雷伯氏菌合成2’-脱氧腺苷的方法 | |
| CN109136314B (zh) | 利用密西根克雷伯氏菌合成2’-脱氧-2-氨基腺苷的方法 | |
| CN116200286B (zh) | 一株高效糖化纤维素的热纤梭菌及其应用 | |
| CN106434466A (zh) | 一种产生天然红色素的赤红球菌及其制备方法与应用 | |
| CN110305819A (zh) | 一株羽毛高效降解菌株及其应用 | |
| CN112458022B (zh) | 高产几丁质脱乙酰酶的地衣芽孢杆菌Bl22及其相关产品和应用 | |
| CN116656502A (zh) | 一种出芽短梗霉变种h026及其应用 | |
| CN114015607B (zh) | 一种高产5-甲基四氢叶酸的解淀粉芽孢杆菌及其应用 | |
| CN111808763B (zh) | 一株产类胡萝卜素的双倒卵形红酵母及其应用 | |
| CN107365730A (zh) | 枯草芽孢杆菌菌株及利用该菌株生产支链淀粉酶的方法 | |
| CN108018246A (zh) | 一株联产壳聚糖酶和γ-聚谷氨酸的菌株及其应用 | |
| CN116286474B (zh) | 一种低温降解半纤维素的微生物菌株 | |
| CN116179402B (zh) | 一株类胡萝卜素合成菌株及其应用 | |
| CN117070367B (zh) | 出芽短梗霉ncps2022-m及培养方法 | |
| CN116286513B (zh) | 一株希氏乳杆菌FR-1012及其工业化生产γ-氨基丁酸的方法 | |
| CN116731934B (zh) | 一株大肠埃希氏菌及其在生产氨基葡萄糖中的应用 | |
| KR0148042B1 (ko) | 내열성 효모 및 그를 이용한 알코올 발효법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |