KR0148042B1 - 내열성 효모 및 그를 이용한 알코올 발효법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 45℃이상의 고온에서 생육가능하며 35℃ 이상의 온도에서도 알코올 발효능을 유지하는 신규한 내열성 효모 사카로미세스 세레비시아에 (Saccharomyces cerevisiae) RA-72-2(KCTC-8633P) 및 이 균주를 이용하여 35℃의 고온에서 알코올 발효를 행함을 특징으로 하는 알코올 발효방법을 제공한다.

Description

내열성 효모(Saccharomyces cerevisiae) 및 그를 이용한 알코올 발효법

제 1 도는 본 발명에 따른 신규 내열성 효모를 스크리닝하는 과정을 보여 주는 개략도이다.

제 2 도는 본 발명에 따른 신규 내열성 효모의 생육에 미치는 온도의 영향을 보여주는 그래프이다.

제 3(a)도 및 3(b)도는 각각 공지균 및 본 발명에 따른 신규 내열성 효모를 이용한 에탄올 발효에 있어서 온도가 미치는 영향을 보여주는 그래프이다.

제 4(a)도 및 제 4(b)도는 공지균 및 본 발명 에 따른 신규 내열성 효모의 생육에 미치는 알코올 농도의 영향을 30℃ 및 41℃의 온도별로 나타낸 그래프이다.

제 5 도는 본 발명에 따른 신규 내열성 효모와 종래의 내열성 효모의 온도별 발효능을 비교한 막대 그래프이다.

제 6(a)도 및 제6(b)도는 각각 30℃ 및 40℃에서 공지균 및 본 발명에 따른 신규 내열성 효모의 생육에 있어서 글루코스 농도가 미치는 영향을 보여주는 그래프이다.

본 발명은 신규한 내열성 효모 및 이를 이용하여 비교적 고온에서 알코올을 발효하는 방법에 관한 것이며, 보다 상세하게는 특히 에탄올 발효에 유리하게 사용될 수 있는 신규의 내열성 효모(Saccharomyces cerevisiae), 이를 이용하여 35℃ 이상의 고온에서 알코올을 발효시키는 방법, 및 통상의 30℃ 발효에 있어서 냉각수를 사용하지 않고 발효하는 방법에 관한 것이다.

알코올 발효에 있어서, 발효 도중에 발생되는 발효열로 인해 발효 시스템이 40℃ 에 접근하게 되면 효모의 생장이 억제되므로, 냉각 시스템을 사용하는 것이 필수적이다. 특히, 열대지방이나 1994년 한국의 여름에서와 같이 발효조의 외부 온도가 높게 되면 이러한 문제는 더욱 심각해지고, 냉각 시스템을 운영하는 비용의 부담이 가중된다.

그래서 이러한 문제를 개선하는 방법 중 하나로써 내열성 효모를 선발하고자 하는 노력이 있어왔다(Hughes et al., Biotechnol. Lett., 6,1. 1984). 본 발명에서의 효모의 내열성(thermptolerance)은 효모가 45℃ 이상에서 생장하거나, 40℃ 이상에서 에탄올을 발효할 수 있는 성질을 의미한다(Laluce et al., Biotechnol, Bioeng., 37,528,1991).

내열성 효모를 사용함에 따라 냉각작업이 용이해지고(Burrows, The Yeasts, ed. by Rose Harrison, vol. 3, Chap. 7,pp. 349, Academic Press, 1970), 적은 효소 양으로도 가수분해속도를 증가시켜 동시 당화 발효 생산성이 증가되고(Spindler et al., Biothechnol. bioeng., 34,189,1989), 진공하에 에탄올을 회수하는 새로운 공정 개발이 가능해지는(Lee et al., Biothchnol. Lett., 2,141,1981)등 유리한 점이 관찰되었다.

내열성 효모로는 효모(Laluce et al., Biotechnol, Bioeng., 37,528,1991; 류병호등, 산업미생물학회지, 16,265,1988), 클루이베로미세스 마르시아누스(Hughes et al., Biotechnol. Lett., 6,1. 1984), 캔디다속, 한세눌라속, 크립토코커스속, 로도스포리디움속, 브레타노미세스속(Idris Berry, Biotechnol. Lett., 2,61,1980)등이 보고되었는데, 지금까지 알려진 이들 내열성 효모들은 40~45℃까지 생장되기는 하지만, 최종 에탄올 생성농도가 5% 를 넘지 못하여 산업적으로 사용되기에는 불리한 점이 많았다.

따라서, 고온에서도 생육이 왕성하면서 동시에 알코올 발효능이 우수한 새로운 내열성 효모의 제공이 요망되어 왔다.

이러한 상황하에서 본 발명자들은 고온에서도 생육이 왕성함과 동시에 알코올 발효능이 우수한 새로운 내열성 효모를 제공하고자 광범위하게 연구하였고, 그 결과로써 본 발명 을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명의 목적은 고온에서도 생육이 왕성함과 동시에 알코올 발효능이 우수한 새로운 내열성 효모를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기의 새로운 내열성 효모를 이용하여 35℃이상의 고온에서 알코올 발효를 행하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 30℃정도의 온도에서 행하는 통상의 알코올 발효에 있어서, 알코올 발효 효모로서 본 발명의 균주를 이용하고 발효조의 냉각처리를 행하지 않음을 특징으로 하는 발효방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 기타 적용은 하기 발명의 상세한 설명란으로부터 당업자에게 명백해질 것이다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명에 따르면 40℃에서 48시간 발효후 11% 의 에탄올을 생성할 수 있고 40℃ 이상의 고온에서 생육하는 새로운 효모(Saccharomyces cerevisiae)가 제공된다.

본 발명의 신규 내열성 효모는 상기와 같은 고온에서의 우수한 발효특성 및 생육특성을 갖기 때문에 35℃ 이상의 고온에서도 알코올발효를 가능케 하며, 또한 통상의 30℃ 정도에서 행하는 알코올 발효에 사용하는 경우 알코올발효조를 냉각수등의 냉각매를 이용하여 냉각시키지 않은 채로 발효를 행할 수 있게 한다.

또한 35℃ 이상의 온도에서 발효시키는 경우에도, 냉각매등을 이용하여 냉각처리를 행하지 않아도 40℃까지 정상적인 발효가 가능하다.

본 발명에 따른 신규의 내열성 효모는 대구근교 주정공장 부근의 고온 환경의 토양에서 스크리닝하는 단계를 거친 후, 에탄올 발효능율 3ℓ 발효조에서 직접 발효시켜 선발하는 방법에 의해 선발되었다.

본 발명에서는 500여개의 분리 미생물중에서 고온에서의 생육특성과 에탄올 발효능이 비교적 우수한 9균주를 분리한 후, 이들로부터 다시금 40℃ 이상에서 에탄올을 우수하게 생성하는 한 균주를 선발하였다. 본 발명자들은 에탄올에 대한 내성과 당에 대한 내성등 생육 특성과 발효 특성을 검토하였다.

그 결과, 본 발명의 신규한 효모는 40℃ 이상의 온도에서 48시간 발효후 11%의 에탄올을 생성할 수 있다는 것을 확인하였다.

본 발명은 이상과 같은 특성을 갖는 본 발명의 효모를 이용하여 알코올 발효를 행하는 방법도 제공하는데, 본 발명의 방법에 따르면 고온에서의 생육특성과 발효특성이 우수한 본 발명의 균주를 이용하기 때문에 발효열에 의해 발효조가 가열되는 것을 방지하기 위한 냉각 시스템의 비용을 크게 절감할 수 있는 효과가 얻어진다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하지만 본 발명이 이들 실시예만 국한되는 것은 아니다.

[실시예1]

대구근교 주정공장 부근 고온 환경의 토양으로부터 약 500개의 토양시료를 수집하고, 각 토양 시료 1g 을 증류수10mℓ와 혼합하였다. 약 10분간 방치한 후 상등액 1mℓ를 YPD배지 (포도당 1%, 폴리펩톤 1%, 효모엑기스 0.2%, pH 6.0)에 접종하고 45℃에서 하루 배양하여 내열성을 갖는 미생물을 집식 배향하였다. 집식 배양액 0.1mℓ를 발효배지(포도당 20%, 폴리펩톤 0.2%, 효모엑기스 0.2%, 황산암모늄 0.3%, 제2인산칼리 0.1%, 황산마그네슘 0.2%, pH 6.0)7mℓ가 들어있는 더람관(Durham tube)을 첨가한 시험관에 다시 접종하였다. 40℃에서 하루 발효시켜 내열성 알코올발효 효소가 존재하는 우선 시료를 선별하였다. 이상과 같은 대략적인 분리 방법을 제 1 도에 참고삼아 기재하였다.

이후 순수 분리된 각각의 집략을 접종하고, 40℃에서 2일반 배양하여 에탄올 생성이 우수한 20균주를 1차 선별하였다.

진한 황산이 채워진 황산발효관을 부착시킨 플라스크에 발효배지 500mℓ을 첨가하고, 30,37,41,43 및 45℃의 온도별로 각각 3일간 배양하여 균체 생육도가 높고, 에탄올 생성능이 비교적 높은 9균주를 선별하였다.

발효조를 이용하여 20% 글루코스 발효배지 3ℓ에 상기 9균주를 접종하고, 각종 온도에서 72시간동안 발효를 행하였다. 이산화탄소 양으로부터 중량손실을 측정하고 그 결과를 하기 표1에 상대 발효율(%)로 표시하였다.

* 확인안됨 -: 발효안됨

상기 9균주들중 에탄올 생성율이 우수한 2주중 하나인 내열성 효모 RA-74-2에 대하여 로더의 방법(Lodder, The yeasts, North Holland Publ. Co., 1970)에 따라 생화학적인 특성을 확인하였다.

형태학적인 특성으로 YPD 고체배지에서 30℃, 3일간 배양하였을 때, 흰색 또는 크림색의 집락을 이루며, 세포 크기는 장경 4.8±0.2μm, 단경 3.2±0.2μm로 통상의 효모 크기인 7.1 × 5.4μm 보다 1/5정도 작다. 부드러운 난형 또는 둥근 자낭 포자를 1~4개 형성하며, 다면 출아를 한다.

한편 생화학적인 특성은 다음과 같다.

(1) 발효능

포도당 +

유당 -

설탕 +

갈락토스 +

말토스 +

라피노스 +

이눌린 -

전분 -

(2) 탄소원 이용능

포도당 +

만노스 +

자일로스 -

리보스 -

갈락토스 -

L-아리비노스 -

살리신 -

알부틴 -

설탕 +

유당 -

말토스 +

라피노스 +

람노스 -

멜리지로스 -

숙신산 -

글루콘산 -

아도니돌 -

이노시돌 -

만니돌 -

솔비돌 -

글리세롤 -

메탄올 -

에탄올 +

자일란 -

이눌린 -

전분 -

(3)질소동화능

암모니아 +

질산 -

아질산 -

(4)기타 특성

0.0% 사이클로헥시미드에서의 성장 -

37℃에서의 성장 +

42℃에서의 성장 +

45℃에서의 성장 -

요소분해능 -

상기한 특성들, 그리고 특히 디아조니움 블루 B반응에서 음성으로 나타나 아스코미세테스에 속한다는 것을 알았으며, 본 발명의 내열성 효모는 일반적인 효모(Saccharomyces cerevisiae)와 일치하였다. 본 발명에 따른 내열성 효모(Saccharomyces cerevisiae) RA-74-2는 1994년 11월 15일에 한국과학기술원, 유전자은행에 기탁되어 KCTC 8633P의 수탁번호를 부여받았다.

본 발명의 내열성 효모 RA-72-2를 스크링닝하는 과정을 개략적으로 제 1 도에 나타내었다.

[실시예2]

고온에서의 생육

고안에서의 생육도를 검사하기 위하여, YPD(5% 글루코스, 1% 폴리펩톤, 0.5% 효모 추출액)배지에 30℃에서 24시간동안 예비배양한 배양액 0.1mℓ(산업적으로 이용되고 있는 B사 균주 및 본 발명의 RA-72-2 균주)를 접종하고 20~55℃에서 72시간동안 온도구배 배양기(Toyo Kagaku Sanyo Co., Ltd. Model TN-3)를 이용하여 배양하였다.

결과는 제 2 도에 나타내었다. 제 2 도에서 알 수 있는 바와같이, 본 발명의 균주는 현재 산업적으로 이용되고 있는 타 내열성 균주에 비해 더 높은 온도에서도 생육한다.

[실시예3]

알코올 발효에서의 온도의 영향(1)

본 발명에 따른 균주를 이용하여 알코올 발효를 행함에 있어서 온도가 미치는 영향을 알아보기 위하여, 산업적으로 이용되고 있는 내열성 알코올 발효효모(Saccharomyces cerevisiae) B,D 및 F(이상의 균주는 RaCER로부터 구입) 및 본 발명의 균주 RA-72-2(KCTC-8633P)를 이용하여 32℃ 및 40℃에서 알코올 발효를 행하였다.

즉, 포도당 200g /ℓ, 효모추출액 2g /ℓ, 폴리펩톤 2g/ℓ (NH)SO3g /ℓ, KHPO. 1HO 3g /ℓ, MgSO.7HO 2g /ℓ 를 함유하는 발효 배지 3ℓ 를 함유하는 발효조에서 종 발효액을 3% 의 양으로 접종하고 pH는 조정하지 않으면서 배양하였다. 배양 24,48,72 및 96시간마다 알코올 농도를 측정하여 발효율을 계산하였다.

결과를 제 3(a)도 및 제 3(b)도에 나타내었다. 제 3(a) 도는 공지균에 대한 결과이고 제 3(b) 도는 본 발명 균주에 대한 결과이다. 이들 결과로부터 알 수 있는 바와같이, 32℃ 배양에서는 공지균과 본 발명 균주가 시간 경과에 따라 거의 유사한 발효 패턴을 나타내지만, 40℃ 배양에서는 공지균이 24시간 경과후에는 발효율이 32℃에서의 발효보다 감소되기 시작하여 48시간 배양후에 발효율이 정지기앞에 도달하는 반면, 본 발명 균주는 24시간 경과후까지는 32℃에서와 동일한 발효율 유지하고 48시간 경과후에 발효율이 약간 상대적으로 감소하기는 하지만 공지균과 비교하여서는 훨씬 높은 발효율을 나타낸다.

따라서, 40℃에서 발효를 행하는 경우 본 발명 균주가 훨씬 유리하게 사용될 수 있다는 것이 입증된다.

[실시예4]

알코올 농도의 영향

본 발명의 균주의 알코올 내성을 알아보기 위하여 다음과 같이 실험을 행하였다.

폴리펩톤 1%, 효모 추출액 0.5% 및 포도당 2% 를 함유하는 기본 배지에 공지균인 사카로미세스 세리비시아에 B와 본 발명 균주 RA-72-2(KCTC-8633P)를 접종한 직후 무수 알코올(99.9%, v/v)을 2,4,6,8,10,12,14 및 16% (v/v)의 농도로 첨가하고 각각 30℃ 및 41℃에서 배양을 행하였다. 각 알코올 농도 및 온도별로 균의 생육을 660nm에서의 흡광도로 측정하였다. 그 결과를 제 4(a)도 (30℃) 및 제 4(b) 도 (41℃)에 나타내었다. 이들 도면에서 △-△는 공지균을, 그리고 □-□는 본 발명 균주를 나타낸다.

제 4(a)도 및 제 4(b)도에서 알 수 있는 바와같이, 30℃에서는 공지균과 본 발명 균주에 있어서 알코올 농도가 미치는 영향이 거의 동일한 패턴을 나타내지만 41℃의 고온에서는 본 발명 균주가 공지균보다 우수한 알코올 내성을 나타냄을 알 수 있다. 따라서, 본 발명 균주는 40℃ 정도의 고온에서의 알코올 발효에 유리하게 이용될 수 있다.

[실시예5]

알코올 발효에서의 온도의 영향(2)

실시예3과 동일하게 실시하되, 발효 온도를 30℃, 37℃, 41℃, 43℃ 및 45℃로 하여 96시간동안 알코올 발효를 행하고, 각 균주가 이들 온도별로 나타내는 발효율을 막대 그래프로 나타내었다.

결과를 제 5 도에 나타내었다. 제 5 도에서 알 수 있는 바와같이, 본 발명 균주와 공지균들 사카로미세스 세레비시아에 B,D 및 F는 30℃에서는 거의 유사한 발효율을 나타내지만, 37℃ 이상에서는 본 발명의 균주가 월등히 높은 발효율을 나타낸다. 특히 공지균들은 41℃ 이상에서는 거의 발효능을 상실하지만 본 발명 균주는 41~43℃의 온도범위에서도 우수한 발효능을 유지한다.

[실시예6]

글루코스 농도의 영향

폴리펩톤 1%, 효모엑기스 0.5%에 포도당을 0,5,10,20,30,40, 또는 50% 씩 첨가하고, 공지균인 사카로미세스 세레비시아에 B와 본 발명 균주 RA-72-2(KCTC-8633P)를 각각 30℃ 및 40℃ 에서 배양을 행하였다. 각 글루코스 농도 및 온도별로 균의 생육을 660nm에서의 흡광도로 측정하였다. 그 결과를 제 6(a)도 (30℃)및 제 6(b)도 (40℃)에 나타내었다. 이들 도면에서 △-△는 공지균을, 그리고 □-□는 본 발명 균주를 나타낸다.

제 6(a)도 및 제 6(b)도에서 알 수 있는 바와같이, 30℃에서는 공지균과 본 발명 균주에 있어서 알코올 농도가 미치는 영향이 거의 동일한 패턴을 나타내지만 40℃의 고온에서는 본 발명 균주가 공지균보다 우수한 알코올 내성을 나타냄을 알 수 있다. 따라서, 본 발명 균주는 40℃ 정도의 고온에서의 알코올 발효에 유리하게 이용할 수 있다.

Claims (3)

1. 알코올 발효능을 갖는 내열성 효모 사카로미세스 세레비시아에 (Saccharomyces cerevisiae) RA-72-2(KCTC-8633P).
2. 알코올 발효능을 갖는 내열성 사카로미세스 세레비시아에 (Saccharomyces cerevisiae) RA-72-2(KCTC-8633P)를 발효균주로 이용하여 35℃이상의 온도에서 발효를 행함을 특징으로 하는 고온 알코올 발효방법.
3. 30℃ 정도의 온도에서 알코올 발효 효모를 이용하여 알코올 발효를 행하는 방법에 있어서, 상기 알코올 발효 효모는 내열성 효모 사카로미세스 세레비시아에 (Saccharomyces cerevisiae) RA-72-2(KCTC-8633P)이고 발효조를 냉각처리하지 않음을 특징으로 하는 발효방법.