CN109680054A - 一种低频dna突变的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于DNA文库构建的接头混合物，以及利用该接头混合物的DNA突变检测方法。本发明通过在建库前修复DNA片段的氧化损伤，并在每条DNA片段中导入特异性的内参序列，辅以独特的数据分析方法，排除氧化损伤、PCR引入或测序产生的假阳性突变，从而提高低频DNA突变检测的灵敏度和特异性。

Description

一种低频DNA突变的检测方法
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，特别涉及一种针对低频DNA突变的检测方法。
背景技术
随着分子生物学研究的深入，携带遗传信息的DNA被证实与人体健康密切相关，尤其是越来越多的疾病被证实与基因或蛋白质的变异相关。在这样的背景下，通过分子生物学方法检测人体DNA的临床应用前景非常广阔。目前，广泛应用的DNA突变检测方法包括聚合酶链式反应(PCR)、荧光原位杂交技术(FISH)、基因芯片(gene chip)、Sanger测序等。
低频突变是指存在于大量野生基因序列背景中的极为稀少的基因突变。低频突变最为常见的例子就是发生在肿瘤细胞中的基因变异，许多引起肿瘤的体细胞突变都是掺杂在野生型细胞内的，所得到的DNA样本中会带有大量野生型DNA。
肿瘤是一种符合达尔文进化特征的疾病，异质性是恶性肿瘤的特征之一。肿瘤在生长过程中，经过多次***增殖，其子细胞呈现出分子生物学及基因组方面的多样化改变，从而使肿瘤的生长速度、侵袭能力、对药物的敏感性、预后等各方面产生了相当大的差异。肿瘤的异质性是目前抗肿瘤靶向药物治疗效果的首要制约因素，因而实时、高灵敏度的无创DNA检测方法对肿瘤的诊断意义重大。
ctDNA(circulating tumor DNA)即循环肿瘤DNA，是一种无细胞状态的胞外DNA，存在于血液、滑膜液和脑脊液等体液中。这些ctDNA携带了与肿瘤细胞中一样的基因突变信息，同样可以用于肿瘤的早期检测、靶向用药和预后检测。ctDNA半衰期较短，能准确反映患者肿瘤当前的突变状态，可以作为肿瘤治疗的实时指示信息。另外，ctDNA是无创取样，从突变信息上说更能反映肿瘤基因突变的全貌，因此，以ctDNA为检测对象的液体活检技术具有其优越性，应用也越来越受到重视。而对于肿瘤已出现扩散或状态难以耐受组织活检的患者，ctDNA检测更是当下唯一的选择。
虽然ctDNA检测技术具有很大潜力，但要将其广泛应用于临床还需克服诸多障碍。血液中游离DNA含量很少，平均1ml血浆中只能提取到约10ng左右总游离DNA，而ctDNA占总游离DNA比例较低，一般只有0.1％～10％。所以，低频突变位点检测是目前ctDNA检测技术遇到的一个瓶颈。
低频突变检测方法中，Sanger测序法被视为“金标准”。但是Sanger测序的灵敏度有限，在大量野生型基因的背景下，Sanger测序仅能检测到含有5％的突变，所以不适于对ctDNA的检测。目前用于ctDNA突变检测的技术主要有ARMS法(主要是Super-ARMS)、数字PCR(dPCR，包括BEAMing技术)和第二代测序(NGS)。Super-ARMS及数字PCR技术简便快速，特异性及灵敏度均较高，缺点是只能检测有限个数的已知突变，通量低。NGS通量高，检测基因数量不受限，可检测已知或未知突变，让使用液体活检来分析微量ctDNA成为可能。
NGS针对多基因突变的检测，假阴性结果通常可以通过简单的加大测序数据量，即增加测序深度等方式予以抑制。但由于ctDNA本身的特殊性，所采集的样本量通常较低，加大测序数据量会造成大量的重复序列(duplicate)，测序深度的增加与数据量的增加并不具有线性关系。因此实际应用时，测序产生的成本十分高昂，而对假阴性的抑制效果却并不理想。
而对于假阳性结果，由于原理层面所存在的缺陷，目前尚缺乏简单的控制手段。这就造成了NGS应用于ctDNA检测时，检测灵敏度时常不能满足所需，假阳性的出现导致错误的医疗指导策略风险增加等问题。
目前制约NGS检测灵敏度的问题及缺陷主要有以下3点：(1)二代测序平台错误率：目前测序精度最高的二代测序平台度Illumina NextSeq的单碱基测序错误率约为0.01％～1％之间。在0.1％及以下的检测限的情况下，难以将ctDNA突变与测序错误相区分，制约了检测的特异度。(2)PCR引入的碱基错配：由于ctDNA本身的特性所限，其起始样本量通常较少，因而在进行文库构建时均需要通过PCR为手段，进行检测信号的放大，以满足测序反应下限所需。而目前在PCR技术中所应用的高保真酶，其DNA的复制随机错误率约为10-6。PCR反应所引入的碱基错配会与正常组织DNA背景下低频ctDNA的真实突变相混淆，极大的干扰检测的灵敏度及特异性。(3)ctDNA的氧化性损伤：最新研究表明ctDNA在体外环境的保存及富集处理过程中均会受到一定的氧化损伤。其中以8-羟基-鸟嘌呤(8-oxo-dG)最为常见，该损伤经文库制备流程的PCR反应，极易错误配对腺嘌呤，导致在建库过程中人为的引入G→T突变，造成最终测序结果假阳性的出现。有报道甚至称该类型的假阳性突变，多达公共基因组数据库总收录的G→T型突变的三分之一以上。而存在的其他各类DNA氧化损伤造成的检测数据错误亦不能小觑(图1)。
发明内容
为了解决低频DNA突变检测中存在的上述问题，本发明通过在建库前修复DNA片段的氧化损伤，并在每条DNA片段中导入特异性的内参序列，辅以独特的数据分析方法，排除氧化损伤、PCR引入或测序产生的假阳性突变，从而提高低频DNA突变检测的灵敏度和特异性。
本发明所使用的接头为特殊设计合成的序列进行退火而成，它是本发明排除假阳性突变干扰的关键。
因此，本发明的第一方面提供了一种用于DNA文库构建的接头混合物。所述接头混合物包括含有不同内参序列的多种Y型双链接头，每种Y型接头均由以下结构的第一链和第二链组成(图2)：
第一链：5’-A1区-B1区-C1区-T-3’，
第二链：3’-A2区-B2区-C2区-p-5’；
其中，A2区与A1区不互补，B2区与B1区互补，C2区与C1区互补，T为胸腺嘧啶，p表示第二链的5’末端磷酸化；
所述接头混合物中的多种双链接头的A1区、A2区、B1区、B2区的序列分别相同；C1区、C2区为内参序列，由随机核苷酸序列组成，且多种双链接头的内参序列互不相同。
在一个特定的实施方案中，A1区包括P5序列，A2区包括P7互补序列。P5序列和P7序列是广泛使用的建库接头序列，可针对其设计引物用于文库扩增。
当用于多样本建库时，A1区和/或A2区还可以包括标签序列，优选地，所述标签序列由6个核苷酸组成，更优选地，所述标签序列位于A1区的3’末端和/或A2区的5’末端。最优选地，A1区和A2区包括不同的标签序列，两条标签序列可以进行双重检验，这样可以将在各个阶段由于串扰而导致的index misassignment的Reads有效识别，并剔除，保证进入最终分析流程的Reads可以代表真实样品。
在一个特定的实施方案中，第一链和第二链的序列分别为5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAGGCTCTTCCGATCNNNNNT-3’和5’-pNNNNNGATCGGAAGAGCACACGTTCTGAACTCCAGTCACCGATGTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’。
本发明的接头混合物用于DNA文库构建时，每条DNA片段连接具有独特内参序列的两个接头，通过这两个内参序列作为该DNA片段的唯一标识，并且将该DNA片段在扩增和测序前的状态固定了下来。在此基础上，测序完成后，通过对Reads数据的分析，可以识别和排除假阳性突变。
进一步地，本发明的第二方面提供了一种低频DNA突变的检测方法，包括以下步骤：
(1)从样本中提取总DNA；
(2)总DNA的氧化损伤修复与纯化；
(3)修复的总DNA片段的末端补齐及3’末端添加A碱基；
(4)DNA片段与本发明的接头混合物进行连接；
(5)基于探针的目标区域杂交捕获；
(6)文库扩增；
(7)上机测序；
(8)测序数据分析。
检测样本可以是含有DNA的任何样本，例如：血液、羊水、组织等。检测的低频DNA突变可以是已知突变，也可以是未知突变。
在一个特定的实施方案中，检测样本为血液。上述步骤(1)首先从采集的血液样本中分离出血浆，然后从血浆中提取纯化出总游离DNA；优选地，血浆的分离采用两步离心法，全血1600g离心10min取上清，上清16000g再离心10min，第二步离心所得上清即为血浆。
如果样本中提取的总DNA分子较长，为了上机测序，需要对其进行片段化处理，片段化可在氧化损伤修复之前或之后进行。片段化处理的要求视样本类型和测序***的读长而定。在一个特定的实施方案中，样本为血液样本中的游离DNA，其长度一般为170bp左右，一般的二代测序仪对该长度的核酸分子均可直接测序，故无需片段化处理即可进行下一步的操作。
步骤(2)对总DNA的氧化损伤修复能够使氧化产生的大部分8-羟基-鸟嘌呤被还原，这能够极大减少由于氧化损伤导致的假阳性突变，从而提高检测的准确性。优选地，步骤(2)使用NEB公司的FFPE DNA Repair Mix体系对总DNA进行氧化损伤修复。
步骤(3)中将修复的总DNA片段末端补齐成为平端，并在3’末端添加A碱基，以便于下一步的连接。步骤(4)中，利用接头第一链3’末端的T碱基与DNA片段3’末端添加的A碱基通过氢键连接，然后通常使用T4DNA连接酶连接DNA片段与接头。
在一个特定的实施方案中，步骤(5)将RNA探针与上述步骤(4)得到的连接产物杂交，然后用生物素亲和磁珠捕获杂交文库。步骤(6)使用基于第一链A1区和第二链A2区设计的引物PCR扩增文库。
本发明的方法适用于各种测序方法，尤其是二代测序，最适用于Illumina公司的NextSeq测序平台。
由于突变基因型在DNA片段的两条链上都是突变碱基，按照本发明的方法扩增之后得到的所有片段都包含该位点的突变，而氧化损伤、PCR扩增或测序引入的突变则只存在于一条DNA片段的一条链上，经过扩增之后只有部分片段包含该位点的突变。因此，在步骤(8)中，将两端连接的内参序列均相同或互补的Reads数据整合，如果这一组Reads数据相同，则形成一条Group数据；如果这一组Reads数据不同，则作为异常数据抛弃。然后，以Group数据为单位，与Ref标准数据进行比对，发现突变基因型，并进一步以突变型Group数占总Group数的比例计算突变频率。
附图说明
图1目前针对ctDNA检测常用的接头连接建库方法，氧化损伤产生的错误会造成假阳性。其原理如下：
(1)氧化产生的8-羟基-鸟嘌呤(G+)随机发生在双链上，T#为真实突变；
(2)双链链接“Y”字型测序接头；
(3)经过PCR反应，8-羟基-鸟嘌呤(G+)错误的与腺嘌呤A配对，进而扩增为胸腺嘧啶T，TΔ为PCR错误产生的错配；
(4)测序结果进行数据分析时，产生的配对错误造成假阳性。
图2本发明的Y型接头。A2区与A1区不互补，B2区与B1区互补，C2区与C1区互补，T为胸腺嘧啶，p表示第二链的5’末端磷酸化。
图3本发明的实现流程。
图4本发明的原理，极大提高了检测灵敏度。其原理如下：
(1)氧化产生的8-羟基-鸟嘌呤(G+)随机发生在双链上，T#为真实突变；
(2)氧化产生的8-羟基-鸟嘌呤(G+)经修复大部分被还原正常，少部分仍存在未被修复的氧化损伤；
(3)双链连接特殊设计，带有内参序列且自退火的“Y”字型测序接头，此处内参序列以“GTTCA”及“ATCGG”为例；
(4)经过PCR反应，少数8-羟基-鸟嘌呤(G+)错误的与腺嘌呤A配对，进而扩增为胸腺嘧啶T，而内参序列引入双链，TΔ为PCR错误产生的错配；
(5)在与Ref标准序列比对前，将含有同一内参序列的“GTTCAATCGG”及互补的“CAAGTTAGCC”的Reads数据进行整合，形成Group数据或抛弃异常数据；
(6)以Group数据为单位，与Ref标准数据进行对比，以ctDNA为目标的突变分析特异性极大地提高。
图5本发明处理文库的片段长度。
图6本发明处理文库定量数据。
图7数字PCR EGFR p.T790M位点验证数据。
具体实施方式
下面结合实例，进一步说明本发明。
实施例1DNA样品制备
取非小细胞肺癌患者全血30ml，采用streck公司的BCT管3管常温运输，运输时间约46小时。
血浆的分离采用两步离心法，即全血1600g离心10min取上清；前步上清16000g离心10min，所得上清即为血浆。
分离好的血浆取2份随即使用Qiagen公司的QIAamp Circulating Nucleic AcidKit，分别进行总游离DNA的提取，提取量见表1。
表1
样品名称 样本提取量
SLZ1 68.5ng
SLZ2 57.3ng
实施例2DNA氧化损伤修复
取实施例1制备的其中一份DNA样品，参照表2的配比准备DNA氧化损伤修复反应混合液。
表2
DNA修复缓冲液及酶混合液为NEB公司的FFPE DNA Repair Mix体系。
将上述体系移入PCR仪中，20℃，15分钟，进行DNA的氧化损伤的修复。而后加入186μl AMPure XP磁珠(购自Beckman)进行纯化，以50μl无核酸酶水进行洗脱。
实施例3DNA片段的末端补齐与3’末端添加A碱基
取实施例2修复的总游离DNA片段，参照表3配比准备反应混合液。本实例中末端修复及加A缓冲液与末端修复及加A酶混合液使用KAPA Hyper Prep Kit。
表3
将上述体系移入PCR仪中，按表4设置程序进行反应。
表4
实施例4接头连接
本发明所使用的接头为特殊设计合成的序列进行退火而成。本实例中使用包含Illumina Index 1(ATCACG)标签序列的接头(参见表5)，其中“NNNNN”为内参序列，N即ATGC四种碱基的多义碱基。
表5
按照表6的配比准备反应混合液。
表6
连接缓冲液为50mM Tris-HCl、10mM MgSO4、1mM ATP。
将配好的体系分为2管，每管55μl，放于PCR仪上，25℃反应45min。反应结束后，使用0.8×的AMPure XP磁珠纯化DNA样本。
实施例5基于探针的目标区域杂交捕获
将实施例4得到的接头连接产物与5μl封闭试剂混合，移入PCR仪中，按表7设置程序进行反应。
表7
用于目标区域杂交捕获的RNA探针可在Aglient公司SureSelect官网(https://earray.chem.agilent.com/suredesign/home.htm)上根据需要捕获的目标区域自行设计。本实例使用的探针总数为677个，捕获目标区域28.583kb，覆盖EGFR、ERBB2、ALK、ROS1、RET、BRAF、KRAS、NRAS、PIK3CA、MET、DD2、PTEN、FGFR1等13个基因的部分位点。探针设计的目标区域具体范围如表8所示。
表8
按照表9的配比准备探针杂交混合液，在探针加入步骤中，将该体系加入封闭后的接头连接产物中。其中，杂交缓冲液为Aglient SureSelectXT Reagent Kit，RNA酶抑制剂购自Thermo Fisher Scientific。
表9
反应结束后，使用生物素亲和磁珠捕获杂交文库，本例中使用Dynabeads MyOneStreptavidin T1(Thermo Fisher Scientific)。
实施例6文库扩增
按照表10的配比准备文库扩增反应混合液。
表10
本实例中DNA聚合酶及PCR缓冲液使用KAPA Hyper Prep Kit。
放入PCR仪，按表11设置程序反应。
表11
反应结束后，采用1.2×的AMPure XP磁珠对扩增产物进行纯化，最后将文库溶于50μl NF-water中。采用Thermo Fisher Scientific公司Qubit 3.0荧光计对文库进行精确定量。
将纯化产物稀释到1.5ng/μl，取1μl使用Aglient公司2100Bioanalyzer进行片段大小检测(图5)；
取出1μl使用KAPA公司的文库定量试剂盒，以Roche公司480Ⅱ平台，进行qPCR有效文库定量检测(图6)。
实施例7测序
根据实施例6所测得的浓度，将文库稀释到上机要求后(2nM)，在Illumina公司NextSeq测序平台上进行PE150测序。
根据本实例所使用捕获探针区域大小，测序总数据量应大于5G，目标区域数据占比大于20％，平均测序深度30000×以上。
合并相同内参序列Group时平均同一内参序列支持数6个reads以上。
合并后平均测序Group深度3000×以上，目标区域测序深度大于2000×的在90％以上。
本实例中的样本质控数据见表12。
表12
数据量(G) 目标区域 平均测序深度 合并后平均测序深度 大于2000×占比
5.7 26.7％ 53244 4126 92.7％
本实例中所使用样本经数据分析，检测突变信息见表13。
表13
注释 参考基因型 突变基因型 总Group数 突变型Group数 突变频率
EGFR p.T790M C T 4768 7 0.147％
本实例中，使用Raindance公司的Raindrop数字PCR平台，对本实例样本的检测结果进行验证。选取检测位点EGFR p.T790M，验证的结果为带有0.1825％频率的EGFRp.T790M阳性突变(图7)，这与本发明提供的方法的检测结果一致性很高。
数字PCR检出的EGFR p.T790M突变频率略高，可能来源于ctDNA样本的氧化损伤，而经本流程处理，测序用样本损伤已被修复。
特别的，本建库方法使用Horizon公司的ctDNA标准品进行常见突变测试，检测结果与预期一致度很高(表14)。
表14
Gene pHGVS Mutation Standard Result Wild Standard Result
EGFR L858R 0.10％ 0.076％ 0％ 0.00％
EGFR E746_A750del 0.10％ 0.089％ 0％ 0.00％
EGFR T790M 0.10％ 0.085％ 0％ 0.00％
EGFR V769_D770insASV 0.10％ 0.077％ 0％ 0.00％
KRAS G12D 0.13％ 0.131％ 0％ 0.00％
NRAS Q61K 0.13％ 0.117％ 0％ 0.00％
NRAS A59T 0.13％ 0.136％ 0％ 0.00％
PIK3CA E545K 0.13％ 0.116％ 0％ 0.00％
序列表
<110> 北京中源维康基因科技有限公司
<120> 一种低频DNA突变的检测方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 1
aatgatacgg cgaccaccga 20
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<212> DNA
<213> Artificial
<400> 2
tcgtatgccg tcttctgctt g 21
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<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 3
gctcttccga tc 12
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<211> 12
<212> DNA
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<400> 4
gatcggaaga gc 12
<210> 5
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<221> misc_feature
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<222> (1)..(5)
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<400> 6
nnnnngatcg gaagagcaca cgttctgaac tccagtcacc gatgtatctc gtatgccgtc 60
ttctgcttg 69

Claims (16)

1.一种用于DNA文库构建的接头混合物，其特征在于：所述接头混合物包括多种由以下结构的第一链和第二链组成的Y型双链接头：
第一链：5’-A1区-B1区-C1区-T-3’，
第二链：3’-A2区-B2区-C2区-p-5’；
其中，A2区与A1区不互补，B2区与B1区互补，C2区与C1区互补，T为胸腺嘧啶，p表示第2链的5’末端磷酸化；
所述接头混合物中的多种双链接头的A1区、A2区、B1区、B2区的序列分别相同；C1区、C2区为内参序列，由随机核苷酸序列组成，且多种双链接头的内参序列互不相同。
2.权利要求1的接头混合物，其中，A1区包括P5序列，A2区包括P7互补序列，优选地，所述P5序列和P7互补序列分别如SEQ ID NO：1和2所示。
3.权利要求1或2的接头混合物，其中，A1区和/或A2区包括标签序列，优选地，所述标签序列由6个核苷酸组成，更优选地，所述标签序列位于A1区的3’末端和/或A2区的5’末端。
4.权利要求1的接头混合物，其中，B1区包括SEQ ID NO：3的序列，B2区包括SEQ ID NO：4的序列。
5.权利要求1的接头混合物，其中，C1区、C2区是由5个核苷酸组成的随机核苷酸序列。
6.一种低频DNA突变的检测方法，包括以下步骤：
(1)从样本中提取总DNA；
(2)总DNA的氧化损伤修复与纯化；必要时，在修复前或修复后对总DNA进行片段化处理；
(3)修复的总DNA片段的末端补齐及3’末端添加A碱基；
(4)DNA片段与权利要求1-5任一项的接头混合物进行连接；
(5)基于探针的目标区域杂交捕获；
(6)文库扩增；
(7)上机测序；
(8)测序数据分析。
7.权利要求6的检测方法，其中，所述样本为血液。
8.权利要求7的检测方法，其中，步骤(1)首先从采集的血液样本中分离出血浆，然后从血浆中提取纯化出总游离DNA；优选地，血浆的分离采用两步离心法，全血1600g离心10min取上清，上清16000g再离心10min，第二步离心所得上清即为血浆。
9.权利要求6的检测方法，其中，步骤(2)使用NEB公司的FFPE DNA Repair Mix体系对总DNA进行氧化损伤修复。
10.权利要求6的检测方法，其中，步骤(4)使用T4 DNA连接酶连接DNA片段与接头。
11.权利要求6的检测方法，其中，步骤(5)将RNA探针与步骤(4)得到的连接产物杂交，然后用生物素亲和磁珠捕获杂交文库。
12.权利要求6的检测方法，其中，步骤(6)使用基于第一链A1区和第二链A2区设计的引物PCR扩增文库。
13.权利要求6的检测方法，其中，步骤(7)使用二代测序平台进行测序，优选地，在Illumina公司的NextSeq测序平台进行测序。
14.权利要求6的检测方法，其中，步骤(8)中，将两端连接的内参序列均相同或互补的Reads数据整合，如果这一组Reads数据相同，则形成一条Group数据；如果这一组Reads数据不同，则作为异常数据抛弃。
15.权利要求14的检测方法，其中，步骤(8)中，进一步以Group数据为单位，与Ref标准数据进行比对，发现突变基因型，然后以突变型Group数占总Group数的比例计算突变频率。
16.权利要求6-15任一项的检测方法，其中，所述低频DNA突变为ctDNA携带的基因突变。
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