CN116635426A - 特异性结合cd47的抗体及其抗原结合片段 - Google Patents
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Abstract
提供了一种特异性结合CD47的抗体及其抗原结合片段。该抗体及其抗原结合片段的特异性和稳定性高，能够特异性阻断CD47‑SIPRα通路，并且在一定浓度范围内不引起红细胞凝集，能够在体内显著抑制肿瘤的生长。
Description
本发明涉及抗体及抗体人源化改造研究领域，具体而言，本发明涉及一种能够特异性结合CD47的抗体及其抗原结合片段。
CD47也称为整合素相关蛋白(integrin associated protein,IAP)，属于免疫球蛋白超家族，其结构主要包括胞外免疫球蛋白可变区式样结构域、高度疏水的5次跨膜区和胞内选择性拼接的羧基端胞质尾区。CD47广泛表达于细胞表面，可以结合信号调节蛋白SIPRα、整合素和血小板反应蛋白TSP1，涉及多种生理功能，主要作用是通过与吞噬细胞表面的SIPRα结合而来抑制巨噬细胞的吞噬作用。SIPRα也是免疫球蛋白超家族的一员，其胞内区含有富含酪氨酸的免疫抑制性基序(ITIM)。当CD47与巨噬细胞表面的SIPRα结合时，ITIM发生磷酸化并与下游分子SHP1/SHP2结合，阻止肌球蛋白在吞噬突触亚膜的积累来抑制吞噬作用。在正常情况下，CD47是“自我”信号，代表“别吃我”，能阻碍吞噬作用的自身攻击；在病理情况下，CD47在肿瘤细胞上高表达，帮助肿瘤细胞逃避吞噬细胞的监控(Science,2000,288(5473):2051-2054；Trends in Cell Biology,2001,11(3):130-135.)。
肿瘤研究发现，CD47在多种人类肿瘤类型中表达，包括急性骨髓白血病、慢性骨髓白血病、急性淋巴细胞白血病、非霍金性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、膀胱癌和其他实体瘤。肿瘤细胞通过上调高表达的CD47，与SIPRα结合，借以逃避巨噬细胞的免疫监视。因此，通过阻断CD47-SIPRα之间的相互作用(CD47抗体或者SIPRα-Fc)可以激活巨噬细胞对肿瘤的吞噬作用以及通过DC细胞递呈抗原给CD8+T细胞而发挥CD8+T细胞对肿瘤的特异性杀伤作用(Current Opinion in Immunology,2012,24(2):225-232；Nature Medicine,2015,21(10):1209.)。
阻断CD47-SIPRα通路的抗体应用前景广泛，因为几乎所有的肿瘤细胞类型都表达CD47，在抗肿瘤中具有广谱性；CD47作为免疫检查点，有研究发现CD47抗体与抗其他免疫检查点CTLA4/PD-1药物联用能增强药效。但由于红细胞也表达CD47，CD47抗体的安全性需要考虑。研究发现，巨噬细胞发挥吞噬作用除了有阻断CD47的“别吃 我”信号，还要有钙网织蛋白(CRT)介导的“吃我”信号。通常情况下，肿瘤细胞高表达钙网织蛋白，而正常细胞不表达。另外，在筛选CD47抗体时挑选不引起红细胞凝集的抗体，并且抗体采用IgG4形式，就不会激活巨噬细胞对红细胞的吞噬。本领域依然存在对抗CD47抗体的需求。
发明内容
在一个方面，本发明涉及一种分离的抗人CD47抗体、其抗原结合片段或其变体，其中所述抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区和/或重链可变区，其中
轻链可变区的LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID No.1、2和3所示；和/或
重链可变区的HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；重链可变区的HCDR2的氨基酸序列与SEQ ID No.5或6具有至少约94％的同一性；重链可变区的HCDR3的氨基酸序列与SEQ ID No.7或8具有至少约78％的同一性；或者
所示轻链可变区或重链可变区的CDR的氨基酸序列分别与SEQ ID No.1-8所示序列具有至少70％的同一性且保留相应母体序列生物活性的变体序列，所述同一性如至少约75％、约80％、约85％、约90％或约95％或更高；或者
所述轻链可变区或重链可变区的CDR的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：1-8所示序列经删除、替换和/或添加一个或多个氨基酸残基后获得的保留相应母体序列生物活性的变体序列，如1个、2个、3个或4个或更多个氨基酸残基；
其中所述变体选自嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体之一。
在一些实施方案中，所述抗体的重链恒定区序列选自人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD之一的恒定区序列，和/或，所述抗体的轻链恒定区序列选自κ链或λ链；优选地，重链恒定区序列选自IgG1或者IgG4的恒定区序列，和/或轻链恒定区序列选自轻链κ链的恒定区序列。
在一些实施方案中，CD47嵌合抗体或其功能片段的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.9或10所示；或与SEQ ID No.9或10所示序列具有至少70％的同一性且保留相应母体序列生物活性，所述同一性如至少约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高；或为SEQ ID NO.9或10所示序列经删除、替换和/或添加一个或多个氨基酸残基后获得的保留相应母体序列生物活性的变体序列，如1个、2 个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个或更多个氨基酸残基；和/或重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.11或12所示；或与SEQ ID No.11或12所示序列具有至少70％的同一性且保留相应母体序列生物活性，所述同一性如至少约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高；或为SEQ ID NO.11或12所示序列经删除、替换和/或添加一个或多个氨基酸残基后获得的保留相应母体序列生物活性的变体序列，如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个或更多个氨基酸残基；和/或
所述CD47嵌合抗体及其功能片段的轻链恒定区和重链恒定区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14-16所示；或分别与SEQ ID No.13和SEQ ID NO.14-16所示序列具有至少70％的同一性且保留相应母体序列生物活性，所述同一性如至少约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.2％、约99.5％或更高；或为SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14-16所示序列分别经删除、替换和/或添加一个或多个氨基酸残基后获得的保留相应母体序列生物活性的变体序列，如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个或更多个氨基酸残基。
在一些实施方案中，所述抗人CD47抗体、其抗原结合片段或其变体的轻链可变区骨架区包括FR-L1、FR-L2、FR-L3及FR-L4，重链可变区骨架区包括FR-H1、FR-H2、FR-H3及FR-H4，和/或其中，
所述FR-L1的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示；
所述FR-L2的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示，或是进一步经过以下取代之一或其任意组合所得到的氨基酸序列：
第12个氨基酸R替换为T；
所述FR-L3的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示，或是进一步经过以下取代之一或其任意组合所得到的氨基酸序列：
第31个氨基酸Y替换为F；
所述FR-L4的氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示；
所述FR-H1的氨基酸序列如SEQ ID NO.21所示；
所述FR-H2的氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示；
所述FR-H3的氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示，或是经过以下取代之一或其任意组合所得到的氨基酸序列：
第8个氨基酸E替换为T，
第11个氨基酸S替换为N，
第31个氨基酸A替换为V；和/或
所述FR-H4的氨基酸序列如SEQ ID NO.24所示。
在一些实施方案中，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.25-27任一项所示，和/或所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.28-33任一项所示；或者，是与SEQ ID NO.25-27或28-33所示氨基酸序列具有至少70％的同一性且保留相应母体序列生物活性的变体序列，所述同一性如至少约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高；或者，是SEQ ID NO.25-27或28-33所示序列经删除、替换和/或添加一个或多个氨基酸残基后获得的保留相应母体序列生物活性的变体序列，如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个或更多个氨基酸残基；
优选地，轻链可变区序列如SEQ ID NO.26或27所示，和/或重链可变区序列如SEQ ID NO.33所示。
本领域公知，在提及同一性时，由于氨基酸序列的长度只能是自然数，因此，实际计算获得的同一性数值可能并非是如95％一样的有限位的百分数，而是与如95％这样的百分数接近的数字，例如对于117位氨基酸残基的可变区序列，当仅有一位氨基酸残基发生改变时，其对应的同一性百分数实际为接近99.15％的百分数，但为方便起见，这样的数字在本文中仅标记为99％。
在一些实施方案中，所述抗原结合片段选自F(ab')
2、Fab'、Fab、Fd、Fv、scFv、双特异抗体、骆驼抗体、CDR和抗体最小识别单位(dAb)中的一种或多种，优选地，所述抗原结合片段为Fab、F(ab')
2或scFv。
本发明的另一方面涉及一种分离的核酸分子，其选自：
(1)DNA或RNA，其编码如上所述的抗人CD47抗体、其抗原结合片段或其变体；
(2)与(1)中定义的核酸完全互补的核酸。
本发明的再一方面涉及一种载体，其包含有效连接的如上所述的核酸分子，优选地，所述载体为表达载体。
本发明的一个方面涉及一种宿主细胞，其包含如上所述的核酸分子或载体。
本发明的另一个方面涉及一种组合物，其包含如上所述的抗人CD47抗体、其抗原结合片段或其变体，如上所述的核酸分子，如上所述的载体或如上所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本发明的再一方面涉及一种生产如上所述的抗人CD47抗体、其抗原结合片段或其变体的方法，其包括步骤：
将如上所述的宿主细胞在适合所述抗人CD47抗体、其抗原结合片段或其变体表达的培养条件下表达，任选地，分离、纯化所得的产物。
本发明的另一方面涉及如上所述的抗人CD47抗体、其抗原结合片段或其变体，如上所述的核酸分子，如上所述的载体或如上所述的宿主细胞在制备用于预防和/或治疗CD47介导的疾病或病症如自身免疫性疾病、针对移植物的免疫应答、***反应、感染性疾病、神经退行性疾病和肿瘤的药物中的用途。
本发明的另一方面涉及如上所述的抗人CD47抗体、其抗原结合片段或其变体，如上所述的核酸分子，如上所述的载体或如上所述的宿主细胞，其用于预防和/或治疗CD47介导的疾病或病症如自身免疫性疾病、针对移植物的免疫应答、***反应、感染性疾病、神经退行性疾病和肿瘤。
本发明的另一方面涉及一种预防和/或治疗CD47介导的疾病或病症如自身免疫性疾病、针对移植物的免疫应答、***反应、感染性疾病、神经退行性疾病和肿瘤的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用如上所述的抗人CD47抗体、其抗原结合片段或其变体，如上所述的核酸分子，如上所述的载体或如上所述的宿主细胞。
在一些实施方案中，所述自身免疫性疾病选自关节炎、风湿性关节炎、银屑病、多发性硬化症、溃疡性结肠炎、克罗恩病、***性红斑狼疮、肾小球肾炎、扩张型心肌病样疾病、斯耶格伦氏综合征、过敏性接触性皮炎、多肌炎、硬皮病、动脉周性多动脉炎、风湿热、白癜风、胰岛素依赖性糖尿病、白塞氏综合征和慢性甲状腺炎的一种或多种；优选地，所述自身免疫性疾病选自关节炎、风湿性关节炎、银屑病、多发性硬化症、溃疡性结肠炎、克罗恩病、***性红斑狼疮、肾小球肾炎、风湿热、白癜风、胰岛素依赖性糖尿病和慢性甲状腺炎的一种或多种；更优选地，所述自身免疫性疾病选自风湿性关节炎、银屑病、多发性硬化症、溃疡性结肠炎、克罗恩病、***性红斑狼疮、胰岛素依赖性糖尿病和慢性甲状腺炎的一种或多种。
在一些实施方案中，所述针对移植物的免疫应答包括例如移植物抗宿主病。
在一些实施方案中，所述***反应选自荨麻疹、湿疹、血管神经性水肿、过敏性鼻炎、支气管哮喘、喉头水肿、食物过敏性胃肠炎、过敏性休克的一种或多种；优选地，所述***反应选自荨麻疹、湿疹、过敏性鼻炎、支气管哮喘、过敏性休克的一种或多种；更优选地，所述***反应选自过敏性鼻炎、支气管哮喘、过敏性休克的一种或多种。
在一些实施方案中，所述感染性疾病是指病毒、细菌、真菌、寄生虫等病原体及特定毒素侵入人体所引起的局部组织和全身性炎症反应。致病性病毒的例子包括例如HIV、(甲型、乙型和丙型)肝炎病毒、疱疹病毒(例如，VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II和CMV、EB病毒)、腺病毒、流感病毒、黄病毒、艾柯病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、冠状病毒、呼吸道合胞体病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、细小病毒、痘苗病毒、HTLV病毒、登革病毒、***状瘤、软疣病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒和虫媒脑炎病毒。致病性细菌包括例如梅毒菌、衣原体、立克次体菌、分枝杆菌、葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌、脑膜炎球菌和***(conococci)、克雷伯菌、变形菌、沙雷菌、假单胞菌、军团菌、白喉杆菌、沙门氏菌、芽孢杆菌、霍乱菌、破伤风菌、肉毒杆菌、炭疽菌、鼠疫菌、钩端螺旋体病菌和莱姆病菌。致病性真菌包括例如假丝酵母(白假丝酵母(Candida albicans)、克柔假丝酵母(Candida krusei)、光滑假丝酵母(Candidaglabrata)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)等)、新型隐球酵母(Cryptococcusneoformans)、曲霉(Aspergillus)(烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、黑曲霉(Aspergillus niger)等)、毛霉目(Mucorales)(毛霉(mucor)、犁头霉(bsidia)、根霉(rhizophus))、申克孢子丝菌(Sporothrix schenkii)、皮炎芽生菌(Blastomycesdermatitidis)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)和荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)。致病性寄生虫包括例如溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、结肠小袋纤毛虫(Balantidium coli)、福氏耐格里变形虫(Naegleria fowleri)、棘阿米巴属物种(Acanthamoeba sp.)、蓝氏贾第鞭毛虫(Giardialambia)、隐孢子虫属物种(Cryptosporidium sp.)、卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、田鼠巴贝虫(Babesia microti)、布氏锥虫(Trypanosomabrucei)、枯氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondi)和巴西日圆线虫(Nippostrongylus brasiliensis)。
在一些实施方案中，所述神经退行性疾病选自帕金森氏病、亨廷顿氏病、马查多-约瑟夫病、肌萎缩性侧索硬化症、克罗伊茨费尔特-雅各布病的一种或多种。优选地，所述神经退行性疾病选自帕金森氏病、亨廷顿氏病、肌萎缩性侧索硬化症的一种或多种；更优选地，所述神经退行性疾病选自帕金森氏病和亨廷顿氏病的一种或多种。
在一些实施方案中，所述肿瘤选自白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、脑肿瘤、头颈部鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、鼻咽癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、胆囊癌、肝癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、***、子宫内膜癌、子宫肉瘤、***癌、膀胱癌、尿路上皮癌、肾细胞癌、骨肉瘤、黑色素瘤和梅克尔细胞癌的一种或多种；优选地，所述肿瘤选 自淋巴瘤、骨髓瘤、头颈部鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、鼻咽癌、食道癌、胃癌、肝癌、结直肠癌、乳腺癌、***、子宫内膜癌、***癌、尿路上皮癌、肾细胞癌、骨肉瘤、黑色素瘤的一种或多种；更优选地，所述肿瘤选自淋巴瘤、头颈部鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、胃癌、肝癌、结直肠癌、***、尿路上皮癌、肾细胞癌、黑色素瘤的一种或多种。
在一些实施方案中，所述受试者选自哺乳动物，包括但不限于人和/或其它灵长类动物；哺乳动物，包括商业上相关的哺乳动物，如牛、猪、马、羊、猫、狗、小鼠和/或大鼠。
在一些实施方案中，本发明的抗人CD47抗体、其抗原结合片段或其变体，核酸分子，载体或宿主细胞以本领域的常规施用方法使用，例如胃肠外途径，例如静脉注射。
换言之，本发明通过杂交瘤手段获得了抗CD47单抗，并筛选了不引起红细胞凝集的抗体。通过采用IgG4的抗体形式，得到了能特异性阻断CD47-SIPRα通路，并且在一定浓度范围内不引起红细胞凝集的人源化的IgG4抗体。
本发明提供的抗体及其功能片段能够以1nM或者更小的K
D结合人的CD47特异性地结合CD47、阻断CD47与受体结合的活性、介导巨噬细胞吞噬肿瘤细胞和/或不引起红细胞凝集，可以用于预防和/或治疗自身免疫性疾病、针对移植物的免疫应答、***反应、感染性疾病、神经退行性疾病和肿瘤等。
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1显示了实施例1中抗人CD47阳性克隆分泌的抗人CD47鼠源单抗的体外活性。其中A图为鼠源单抗与CD47的结合活性；B图为鼠源单抗对CD47/SIRPα结合的封闭活性。
图2显示了实施例1中抗人CD47阳性克隆分泌的抗人CD47鼠源单抗对红细胞的影响。
图3显示了实施例3中抗人CD47嵌合单抗与人CD47的结合活性。
图4显示了实施例4中抗人CD47嵌合单抗的特异性。其中A图为种属特异性；B 图为结合特异性。
图5显示了实施例5中抗人CD47嵌合单抗对CD47/SIRPα结合的封闭活性。
图6显示了实施例6中抗人CD47嵌合单抗介导的肿瘤细胞吞噬活性。
图7显示了实施例7中抗人CD47嵌合单抗对红细胞的影响。
图8显示了实施例8中抗人CD47嵌合单抗的体内抗肿瘤药效。
图9显示了实施例10中抗人CD47人源化单抗的抗原结合活性。
图10显示了实施例11中抗人CD47人源化单抗对CD47/SIRPα结合的封闭活性。
图11显示了实施例13中抗人CD47人源化单抗对红细胞的影响。
图12显示了实施例16中抗人CD47人源化单抗的体内抗肿瘤药效。
定义
术语“CD47”是指整合素相关蛋白(integrin associated protein,IAP)，其可以是任何哺乳动物来源的CD47分子，在一些实施方案中，其是灵长类动物来源的CD47分子，在一些实施方案中，其是人类来源的CD47分子。
本文所用的术语“抗CD47抗体”、“抗CD47”、“CD47抗体”或“结合CD47的抗体”是指能够以足够的亲和力结合CD47蛋白或其片段的抗体以致所述抗体可以用作靶向CD47中的诊断剂和/或治疗剂。在某些实施方案中，抗CD47抗体结合到来自不同物种的CD47中保守的CD47的表位。
术语“抗体”是指免疫球蛋白分子或免疫球蛋白分子的具有结合到抗原的表位上的能力的片段。天然存在的抗体典型地包含四聚体，其通常由至少两条重(H)链和至少两条轻(L)链构成。免疫球蛋白包括如下同种型：IgG、IgA、IgM、IgD以及IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链、和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4亚型，IgA可分为IgA
1和IgA
2亚型。轻链根据恒定区的不同分为κ链和λ链。
在本文中，术语“抗体”以最广泛意义使用，指包含抗原结合位点的蛋白质，涵盖各种结构的天然抗体和人工抗体，包括但不限于完整抗体和抗体的抗原结合片段。
“可变区”或“可变结构域”是抗体的重链或轻链中参与抗体与其抗原的结合的结构域。抗体的每条重链由重链可变区(本文中简称为VH)和重链恒定区(本文中简称为CH)构成，重链恒定区通常由3个结构域(CH1、CH2和CH3)构成。每条轻链由轻链可 变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区(本文中缩写为CL)组成。重链和轻链可变区典型地负责抗原识别，而重链和轻链恒定域可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫***的各种细胞(例如，效应细胞)、Fc受体和经典补体***的第一组分(C1q))的结合。重链和轻链可变区含有与抗原相互作用的结合区。VH和VL区可以进一步细分成称作“互补性决定区(CDR)”的超变区(HVR)，它们中间穿插着更保守的称为“骨架区”(FR)的区域。每个VH和VL由三个CDR域和四个FR域构成，按以下顺序从氨基末端排到羧基末端：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
术语“互补决定区”或“CDR区”或“CDR”(在本文中与超变区“HVR”可以互换使用)即指抗体可变结构域中在序列上高变并且形成在结构上确定的环(“超变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”)的区域。CDR主要负责与抗原表位结合。在本文中，重链的三个CDR称为HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链的三个CDR称为LCDR1、LCDR2和LCDR3。
应该注意，基于不同的指派***获得的同一抗体的可变区的CDR的边界可能有所差异。即不同指派***下定义的同一抗体可变区的CDR序列有所不同。因此，在涉及用本发明定义的具体CDR序列限定抗体时，所述抗体的范围还涵盖了这样的抗体，其可变区序列包含所述的具体CDR序列，但是由于应用了不同的方案(例如不同的指派***规则或组合)而导致其所声称的CDR边界与本发明所定义的具体CDR边界不同。
术语“单抗”、“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指单分子组合物的抗体分子制剂，指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即包含个体抗体的群体除可能少量存在的天然发生的突变之外是相同的。常规的单克隆抗体组合物表现出对特定表位的单一结合特异性和亲和力。在某些实施方案中，单克隆抗体可以由多于一种Fab域构成，由此增加对多于一种靶标的特异性。术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”并不受限于任何具体的产生方法(例如，重组的、转基因的、杂交瘤等)。
术语“双抗”、“双功能抗体”“双特异性抗体”、“bispecific antibody”或“BsAb”是指拥有2个不同的抗原结合位点，从而可以同时与两个靶抗原结合，在发挥抗体靶向性的同时具有介导另外一种特殊功能的作用，所介导的特殊功能效应分子还可以是毒素、酶、细胞因子、放射核素等，双特异性抗体结合抗原的两条臂可分别来自Fab、Fv、ScFv或dSFv等。
术语“多克隆抗体”是指包括抗不同决定簇(“表位”)的不同抗体的制备物。
术语“抗体的抗原结合片段”指能够与表位结合的抗体的片段、部分、区域或结构 域(例如可经由切割、重组、合成等获得)。抗原结合片段可以含有该类抗体的1、2、3、4、5或所有6个CDR域，并且尽管能够结合到所述表位，仍可以展现出不同的特异性、亲和力或选择性。优选地，抗原结合片段含有所述抗体的所有6个CDR域。抗体的抗原结合片段可以是单条多肽链(例如，scFv)的一部分或包含单条多肽链，或者可以是两条或更多条多肽链(各自具有氨基末端和羧基末端)(例如，双抗体、Fab片段、F(ab')
2片段等)的一部分或包含两条或更多条多肽链。
本发明所包括的抗原结合片段的实例包括(a)Fab'或Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(b)F(ab')
2片段，包含两个由二硫键在铰链结构域连接的Fab片段的二价片段；(c)由VH区和CHl域组成的Fd片段；(d)由抗体单臂的VL区和VH区组成的Fv片段；(e)单链抗体(single chain Fv,scFv)，用基因工程方法将抗体VH和VL通过一段链接肽连接而成的重组蛋白；(f)dAb片段(Ward等人，Nature，341，544-546(1989))，其基本上由VH区组成并且也称为结构域抗体(Holt等人，Trends Biotechnol.，2i(ll):484-90)；(g)骆驼或纳米抗体(Revets等人，Expert Opin Biol Ther.，5(l):111-24)以及(h)分离的互补决定区(CDR)。
术语“嵌合抗体”，指重链和/或轻链的一部分与来自特定物种的或属于特定抗体类别或亚类的抗体的相应序列是相同或同源的，而链的其余部分与来自另一个物种或属于另一个抗体类别或亚类的抗体以及此类抗体的片段的相应序列是相同的或同源的，只要它们展现出期望的生物学活性。本发明提供了来自人抗体的可变区抗原结合序列。因此，本文主要关注的嵌合抗体包括具有一个或多个人抗原结合序列(如CDR)并含有一个或多个来自非人抗体的序列如FR或C区序列的抗体。此外，本文所述的嵌合抗体是包含一种抗体类别或亚类的人可变区域抗原结合序列以及来自另一个抗体类别或亚类的另一个序列如FR或C区序列的抗体。
术语“人源化抗体”指其中来源于另一种哺乳动物物种如小鼠的种系的CDR序列已被移植到人框架序列上的抗体。可以在人框架序列内进行额外的框架区修饰。
术语“人抗体”或“全人抗体”(“humAb”或“HuMab”)指包括具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变域和恒定域的抗体。本发明的人抗体可以包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，在体外通过随机或位点特异性诱变或在基因重排期间或在体内通过体细胞突变引入的突变)。
变体抗体也包括在本发明范围之内。因此，申请中所列举的序列的变体也包括在 本发明范围之内。可以通过使用本领域已知的方法获得具有改良的亲和性的抗体序列的其他变体并且这些变体也包括在本发明范围之内。例如，氨基酸替换可用于获得具有进一步改良的亲和性的抗体。或者，核苷酸序列的密码子优化可用于改善抗体生产中的表达***的翻译效率。
这样的变体抗体序列与申请中列举的序列具有70％或更多(例如80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或更高)的序列同源性。这样的序列同源性是相对于参考序列(即，申请中列举的序列)的全长计算获得的。
本发明中的氨基酸残基的编号是根据
(the international ImMunoGeneTics information system)
或Kabat,E.A.，Wu,T.T.，Perry,H.M.，Gottesmann,K.S.&Foeller,C.,(1991),Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版，NIH公开号91-3242，美国卫生与公众服务部；Chothia,C.&Lesk,A.M.,(1987),Canonical structures For The Hypervariable domains Of Immunoglobulins.,J.Mol.Biol.,196,901-917进行的。在没有明确指明的情况下，本发明中的氨基酸残基的编号是根据Kabat编号***进行。
抗体或其抗原结合片段“特异性地”结合另一分子的区域(即，表位)是指，它相对于另外的表位与该表位更加频繁地、更加快速地、以更长的持续时间和/或以更大的亲和力或亲合力反应或结合。在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段以至少10
-7M的亲和力结合人PD-L1，例如10
-8M、10
-9M、10
-10M、10
-11M或更高。优选地，抗体或其抗原结合片段在生理条件下(例如，在体内)结合。因此，特异性地结合到PD-L1是指该抗体或其抗原结合片段以上述特异性和/或在这样的条件下结合到PD-L1上的能力。适合于确定所述结合的方法是本领域已知的。
在抗体与指定抗原结合的背景下，术语“结合”通常是指以对应于约10
-6M或更小的K
D的亲和力结合，该K
D比该抗体对与除指定抗原或紧密相关抗原之外的非特异性抗原(例如，BSA、酪蛋白)结合的亲和力低至少10倍，如低至少100倍、至少1,000倍。
如本文所用，术语“k
d”(sec-1或1/s)是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率常数。所述值又称为k
off值。
如本文所用，术语“k
a”(M-1 x sec-1或1/Msec)是指特定抗体-抗原相互作用的结合速率常数。
如本文所用，术语“K
D”(M)是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数并且 通过k
d除以k
a获得。
如本文所用，术语“K
A”(M-1或1/M)是指特定抗体-抗原相互作用的结合平衡常数并且通过k
a除以k
d获得。
在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段仅需要CDR的一部分(即结合所需的CDR残基亚群，称为SDR)在人源化抗体中保持结合。可以通过分子建模和/或凭经验或者如在Gonzales,N.R.等人，(2004),SDR Grafting Of A Murine Antibody Using Multiple Human Germline Templates To Minimize Its Immunogenicity,Mol.Immunol.,41:863-872中所述的，基于先前研究(例如CDR H2中的残基H60-H65通常是不需要的)从位于Chothia超变环外的Kabat CDR区域(参见，Kabat等人，(1992),Sequences of Proteins of Immunological Interest,National Institutes of Health,公开号91-3242；Chothia,C.等人，(1987),Canonical Structures For The Hypervariable Regions Of Immunoglobulins,J.Mol.Biol.,196:901-917)中鉴定不接触相关表位并且不在SDR中的CDR残基。在此类人源化抗体中，在一个或多个供体CDR残基不存在或整个供体CDR被省略的位置处，占据该位置的氨基酸可以是在受体抗体序列中占据相应位置(通过Kabat编号)的氨基酸。此类取代在降低人源化抗体中小鼠氨基酸的数目以及因此降低潜在的免疫原性方面是潜在有利的。然而，取代还可能引起亲和力的变化，并且优选避免亲和力的显著减少。还可以凭经验选择CDR内的取代位置和待取代的氨基酸。
利用CDR残基的单个氨基酸改变可以导致失去功能性结合的事实(Rudikoff,S.等人，(1982),Single Amino Acid Substitution Altering Antigen-binding Specificity,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA))79(6):1979-1983)，可以***性鉴定可替代的功能性CDR序列。在一种用于获得此类变体CDR的优选方法中，将编码CDR的多核苷酸诱变(例如经由随机诱变或通过位点定向方法)以产生具有取代的氨基酸残基的CDR。通过比较原始(功能性)CDR序列中的相关残基的身份与取代的(非功能性)变体CDR序列的身份，可以鉴定出该取代的BLOSUM62.iij取代得分。BLOSUM***提供了通过分析序列数据库创建的氨基酸取代矩阵，用于可信比对(Eddy,S.R.,(2004),Where Did The BLOSUM62 Alignment Score Matrix Come From？,Nature Biotech.,22(8):1035-1036；Henikoff,J.G.,(1992),Amino acid substitution matrices from protein blocks),Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),89:10915-10919；Karlin,S.等人，(1990),Methods For Assessing The Statistical Significance Of Molecular Sequence Features By Using General Scoring Schemes),PNAS,87:2264-2268；Altschul,S.F.,(1991),Amino Acid Substitution Matrices From An Information Theoretic Perspective,J.Mol.Biol.,219，555-565。目前，最先进的BLOSUM数据库是BLOSUM62数据库(BLOSUM62.iij)。表1呈现了BLOSUM62.iij取代得分(得分越高取代越保守，并且因此更加可能地，该取代将不会影响功能)。例如，如果包含所得CDR的抗原结合片段不能结合到PD-L1，则BLOSUM62.iij取代得分被认为是不充分保守的，并且选择且产生新的具有更高取代得分的候选取代。因此，例如，如果原始残基是谷氨酸(E)并且非功能性取代残基是组氨酸(H)，则BLOSUM62.iij取代得分将为0，并且更保守的变化(如到天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或赖氨酸)是优选的。
本发明因此考虑了随机诱变用于鉴定改进的CDR的用途。在本发明的背景下，保守取代可以由反映在以下三个表中的一个或多个中的氨基酸类别内的取代定义：
保守取代的氨基酸残基类别：
替代性保守氨基酸残基取代类别：
氨基酸残基的物理和功能替代性分类：
更保守的取代分组包括：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸以及天冬酰胺-谷氨酰胺。
在一些实施方案中，亲水性氨基酸选自Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、His、Tyr和Lys。
还可以使用描述于例如Creighton,(1984),Proteins:Structure and Molecular Properties,W.H.Freeman and Company)中的原理制定另外的氨基酸组群。
因此，所包含的抗体或其抗原结合片段的CDR变体的序列可以通过取代而不同于亲本抗体的CDR的序列；例如4、3、2或1个氨基酸残基的取代。根据本发明的实施方案，CDR区中的氨基酸可以用保守取代进行取代，如在以上3个表中所定义的。
“同源性”或“序列同一性”是指在序列比对和引入缺口后，多核苷酸或多肽序列变体的残基与非变体序列的相同的百分比。在具体实施方式中，多核苷酸和多肽变体与本文所述的多核苷酸或多肽具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、或至少约99％的多核苷酸或多肽同源性。
这样的变体多肽序列与申请所列举的序列具有70％或以上(即80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或更多)的序列同一性。在其他实施方式中，本发明提供了多肽片段，其包括本文所公开的氨基酸序列的各种长度的连续延伸段。例如，适用的情况下，本发明提供的肽序列包含至少约5、10、15、20、30、40、50、75、100、150或更多的本发明公开的一个或多个序列的连续肽以及其之间所有的中间长度的肽。
术语“治疗”指改善、减缓、减弱或逆转疾病或病状的进展或严重性，或者改善、减缓、减弱或逆转这种疾病或病状的一种或多种症状或副作用。在本发明中，“治疗”还指用于获得有益的或希望的临床结果的方法，其中“有益的或希望的临床结果”包括但不限于症状的缓解、病状或疾病程度的减小、稳定化的(即没有恶化的)疾病或病状状态、疾病或病状状态进展的延缓或减缓、疾病或病状状态的改善或减轻 以及疾病或病状的缓解，不论是部分地或全部地、可检出的或不可检出的。
术语“预防”指施用本发明的抗体及其功能片段，从而阻止或阻碍疾病或病况的至少一种症状的发展。该术语还包括治疗缓解中的受试者以预防或阻碍复发。
本发明的抗体可以是通过重组DNA产生的单克隆抗体。
本发明的抗体可以具有任何同种型。同种型的选择通常由希望的效应物功能(如ADCC诱导)来决定。示例性同种型是IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。可以使用人轻链恒定域κ或λ中任一者。如果需要，可以通过已知方法转换本发明的抗CD47抗体的类别。例如，最初是IgG的本发明抗体可以类别转换为本发明的IgM抗体。此外，类别转换技术可以用来将一个IgG亚类转化成另一亚类，例如从IgGl转换为IgG2。因此，本发明抗体的效应物功能可以通过同种型切换变为例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM抗体，以用于各种治疗用途。在一些实施方案中，本发明的抗体是IgG4抗体。如果抗体的氨基酸序列相对于其他同种型与该同种型大部分同源，则该抗体属于特定同种型。
在一些实施方案中，本发明的抗体是全长抗体，优选IgG抗体。在另一些实施方案中，本发明的抗体是抗体抗原结合片段或单链抗体。
在一些实施方案中，抗CD47抗体是单价抗体，优选如在WO 2007059782(通过引用将其全文并入此处)中描述的具有铰链区缺失的单价抗体。因此，在一些实施方案中，抗体是单价抗体，其中所述抗CD47抗体通过以下方法构建：i)提供编码单价抗体的轻链的核酸构建体，所述构建体包含编码所选抗原特异性抗CD47抗体的VL区的核苷酸序列和编码Ig的恒定CL区的核苷酸序列，其中编码所选抗原特异性抗体的VL区的所述核苷酸序列和编码Ig的CL区的所述核苷酸序列被有效连接在一起，并且其中，在IgG1亚型的情况下，编码CL区的核苷酸序列已经被修饰，这样使得在多克隆人IgG的存在下或当给予动物或人时，该CL区不含有能够与包含该CL区的一致氨基酸序列的其他肽形成二硫键或共价键的任何氨基酸；ii)提供编码单价抗体的重链的核酸构建体，所述构建体包含编码所选抗原特异性抗体的VH区的核苷酸序列和编码人Ig的恒定CH区的核苷酸序列，其中编码CH区的核苷酸序列已经被修饰，这样使得在多克隆人IgG的存在下或当给予动物人时，对应于铰链区和(如由Ig亚型所要求的)CH区的其他区域(如CH3区)的区域不包含参与和包含人Ig的CH区的一致氨基酸序列的其他肽形成二硫键或共价或稳定的非共价重链间键的任何氨基酸残基，其中编码所选抗原特异性抗体的VH区的所述核苷酸序列和编码所述Ig的CH区的所述核苷酸序列被有效 连接在一起；iii)提供用于产生单价抗体的细胞表达***；iv)通过在(iii)的细胞表达***的细胞中共表达(i)和(ii)的核酸构建体来产生所述单价抗体。
类似地，在一些实施方案中，抗CD47抗体是单价抗体，其包含：
(i)如本文所述的本发明抗体的可变区或所述结构域的抗原结合部分，以及
(ii)免疫球蛋白的CH区或其包含CH2和CH3域的结构域，其中该CH区或其结构域已经被修饰，这样使得对应于铰链区和(如果该免疫球蛋白不是IgG4亚型的话)CH区的其他结构域(如CH3域)的结构域不包含任何氨基酸残基，这些任何氨基酸残基能够与相同CH区形成二硫键或在多克隆人IgG的存在下与相同CH区形成其他共价或稳定的非共价重链间键。
在另外的一些实施方案中，单价抗体的重链被修饰，使得缺失整个铰链区。
在另外的实施方案中，单价抗体的序列被修饰，使得它不包含用于N-连接的糖基化的任何受***点。
本发明还包括“双特异性抗体”，其中抗CD47结合区(例如，抗CD47单克隆抗体的CD47结合区)是靶向一种以上表位的二价或多价双特异性框架的一部分(例如第二表位可以包含主动转运受体的表位，这样使得该双特异性抗体将展现出跨生物屏障(如血脑屏障)的改进的胞转作用)。因此，在另外的实施方案中，抗CD47抗体的单价Fab可以连接到另外的靶向不同蛋白的Fab或scfv，以产生双特异性抗体。双特异性抗体可以具有双重功能，例如由抗CD47结合区赋予的治疗功能和可以结合到受体分子以增强跨生物屏障(如血脑屏障)转移的转运功能。
本发明的抗体及其抗原结合片段还包括单链抗体。单链抗体是重链和轻链Fv域被连接的肽。在一些实施方案中，本发明提供了单链Fv(scFv)，其中本发明的抗CD47抗体的Fv中的重链和轻链由柔性肽接头(典型地为约10、12、15或更多个氨基酸残基)连接成单条肽链。产生此类抗体的方法描述于例如US 4,946,778；Pluckthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,Vol.113,Rosenburg and Moore ed.,Springer-Verlag,New York,pages:269-315(1994)；Bird等人,Science,242，423-426(1988)；Huston等人,PNAS USA 85，5879-5883(1988)和McCafferty等人,Nature,348，552-554(1990)。如果仅使用单个VH和VL，单链抗体是单价的；如果使用两个VH和VL，则是二价的；或如果使用两个以上VH和VL，则是多价的。
通过本领域已知的任何技术产生本发明的抗体，如但不限于任何化学、生物学、遗传学或酶学技术，可单独使用或组合使用。通常，知道期望序列的氨基酸序列，本 领域技术人员可通过用于产生多肽的标准技术容易地产生所述抗体。例如，可以使用公知的固相方法合成这些抗体，优选使用市售的肽合成装置(如Applied Biosystems,Foster City,California制造的装置)并遵循制造商的说明书合成这些抗体。或者，可以通过本领域熟知的重组DNA技术合成本发明的抗体。例如，在将编码抗体的DNA序列并入表达载体并将这些载体导入合适的表达所需抗体的真核或原核宿主中后，可以获得作为DNA表达产物的抗体，之后可以使用已知技术从宿主分离抗体。
可以通过包含任何“适合”数目的经修饰的氨基酸和/或与偶联取代基结合来修饰本发明的抗体及其抗原结合片段。在这种情况下，“适合”通常由至少基本上保留与非衍生化亲本抗CD47抗体相关的CD47选择性和/或CD47特异性的能力决定。包含一个或多个经修饰的氨基酸在例如增加多肽血清半衰期、降低多肽抗原性或增加多肽储存稳定性中可以是有利的。对一种或多种氨基酸进行修饰，例如，在重组生产的过程中与翻译同时进行或在翻译之后进行(例如，在哺乳动物细胞表达过程中在N-X-S/T基序上的N-连接的糖基化作用)，或通过合成手段进行修饰。经修饰的氨基酸的非限制性实例包括糖基化的氨基酸、硫酸化的氨基酸、异戊二烯化(例如，法尼基化、香叶基-香叶基化)的氨基酸、乙酰化的氨基酸、酰化的氨基酸、聚乙二醇化的氨基酸、生物素酰化的氨基酸、羧基化的氨基酸、磷酸化的氨基酸等。进行氨基酸修饰的参考文献在本领域中司空见惯，参见例如Walker,(1998),Protein Protocols On CD-Rom,Humana Press,Totowa,New Jersey。经修饰的氨基酸可以例如选自糖基化的氨基酸、聚乙二醇化的氨基酸、法尼基化的氨基酸、乙酰化的氨基酸、生物素酰化的氨基酸、偶联到脂质部分的氨基酸或偶联到有机衍化剂的氨基酸。
本发明的抗体及其抗原结合片段还可以通过共价偶联到聚合物而化学修饰，以增加其循环半衰期。示例性聚合物以及将它们连接到肽的方法参见例如US 4,766,106；US 4,179,337；US 4,495,285和US 4,609,546。另外的示例性聚合物包括聚氧乙基化的多元醇和聚乙二醇(PEG)(例如，分子量在约1,000～40,000D之间，如在约2,000～20,000D之间，例如约3,000～12,000D的PEG)。
术语“受试者”是指温血动物，优选哺乳动物(包括人、家畜和农场动物、动物园动物、运动动物或宠物动物，如狗、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊、兔等)，更优选人。在一个实施方案中，受试者可以是“患者”，即，温血动物，更优选是人，其正在等待接收或正在接受医疗护理或将是医疗程序、或疾病发展监测的对象。在一个实施方案中，受试者是成年人(例如18岁以上的受试者)。在另一个实施方案中，受试者 是儿童(例如，18岁以下的受试者)。在一个实施方案中，受试者是男性。在另一个实施方案中，受试者是女性。
在本发明的一个实施方案中，样品是生物样品。生物样品的实例包括但不限于从患病组织，体液，优选血液，更优选血清、血浆、滑液、支气管肺泡灌洗液、痰、淋巴液、腹水、尿液、羊水、腹膜液、脑脊液、胸膜液、心包液和肺泡巨噬细胞制备的组织裂解物和提取物。
在本发明的一个实施方案中，术语“样品”旨在表示在任何分析之前取自个体的样品。
因此，在一些实施方案中，本发明的抗CD47抗体及其抗原结合片段包括完整抗体，如IgG(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚型)、IgA(IgA1和IgA2亚型)、IgM以及IgE；抗原结合片段如SDR、CDR、Fv、dAb、Fab、Fab
2、Fab'、F(ab')
2、Fd、scFv、骆驼抗体或纳米抗体；抗体或其抗原结合片段的变体序列，如与上述抗体或其抗原结合片段具有至少80％序列同一性的变体序列。在一些实施方案中，本发明还包括包含抗CD47或其抗原结合片段的衍生物，如来源于完整抗体的嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体、重组抗体、双特异抗体。
在另外的方面，本发明涉及编码本发明的抗体或其抗原结合片段的一条或多条多肽链的表达载体。此类表达载体可以用于重组产生本发明的抗体和其抗原结合片段。
在本发明中，表达载体可以是任何适合的DNA或RNA载体，包括染色体载体、非染色体载体和合成核酸载体(包含一组适合的表达控制元件的核酸序列)。此类载体的实例包括SV40的衍生物、细菌质粒、噬菌体DNA、杆状病毒、酵母质粒、衍生自质粒与噬菌体DNA的组合的载体以及病毒核酸(RNA或DNA)载体。在一些实施方案中，编码抗CD47抗体的核酸被包含在裸DNA或RNA载体中，包括例如线性表达元件(如描述于例如Sykes and Johnston,Nat Biotech,12，355-59(1997))、紧凑型核酸载体(如描述于例如US 6,077,835和/或WO 00/70087)、质粒载体(如pBR322、pUC 19/18或pUC 118/119)、最小尺寸的核酸载体(如描述于例如Schakowski等人,MoI Ther,3，793-800(2001))，或作为沉淀型核酸载体构建体，如CaPO
4沉淀型构建体(如描述于例如WO 00/46147；Benvenisty and Reshef,PNAS USA 83，9551-55(1986)；Wigler等人,Cell,14，725(1978)以及Coraro and Pearson,Somatic Cell Genetics,2，603(1981))。此类核酸载体及其使用在本领域是熟知的(参见例如US 5,589,466和US 5,973,972)。
在一些实施方案中，载体适用于在细菌细胞中表达抗CD47抗体或其抗原结合片 段。此类载体的实例包括例如BlueScript(Stratagene)、pIN载体(Van Heeke&Schuster,J Biol Chem,264，5503-5509(1989))、pET载体(Novagen,Madison,Wisconsin)等。
表达载体还可以是适用于在酵母***中进行表达的载体。可以采用任何适用于在酵母***中进行表达的载体。适合的载体包括例如包含组成型或诱导型启动子(如α因子、醇氧化酶和PGH)的载体(综述于：F.Ausubel等人,ed.,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley InterScience,New York(1987)；Grant等人,Methods in Enzymol,153，516-544(1987)；Mattanovich,D.等人,Methods Mol.Biol.,824，329-358(2012)；Celik,E.等人,Biotechnol.Adv.,30(5)，1108-1118(2012)；Li,P.等人,Appl.Biochem.Biotechnol.,142(2)，105-124(2007)；
E.等人,Appl.Microbiol.Biotechnol.,77(3)，513-523(2007)；van der Vaart,J.M.,Methods Mol.Biol.,178，359-366(2002)和Holliger,P.,Methods Mol.Biol.,178，349-357(2002))。
在本发明的表达载体中，编码抗CD47抗体的核酸可以包含任何适合的启动子、增强子和其他有助于表达的元件或者与其结合。此类元件的实例包括强表达型启动子(例如，人CMV IE启动子/增强子以及RSV、SV40、SL3-3、MMTV和HIV LTR启动子)、有效的聚(A)终止序列、用于在大肠杆菌中产生质粒的复制起点、作为选择性标记的抗生素抗性基因和/或便利的克隆位点(例如，多聚接头)。核酸还可以包含与组成型启动子(如CMV IE)相对的诱导型启动子。
在另外的方面，本发明涉及重组真核或原核宿主细胞(如转染瘤)，其产生本发明的抗体或其抗原结合片段或本发明的双特异性分子。宿主细胞的实例包括酵母、细菌和哺乳动物细胞(如CHO或HEK细胞)。例如，在一些实施方案中，本发明提供了包含稳定整合进细胞基因组中的核酸的细胞，该基因组包含编码本发明的抗CD47抗体或其抗原结合片段的核酸序列。在另一些实施方案中，本发明提供了包含非整合型核酸(如质粒、粘粒、噬菌粒或线性表达元件)的细胞，该核酸包含编码本发明的抗CD47抗体或其抗原结合片段的序列。
本发明的抗体及其抗原结合片段可以在不同细胞系中产生，如人细胞系、非人哺乳动物细胞系和昆虫细胞系，例如CHO细胞系、HEK细胞系、BHK-21细胞系、鼠类细胞系(如骨髓瘤细胞系)、纤维肉瘤细胞系、PER.C6细胞系、HKB-11细胞系、CAP细胞系和HuH-7人细胞系(Dumont等人,2015,Crit Rev Biotechnol.,Sep.18,1-13.，其内容通过引用并入本文)。
通过常规免疫球蛋白纯化方法适当地将本发明的抗体与培养基分离，所述方法如 蛋白A-Sepharose、羟磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析或亲和色谱法。
本发明进一步涉及组合物，其包含本发明的抗体、由其组成或基本上由其组成。
如本文所用，关于组合物，“基本上由......组成”是指至少一种如上所述的本发明抗体是所述组合物中具有生物学活性的唯一一种治疗剂或试剂。
在一个实施方案中，本发明的组合物是药物组合物，并且还包含药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
术语“药学上可接受的载体”是指当施用于动物，优选人时，不产生不利的、过敏或其他不良反应的赋形剂。其包括任何和所有溶剂、分散介质、涂层、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。对于人类施用，制剂应满足监管机构(例如FDA办公室或EMA)所要求的无菌、致热原性、一般安全性和纯度标准。
本发明进一步涉及药物，其包含本发明的抗体、由其组成或基本上由其组成。
在一些实施方案中，修饰本发明抗体的糖基化。例如，可以制备无糖基化的抗体(即，抗体缺少糖基化)。可以改变糖基化以例如增加抗体对抗原的亲和力或改变抗体的ADCC活性。这种碳水化合物修饰可以通过例如改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来实现。例如，可以进行一个或多个氨基酸取代，其导致消除一个或多个可变区框架糖基化位点，从而消除该位点的糖基化。这种无糖基化可以增加抗体对抗原的亲和力。在Co等人的美国专利No.5,714,350和No.6,350,861(通过引用并入本文)中进一步详细描述了这种方法。另外或可替代地，可以制备具有改变的糖基化类型的抗体，如具有减少量或不具有岩藻糖基残基的低岩藻糖基化或非岩藻糖基化抗体或具有增加的二等分GlcNac结构的抗体。已经证明这种改变的岩藻糖基化模式增加了抗体的ADCC能力。这种碳水化合物修饰可以通过例如在具有改变的糖基化机制的宿主细胞中表达抗体来实现。具有改变的糖基化机制的细胞已在本领域中描述，并且可用作宿主细胞，在该宿主细胞中表达本发明的重组抗体，从而产生具有改变的糖基化的抗体。例如，Hang等人的EP1176195(通过引用并入本文)描述了具有功能性破坏的FUT8基因的细胞系，该FUT8基因编码岩藻糖基转移酶，使得在这种细胞系中表达的抗体表现出低岩藻糖基化或缺少岩藻糖基残基。因此，在一些实施方案中，本发明的人抗体(优选单克隆抗体)可以通过在表现出低岩藻糖基化或非岩藻糖基化模式的细胞系中重组表达来产生，例如，具有缺少编码岩藻糖基转移酶的FUT8基因表达的哺乳动物细胞系。Presta的PCT公开WO 03/035835(通过引用并入本文)描述了变体CHO细胞系、Lecl3细胞，其具有降低的将岩藻糖附着至Asn(297)连接的碳水化合物的能力，也导致在该 宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖基化(也参见Shields,R.L.等人2002J.Biol.Chem.277:26733-26740)。Umana等人的PCT公开WO 99/54342(通过引用并入本文)描述了工程化细胞系以表达糖蛋白修饰的糖基转移酶(例如，β(1,4)-N乙酰葡糖胺基转移酶III(GnTIII))，使得在工程化的细胞系中表达的抗体表现出增加的二等分GlcNac结构，其导致抗体的ADCC活性增加(还参见Umana等人1999Nat.Biotech.17:176-180)。Eureka Therapeutics进一步描述了基因工程化的CHO哺乳动物细胞，其能够产生具有缺少岩藻糖残基的改变的哺乳动物糖基化模式的抗体(http://www.eurekainc.com/a&boutus/companyoverview.html)。或者，本发明的人抗体(优选单克隆抗体)可以在酵母或丝状真菌中产生，所述酵母或丝状真菌用于哺乳动物样糖基化模式并且能够产生缺少岩藻糖作为糖基化模式的抗体(参见例如EP1297172B1)。
本发明的抗体作用于人CD47，能特异性识别人肿瘤细胞表面的CD47表达，从而阻断CD47与受体SIRPα结合所传递的抑制性信号通道，能促进巨噬细胞介导的肿瘤吞噬反应，从而为肿瘤免疫治疗提供新的方法。本发明的抗体可以用于预防和/或治疗自身免疫性疾病，例如关节炎、风湿性关节炎、银屑病、多发性硬化症、溃疡性结肠炎、克罗恩病、***性红斑狼疮、肾小球肾炎、扩张型心肌病样疾病、斯耶格伦氏综合征、过敏性接触性皮炎、多肌炎、硬皮病、动脉周性多动脉炎、风湿热、白癜风、胰岛素依赖性糖尿病、白塞氏综合征和慢性甲状腺炎等，针对移植物的免疫应答，***反应，感染性疾病，神经退行性疾病，例如帕金森氏病、亨廷顿氏病、马查多-约瑟夫病、肌萎缩性侧索硬化症以及克罗伊茨费尔特-雅各布病等，和肿瘤，例如白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、脑肿瘤、头颈部鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、鼻咽癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、胆囊癌、肝癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、***、子宫内膜癌、子宫肉瘤、***癌、膀胱癌、肾细胞癌以及黑色素瘤等。
在一些实施方案中，本发明涉及如下项的技术方案。
项1、一种分离的抗人CD47抗体、其抗原结合片段或其变体，其中所述抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区和/或重链可变区，其中
轻链可变区的LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID No.1、2和3所示；和/或
重链可变区的HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，重链可变区的HCDR2的氨基酸序列与SEQ ID No.5或6具有至少约94％的同一性；重链可变区的HCDR3的氨基酸序列与SEQ ID No.7或8具有至少约78％的同一性；或者
所示轻链可变区或重链可变区的CDR的氨基酸序列分别与SEQ ID No.1-8所示序列具有至少70％的同一性且保留相应母体序列生物活性的变体序列；或者
所述轻链可变区或重链可变区的CDR的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：1-8所示序列经删除、替换和/或添加一个或多个氨基酸残基后获得的保留相应母体序列生物活性的变体序列；
其中所述变体选自嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体之一。
项2、根据项1所述的抗人CD47抗体、其抗原结合片段或其变体，其中，所述抗体的重链恒定区序列选自人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD之一的恒定区序列，和/或，所述抗体的轻链恒定区序列选自κ链或λ链；
优选地，重链恒定区序列选自IgG1或者IgG4的恒定区序列，和/或轻链恒定区序列选自轻链κ链的恒定区序列。
项3、根据项1或2所述的抗人CD47抗体、其抗原结合片段或其变体，其特征在于，CD47嵌合抗体或其功能片段的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.9或10所示，或与SEQ ID No.9或10所示序列具有至少70％的同一性且保留相应母体序列生物活性，或为SEQ ID NO.9或10所示序列经删除、替换和/或添加一个或多个氨基酸残基后获得的保留相应母体序列生物活性的变体序列；和/或重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.11或12所示，或与SEQ ID No.11或12所示序列具有至少70％的同一性且保留相应母体序列生物活性，或为SEQ ID NO.11或12所示序列经删除、替换和/或添加一个或多个氨基酸残基后获得的保留相应母体序列生物活性的变体序列；和/或
所述CD47嵌合抗体及其功能片段的轻链恒定区和重链恒定区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14-16所示，或分别与SEQ ID No.13和SEQ ID NO.14-16所示序列具有至少70％的同一性且保留相应母体序列生物活性，或为SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14-16所示序列分别经删除、替换和/或添加一个或多个氨基酸残基后获得的保留相应母体序列生物活性的变体序列。
项4、根据项1或2所述的抗人CD47抗体、其抗原结合片段或其变体，其中，所述抗人CD47抗体、其抗原结合片段或其变体的轻链可变区骨架区包括FR-L1、FR-L2、FR-L3及FR-L4，重链可变区骨架区包括FR-H1、FR-H2、FR-H3及FR-H4，和/或其中，
所述FR-L1的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示；
所述FR-L2的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示，或是进一步经过以下取代之一或 其任意组合所得到的氨基酸序列：
第12个氨基酸R替换为T；
所述FR-L3的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示，或是进一步经过以下取代之一或其任意组合所得到的氨基酸序列：
第31个氨基酸Y替换为F；
所述FR-L4的氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示；
所述FR-H1的氨基酸序列如SEQ ID NO.21所示；
所述FR-H2的氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示；
所述FR-H3的氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示，或是经过以下取代之一或其任意组合所得到的氨基酸序列：
第8个氨基酸E替换为T，
第11个氨基酸S替换为N，
第31个氨基酸A替换为V；和/或
所述FR-H4的氨基酸序列如SEQ ID NO.24所示。
项5、根据项1或2所述的抗人CD47抗体、其抗原结合片段或其变体，其中轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.25-27任一项所示，和/或所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.28-33任一项所示；或者，是与SEQ ID NO.25-27或28-33所示氨基酸序列具有至少70％的同一性且保留相应母体序列生物活性的变体序列；或者，是SEQ ID NO.25-27或28-33所示序列经删除、替换和/或添加一个或多个氨基酸残基后获得的保留相应母体序列生物活性的变体序列；
优选地，轻链可变区序列如SEQ ID NO.26或27所示，和/或重链可变区序列如SEQ ID NO.33所示。
项6、根据项1-5任一项所述的抗人CD47抗体、其抗原结合片段或其变体，其中，所述抗原结合片段选自F(ab')
2、Fab'、Fab、Fd、Fv、scFv、双特异抗体、骆驼抗体、CDR和抗体最小识别单位(dAb)中的一种或多种，优选地，所述抗原结合片段为Fab、F(ab')
2或scFv。
项7、一种分离的核酸分子，其选自：
(1)DNA或RNA，其编码项1-6任一项所述的抗人CD47抗体、其抗原结合片段或其变体；
(2)与(1)中定义的核酸完全互补的核酸。
项8、一种载体，其包含有效连接的项7所述的核酸分子，优选地，所述载体为表达载体。
项9、一种宿主细胞，其包含项7所述的核酸分子或项8所述的载体。
项10、一种组合物，其包含项1-6任一项所述的抗人CD47抗体、其抗原结合片段或其变体，项7所述的核酸分子，项8所述的载体或项9所述的宿主细胞，以及药学上可接受的赋形剂、稀释剂和/或载体。
项11、一种生产项1-6任一项所述的抗人CD47抗体、其抗原结合片段或其变体的方法，其包括步骤：
将项9所述的宿主细胞在适合所述抗人CD47抗体、其抗原结合片段或其变体表达的培养条件下培养，任选地，分离、纯化所得的产物。
项12、项1-6任一项所述的抗人CD47抗体、其抗原结合片段或其变体，项7所述的核酸分子，项8所述的载体或项9所述的宿主细胞在制备用于预防和/或治疗自身免疫性疾病、针对移植物的免疫应答、***反应、感染性疾病、神经退行性疾病和肿瘤的药物中的用途；
优选地，所述自身免疫性疾病选自关节炎、风湿性关节炎、银屑病、多发性硬化症、溃疡性结肠炎、克罗恩病、***性红斑狼疮、肾小球肾炎、扩张型心肌病样疾病、斯耶格伦氏综合征、过敏性接触性皮炎、多肌炎、硬皮病、动脉周性多动脉炎、风湿热、白癜风、胰岛素依赖性糖尿病、白塞氏综合征和慢性甲状腺炎的一种或多种；
优选地，所述针对移植物的免疫应答是移植物抗宿主病；优选地，所述***反应选自荨麻疹、湿疹、血管神经性水肿、过敏性鼻炎、支气管哮喘、喉头水肿、食物过敏性胃肠炎、过敏性休克的一种或多种；
优选地，所述感染性疾病是指病毒、细菌、真菌、寄生虫等病原体及特定毒素侵入人体所引起的局部组织和全身性炎症反应；
优选地，所述神经退行性疾病选自帕金森氏病、亨廷顿氏病、马查多-约瑟夫病、肌萎缩性侧索硬化症、克罗伊茨费尔特-雅各布病的一种或多种；
优选地，所述肿瘤选自白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、脑肿瘤、头颈部鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、鼻咽癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、胆囊癌、肝癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、***、子宫内膜癌、子宫肉瘤、***癌、膀胱癌、肾细胞癌、黑色素瘤的一种或多种。
在提供了范围的值时，应该理解，除非文中另有明确说明，否则每个***值、到 下限的单位的十分之一、该范围的上限和下限之间和任何其它在所述范围内的所述值或***值都包含于本发明范围之内。可独立地包括于较小范围内的这些较小范围的上限和下限也包含在本发明内，只要去除被特地排除在外的极限所述范围内被特定排除在外的任何界限。当所述范围包括界限的一个或两个时，排除被包括的界限的一个或两个的范围也包括于本发明中。
除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的具有相同的含义。虽然任何类似或等同于本文所述的方法和材料也可以在本发明的实施或测试中使用，但现在公开了优选的方法和材料。本文提及的所有出版物均通过引用而全部并入本文。
本发明提供实施例一方面是用于描述本发明抗体制备过程，该制备过程仅是说明相关方法，并非是限制性的，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。本发明提供实施例另一方面是用于表明本发明抗体的特征和优点，但本发明不限于这些特征和优点。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例
实施例1鼠源抗人CD47单抗的制备
1.1、动物免疫
实验动物选用雌性BALB/c小鼠，6至8周龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。小鼠适应环境一周后，开始免疫。首次免疫使用50μg重组人CD47-Fc蛋白(北京百普赛斯，货号CD7-H5256)和弗氏完全佐剂(Sigma-Aldrich，货号F5881)，二者充分混合形成乳液，腹腔注射小鼠。两周之后，进行加强免疫。加强免疫使用25μg重组人CD47-Fc蛋白与弗氏不完全佐剂(Sigma-Aldrich，货号F5806)，二者充分混合形成乳液，腹腔注射小鼠。每隔2周以同样的方法加强免疫，共3次。末次免疫后第10天，从小鼠眼眶后静脉丛采血并离心分离血清，针对重组人CD47-Fc蛋白ELISA测定抗体效价。选择效价高的小鼠用来融合做杂交瘤。融合前三天，腹腔注射50μg重组人CD47-Fc蛋白，不含佐剂。融合当天，无菌取脾，DMEM培养基(Dulbecco改良Eagle培养基， Gibco，目录号11965)加15％胎牛血清(FBS)(Corning，目录号35-076-CV)制成单脾细胞悬液，加入0.25μM CpG ODN(InvivoGen，目录号tlrl-1826-1)刺激24h，准备采用BTX ECM2001电融合仪(Harvard Apparatus，目录号45-0010)进行电融合。
1.2、杂交瘤细胞的制备
取对数生长的骨髓瘤细胞SP2/0(购自于中国科学院细胞库)，1000rpm离心5min，弃上清，用不完全DMEM培养液，混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用由0.3M甘露醇(Sigma，目录号M8429)、0.1mM硫酸铵(Sigma，目录号M7774)、0.1mM氯化钙((Sigma，目录号C5670)组成的E-fusion缓冲液洗2次，1000rpm离心5min。同时用E-fusion缓冲液洗脾细胞2次，240g，离心6min。将骨髓瘤细胞与脾细胞按照一定比例混合在一起，在50ml塑料离心管内用E-fusion缓冲液洗1次，240g，离心6min。弃上清，在手掌上轻击离心管底，使沉淀细胞松散均匀；按照2ml E-fusion缓冲液/(1-1.5)*10E7脾细胞加入E-fusion缓冲液，每个10mm间隙的融合池(Harvard Apparatus,，目录号45-0107)加入2ml细胞混合液，检查参数设置，按下Automatic Start，即可。融合后，无菌条件下用移液管小心的把细胞悬液从融合槽转移到含有28ml HAT培养基(DMEM+HAT，Sigma，目录号：H0262-10VL)的50ml离心管，37℃静置10min，按照每孔细胞数(3-5)*10E4加入HAT培养基并铺板，置37℃，5％CO
2培养箱内培养。5天后用HAT培养基换出1/2培养基。在7～10天后用HT培养基(DMEM+HT，Sigma，目录号H0137-10VL)换出HAT培养基。定期观察杂交瘤细胞生长情况，待其长至孔底面积1/10以上时吸出上清供抗体检测。将阳性克隆的细胞扩大培养并冻存。
1.3、克隆筛选与鉴定
ELISA用于筛选杂交瘤培养上清液的抗人CD47抗体。用pH＝9.6的碳酸盐缓冲溶液在96孔高吸附酶标板(Coster，目录号42592)上包被重组人CD47(购自北京义翘神州)，包被浓度为1μg/mL，包被量为100μL每孔，包被在4℃过夜进行。PBST缓冲液洗涤5次。用含1％牛血清白蛋白(BSA)的PBST缓冲液按300μL/孔封闭，25℃孵育1hr。PBST缓冲液洗涤5次。加入培养上清液样品以及阳性血清对照，每孔加入100μL，25℃孵育1hr。PBST缓冲液洗涤5次。然后加入1:10000稀释在含1％BSA的PBST缓冲液里的辣根过氧化物酶标记的抗小鼠IgG抗体(Abcam，货号Ab7068)，每孔加入100μL，25℃孵育1hr。PBST缓冲液洗涤5次。加入比色底物TMB，100μL/孔，室温显色10min。加入1M H
2SO
4，100μL/孔，终止显色。在酶标仪上读取450nm处的吸光度。根据OD
450nm的强弱选取能够分泌抗人CD47选择抗体的阳性克隆。
ELISA测定阳性克隆分泌的抗人CD47选择抗体是否能够阻断CD47/SIRPα的结合。用pH＝9.6的碳酸盐缓冲溶液在96孔高吸附酶标板上包被重组人CD47-Fc(购自北京百普赛斯)，包被浓度为1μg/mL，包被量为100μL每孔，包被在4℃过夜进行。PBST缓冲液洗涤5次。用含1％BSA的PBST缓冲液按300μL/孔封闭，25℃孵育1hr。PBST缓冲液洗涤5次。加入抗人CD47选择抗体样品，每孔加入50μL，并加入生物素标记的SIRPα(购自北京百普赛斯)，浓度为4nM(终浓度2nM)，每孔加入50μL，25℃孵育90min。PBST缓冲液洗涤5次。然后加入1:1000稀释在含1％BSA的PBST缓冲液里的Streptavidin-HRP(BD Pharmingen，货号554066)，每孔加入100μL，25℃孵育1hr。PBST缓冲液洗涤5次。加入比色底物TMB，100μL/孔，室温显色10min。加入1M H
2SO
4，100μL/孔，终止显色。在酶标仪上读取450nm处的吸光度。能够抑制人CD47-Fc/生物素标记的SIRPα结合的抗人CD47选择抗体即具有中和活性。根据封闭能力强弱选取能够分泌抗人CD47中和抗体的阳性克隆。
红细胞(RBC)高表达CD47，一些抗CD47抗体能够引起红细胞的凝集。测定阳性克隆分泌的抗人CD47中和抗体是否引起红细胞的凝集。将内部捐献的健康抗凝人全血加入DPBS(Gibco,目录号：14190250)后离心去上清，收集管底的红细胞，重复洗涤3次后，将红细胞重悬在DPBS中成2％红细胞悬液。此悬液加入低吸附的96孔板(Coster，目录号3879)中，50μL/孔，并加入序列稀释的抗人CD47抗体样品以及阳性对照(克隆号CC2C6的抗CD47抗体，Biolegend，货号323102)，50μL/孔，混匀。把板子放入在37℃培养箱孵育2hr，然后观察、拍照。
结果如表5所示，多个抗人CD47克隆具有强的CD47结合活性和CD47/SIRPα封闭活性，其中CD47-18-5克隆鼠源单抗的体外活性见图1。红细胞凝集的结果如图2所示，CD47-5-65、CD47-8-21、CD47-16-5克隆可以引起人红细胞凝集，而CD47-5-191、CD47-18-5、CD47-18-10克隆不引起红细胞凝集。
表5.抗人CD47的CD47结合活性、CD47/SIRPα封闭活性
1.4、单克隆抗体序列的测定
将筛选得到的同时具有抗原结合活性、抗原中和活性以及在体外不会使红细胞凝集的克隆，进行抗体DNA序列的测定。首先提取细胞mRNA，使用RNAprep Pure试剂盒(Tiangen，DP419)。然后使用SMART 5’RACE试剂盒(Clontech目录号634849)将杂交瘤提取的总RNA反转录合成人CD47cDNA第一条链，分别设计PCR扩增可变区的引物VHGSP:GATTACGCCAAGCTTGCCAGTGGATAGACAAGCTTGGGTGTCGTTTT(SEQ ID NO：36)和VLGSP:GATTACGCCAAGCTTGATGGATCCAGTTGGTGCAGCATCAGC(SEQ ID NO：37)。将PCR扩增得到的目的条带用in-fusion方式克隆到线性化的pRACE载体(Clontech，货号：634859)中，挑单克隆进行DNA测序。
实施例2嵌合的抗人CD47单抗的制备
CD47-18-5克隆经过PCR扩增得到其抗体轻链可变区序列如SEQ ID NO:9所示，抗体重链可变区序列如SEQ ID NO:11所示。根据小鼠可变区序列排除骨架区序列后即可得到其互补决定区序列；其中轻链的三个互补决定区LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、2和3所示；重链的三个互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、5和7所示。CD47-18-5克隆构建的嵌合的CD47单抗分别命名为mAb-18-5、mAb-18-5N297A，两者抗体轻链都是由CD47-18-5克隆轻链可变区(SEQ ID NO:9)与轻链恒定区(序列SEQ ID NO:13)连接而成，mAb-18-5抗体重链是由重链可变区(SEQ ID NO:11)与重链恒定区(序列SEQ ID NO:14)连接而成，mAb-18-5N297A抗体重链是由重链可变区(SEQ ID NO:11)与重链恒定区(序列SEQ ID NO:15)连接而成。CD47-18-10克隆经过PCR扩增得到抗体轻链可变区序列如SEQ ID NO:10所示，抗体重链可变区序列如SEQ ID NO:12所示。根据小鼠可变区序列排除骨架区序列后即可得到其互补决定区序列；其中轻链的三个互补决定区LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、2和3所示；重链的三个互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、6和8所示。CD47-18-10克隆构建的嵌合的CD47单抗分别命名为mAb-18-10、mAb-18-10N297A，两者抗体轻链都是由CD47-18-10克隆轻链可变区(SEQ ID NO:10)与轻链恒定区(序列SEQ ID NO:13)连接而成， mAb-18-10抗体重链是由重链可变区(SEQ ID NO:12)与重链恒定区(序列SEQ ID NO:14)连接而成，mAb-18-10N297A抗体重链是由重链可变区(SEQ ID NO:12)与重链恒定区(序列SEQ ID NO:15)连接而成，得到的嵌合抗体的轻链可变区、轻链恒定区、重链可变区、重链恒定区的序列信息见表6。
表6嵌合抗体序列信息
将编码上述抗体轻重链氨基酸序列的基因进行基因合成(交苏州金唯智生物科技有限公司)，获得核苷酸序列并克隆到真核细胞表达载体X0GC中，然后表达载体转染ExpiCHO细胞系(ExpiCHO
TM，货号A29133，invitrogen)。转染前一天接种细胞，细胞重悬于新鲜的ExpiCHO
TM表达培养基(ExpiCHO
TM Expression Medium，货号A29100，invitrogen)中，细胞密度为35×10
5细胞/mL，转染当天计数，细胞密度在(70-200)×10
5细胞/mL范围内，活率应高于95％，用预热的ExpiCHO
TM表达培养基稀释细胞，最终密度为60×10
5细胞/mL。按照转染体积用OptiPRO
TM培养基(货号12309，invitrogen)分别稀释质粒和转染试剂ExpiFectamine
TM CHO试剂(货号A29131，invitrogen)，质粒的终浓度为0.5μg/ml。轻轻将稀释后的转染试剂加入到质粒中，静置1-5min，之后将质粒转染试剂复合物加入到细胞中，放入细胞培养箱，125rpm摇床37℃、8％CO
2。转染第二天，补加ExpiFectamine
TM CHO Enhancer(货号A29131，invitrogen)和ExpiCHO
TM Feed(货号A29101-02，invitrogen)，细胞培养箱调整为125rpm摇床32℃、5％CO
2，离心收集转染10天的细胞培养上清。
实施例3嵌合的抗人CD47单抗与人CD47的结合活性及动力学常数
用pH＝9.6的碳酸盐缓冲溶液在96孔高吸附酶标板上包被重组人CD47(购自北京义翘神州)，包被浓度为1μg/mL，包被量为100μL每孔，包被在4℃过夜进行。PBST缓冲液洗涤5次。用含1％BSA的PBST缓冲液按300μL/孔封闭，25℃孵育1hr。PBST缓冲液洗涤5次。加入抗人CD47抗体样品以及对照CC-90002(来源于专利序列WO2016109415)，每孔加入100μL，25℃孵育1hr。PBST缓冲液洗涤5次。然后加入1:10000稀释在含1％BSA的PBST缓冲液里的辣根过氧化物酶标记的抗小鼠IgG抗体(Abcam，货号Ab7068)，每孔加入100μL，25℃孵育1hr。PBST缓冲液洗涤5次。加入比色底物TMB，100μL/孔，室温显色10min。加入1M H
2SO
4，100μL/孔，终止显色。在酶标仪上读取450nm处的吸光度。结果如图3所示，抗人CD47嵌合单抗mAb-18-5、mAb-18-5N297A、mAb-18-10、mAb-18-10N297A具有良好的人CD47结合亲和力，相比对照CC-90002的结合活性更强。
用Biacore X100仪器(购自于GE)来检测抗人CD47嵌合单抗与其抗原人CD47结合的动力学常数。该仪器利用光学的表面等离子体共振技术来检测偶联包被在生物芯片上的分子与待测分子之间的结合和解离。所用的主要试剂为Protein A芯片(GE Healthcare，29-1275-57)。实验过程简述如下，将抗人CD47嵌合抗体稀释于运行缓冲液(1×HBS-EP+10mM HEPES,150mM NaCl,3mM EDTA,0.05％表面活性剂P20,pH7.4)。在捕获结合阶段，将浓度为2μg/mL的抗体以10μL/min的速度注入60sec。在结合阶段，将抗原CD47用运行缓冲液稀释成多个浓度，分别以30μL/min的速度注入120sec。在解离阶段，用运行缓冲液以10μL/min的速度注入600sec。再生条件为10mM甘氨酸盐溶液,pH1.5。结合动力学常数和解离动力学常数通过Biacore X100评价软件来进行分析计算。抗人CD47嵌合抗体的结合动力学常数、解离动力学常数和解离平衡常数见表7。数据表明，抗人CD47嵌合单抗与CC-90002的结合解离参数相当或更强。
表7抗人CD47嵌合单抗与人CD47结合的动力学常数
实施例4嵌合的抗人CD47单抗的种属特异性和结合特异性
用ELISA测定抗人CD47嵌合单抗的种属特异性。用pH＝9.6的碳酸盐缓冲溶液在96孔高吸附酶标板上包被重组人CD47、猴子CD47、大鼠CD47和小鼠CD47，均购自北京义翘神州，包被浓度为1μg/mL，包被量为100μL每孔，包被在4℃过夜进行。PBST缓冲液洗涤5次。用含1％BSA的PBST缓冲液按300μL/孔封闭，25℃孵育1hr。PBST缓冲液洗涤5次。加入序列稀释在含1％BSA的PBST缓冲液里的抗人CD47嵌合单抗样品，每孔加入100μL，25℃孵育1hr。PBST缓冲液洗涤5次。然后加入1:10000稀释在含1％BSA的PBST缓冲液里的辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体(Chemicon，货号AP309P)，每孔加入100μL，25℃孵育1hr。PBST缓冲液洗涤5次。加入比色底物TMB，100μL/孔，室温显色10min。加入1M H
2SO
4，100μL/孔，终止显色。在酶标仪上读取450nm处的吸光度。
用流式细胞仪FACS确认抗人CD47嵌合单抗的种属特异性。收集内部捐献的正常人RBC、食蟹猴RBC、大鼠RBC和小鼠RBC细胞。用含2％FBS(Hyclone，货号SH30084.03)的冷PBS(GIBCO，货号14190)洗涤一次。将RBC按每管2×10
6个细胞重悬于100μL含2％FBS的冷PBS中，加入100μL序列稀释的抗人CD47抗体样品以及对照CC-90002，同型对照。流式管于冰上孵育30min。用含2％FBS的PBS洗涤两次。再重悬于200μL含2％FBS以及1:1000稀释的FITC标记的抗人IgG抗体(北京中杉金桥，货号ZF0306)的冷PBS中。冰上避光孵育30min。用含2％FBS的PBS洗涤两次。再重悬于500μL冷PBS中。该细胞悬液于流式细胞仪(BD,FACS Calibur)上进行检测分析，读取RBC细胞上的荧光强度。
用ELISA测定抗人CD47嵌合单抗的结合特异性。用pH＝9.6的碳酸盐缓冲溶液在96孔高吸附酶标板上包被重组人PD-1、CD28、CTLA4、ICOS、BTLA、CD47、PD-L2、CD80、CD86、B7-H2、CD47、SIRPα、SIRPγ，均购自义翘神州，包被浓度为1μg/mL，包被量为100μL每孔，包被在4℃过夜进行。PBST缓冲液洗涤5次。用含1％BSA的PBST缓冲液按300μL/孔封闭，25℃孵育1hr。PBST缓冲液洗涤5次。加入序列稀释在含1％BSA的PBST缓冲液里的抗人CD47嵌合单抗样品以及对照CC-90002，同型对照，每孔加入100μL，25℃孵育1hr。PBST缓冲液洗涤5次。然后加入1:10000稀释在含1％BSA的PBST缓冲液里的辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体(Chemicon，货号AP309P)，每孔加入100μL，25℃孵育1hr。PBST缓冲液洗涤5次。加入比色底 物TMB，100μL/孔，室温显色10min。加入1M H
2SO
4，100μL/孔，终止显色。在酶标仪上读取450nm处的吸光度。
结果如图4的A和表8所示，抗人CD47嵌合单抗可以结合人CD47和猴子CD47，且亲和力相似，但不与大鼠、小鼠CD47结合，具有种属特异性。同时，如图4的B所示，抗人CD47嵌合单抗还具有很强的结合特异性，仅与CD47结合，不与B7家族成员、CD28家族成员和SIRPγ结合。
表8抗人CD47嵌合单抗与人/食蟹猴/大鼠/小鼠RBC的结合活性
实施例5嵌合的抗人CD47单抗的封闭CD47与受体结合的活性
用pH＝9.6的碳酸盐缓冲溶液在96孔高吸附酶标板上包被重组人CD47-Fc(购自北京百普赛斯)，包被浓度为1μg/mL，包被量为100μL每孔，包被在4℃过夜进行。PBST缓冲液洗涤5次。用含1％BSA的PBST缓冲液按300μL/孔封闭，25℃孵育1hr。PBST缓冲液洗涤5次。加入抗人CD47抗体样品，每孔加入50μL，并加入生物素标记的SIRPα(购自北京百普赛斯)，浓度为4nM(终浓度2nM)，每孔加入50μL，25℃孵育90min。PBST缓冲液洗涤5次。然后加入1:1000稀释在含1％BSA的PBST缓冲液里的链霉亲和素-HRP(Streptavidin-HRP)(BD Pharmingen，货号554066)，每孔加入100μL，25℃孵育1hr。PBST缓冲液洗涤5次。加入比色底物TMB，100μL/孔，室温显色10min。加入1M H
2SO
4，100μL/孔，终止显色。在酶标仪上读取450nm处的吸光度。
结果如图5示，抗人CD47嵌合单抗具有跟CC-90002相似的CD47/SIRPα封闭活性。
实施例6嵌合的抗人CD47单抗介导的肿瘤细胞吞噬活性
成熟人巨噬细胞的制备：复苏收集人PBMC细胞(Lonza，货号CC-2702)。将人PBMC细胞以细胞密度5×10
6/mL重悬于无血清的RPMI 1640培养基(Gibco，目录号11875)并接种在细胞培养瓶中，在37℃二氧化碳培养箱中孵育90min。弃除培养上清及 悬浮细胞，贴壁细胞在完全培养基(RPMI 1640含10％FBS)中培养，并加入25ng/ml M-CSF(北京义翘神州,货号11792-HNAN)，孵育7天。然后收取巨噬细胞，重悬于含25ng/ml M-CSF和50ng/ml IFN-γ(北京义翘神州，货号11725-HNAS)的完全培养基(RPMI 1640含10％FBS)中。将此细胞悬液接种到48孔细胞培养板中，每孔50000个细胞，孵育1天使巨噬细胞成熟，备用。
参照CFSE试剂盒(Life technology，货号C34554)使用说明书染色Raji肿瘤细胞(购自于北京协和细胞资源中心，资源编号：3111C0001CCC000046)。简要的说，用PBS稀释CFSE到工作浓度5μM并在37℃预热，1000rpm离心5min收集Raji细胞，用预热的CFSE工作溶液重悬Raji，在37℃孵育15min。用完全培养基洗涤1次，再重悬于完全培养基中，孵育30min，再用完全培养基洗涤2次，再重悬于完全培养基备用。
将48孔板用完全培养基洗涤3次。将CFSE染色后的Raji细胞与待测的抗人CD47抗体样品以及对照CC-90002，同型对照预先孵育15min，然后加入48孔培养板中，在37℃二氧化碳培养箱中孵育2hr。孵育结束后，将48孔板用完全培养基洗涤3次，加入稀释在完全培养基中的麦胚凝集素(wheat germ agglutinin)，alexa fluor 555(Life technologies，货号W32464)，10μg/ml，避光孵育15min。将48孔板再用完全培养基洗涤3次，加入4％多聚甲醛固定15min。将48孔板再用完全培养基洗涤3次，加入完全培养基。荧光显微镜拍照，计细胞数。吞噬指数(％)的计算方法为：被吞噬的绿色标记的Raji细胞的数目/存在的红色标记的巨噬细胞数目×100。
结果如图6示，抗人CD47嵌合单抗能介导巨噬细胞吞噬Raji肿瘤细胞，与CC-90002的活性相当或更强。
实施例7嵌合的抗人CD47单抗对红细胞的影响
红细胞(RBC)高表达CD47，一些抗CD47抗体能够引起红细胞的凝集。测定抗人CD47嵌合单抗是否引起红细胞的凝集。将内部捐献的健康抗凝人全血加入DPBS重悬然后离心去上清，收集管底的红细胞，重复洗涤3次后，将红细胞重悬在DPBS中成2％红细胞悬液。此悬液加入低吸附的96孔板中，50μL/孔，并加入序列稀释的抗人CD47嵌合单抗样品以及阳性对照(克隆号CC2C6的抗CD47抗体，Biolegend，货号323102)，50μL/孔，混匀。把板子放入在37℃培养箱孵育2hr，然后观察、拍照。
结果如图7示，只有阳性对照引起人红细胞凝集，而mAb-18-5、mAb-18-10不引起 红细胞凝集。
实施例8嵌合的抗人CD47单抗的抗肿瘤药效研究
本实施例检测嵌合的抗人CD47单抗对接种于NCG小鼠的Raji肿瘤移植物的生长抑制作用。实验材料选用NCG小鼠(购自南京生物医药研究院)，雌性，6-8周龄。小鼠适应环境一周后，每只小鼠接种5 x 10
6个人Raji淋巴瘤细胞。待肿瘤体积长至约150mm
3时，按肿瘤体积分组，每组6只小鼠，分别设定为溶媒对照组、CC-90002对照组、抗人CD47嵌合单抗mAb-18-5给药组、抗人CD47嵌合单抗mAb-18-5N297A给药组。给药剂量为35nmol/kg，腹腔注射，每周给药2次，连续给药2周。自给药之日起，每周测量2次肿瘤体积，测量其长径a，短径b，肿瘤体积计算公式为：肿瘤体积(mm
3)＝(a x b
2)/2。
结果如图8示，抗人CD47嵌合单抗mAb-18-5具有抗肿瘤活性，显著抑制了接种于NCG小鼠的Raji移植瘤的生长，药效与CC-90002相当。
实施例9人源化抗人CD47单抗的制备
人源化抗人CD47单抗是根据Leung等人(1995，Molecule Immunol 32:1413-27)所述的方法获得的。
在Germline数据库中选取与鼠源抗体可变区序列匹配最好的人源化模板，其中轻链可变区的模板为IGKV1-17*02，序列如SEQ ID NO:34所示；重链可变区的模板为IGHV1-69*01，序列如SEQ ID NO:35所示。将鼠源抗体CDR区移植到选择的人源化模板上，替换人模板的CDR区，得到移植的人源化抗体轻链可变区，序列如SEQ ID NO:25所示，移植的人源化抗体重链可变区，序列如SEQ ID NO:28所示。在SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:28上选择位点进行回复突变，得到轻链可变区序列如SEQ ID NO:26、27所示，得到重链可变区序列如SEQ ID NO:29-33所示。将轻链可变区与轻链恒定区(序列SEQ ID NO:13)连接，分别得到对应的轻链全长序列，将重链可变区与重链恒定区(序列SEQ ID NO:14)连接，分别得到对应的重链全长序列。通过亲和力和稳定性筛选得到可用的人源化序列，得到的人源化序列的轻链和重链可变区序列信息见表9。
表9人源化序列的轻链和重链可变区序列信息
实施例10人源化抗人CD47单抗的抗原结合活性
人源化CD47单抗命名为BH3008b、BH3011b，其中可变区分别对应于Z11、Z12，轻链可变区与轻链恒定区(序列SEQ ID NO：13)连接，重链可变区与重链恒定区(序列SEQ ID NO：16)连接。如上所述，进行人源化抗人CD47单抗的抗原结合活性的检测。结果如图9所示，人源化的抗人CD47单抗BH3008b、BH3011b具有良好的人CD47结合亲和力，跟对照CC-90002的结合活性相当。
实施例11人源化抗人CD47单抗封闭CD47与受体结合的活性
如上所述，进行人源化抗人CD47单抗封闭CD47与受体结合的活性的检测。
结果如图10所示，人源化抗人CD47单抗BH3008b、BH3011b具有跟CC-90002相似的CD47/SIRPα封闭活性。
实施例12人源化抗人CD47单抗与人CD47的结合动力学常数
如上所述，用Biacore X100仪器来检测抗人CD47人源化单抗与其抗原人CD47结合的动力学常数。抗人CD47人源化抗体的结合动力学常数、解离动力学常数和解离平衡常数见表10。数据说明，抗人CD47人源化单抗BH3008b、BH3011b与CC-90002的结合解离参数相当。
表10.抗人CD47人源化单抗与人CD47结合的动力学常数
实施例13人源化的抗人CD47单抗对红细胞的影响
如上所述，测定抗人CD47人源化单抗BH3008b、BH3011b以及对照CC-90002是否引起红细胞的凝集。其中，阳性对照为克隆号CC2C6的抗CD47抗体，Biolegend，货号323102。
结果如图11所示，只有阳性对照引起人红细胞凝集，而CC-90002、BH3008b、BH3011b不引起红细胞凝集。
实施例14分子筛高效液相色谱法(SE-HPLC)检测人源化抗人CD47单抗的纯度及其热稳定性
选用Waters Xbridge BEH200色谱柱(货号：186007640)；流动相为0.1mol/L NaCl缓冲液，pH 6.7；流速为0.8mL/min；色谱柱温度为25℃；样品池温度为4℃；检测波长为280nm；用样品缓冲液DPBS稀释样品至1mg/mL，进样体积10μL。用Agilent高效液相分析仪1260***工作站对实验结果进行数据处理，用面积归一化法计算主峰比例即为纯度。对上述制备的人源化抗人CD47单抗BH3008b、BH3011b进行SE-HPLC纯度检测。为了确定这些单抗的热稳定性，将上述样品置于40℃高温条件下，在第2周和第4周分别取样进行SE-HPLC检测以观察热稳定性，结果如下表11所示。人源化抗人CD47抗体，均显示出了很好且相当的稳定性。
表11.SE-HPLC检测人源化的抗人CD47单抗在40℃条件下的热稳定性
实施例15离子交换色谱法(IEX)检测人源化抗人CD47单抗的电荷异构体
采用阳离子交换色谱柱MabPac SCX-10,4mm×250mm(Thermo，货号：78655)，以20mmol/L吗啉乙磺酸(2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid，MES)(pH5.6)和60mmol/L氯化钠为流动相A；以10mmol/L MES(pH5.6)和300mmol/L氯化钠为流动相B；流速为0.6mL/min；柱温为25℃；样品池温度为4℃；检测波长为280nm；样品上样量为40μl(1mg/mL)；洗脱方式为10～55％线性梯度运行43min。用Agilent高效液相分析仪1260***工作站对实验结果进行数据处理，用面积归一化法计算峰面积百分比。对上述制备的人源化抗人CD47单抗BH3008b、BH3011b进行IEX检测。为了确定这些单抗的化学稳定性，将上述样品置于40℃高温条件下，在第2周和第4周分别取样进行IEX检测，观察电荷变异体比例的变化，结果如表12所示。人源化抗人CD47抗体的电荷变异体的比例变化均比较低。
表12.IEX检测人源化的抗人CD47单抗在40℃条件下电荷变异体的变化
实施例16人源化抗人CD47单抗的抗肿瘤药效研究
本实施例检测人源化抗人CD47单抗对接种于NCG小鼠的Raji肿瘤移植物的生长抑制作用。实验材料选用NCG小鼠(购自南京生物医药研究院)，雌性，6-8周龄。小鼠适应环境一周后，每只小鼠接种5 x 10
6个Raji人淋巴瘤细胞。待肿瘤体积长至约150mm
3时，按肿瘤体积分组，每组6只小鼠，分别设定为溶媒对照组、CC-90002对照组、抗人CD47人源化单抗BH3008b给药组、抗人CD47人源化单抗BH3011b给药组。给药剂量 为17.5nmol/kg，腹腔注射，每周给药2次，连续给药2周。自给药之日起，每周测量2次肿瘤体积，测量其长径a，短径b，肿瘤体积计算公式为：肿瘤体积(mm
3)＝(a x b
2)/2。
结果如图12所示，抗人CD47人源化单抗BH3008b、BH3011b具有抗肿瘤活性，显著抑制了接种于NCG小鼠的Raji移植瘤的生长，药效与CC-90002相当。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解，其依然可以对前述各实施方案所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (14)
- 一种分离的抗人CD47抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区和/或重链可变区，其中，轻链可变区包含氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的LCDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的LCDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的LCDR3；和/或重链可变区包含氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的HCDR1，氨基酸序列与SEQ ID No.5或6具有至少约94％同一性的HCDR2；氨基酸序列与SEQ ID No.7或8具有至少约78％同一性的HCDR3。
- 根据权利要求1所述的抗人CD47抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗人CD47抗体或其抗原结合片段为嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体。
- 根据权利要求1或2所述的抗人CD47抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体的重链恒定区序列选自人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD之一的恒定区序列，和/或，所述抗体的轻链恒定区序列选自κ链或λ链；优选地，所述重链恒定区序列选自IgG1或者IgG4的恒定区序列，和/或所述轻链恒定区序列选自κ链的恒定区序列。
- 根据权利要求1-3任一项所述的抗人CD47抗体或其功能片段，其中，所述轻链可变区具有如SEQ ID NO.9或10所示的氨基酸序列，和/或所述重链可变区具有如SEQ ID NO.11或12所示的氨基酸序列，和/或轻链恒定区和重链恒定区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14-16任一项所示。
- 根据权利要求1-4任一所述的抗人CD47抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗人CD47抗体或其抗原结合片段的轻链可变区骨架区包括FR-L1、FR-L2、FR-L3及FR-L4，重链可变区骨架区包括FR-H1、FR-H2、FR-H3及FR-H4，其中，所述FR-L1的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示；所述FR-L2的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示，或是进一步经过以下取代之一或其任意组合所得到的氨基酸序列：第12个氨基酸R替换为T；所述FR-L3的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示，或是进一步经过以下取代之一或其任意组合所得到的氨基酸序列：第31个氨基酸Y替换为F；所述FR-L4的氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示；所述FR-H1的氨基酸序列如SEQ ID NO.21所示；所述FR-H2的氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示；所述FR-H3的氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示，或是经过以下取代之一或其任意组合所得到的氨基酸序列：第8个氨基酸E替换为T，第11个氨基酸S替换为N，第31个氨基酸A替换为V；和/或所述FR-H4的氨基酸序列如SEQ ID NO.24所示。
- 根据权利要求1-5任一项所述的抗人CD47抗体或其抗原结合片段，其中，轻链可变区具有如SEQ ID No.25-27任一项所示的氨基酸序列；和/或所述重链可变区具有如SEQ ID No.28-33任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求6所述的抗人CD47抗体或其抗原结合片段，其中，轻链可变区具有如SEQ ID NO.26或27所示的氨基酸序列，和/或重链可变区具有如SEQ ID NO.33所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-7任一项所述的抗人CD47抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗原结合片段选自F(ab') 2、Fab'、Fab、Fd、Fv、scFv、双特异抗体、骆驼抗体、CDR和抗体最小识别单位(dAb)中的一种或多种，优选地，所述抗原结合片段为Fab、F(ab') 2或scFv。
- 一种分离的核酸分子，其选自：(1)DNA或RNA，其编码权利要求1-8任一项所述的抗人CD47抗体或其抗原结合片段；(2)与(1)中定义的核酸完全互补的核酸。
- 一种表达载体，其包含有效连接的权利要求9所述的核酸分子。
- 一种宿主细胞，其包含权利要求9所述的核酸分子或权利要求10所述的表达载体。
- 一种组合物，其包含权利要求1-8任一项所述的抗人CD47抗体或其抗原结合片段，权利要求9所述的核酸分子，权利要求10所述的表达载体或权利要求11所述的宿主细胞，以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
- 一种生产权利要求1-8任一项所述的抗人CD47抗体或其抗原结合片段的方法，其包括步骤：将权利要求11所述的宿主细胞在适合所述抗人CD47抗体或其抗原结合片段表达的培养条件下培养，任选地，分离、纯化所得的产物。
- 权利要求1-8任一项所述的抗人CD47抗体或其抗原结合片段，权利要求9所述的核酸分子，权利要求10所述的表达载体或权利要求11所述的宿主细胞在制备用于预防和/或治疗CD47介导的疾病或病症的药物中的用途，优选地，所述疾病或病症为肿瘤；更优选地，所述肿瘤选自白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、脑肿瘤、头颈部鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、鼻咽癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、胆囊癌、肝癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、***、子宫内膜癌、子宫肉瘤、***癌、膀胱癌、肾细胞癌、黑色素瘤的一种或多种。
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