CN112679611B - 人源化cd47抗体或其抗原结合片段及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了人源化CD47抗体或其抗原结合片段及应用，低毒、高效，在体外未发生红细胞凝集，不会导致红细胞的清除。此外，本发明提供的人源化CD47抗体与血小板及红细胞表现出极弱水平的低结合或不结合，展现出于CD47+肿瘤细胞更加特异的靶向特异性。本发明提供的人源化CD47抗体或其抗原结合片段，在功能上能够有效地阻断CD47与SIRPα结合、激活介导巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬活性。

Description

人源化CD47抗体或其抗原结合片段及应用

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体涉及包括抗体技术领域及免疫领域，更具体的涉及人源化CD47抗体或其抗原结合片段及应用。

背景技术

CD47也被称为整合素相关蛋白(IntegrinAssociated Protein，IAP)，广泛的表达于细胞的表面，可与信号调节蛋白α(Signalregμlatoryproteinα，SIRPα)、血小板反应蛋白(thrombospondin-1，TSP1)以及整合素(integrins)相互作用，介导细胞凋亡、增殖、免疫等一系列的反应。CD47在20世纪80年代首次被确认为人类卵巢癌的肿瘤抗原，继而CD47被发现在多种类型的人类肿瘤中表达，包括急性髓细胞白血病(AML)、慢性髓细胞白血病(CML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、非霍金性淋巴瘤(NHL)、多发性骨髓瘤(MM)、膀胱癌(BC)和其他实体肿瘤。它的表达和活性已经与许多疾病和失调相关联。它是一种广泛表达的跨膜糖蛋白，并带有一个免疫球蛋白样结构域和五个跨膜区，其作为SIRPα的细胞配体，通过信号调节蛋白α(SIRPα)的NH2末端的V样结构域与SIRPα结合。SIRPα主要表达于骨髓细胞，包括巨噬细胞，粒细胞，树突状细胞(DC)，肥大细胞，和它们的前体细胞，包括造血干细胞。

CD47是一个“自我”标记，代表“别吃我”信号。人体需要20-30万亿的红细胞，以此保持氧气有效的运输到全身各处。红细胞的生命周期较短，仅有120天，每小时有100亿的红细胞生成，也有无数衰老的红细胞被巨噬细胞吞噬清除。然而巨噬细胞是如何区分年轻和衰老的红细胞，只进攻衰老红细胞的机理却不为人知。直到2000年，Oldenborg等人证实CD47是细胞表面一个重要的“self”标记，是调节巨噬细胞吞噬作用的一个重要信号。CD47可以与巨噬细胞表面SIRPα结合，磷酸化其ITIM，随后招募SHP-1蛋白，产生一系列的级联反应抑制巨噬细胞的吞噬作用。年轻的红细胞表达较高的CD47向巨噬细胞释放“自己人，别吃我”的信号，而衰老的红细胞CD47下调，最终被巨噬细胞清除。

不同的研究表明，几乎所有的肿瘤细胞和组织都高表达CD47。肿瘤细胞表面高表达的CD47通过与巨噬细胞表面SIRPα结合，释放“不要吃我”的信号，导致肿瘤组织浸润区的巨噬细胞不但同肿瘤细胞和谐相处，而且还会通过促进肿瘤内血管增殖，抑制效应T细胞发挥作用，促进肿瘤细胞扩增和生长。多个研究表明在细胞水平上，通过阻断SIRPα-CD47之间的相关作用可有效激活巨噬细胞对癌细胞的吞噬作用，在体内通过CD47抗体阻断SIRPα-CD47之间的相关作用可有效的抑制肿瘤在小鼠体内的生长。

针对阻断SIRPα-CD47信号通路已有多种抑制剂的研究报道，包括FortySevern公司的抗CD47单抗h5F9-G1(US9382320B2)、Celgene公司的单抗CC9002(专利US9045541B2)、信达生物的单抗ADI-26630(专利CN201710759828.9)、天境生物的单抗13H3/1F8(专利CN201780003451)等，此外还有TRILLIUMTHERAPEUTICS，INC.公司的双功能融合蛋白TTI-621(专利US20150329616A1)、ALX公司的ALX148(专利US20160186150A1)等，目前处于临床PhaseI/II。临床初步结果显示与CD20联合治疗CD20复发或难治性滤泡性淋巴瘤(FL)及大B细胞淋巴瘤(DLBCL)取得了令人惊喜的疗效，ALX148联合Trastuzumab、Pembrolizumab在胃癌(GC)、头颈癌(HNSCC)、非小细胞肺癌(NSCLC)都显示了一定的疗效。迄今CD47抑制剂(包括单抗、SIRPα融合蛋白)与CD20、HER2、PD-1等多个抗体抑制剂处于临床研究进展中。

现已开发的处于临床或临床前的CD47抑制剂在阻断CD47与SIRPα结合、促进巨噬细胞发挥吞噬作用的同时，会在不同程度上引起血红细胞的凝集。此外这些CD47单克隆抗体与红细胞及血小板有较高的靶向结合性，使得相应抗体不仅在治疗效果大打折扣、也引入了药物副作用，在临床上发生红细胞和血小板降低及其他相关副作用。

发明内容

针对上述技术问题，本发明提供了一种人源化CD47抗体或其抗原结合片段及应用，低毒、高效，在体外未发生红细胞凝集，不会导致红细胞的清除。此外，本发明提供的人源化CD47抗体与血小板及红细胞表现出极弱水平的低结合或不结合，展现出于CD47+肿瘤细胞更加特异的靶向特异性。本发明提供的人源化CD47抗体或其抗原结合片段，在功能上能够有效地阻断CD47与SIRPα结合、激活介导巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬活性。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

在一些实施方案中，本发明提供结合CD47或其片段(优选人CD47蛋白质)的抗CD47抗体或其抗原结合片段(优选人CD47抗原结合片段)。

在一些实施方案中，本发明所提供的人源化CD47抗体或其抗原结合片段选自：包括重链可变区VH序列和轻链可变区VL序列，所述VH序列与选自包括以下序列的组中的氨基酸序列具有至少98％的一致性：SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：39，SEQ IDNO：41，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：49，SEQ ID NO：51，SEQ IDNO：53，SEQ ID NO：55，SEQ ID NO：56，SEQ ID NO：57；所述VL序列与选自包括以下序列的组中的氨基酸序列具有至少98％的一致性：SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：5，SEQID NO：7，SEQ IDNO：9，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：16，SEQID NO：18，SEQ ID NO：20，SEQ IDNO：22，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：32，SEQ IDNO：34，SEQ ID NO：36，SEQ ID NO：38，SEQID NO：40，SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：44，SEQ IDNO：46，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：54。

在一些实施方案中，本发明所提供的人源化CD47抗体或其抗原结合片段，包括：VH/VL序列对，所述的VH/VL序列对包括VH和VL链的氨基酸序列及其核苷酸序列，所述的VH/VL序列对与选自包括以下序列对的组中的VH和VL氨基酸序列对具有至少98％的一致性：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：15和SEQ IDNO：16，SEQ IDNO：17和SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21和SEQID NO：22，SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36，SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38，SEQIDNO：39和SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42,SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44，SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：49和SEQ IDNO：50，SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：51和SEQID NO：50，SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：54，SEQ IDNO：56和SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：54，SEQID NO：57和SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：54。序列如下表1所示：

表1.本发明示例人源化CD47抗体的VH和VL序列

在一些实施方案中，本发明所提供的人源化CD47抗体或其抗原结合片段，当按照Kabat编码规则对抗体HCDRs编码时，(1)HCDR1/HCDR2/HCDR3组合包含选自以下的一组或多组重链互补决定区HCDR的序列：HCDR1/HCDR2/HCDR3选自为SEQ ID NO:61/SEQ ID NO:62/SEQ ID NO:63，SEQ ID NO:67/SEQ ID NO:68/SEQ ID NO:69，SEQ ID NO:73/SEQ ID NO:74/SEQ ID NO:69，SEQ ID NO:77/SEQ ID NO:78/SEQ ID NO:79。(2)含有一处或多处不超过5个氨基酸的氨基酸取代、缺失或***的上述(1)的HCDR。

在一些实施方案中，本发明所提供的人源化CD47抗体或其抗原结合片段，当按照Kabat编码规则对抗体LCDRs编码时，(1)LCDR1/LCDR2/LCDR3组合包含选自以下的一组或多组重链互补决定区LCDR的序列：LCDR1/LCDR2/LCDR3选自为SEQ ID NO:64/SEQ ID NO:65/SEQ ID NO:66，SEQ ID NO:70/SEQ ID NO:71/SEQ ID NO:72，SEQ ID NO:70/SEQ ID NO:75/SEQ ID NO:76，SEQ ID NO:80/SEQ ID NO:81/SEQ ID NO:82。(2)含有一处或多处不超过5个氨基酸的氨基酸取代、缺失或***的上述(1)的LCDR。

在一些实施方案中，本发明所提供的人源化CD47抗体或其抗原结合片段，当按照Kabat编码规则对抗体CDRs编码时，HCDR1/HCDR2/HCDR3与LCDR1/LCDR2/LCDR3按如下进行配对(1)：SEQ ID NO:61/SEQ ID NO:62/SEQ ID NO:63与SEQ ID NO:64/SEQ ID NO:65/SEQID NO:66，SEQ ID NO:67/SEQ ID NO:68/SEQ ID NO:69与SEQ ID NO:70/SEQ ID NO:71/SEQ ID NO:72，SEQ ID NO:73/SEQ ID NO:74/SEQ ID NO:69与SEQ ID NO:70/SEQ ID NO:75/SEQ ID NO:76，SEQ ID NO:77/SEQ ID NO:78/SEQ ID NO:79与SEQ ID NO:80/SEQ IDNO:81/SEQ ID NO:82。CDRs序列如下表2所示：

表2.本发明示例人源化CD47抗体的HCDRs和LCDR序列

在一些实施方案中，所述人源化CD47抗体的轻链恒定区任选人抗体κ链或λ链恒定区(SEQ ID NO:58)，重链恒定区任选人抗体IgG1或IgG4 S228P突变的恒定区(SEQ ID NO:59或SEQ ID NO:60)。

在一些实施方案中，所述抗原结合片段选自Fab、Fab′-SH、Fv、scFv或(Fab′)2片段。

本发明提供了编码以上任意所述人源化CD47抗体或其抗原结合片段的核酸。核酸序列如表3所示：

表3.编码本发明示例人源化CD47抗体或其抗原结合片段的核酸序列

本发明还提供了包含所述核酸的表达载体，以及包含所述表达载体的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞优选酵母细胞、中国仓鼠卵巢细胞、人胚肾细胞等哺乳动物细胞或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞。

在一些实施方案中，本发明提供一种双特异性抗体。所述双特异性抗体包括不同的两个臂，第一臂(arm1)和第二臂(arm2)，其中的一个臂(arm 1)包括能够与人CD47结合的以上任意所述人源化CD47抗体或其抗原结合片段，另一个臂(arm 2)包括不与人CD47结合的其他单克隆抗体或融合蛋白。所述另一个臂(arm2)能够与恶性肿瘤细胞/免疫细胞结合，其靶向结合以下靶点：EGFR，HER2，CD47，PD-1，PD-L1，CTLA4，TGFβ，VEGF，HER3，TIGIT，CLAUDIN18.2，CD3，TIM3，LAG3，CD20，CD19，CD33等靶点。

在一些实施方案中，本发明提供一种三特异性抗体或三特异性融合蛋白其包含上述人源化CD47抗体或抗原结合片段，三特异性抗体或三特异性融合蛋白的另两端靶向肿瘤细胞的肿瘤相关抗原或者靶向免疫细胞的免疫检验靶点，包含EGFR，HER2，CD47，PD-1，PD-L1，CTLA4，TGFβ，VEGF，HER3，TIGIT，CLAUDIN18.2，CD3，TIM3，LAG3 CD20，CD19，CD33等靶点。

在一些实施方案中，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括本发明提供的人源化CD47抗体或其抗原结合片段或包含本发明所述的人源化CD47抗体或其抗原结合片段作为其中一个臂的双特异性抗体，和药学上任选的药用载体。

在一些实施方案中，本发明还提供一种上述人源化CD47抗体或其抗原结合片段在制备***疾患CD47过度表达的药物中的应用。

优选的是，肿瘤疾患包括血液瘤、实体瘤疾患中的至少一种，血液瘤为急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、成人T-细胞白血病、多发性骨髓瘤(MM)、混合白血病、非霍奇金淋巴瘤(NHL)中的至少一种；实体瘤为淋巴瘤、乳腺癌、头颈癌、胃癌、肺癌、食管癌、肠癌、卵巢癌、***、肝癌、肾癌、胰腺癌、膀胱癌、结直肠癌、神经胶质瘤、黑素瘤和其他实体瘤中的至少一种。

本发明的有益效果如下：

本发明提供了新型人源化CD47抗体或其抗原结合片段，该人源化CD47抗体可特异性阻断CD47蛋白与SIRPα的相互作用，且具有相应的生物学功能，可以在不同水平上激活巨噬细胞介导对CD47+细胞的吞噬作用。该人源化CD47抗体与血小板及红细胞表现出极弱水平的低结合或不结合，展现出于CD47+肿瘤细胞更加特异的靶向特异性。该人源化CD47抗体在肿瘤细胞与人正常红细胞或人外周血PBMC或其他可能表达CD47分子的其他正常细胞的混合细胞群中，能够特异靶向肿瘤细胞。本申请所述人源化CD47抗体或其抗原结合片段还可以抑制肿瘤或肿瘤细胞的生长和/或增殖。

附图说明

图1a.人源化的6E8抗体与CD47蛋白的结合活性；图1b.人源化100与99B5抗体与CD47蛋白的结合活性；图1c.人源化的81C1抗体与CD47蛋白结合活性；图1d.人源化99B5抗体与CD47蛋白结合活性。

图2a.人源化的99B5抗体与jurkat细胞、MDA-MB-231细胞、CHO-K1/Human CD47细胞、SHP77细胞的结合活性；图2b.人源化的6E8抗体与U-87细胞、CHO-K1/cyno CD47细胞、CHO-K1/Human CD47细胞、Raji细胞的结合活性。

图3a.人源化的99B5抗体对人CD47蛋白与SIRPα的结合阻断效果；图3b.人源化的6E8抗体对人CD47蛋白与SIRPα的结合阻断效果。

图4.人源化的99B5抗体在细胞水平对人CD47配体SIRPα与CD47相互作用的阻断效果。

图5a.人源化99B5抗体各浓度梯度下红细胞凝集实验结果；图5b.人源化100抗体各浓度梯度下红细胞凝集实验结果；图5c.人源化6E8抗体各浓度梯度下红细胞凝集实验结果。

图6a.CD47在多种肿瘤细胞株高表达实验结果；图6b.CD47在多种肿瘤细胞株高表达实验结果

图7a.显示本发明的CD47人源化抗体h99B5-IgG4-1、h99B5-IgG4-2、h99B5-IgG4-3、h100-IgG4-1、h100-IgG4-4、h100-IgG4-5、h100-IgG4-6、h100-IgG4-7等在Jurkat肿瘤模型中的活性；图7b.显示本发明的CD47人源化抗体h99B5-IgG4-1、h99B5-IgG4-2、h99B5-IgG4-3、h100-IgG4-1、h100-IgG4-2、h100-IgG4-3、h100-IgG4-4、h100-IgG4-5、h100-IgG4-6、h100-IgG4-7等在SHP-77肿瘤模型中的活性。

图8.人源化CD47抗体对Raji细胞有明显的ADCC作用肿瘤杀伤活性的实验结果。

具体实施方式

在下文详细描述本发明前，应理解本发明不限于本文中描述的特定方法学、方案和试剂，因为这些可以变化。还应理解本文中使用的术语仅为了描述具体实施方案，而并不意图限制本发明的范围，其仅会由所附权利要求书限制。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域中普通技术人员通常的理解具有相同的含义。

术语定义：

术语“抗体”在本文中以最广意义使用并且涵盖多种抗体结构物，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们显示出所需的抗原结合活性即可。“抗体”(或“Abs”)和“免疫球蛋白”(或“Igs”)是具有相同结构特征的糖蛋白，抗体通常将包含至少两条全长重链和两条全长轻链，但在某些情况下可包括较少的链，例如骆驼中天然存在的抗体可仅包含重链。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接(也称为“VH/VL对”)，每条重链和轻链也具有规则排列的链内二硫桥。每条重链在一端具有可变结构域(VH)，随后是多个恒定结构域。每条轻链的一端有一个可变结构域(VL)，另一端有一个恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对齐，并且轻链可变结构域与重链的可变结构域对齐。

术语“单克隆抗体”是指具有单一氨基酸组成的抗体分子的制备物，不涉及其制备的方法。单克隆抗体或其免疫活性片段可以通过杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术、合成技术等或其它本领域已知的生产技术来产生，本发明中涉及单克隆抗体制备的方法包括杂交瘤细胞体外培养制备或通过DNA重组技术制备。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。

术语“可变”是指这样的事实，即抗体的可变结构域的序列的某些部分变化强烈，并用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，变异性不均匀地分布在抗体的整个可变区中。它集中在轻链和重链可变区中的三个区段，被称为互补决定区(CDRs)或高变区。可变域中更高度保守的部分被称为框架(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区，两条轻链和重链可变区从N-末端到C-末端通常包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。大部分FR区采用β-折叠构型，通过三个CDRs连接，形成环连接，并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的CDRs通过FR区紧密靠近在一起，并与来自另一条链的CDRs一起促成抗体的抗原结合位点的形成。请参考，例如，Kabat等人，免疫学的蛋白质序列，第五版，美国国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州(1991)。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出各种生物学效应功能，如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体杀伤途径(CDC)等。

根据抗体重链恒定区的氨基酸序列进行区分，将抗体可以分为5类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类别中的几种同种型别可以进一步划分成亚类，如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG1、IgA1以及IgA2。对应于不同种类免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α，δ，ε，γ和μ。根据抗体轻链恒定区(CL)的不同可以划分κ和λ。在全长轻链和重链内，通常可变区和恒定区由约12个或更多个氨基酸的“J”区连接，且重链还包括约10个以上氨基酸的“D”区。

“抗体免疫活性片段”是指不同于完整抗体的分子，其包含完整抗体的部分，所述部分能够结合完整抗体结合的抗原。其中该部分不含完整抗体的Fc区中的恒定重链结构域(即CH2，CH3和CH4，取决于抗体同种型)。抗体免疫活性片段的实例包括Fab，Fab′，Fab′-SH，F(ab′)2，ScFv和Fv片段。Fab片段包括重链/轻链可变区和轻链的恒定结构域及重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab′片段与Fab片段的不同之处在于在重链CH1结构域的羧基末端添加了几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。F(ab′)2抗体片段最初是作为Fab′片段对产生的，在Fab′片段之间具有铰链半胱氨酸的。Fv片段是IgG和IgM类型抗体通过酶法分析后产物中最小的片段。Fv片段抗原结合区，其由VH和VC区域组成，但是他们缺少CH1和CL区域。VH和VL通过非共价键在Fv片段里结合在一起。ScFv是Fv类型片段，其包括了通过易弯曲多肽链接在一起的VH和VL区域。

本发明所述的术语“嵌合抗体”指重链和/或轻链的一部分(一般指可变区)衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的其余部分(一般指恒定区)衍生自另一物种的抗体或属于另一种抗体类别或亚类的抗体、以及这些抗体的片段中的相应序列相同或同源，只要它们表现出期望的生物学活性。在本发明中涉及的嵌合抗体如来自鼠源CD47抗体的重链/轻链可变区通过抗体工程技术嫁接到人源抗体的重链/轻链的恒定区，其表现出相似的生物活性。

术语“人源化抗体”是指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在一些实施方案中，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有的HVR(例如，CDR)对应于非人抗体的序列，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的序列。本发明中人源化抗体主要指鼠源单克隆抗体以基因克隆及DNA重组技术改造，重新表达的抗体，其大部分氨基酸序列(主要包括恒定区及FR区)为人源序列取代，CDR区采取不改变或少量突变，基本保留亲本鼠单克隆抗体的亲和力和特异性，又降低了其异源性，降低在人体中引起的免疫原性。

术语“双特异性抗体”是含有2种特异性抗原结合位点的人工抗体，能在靶细胞和功能分子(细胞)之间架起桥梁应，激发具有导向性的免疫反应，是基因工程抗体的一种。双抗体可以是二价的或双特异性的。双抗体更充分地描述于例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等，Nat.Med.9：129-134(2003)；和Hollinger等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90：6444-6448(1993)中。

术语“三特异性抗体”是含有三种特异性抗原结合位点的人工抗体，能在靶细胞和功能分子(细胞)之间架起桥梁应，激发具有导向性的免疫反应，是基因工程抗体的一种。三抗体可以是三价的或三特异性的。

术语“表位”是指与抗体的互补位结合的抗原上的任何抗原决定簇。表位决定簇通常由分子的化学活性表面基团组成，例如氨基酸或糖侧链，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。

本文中术语“竞争”指用于竞争相同表位的抗原结合蛋白(例如中和抗原结合蛋白或中和抗体)的情况中时，意指在抗原结合蛋白之间竞争，其通过以下测定法来测定：在所述测定法中，待检测的抗原结合蛋白(例如抗体或其免疫学功能片段)防止或抑制(例如降低)参考抗原结合蛋白(例如配体或参考抗体)与共同抗原(例如CD47或其片段)的特异性结合。

术语“阻断”表示存在本发明的抗体时能够减少的CD47信号传递。CD47介导的信号传递阻断指本发明的CD47抗体存在时CD47信号传递水平低于CD47的对照水平(即不存在抗体时的CD47信号传递水平)，降低的幅度大于或等于5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％、99％或100％，可使用多种标准技术测量CD47信号传递水平，如作为非限制性实施例，测量下游基因激活和/或响应CD47激活的荧光素酶报告试验。

术语“载体”在本文中使用时是指能够通过转化扩增与其相连的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及结合到已经引入其的宿主细胞的基因组中的载体。一些载体能够指导与其可操作相连的核酸的表达。这样的载体在本文中被称为“表达载体”。

术语“宿主细胞”是指引入外源核酸的细胞，包括这种细胞的后代。并能够表达外源核酸于细胞内或细胞膜或释放至胞外。

术语“凝集”表示细胞结块，而术语“血凝反应”表示特定的一类细胞(即血红细胞)结块。因此，血凝反应是凝集的一种类型。

本发明所述的人源化CD47抗体可以在体外用于免疫测定中，本发明的CD47抗体可以偶联荧光素酶、生物素酶等可检测标记，在液相或固相中用于FACS、IHC、ELISA等直接或间接的免疫测定，包括竞争性或非竞争性。本发明提供的CD47抗体能方便地用于试剂盒中，体内或体外的生物流体内或组织上的CD47可被本发明提供的CD47抗体检测出来。能用于任何含有可检测量的CD47的样品。样品可以包括但不限于液体如尿、唾液、脑脊髓液、血液、血清及类似物，或者样品可以是固体或半固体如组织、粪便及类似物，或者，可以是如那些常用于组织学诊断的固体组织。

本发明提供的人源化CD47抗体可以随意的与一种或多种试剂配制在一起，所述试剂能提高活性，或提高治疗效果。本发明提供的CD47抗体可以随意的与一种或多种药物配制在一起，所述其他药物包括但能够抑制肿瘤生长的小分子及大分子药物，优选地，所述其他药物例如是通过T细胞识别攻击肿瘤细胞的各种单克隆抗体药，例如利妥昔单抗、西妥昔单抗与曲妥珠单抗。

本发明提供的人源化CD47抗体或药物组合物可以通过任何合适的方式施用，包括肠胃外，皮下、腹腔、肺内和鼻内施用方式。非经胃肠道注射包括肌肉、静脉、动脉、腹腔或皮下施用。

以下实施例进一步说明本发明，然而，应理解实施例以说明而非限定的方式来描述，并且本领域技术人员可以进行多种修改。

实施例1：CD47人源化抗体及对照抗体的生产和纯化

本发明人源化CD47抗体的氨基酸序列及CDR序列见表1、表2，体外构建CD47人源化抗体的表达载体。

具体地，将表1中的轻链可变区(VL)序列构建至人抗体轻链的κ链恒定区(SEQ IDNO:58)，将重链可变区(VH)的序列构建至人抗体重链的恒定区，优选人IgG4(S228P)重链恒定区(SEQ ID NO:60)。构建如下人源化抗体的表达载体：h99B5-IgG4-1，h99B5-IgG4-2，h99B5-IgG4-3，h99B5-IgG4-4，h99B5-IgG4-5，h81C1-IgG4-1，h81C1-IgG4-2，h81C1-IgG4-3，h81C1-IgG4-4，h81C1-IgG4-5，h100-IgG4-1，h100-IgG4-2，h100-IgG4-3，h100-IgG4-4，h100-IgG4-5，h100-IgG4-6，h100-IgG4-7，h100-IgG4-8，h100-IgG4-9，h100-IgG4-10，h6E8-IgG4-1，h6E8-IgG4-2，h6E8-IgG4-3，h6E8-IgG4-4，h6E8-hG4-5，h99-IgG4-L1H1，h99-IgG4-L2H1，h99-IgG4-L3H1，h99-IgG4-L1H2，h99-IgG4-L2H2，h99-IgG4-L3H2，h99-IgG4-L1H3，h99-IgG4-L2H3，h99-IgG4-L3H3，h99-IgG4-L1H4，h99-IgG4-L2H4，h99-IgG4-L3H4，h99-IgG4-L1H5，h99-IgG4-L2H5，h99-IgG4-L3H5，h99-IgG4-L1H6，h99-IgG4-L2H6，h99-IgG4-L3H6,Nh99B5-IgG4-1，Nh99B5-IgG4-2，Nh99B5-IgG4-3，Nh99B5-IgG4-4，Nh99B5-IgG4-5。

将轻链可变区(VL)序列构建至人抗体轻链的κ链恒定区(SEQ ID NO:58)，将重链可变区(VH)的序列构建至人抗体重链的恒定区，优选人IgG1重链恒定区(SEQ ID NO:59)。构建如下人源化抗体的表达载体：h99B5-IgG1-1，h99B5-IgG1-2，h99B5-IgG1-3，h99B5-IgG1-4，h99B5-IgG1-5，h81C1-IgG1-1，h81C1-IgG1-2，h81C1-IgG1-3，h81C1-IgG1-4，h81C1-IgG1-5，h100-IgG1-1，h100-IgG1-2，h100-IgG1-3，h100-IgG1-4，h100-IgG1-5，h100-IgG1-6，h100-IgG1-7，h100-IgG1-8，h100-IgG1-9，h100-IgG1-10，h6E8-IgG1-1，h6E8-IgG1-2，h6E8-IgG1-3，h6E8-IgG1-4，h6E8-IgG1-5，h99-IgG1-L1H1，h99-IgG1-L2H1，h99-IgG1-L3H1，h99-IgG1-L1H2，h99-IgG1-L2H2，h99-IgG1-L3H2，h99-IgG1-L1H3，h99-IgG1-L2H3，h99-IgG1-L3H3，h99-IgG1-L1H4，h99-IgG1-L2H4，h99-IgG1-L3H4，h99-IgG1-L1H5，h99-IgG1-L2H5，h99-IgG1-L3H5，h99-IgG1-L1H6，h99-IgG1-L2H6，h99-IgG1-L3H6。

重组抗体重链/轻链氨基酸的N端加入优化信号肽进行分泌表达，将重组抗体的氨基酸进行密码子优化，核苷酸的5’端加入Kozak序列GCCGCCACC，核苷酸两端加入pcDNA3.4的酶切位点EcoRI/HindIII，合成基因经酶切后连接到pcDNA3.4载体。

人源化抗体h5F9-G1(FortySeven)与美国专利US2015/0183874A1中的抗体“5F9”的序列相同，h5F9-G1为首个进入临床的CD47抗体抑制剂。B6H12序列来自于专利WO2011143624A2；AB6.12(Celgene)序列来源于美国专利US 9045541中的抗体“AB6.12”的序列。99B5-G1，81C1-G1，6E8-G1,100-IgG，99B5-G4，81C1-G4，6E8-G4，100-IgG4嵌合抗体来自于专利CN111454359A。

表达载体经大肠杆菌扩增抽提并去内毒素，按照质粒：培养基＝1μg/ml转染Expi-293F细胞。所用转染试剂为ExpiFectamine 293Transfection Kit(Theromfisher，Lot#：A14524)，转染时细胞密度为25*10⁵cells/ml，转染后16-18h添加表达增强剂Enhancer1及Enhancer2，转染后5天收集细胞上清。经ProteinA纯化，在4℃条件下以10000rpm/min，离心30min上清液去除细胞碎片，ProteinA柱子用平衡液(0.02MPB、0.15MNaCl、pH7.0)平衡10个柱体积后，以2ml/min的速度使上清液流过柱子，上样完成后使用平衡液对结合后的柱子清洗5个柱体积，加入洗脱液(0.02M PB、0.15MNaCl、pH3.0)洗脱，洗脱液滴入到加入中和液(1M Tris，pH9.0)收集管中。收集到蛋白洗脱液，使用超滤管(Millipore UFC903096)4000G超滤浓缩并置换buffer成PBS(HyClone SH30256.01)，SDS-PAGE检测后放到-20℃保存。去内毒素，过滤除菌，SDS-PAGE及SEC-HPLC检测纯度。

实施例2：本发明的人源化CD47抗体与人CD47重组融合蛋白结合的剂量效应(ELISA)

将hCD47-his(Cat#CD7-H5227，Lot#C56P1-737F1-FA)按照1μg/m进行包被，包被缓冲液选择PBS(HyClone Lot:AC13298279)，100μl/孔，常温(25℃)包被16-18h，TBST洗板2次，PBS+3％BSA进行封闭，200μl/孔，常温(25℃)封闭16-18h，TBST洗板1次，扣干，37℃干燥2小时。按照330μl 100μg/ml配制本发明的CD47抗体及对照抗体，10μg/ml为第一个梯度，进行4倍梯度稀释，例如第二个梯度是将第一个梯度80μl加入240μlPBS，依次类推，共11个梯度浓度。37℃孵育1小时。自动洗板机PBST洗板3次后，每孔加入100μl 1：20000稀释的羊抗人HRP二抗(abcam Lot#：ab98624)，37℃孵育45分钟。孵育结束后自动洗板机洗板3次，最后一次洗涤完成后拿酶标板到吸水纸上扣干净残留液体。每孔加入100μl TMB显色液。避光反应3-5分钟，每孔加入50μl 1％H₂SO₄终止反应。设置MD(I3X)酶标仪读取吸光值为450nm和630nm，自动读取完数值后保存数据。

结果显示本发明示例性抗体与人CD47蛋白都有着良好的结合活性，且人源化抗体显示出比阳性对照抗体h5F9-G4更好的蛋白结合活性。

图1a显示了人源化的6E8抗体与CD47蛋白较好的结合活性；图1b显示了人源化100与99B5抗体与CD47蛋白较好的结合活性；图1c显示了人源化的81C1抗体与CD47蛋白较好的结合活性；图1d显示了人源化的99B5抗体与CD47蛋白较好的结合活性。结果显示本发明的示例人源化CD47抗体均与CD47融合蛋白具有较强的结合能力。

实施例3：本发明的人源化CD47抗体与表达人CD47/食蟹猴、各种癌细胞系的细胞结合活性(FACS)利用流式细胞仪(BD FACS Celesta Cell Analyzer)测定本发明CD47抗体与表达人或食蟹猴CD47的CHO-K1稳定细胞株、Jurkat、Raji、MDA-MB-231、SHP77、U-87细胞等癌细胞系的结合活性。

本实验例共采用2种表达CD47的稳定细胞株(CHO-K1-Cyno-CD47/CHO-K1-Human-CD47)及5种癌细胞系，CHO-K1-Cyno-CD47/CHO-K1-Human-CD47源自南京金斯瑞生物技术有限公司，Jurkat、Raji、MDA-MB-231、SHP77、U-87(上海中国科学院细胞库)。分别将所列细胞进行消化后(悬浮细胞无需消化)，室温进行离心处理，1000rpm，5mins，弃上清，经PBS洗涤后，PBS重悬于细胞流式管中，细胞浓度调整为1×10⁶cells/ml。每管PBS体积为250μL，抗体设置8个反应浓度，10μg/ml，3倍梯度稀释，调整抗体浓度后每管加入相应的蛋白250μL；室温孵育1h后，PBS洗涤3次(1500rpm，5mins)；每管样品加入100μL二抗GoatAnti-human IgG/Alexa 647(Bioss Lot:AE041526)，室温避光孵育30mins后，加入1mL PBS洗涤3次(1500rpm，5mins)；每管加入500μLPBS重悬细胞，上机检测。

图2a显示了人源化的99B5抗体分别与MDA-MB-231细胞、jurkat细胞、SHP77、CHO-K1/Human CD47细胞良好的结合活性；图2b显示了人源化的6E8抗体与U-87细胞、CHO-K1/cyno CD47细胞、CHO-K1/Human CD47、Raji细胞的良好结合活性。结果显示本发明的示例CD47人源化抗体均与过表达CD47的细胞具有较强的结合能力。大多数与阳性对照抗体h5F9-G1相比在各类细胞的结合活性上处于同一水平。

实施例4：本发明的人源化CD47抗体在蛋白水平对人CD47配体SIRPα与CD47相互作用的阻断剂量效应(ELISA)

Biotin标记SIRPα-Fc(Cat#4546-SA-050，R&D System)，待测抗体同SIRPα-Fc竞争性结合CD47，检测抗体对SIRPα-Fc和CD47的结合阻断效果。

具体地，CD47(Acro，CD7-H5227-1mg，His tag)按照1μg/ml 100μl/孔在PBS缓冲液条件下包被，分别与不同浓度的待测样品一起混合，加入到预包被CD47抗原的96孔板中，37℃孵育45分钟。孵育结束后自动洗板机洗板5次，最后一次洗涤完成后用酶标板到吸水纸上扣干净残留液体。每孔加入100μl Streptavidin-HRP，37℃孵育45分钟。孵育结束后自动洗板机洗板5次，最后一次洗涤完成后用酶标板到吸水纸上扣干净残留液体。每孔加入100μlTMB显色液。避光反应3-5分钟，每孔加入50μl1％H₂SO₄终止反应。设置MD(I3X)酶标仪读取吸光值为450nm和630nm，自动读取完数值后保存数据。待测抗体起始浓度10μg/ml，3倍梯度稀释，共12个浓度梯度。

结果显示本发明示例性抗体都能有效阻断人CD47蛋白与SIRPα的结合。如图3a、3b。所有示例人源化抗体对人CD47蛋白与SIRPα的结合阻断效果同阳性对照抗体h5F9-G4类似或优于阳性对照抗体h5F9-G4。

实施例5：本发明的人源化CD47抗体在细胞水平对人CD47配体SIRPα与CD47相互作用的阻断(FACS)

将Jurkat细胞进行室温离心处理，1000rpm，5mins，弃上清，经PBS洗涤后，PBS重悬于细胞流式管中，细胞浓度调整为1×10⁷cells/ml。利用Biotin标记SIRPα-Fc(Cat#4546-SA-050，R&D System)，分别与不同浓度的待测样品一起混合加入到Jurkat细胞中(2.5×10⁵cells/reaction)。每个反应体系为250μL，重组抗体的反应浓度为10个梯度，起始浓度300nM，3倍梯度稀释。4℃孵育1h后，PBS洗涤3次(1500rpm，5mins)；每管样品加入100μL二抗Anti-SAiFlour647(genscript，3μg/mL)，4℃避光孵育30mins后，加入1mL PBS洗涤3次(1500rpm，5mins)；每管加入500μLPBS重悬细胞，上机检测。

如图4所示，结果显示本发明的示例人源化99B5抗体在细胞水平上能够有效阻断人CD47配体SIRPα与CD47相互作用。

实施例6：本发明的人源化CD47抗体对促进红细胞凝集活性检测(Hemagglutinationactivity)

利用来自健康人的红细胞测定本发明CD47抗体及对照抗体对红血球的凝集活性。

具体实施如下：

使用柠檬酸钠等抗凝血剂收集全血；将全血置于15ml离心管，PBS补足至15ml，室温离心，200×g，10mins，弃上清；用PBS将RBCs补足至15mL，混匀后，室温离心，1500rpm，5mins。洗涤3次；最后一次洗涤后，使用PBS调节RBCs浓度为2％(如在1ml的RBCs中加入49ml的PBS)；将重组蛋白及阳性抗体按照200μg/ml进行2倍梯度稀释，共计15个浓度梯度；使用96孔圆底板，每孔加入50μl相应浓度的重组蛋白或单抗与50μl的RBCs，室温孵育2h后观察并记录反应结果。

对照抗体h5F9-G4在低浓度下就开始发生红细胞会显著凝聚，如图5a、5b、5c所示，图5a显示了人源化99B5抗体各浓度梯度下达未引起实质上的红细胞凝聚。图5b显示了人源化100抗体各浓度梯度下达未引起实质上的红细胞凝聚。图5c显示了人源化81C1抗体各浓度梯度下达未引起实质上的红细胞凝聚。结果显示本发明的示例人源化CD47抗体在各浓度梯度下达未引起实质上的红细胞凝聚，而对照抗体h5F9-G4的凝集反应非常明显。在显微镜下进一步观察，抗体h5F9-G1会导致数个红细胞聚集在一起。本发明实验了示例抗体对来自多个不同健康人的红细胞凝集，皆能显示出本发明抗体在红细胞凝集方面的安全性。因此本发明的CD47人源化抗体在治疗中具有比h5F9G4抗体更低的副作用，在临床中具有较高的安全性。此外，图中的h99IgG4-1，h99-IgG4-1，H99-G4-1对应分子h99B5-IgG4-1；h99IgG4-2，h99-IgG4-2对应分子h99B5-IgG4-2；h99IgG4-3，h99-IgG4-3对应分子h99B5-IgG4-3；h99IgG4-L3H3，h99-IgG4-L3H3对应分子h99B5-IgG4-L3H3；h99IgG4-gen，99-IgG4-gen对应分子99B5-IgG4；100IgG4对应分子100-IgG4；5F9G4对应分子h5F9-G4；H100-G4-1对应h100-G4-1，H100-G4-2对应h100-G4-2；H100-G4-3对应h100-G4-3；H100-G4-4对应h100-G4-4；H100-G4-5对应h100-G4-5；H100-G4-6对应h100-G4-；H100-G4-7对应h100-G4-7；H100-G4-8对应h100-G4-8；H100-G4-9对应h100-G4-9；H100-G4-10对应h100-G4-10；h81-IgG1-嵌合对应81C1-IgG1；h81-IgG1-1对应h81C1-IgG1-1；h81-IgG1-2对应h81C1-IgG1-2；h81-IgG1-3对应h81C1-IgG1-3；h81-IgG1-4对应h81C1-IgG1-4；h81-IgG1-5对应h81C1-IgG1-5；h81-IgG4-嵌合对应81C1-IgG4；h81-IgG4-2对应h81C1-IgG4-2；h81-IgG4-1对应h81C1-IgG4-1；h81-IgG4-5对应h81C1-IgG4-5。

实施例7：CD47在肿瘤细胞中的表达水平

利用流式细胞仪(BDFACSCelestaCellAnalyzer)测定Raji、Daudi、Ramous、HL60、MDA-MB231、SHP-77等血液瘤及实体瘤细胞系及RBC的CD47表达水平。具体实施如下：

1.先在显微镜下观察各细胞，在细胞圆润、透亮，正常状态下收集细胞，计数，1500rpm离心5min。

2.弃上清，用PBS(Hyclone，SH30256.01)重悬各细胞后，96孔板，每孔加入25×10⁴个细胞，每孔50μL。

3.同时每孔加入相应抗体(h5F9-G1，HIgG)10μg/mL，50μL。室温避光孵育30min。

4.孵育完成后，1500rpm离心5min洗涤3次，加入Alexa Fluor 647AffinipureGoatAnti-Human IgG+IgM(H+L)(Jackson，109605044)。室温避光孵育30min。

5.孵育完成后，1500rpm离心5min洗涤3次后，弃上清，每孔加入100μL PBS，流式细胞仪(Beckman，cytoflex)分析数据，使用GraphPadPrism作图。

结果显示(图6a、6b)CD47在Daudi、CCRF-CEM、HL60、Raji、PC-3、Jurkat等血液瘤细胞株高表达，在MDA-MB-231、A431等实体瘤细胞株高表达。表明CD47人源化抗体将有着广泛的应用前景。

实施例8：本发明的人源化CD47抗体对激活巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的作用检测(ADCP)

效应细胞MDM分离诱导：抽取20个人的静脉血液分离PBMC，分离单核细胞，加入GM-CSF/M-CSF诱导分化MDM，1周后通过CD11b、CD14、CD45、CD163、CD206生物标志物进行鉴定分化的巨噬细胞MDM；ADCP：从培养箱中取出靶细胞HL-60，将细胞收集到15ml离心管，离心，弃去上清，用PBS重悬细胞，计数，用PKH26(SIGMA-ALDRICH)染靶细胞，放置37℃&5％CO₂培养过夜；次日将靶细胞从培养基中取出，离心收集细胞，弃上清，使用完全培养基重悬，计数；取靶细胞，加入完全培养基，将细胞和待测样品加入到对应的96孔板中，50000cells/孔；室温孵育0.5h；从培养基中拿出效应细胞(MDM)，收集上清，加PBS清洗，加Accutase消化MDM，让其脱壁，加入相同体积的完全培养基终止消化，将细胞悬液转移到离心管中，将细胞上清和消化下来的细胞按照300g离心10min；取相应体积的MDM细胞，加入完全培养基，将MDM细胞加入到对应靶细胞的96孔板中。效应细胞：靶细胞＝1:1，37℃孵育4h；加Accutase，显微镜下观察贴壁的细胞是否消化下来(约15min)，取出细胞，将细胞转移到另一块板中，待消化完全将移出的细胞悬液重新加入对应孔中；离心，加入检测抗体CD11b，4℃孵育15min；加PBS到每孔，离心，弃去上清，加PBS重悬；流式细胞仪检测；数据分析：％PhagocytosisbyMDMs＝{(PKH26+&CD11b+cells)/AllPKH26+cells}×100％。

图7a显示本发明的CD47人源化抗体h99B5-IgG4-1、h99B5-IgG4-2、h99B5-IgG4-3、h100-IgG4-1、h100-IgG4-4、h100-IgG4-5、h100-IgG4-6、h100-IgG4-7等在Jurkat肿瘤模型中都显示出了强于h5F9-G4的活性。说明本发明的CD47人源化抗体对过表达CD47的血液肿瘤具有潜在的杀伤及治疗效果。

图7b显示本发明的CD47人源化抗体h99B5-IgG4-1、h99B5-IgG4-2、h99B5-IgG4-3、h100-IgG4-1、h100-IgG4-2、h100-IgG4-3、h100-IgG4-4、h100-IgG4-5、h100-IgG4-6、h100-IgG4-7等在SHP-77肿瘤模型中都显示出了强于h5F9-G4的活性。说明本发明的CD47人源化抗体对过表达CD47的实体肿瘤具有潜在的杀伤及治疗效果。

实施例9：本发明的人源化抗体对肿瘤细胞的ADCC活性

通过Jurkat-FcγRIIIa-NFAT-Luciferase细胞作为效应细胞检测抗体对肿瘤细胞Raji的(RBC)ADCC活性，评估其介导的对肿瘤细胞的杀伤。

具体实施如下：

1.先在显微镜下观察靶细胞，在细胞圆润、透亮，正常状态下收集细胞，计数，1500rpm离心5min。

2.弃上清，用1640+0.5％FBS重悬靶细胞，混匀后加入白色平底无菌板，1×10⁴cells/孔，每孔25μl。

3.在上述板中加入配制好的4倍终浓度的待测抗体，每孔25μl，37℃，5％CO ₂培养箱孵育30min。

4.孵育完成后，加入Jurkat-FcγRIIIa-NFAT-Luciferase细胞，6×10⁴cells/孔，每孔50μl。体积不足100μl(对照孔)，用1640+0.5％FBS培养基补足至100μl，混匀后37℃，5％CO₂培养箱孵育6h。

5.每孔加入40μl Bio-glo，避光孵育5min，酶标仪读取化学发光。

图8结果显示人源化抗体，尤其是h99B5-IgG4-2、h99B5-IgG4-3，两个抗体对Raji细胞有明显的ADCC作用肿瘤杀伤活性，而对照抗体h5F9并没有ADCC作用。

序列表

<110> 倍而达药业（苏州）有限公司

<120> 人源化CD47抗体或其抗原结合片段及应用

<160> 139

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gln Val Gln Leu Val Gln Pro Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Asp Tyr Thr Ile Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Leu Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ser Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Thr Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Lys Tyr Pro Ala Gly Gln Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115 120

<210> 2

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val

35 40 45

Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln His Phe Trp Asp Thr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 3

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Asp Tyr Thr Ile Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Leu Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ser Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Thr Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Pro Ala Gly Gln Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115 120

<210> 4

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Asp Tyr Thr Ile Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Leu Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ser Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Thr Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Tyr Pro Ala Gly Gln Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115 120

<210> 5

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Val

35 40 45

Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln His Phe Trp Asp Thr Pro Trp

85 90 95

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Asn Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys Tyr Arg Lys Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 37

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

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1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Phe

20 25 30

Tyr Ile Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Ala Pro Gly Thr Val Ile Thr His Phe Asn Glu Met Phe

50 55 60

Arg Ala Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Ser Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Asp Phe Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asn Gly Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Ser Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys Tyr Arg Lys Leu Pro Trp

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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr

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Thr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Ser Leu Glu Trp Met

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Gly Val Val Asn Pro Asn Ile Gly Ala Thr Thr Tyr Asn Gln Met Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

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100 105 110

Val Ser Ser

115

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

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20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

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Lys Tyr Asp Ser Gln Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

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65 70 75 80

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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65 70 75 80

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

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50 55 60

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65 70 75 80

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Val Ser Ser

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Asp Ser Gln Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala

65 70 75 80

Glu Asp Ala Gly Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Thr Asn Ser Trp Pro Phe

85 90 95

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asn Asn

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Leu His Trp Tyr Arg Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Asp Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

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65 70 75 80

Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn Ser Trp Pro Phe

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asn Asn

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Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

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Lys Tyr Asp Ser Gln Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

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65 70 75 80

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Asp Tyr Thr Ile Thr Ser Tyr

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Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met

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65 70 75 80

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr

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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile

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50 55 60

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65 70 75 80

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Asp Tyr Thr Ile Thr Ser Tyr

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Trp Ile Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

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Gly Arg Ile Asp Leu Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ser Gln Lys Phe

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65 70 75 80

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr

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Leu Ala Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Val

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Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Phe Cys Gln His Phe Trp Asp Thr Pro Trp

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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 53

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Asp Tyr Thr Ile Thr Ser Tyr

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Trp Ile Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

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Gly Arg Ile Asp Leu Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ser Gln Lys Phe

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Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

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<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 54

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Val

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Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Gln His Phe Trp Asp Thr Pro Trp

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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

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<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 55

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Asp Tyr Thr Ile Thr Ser Tyr

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Trp Ile Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

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Gly Arg Ile Asp Leu Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ser Gln Lys Phe

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Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

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<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 56

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Asp Tyr Thr Ile Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

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Gly Arg Ile Asp Leu Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ser Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Lys Tyr Pro Ala Gly Gln Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

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<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 57

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Asp Tyr Thr Ile Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

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Gly Arg Ile Asp Leu Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ser Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Lys Tyr Pro Ala Gly Gln Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 58

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 58

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

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Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 59

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 59

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

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Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

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130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

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His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

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210 215 220

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225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

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275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 60

<211> 327

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 60

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

115 120 125

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

130 135 140

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

195 200 205

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

210 215 220

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

225 230 235 240

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

245 250 255

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

325

<210> 61

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 61

Ser Tyr Trp Ile Asn

1 5

<210> 62

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 62

Arg Ile Asp Leu Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ser Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Asp

<210> 63

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 63

Tyr Pro Ala Gly Gln Gly Ala Trp Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 64

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 64

Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 65

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 65

Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp

1 5

<210> 66

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 66

Gln His Phe Trp Asp Thr Pro Trp Thr

1 5

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<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 67

Ser Tyr Tyr Ile Asn

1 5

<210> 68

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 68

Arg Ile Ala Pro Gly Ser Val Ile Thr His Tyr Asn Glu Met Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 69

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 69

Ser Asp Phe Tyr Gly Met Asp Tyr

1 5

<210> 70

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 70

Ser Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 71

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 71

Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser

1 5

<210> 72

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 72

Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Trp Thr

1 5

<210> 73

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 73

Thr Phe Tyr Ile Asn

1 5

<210> 74

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 74

Arg Ile Ala Pro Gly Thr Val Ile Thr His Phe Asn Glu Met Phe Arg

1 5 10 15

Ala

<210> 75

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 75

Tyr Ser Ser Ser Leu His Ser

1 5

<210> 76

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 76

Gln Gln Tyr Arg Lys Leu Pro Trp Thr

1 5

<210> 77

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 77

Glu Tyr Thr Leu His

1 5

<210> 78

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 78

Val Val Asn Pro Asn Ile Gly Ala Thr Thr Tyr Asn Gln Met Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 79

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 79

Arg Ala Tyr Leu Asp Tyr

1 5

<210> 80

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 80

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asn Asn Leu His

1 5 10

<210> 81

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 81

Tyr Asp Ser Gln Ser Ile Ser

1 5

<210> 82

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 82

Gln Gln Thr Asn Ser Trp Pro Phe Thr

1 5

<210> 83

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 83

caggtgcagc tggtgcagcc aggagctgag gtggtgaagc ctggcgcctc cgtgaagctg 60

tcttgtaaga cctccgacta caccatcaca tcttattgga tcaactgggt gagacaggct 120

ccaggacagg gactggagtg gatgggaagg atcgacctgt acgatagcga gacccattat 180

tctcagaagt tcaaggacag ggtgaccatg acagtggata agtccaccac aagcacatac 240

ctggagctga ggtctctgcg gtccgacgat accgccgtgt actattgcac aaagtaccca 300

gctggacagg gagcttggtt tgcttattgg ggacagggca ccctggtgac agtgtccgct 360

<210> 84

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 84

gacatccaga tgacacagag cccttccagc ctgagcgcct ctgtgggcga tagggtgacc 60

atcacatgtc gggcctctgg caacatccat aattacctgg cttggtatag acagaagccc 120

ggcaagtccc ctcagctgct ggtgtacaac gccaagaccc tggctgacgg agtgccaagc 180

cgcttttccg gaagcggctc tggcacagat tacaccctga caatctcttc cctgcagcca 240

gaggacttcg ctacctattt ttgccagcac ttctgggata ccccatggac attcggcgga 300

ggaaccaagc tggagatcaa g 321

<210> 85

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 85

caggtgcagc tggtgcagag cggagctgag gtgaagaagc caggagcctc cgtgaagctg 60

tcttgtaaga cctccgacta caccatcaca tcctattgga tcaactgggt gagacaggct 120

cctggacagg gactggagtg gatgggaagg atcgacctgt acgatagcga gacacattat 180

tctcagaagt tcaaggacag ggtgaccatg acagtggata agtccaccac aagcacctac 240

ctggagctga ggtctctgcg gtccgacgat acagccgtgt actattgcgc tagataccca 300

gctggacagg gagcttggtt tgcttattgg ggccagggca ccctggtgac cgtgtccgcc 360

<210> 86

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 86

caggtgcagc tggtgcagag cggagctgag gtgaagaagc caggagcctc cgtgaagctg 60

tcttgtaaga cctccgacta caccatcaca tcctattgga tcaactggat cagacaggct 120

cctggacagg gactggagtg gatgggaagg atcgacctgt acgatagcga gacccattat 180

tctcagaagt tcaaggacag ggtgaccatg acagtggata agtccaccac aagcacatac 240

ctggagctga ggtctctgcg gtccgacgat accgccgtgt actattgcac aagataccca 300

gctggccagg gcgcctggtt tgcttattgg ggccagggca ccctggtgac cgtgtccgcc 360

<210> 87

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 87

gacatccaga tgacacagag cccttccagc ctgagcgcct ctgtgggcga tagggtgacc 60

atcacatgtc gggcctctgg caacatccat aattacctgg cttggtatca gcagaagccc 120

ggcaagtccc ctaagctgct ggtgtacaac gccaagaccc tggctgacgg cgtgccaagc 180

aggttttccg gcagcggctc tggcacagat tacaccctga caatctcttc cctgcagcca 240

gaggacttcg ctacctattt ttgccagcac ttctgggata ccccatggac attcggcgga 300

ggaaccaagc tggagatcaa g 321

<210> 88

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 88

caggtgcagc tggtgcagcc aggagctgag gtgaagaagc ctggagcctc cgtgaagctg 60

tcttgtaaga cctccgacta caccatcaca tcttattgga tcaactggat cagacaggct 120

ccagagcagg gactggagtg gatgggccgc atcgacctgt acgatagcga gacccattat 180

tctcagaagt tcaaggacag ggtgaccatg acagtggata agtccaccac aagcacatac 240

ctggagctga ggtctctgcg gtccgacgat accgccgtgt actattgcac aagatacccc 300

gctggccagg gcgcctggtt tgcttattgg ggacagggca ccctggtgac agtgtccgct 360

<210> 89

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 89

gacatccaga tgacacagag cccttccagc ctgagcgcct ctgtgggcga tagggtgacc 60

atcacatgtc gggcctctgg caacatccat aattacctgg cttggtatca gcagaagccc 120

ggcaagtccc ctcagctgct ggtgtacaac gccaagaccc tggctgacgg cgtgccaagc 180

aggttttccg gcagcggctc tggcacagat tacaccctga caatctcttc cctgcagcca 240

gaggacttcg ctacctattt ttgccagcac ttctgggata ccccatggac attcggcgga 300

ggaaccaagc tggagatcaa g 321

<210> 90

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 90

caggtgcagc tggtgcagag cggagctgag gtgaagaagc caggagcctc cgtgaaggtg 60

tcttgtaagg cctccggcta caccttcaca tcctattgga tcaactgggt gagacaggct 120

cctggacagg gactggagtg gatgggaagg atcgacctgt acgatagcga gacacattat 180

tctcagaagt ttaaggacag ggtgaccatg accacagata cctccacaag caccgcctac 240

atggagctga ggtctctgcg gtccgacgat acagccgtgt actattgcgc tagataccca 300

gctggacagg gagcttggtt tgcttattgg ggccagggca cactggtgac cgtgagcgcc 360

<210> 91

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 91

gacatccaga tgacacagag cccttccagc ctgtccgcct ccgtgggcga tagggtgacc 60

atcacatgtc gggcctctgg caacatccat aattacctgg cttggtatca gcagaagccc 120

ggcaaggccc ctaagctgct gctgtacaac gccaagaccc tggctgacgg agtgccatcc 180

aggttctccg gaagcggctc tggcacagat tataccctga caatctcttc cctgcagcca 240

gaggactttg ccacctacta ttgccagcac ttctgggata ccccctggac atttggcggc 300

ggcaccaagc tggagatcaa g 321

<210> 92

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 92

caggtgcagc tggtgcagag cggagctgag gtgaagaagc caggagcttc cgtgaaggtg 60

agctgtaagg cctctggcta caccttcaca agctactata tcaactggat caagcagagg 120

ccaggacagg gactggagtg gatcggaagg atcgctcctg gctctgtgat cacacattac 180

aacgagatgt tcaagggcag ggtgaccctg acagtggaca ccagcacatc taccgtgtac 240

atcgagctgt ccagcctgag atctgaggat accgccgtgt atttctgcgc tcgctccgac 300

ttttacggca tggattattg gggccagggc acatccgtga ccgtgtcttc c 351

<210> 93

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 93

gacatccaga tgacccagac cacatccagc ctgtccgcca gcgtgggcga tagggtgaca 60

atctcttgtt ccgcctccca gggcatctct aactacctga attggtatca gcagaagccc 120

ggcaaggccc ctaagctgct gatctactat acctcttccc tgcattctgg agtgccatcc 180

cggttctctg gatccggaag cggaaccgac tactccacca caatcagctc tctgcagcca 240

gaggatatcg ctacatacta ttgccagcag tatagcaagc tgccctggac ctttggcggc 300

ggcacaaagc tggagatcaa g 321

<210> 94

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 94

caggtgcagc tggtgcagag cggagctgag gtgaagaagc caggagcttc cgtgaaggtg 60

agctgtaagg cctctggcta caccttcaca agctactata tcaactggat caggcagagg 120

ccaggacagg gactggagtg gatgggcagg atcgctcctg gctctgtgat cacacattac 180

aacgagatgt tcaagggcag agtgaccctg acagtggaca ccagcacatc taccgtgtac 240

atggagctgt ccagcctgag atctgaggat accgccgtgt atttctgcgc tcgctccgac 300

ttttacggca tggattattg gggccagggc acatccgtga ccgtgtcttc c 351

<210> 95

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 95

gacatccaga tgacccagag cacatccagc ctgtccgcca gcgtgggcga tagggtgacc 60

atcacatgtt ctgcttccca gggcatctct aactacctga attggtatca gcagaagccc 120

ggcaaggccc ctaagctgct gatctactat acctcttccc tgcatagcgg agtgccatct 180

cggttcagcg gatctggatc cggaaccgac tactctacca caatcagctc tctgcagcca 240

gaggatatcg ctacatacta ttgccagcag tattccaagc tgccctggac ctttggcggc 300

ggcacaaagc tggagatcaa g 321

<210> 96

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 96

caggtgcagc tggtgcagag cggcgacgat ctggtgaagc caggcgcctc cgtgaagctg 60

agctgtaagg cttctggcta caccttcaca agctactata tcaactggat caagcagaga 120

ccaggacagg gactggagtg gatcggaagg atcgctcctg gatctgtgat cacacattac 180

aacgagatgt tcaagggcag ggtgaccctg acacgggaca ccagcacatc taccgtgtac 240

atcgagctgt ccagcctgag gtctgaggat accgccgtgt atttctgcgc tagatccgac 300

ttttacggca tggattattg gggccagggc acatccgtga ccgtgtcttc c 351

<210> 97

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 97

caggtgcagc tggtgcagag cggcgacgag gtggtgaagc caggagcctc cgtgaaggtg 60

agctgtaagg cttctggcta caccttcaca agctactata tcaactgggt gagacaggct 120

ccaggacagg gactggagtg gatgggaagg atcgctcctg gctctgtgat cacacattac 180

aacgagatgt tcaagggcag ggtgaccatg acagtggaca ccagcacatc taccgtgtac 240

atggagctgt ccagcctgag gtctgaggat accgccgtgt atttctgcgc tcggtccgac 300

ttttacggca tggattattg gggccagggc acatccgtga ccgtgtcttc c 351

<210> 98

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 98

gacatccaga tgacccagac cacatccagc ctgtccgcca gcgtgggcga tagggtggcc 60

atcacatgtt ctgcttccca gggcatctct aactacctga attggtatca gcagaagccc 120

ggcaaggctc ctaagctgct gatctactat acctcttccc tgcatagcgg agtgccatct 180

cggttcagcg gatctggatc cggaaccgac tttaccctga caatcagctc tctgcagcca 240

gaggatatcg ccacatacta ttgccagcag tactccaagc tgccctggac ctttggcggc 300

ggcacaaagc tggagatcaa g 321

<210> 99

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 99

caggtgcagc tggtgcagag cggagctgag gtgaagaagc caggagcttc cgtgaaggtg 60

agctgtaagg cctctggcta caccttcaca agctactata tcaactgggt gaggcaggct 120

ccaggacagg gactggagtg gatgggcaga atcgctcctg gctctgtgat cacacattac 180

aatgagatgt ttaagggcag ggtgaccatg acacgggaca ccagcacatc taccgtgtat 240

atggagctgt ccagcctgag atctgaggat accgccgtgt actattgcgc tcgctccgac 300

ttttacggca tggattattg gggccagggc acatccgtga ccgtgtcttc c 351

<210> 100

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 100

gacatccaga tgacccagag cccttccagc ctgtccgcca gcgtgggcga tagggtgacc 60

atcacatgtt ctgcttccca gggcatctcc aactacctga attggtatca gcagaagccc 120

ggcaaggccc ctaagctgct gatctactat acatcttccc tgcatagcgg cgtgccatct 180

cggttcagcg gatctggatc cggaaccgac ttcaccttta caatcagctc tctgcagcca 240

gaggatatcg ctacatacta ttgccagcag tacagcaagc tgccctggac ctttggcggc 300

ggcacaaagc tggagatcaa g 321

<210> 101

<211> 344

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 101

agctggtgca gagcggagct gaggtgaaga agccaggagc ctccgtgaag gtgtcttgta 60

aggcctccgg ctacaccttc accaccttct acatcaactg ggtgaggcag gctccaggac 120

agggactgga gtggatggga aggatcgctc ctggcaccgt gatcacacat ttcaatgaga 180

tgtttagggc ccgggtgacc atgacaagag acacctctat ctccacagct tacatggagc 240

tgagcagact gcgctctgac gatacagccg tgtactattg cgctcgctct gacttttacg 300

gcatggatta ttggggccag ggcacctccg tgacagtgtc cagc 344

<210> 102

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 102

gacatccaga tgacccagtc tccttccagc ctgagcgcct ctgtgggcga tagggtgacc 60

atcacatgtc aggcttccca gggcatcagc aactacctga attggtatca gcagaagccc 120

ggcaaggccc ctaagctgct gatctactat tcttccagcc tgcattctgg agtgccatcc 180

aggttctccg gaagcggatc tggaaccgac ttcaccttta caatctcttc cctgcagcca 240

gaggatatcg ctacatacta ttgccagcag tacaggaagc tgccatggac ctttggcgga 300

ggcacaaagc tggagatcaa g 321

<210> 103

<211> 344

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 103

agctggtgca gagcggcgac gaggtggtgg agccaggagc ctccgtgaag gtgagctgta 60

aggcttctgg ctacaccttc accaccttct acatcaactg ggtgaggcag aggccaggac 120

agggactgga gtggatggga aggatcgctc ctggcaccgt gatcacacat ttcaatgaga 180

tgtttagagc ccgcgtgacc ctgacagtgg atacctccag ctctacagct tacatcgagc 240

tgtccagcct gtcttccgac gatacagccg tgtatttctg cgctagatct gacttttacg 300

gcatggatta ttggggccag ggcacctccg tgacagtgag ctct 344

<210> 104

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 104

gacatcgtgc tgacccagtc tccatccagc ctgagcgcct ctgtgggcga tagggtgacc 60

atcacatgtt ccgctagcca gggcatcagc aactacctga attggtatca gcagaagcca 120

aacggcacaa tcaagctgct gatctactat tcttccagcc tgcattctgg agtgccatcc 180

aggttctctg gatccggaag cggaaccgac tttaccctga caatctcttc cctgcagccc 240

gaggatatcg ccacatacta ttgccagcag taccggaagc tgccttggac ctttggcggc 300

ggcacaaagc tggagatcaa g 321

<210> 105

<211> 338

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 105

agctggtgca gtccggcgac gaggtggtgg aggcctctgt gaaggtgtcc tgtaaggcct 60

ccggctacac cttcaccacc ttctacatca actgggtgag gcagaggcca ggacagggac 120

tggagtggat gggaaggatc gctcctggca ccgtgatcac acatttcaat gagatgttta 180

gagcccgcgc taccatgaca gtggacacct ccatcagcac agcttacatc cagctgtcca 240

gcctgtcttc cgaggataca gccgtgtatt tctgcgctag aagcgacttt tacggcatgg 300

attattgggg ccagggcacc tctgtgacag tgagctct 338

<210> 106

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 106

gacatcgtgc tgacccagtc cccatccagc ctgtctgcct ccgtgggcga tagggtggcc 60

atcacatgtc aggctagcca gggcatctct aactacctga attggtatca gcagaagcca 120

aacggcacca tcaagctgct gatctactat tcttccagcc tgcattccgg agtgccaagc 180

aggttcagcg gatctggatc cggaaccgac tacaccctga caatctctaa tctgcagccc 240

gaggatatcg ctacatacta ttgccagcag tatcggaagc tgccttggac ctttggcggc 300

ggcacaaagc tggagatcaa g 321

<210> 107

<211> 344

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 107

agctggtgca gagcggcgac gaggtggtgg agccaggagc ctccgtgaag gtgagctgta 60

aggcttctgg ctacaccttc accaccttct acatcaactg ggtgaggcag aggccaggac 120

agggactgga gtggatggga aggatcgctc ctggcaccgt gatcacacat ttcaatgaga 180

tgtttagagc caaggctacc atgacagtgg ataccagcat ctctacagct tacatggagc 240

tgtccagcct gagatctgac gatacagccg tgtactattg cgctcgctcc gacttttacg 300

gcatggatta ttggggccag ggcacctctg tgacagtgtc ttcc 344

<210> 108

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 108

gacatcgtgc tgacccagtc cccatccagc ctgtctgcct ccgtgggcga tagggtggcc 60

atcacatgtc aggctagcca gggcatctct aactacctga attggtatca gcagaagcca 120

aacggcacca tcaagctgct gatctactat tcttccagcc tgcattccgg agtgccaagc 180

aggttcagcg gatctggatc cggaaccgac tacaccctga caatctctaa tctgcagccc 240

gaggatatcg ctacatacta ttgccagcag tatcggaagc tgccttggac ctttggcggc 300

ggcacaaagc tggagatcaa g 321

<210> 109

<211> 344

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 109

agctggtgca gtccggcgac gaggtgaagg agccaggagc ctctgtgaag gtgtcctgta 60

aggcctccgg ctacaccttc accaccttct acatcaactg gatcagacag gctccaggac 120

agggactgga gtggatggga aggatcgctc ctggcaccgt gatcacacat ttcaatgaga 180

tgtttagggc ccgggtgacc atgacaaggg atacctccat cagcacagct tacatggagc 240

tgtccagcct gtcttccgac gatacagccg tgtatttctg cgctagaagc gacttttacg 300

gcatggatta ttggggccag ggcacctctg tgacagtgag ctct 344

<210> 110

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 110

gacatcgtga tgacccagtc tccttccagc ctgagcgcct ctgtgggcga tagggtgacc 60

atcacatgtt ccgctagcca gggcatcagc aactacctga attggtatca gcagaagccc 120

aacggcgccc ctaagctgct gatctactat tcttccagcc tgcattctgg cgtgccatcc 180

aggttctctg gatccggaag cggaaccgac ttcaccttta caatctcttc cctgcagcca 240

gaggatatcg ctacatacta ttgccagcag tacaggaagc tgccatggac ctttggcgga 300

ggcacaaagc tggagatcaa g 321

<210> 111

<211> 344

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 111

agctggtgca gagcggagct gaggtgaaga agccaggagc ttccgtgaag gtgagctgta 60

aggcctctgg ctacaccttc accaccttct acatcaactg ggtgaggcag gctccaggac 120

agggactgga gtggatgggc agaatcgctc ctggcaccgt gatcacacat ttcaatgaga 180

tgtttagggc tcgggtgacc atgacaaggg acaccagcat ctctacagtg tacatggagc 240

tgtccagcct gagatctgag gatacagccg tgtactattg cgctcgctcc gacttttacg 300

gcatggatta ttggggccag ggcacctctg tgacagtgtc ttcc 344

<210> 112

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 112

gacatccaga tgacccagtc tccttccagc ctgagcgcct ctgtgggcga tagggtgacc 60

atcacatgtc gggcttccca gggcatcagc aactacctga attggtatca gcagaagccc 120

ggcaaggccc ctaagctgct gatctactat tcttccagcc tgcattctgg cgtgccatcc 180

agattctccg gcagcggctc tggcaccgac tttaccctga caatctcttc cctgcagcca 240

gaggatgtgg ctacatacta ttgccagaag tacaggaagc tgccatggac ctttggcgga 300

ggcacaaagc tggagatcaa g 321

<210> 113

<211> 344

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 113

agctggtgca gagcggcgac gaggtggtgg agccaggagc ctccgtgaag gtgagctgta 60

aggcttctgg ctacaccttc accaccttct acatcaactg ggtgaggcag aggccaggac 120

agggactgga gtggatggga aggatcgctc ctggcaccgt gatcacacat ttcaatgaga 180

tgtttagagc tcgcgtgacc ctgacagtgg acacctccag ctctacagtg tacatcgagc 240

tgtccagcct gtcttccgag gatacagccg tgtatttctg cgctagatct gacttttacg 300

gcatggatta ttggggccag ggcacctccg tgacagtgag ctct 344

<210> 114

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 114

gacatcgtgc tgacccagtc tccatccagc ctgagcgcct ctgtgggcga tagggtgacc 60

atcacatgtc gggcttccca gggcatcagc aactacctga attggtatca gcagaagcca 120

aacggcacaa tcaagctgct gatctactat tcttccagcc tgcattctgg agtgccatcc 180

agattctccg gaagcggatc tggcaccgac tttaccctga caatctcttc cctgcagccc 240

gaggatgtgg ccacatacta ttgccagaag taccgcaagc tgccttggac ctttggcggc 300

ggcacaaagc tggagatcaa g 321

<210> 115

<211> 338

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 115

agctggtgca gtccggcgac gaggtggtgg aggcctctgt gaaggtgtcc tgtaaggcct 60

ccggctacac cttcaccacc ttctacatca actgggtgag gcagaggcca ggacagggac 120

tggagtggat gggaaggatc gctcctggca ccgtgatcac acatttcaat gagatgttta 180

gagcccgcgc taccatgaca gtggacacct ccatcagcac agtgtacatc cagctgtcca 240

gcctgtcttc cgaggataca gccgtgtatt tctgcgctag aagcgacttt tacggcatgg 300

attattgggg ccagggcacc tctgtgacag tgagctct 338

<210> 116

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 116

gacatcgtgc tgacccagtc cccatccagc ctgtctgcct ccgtgggcga tagggtggcc 60

atcacatgtc gggctagcca gggcatctct aactacctga attggtatca gcagaagcca 120

aacggcacca tcaagctgct gatctactat tcttccagcc tgcattccgg cgtgcccagc 180

agattcagcg gatctggatc cggaaccgac tacaccctga caatctctaa tctgcagccc 240

gaggatgtgg ctacatacta ttgccagaag tatcgcaagc tgccttggac ctttggcggc 300

ggcacaaagc tggagatcaa g 321

<210> 117

<211> 344

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 117

agctggtgca gagcggcgac gaggtggtgg agccaggagc ctccgtgaag gtgagctgta 60

aggcttctgg ctacaccttc accaccttct acatcaactg ggtgaggcag aggccaggac 120

agggactgga gtggatggga aggatcgctc ctggcaccgt gatcacacat ttcaatgaga 180

tgtttagagc caaggctacc atgacagtgg acaccagcat ctctacagtg tacatggagc 240

tgtccagcct gagatctgag gatacagccg tgtactattg cgctcgctcc gacttttacg 300

gcatggatta ttggggccag ggcacctctg tgacagtgtc ttcc 344

<210> 118

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 118

gacatcgtga tgacccagtc cccatccagc ctgtctgcct ccgtgggcga tagggtggcc 60

atcacatgtc gggctagcca gggcatctct aactacctga attggtatca gcagaagcca 120

aacggcacca tcaagctgct gatctactat tcttccagcc tgcattccgg cgtgcccagc 180

agattcagcg gatctggatc cggaaccgac tacaccctga caatctctaa tctgcagccc 240

gaggatgtgg ctacatacta ttgccagaag tatcgcaagc tgccttggac ctttggcggc 300

ggcacaaagc tggagatcaa g 321

<210> 119

<211> 344

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 119

agctggtgca gtccggcgac gaggtgaagg agccaggagc ctctgtgaag gtgtcctgta 60

aggcctccgg ctacaccttc accaccttct acatcaactg gatcagacag gctccaggac 120

agggactgga gtggatggga aggatcgctc ctggcaccgt gatcacacat ttcaatgaga 180

tgtttagggc ccgggtgacc atgacaaggg acacctccat cagcacagtg tacatggagc 240

tgtccagcct gtcttccgag gatacagccg tgtatttctg cgctagaagc gacttttacg 300

gcatggatta ttggggccag ggcacctctg tgacagtgag ctct 344

<210> 120

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 120

gacatcgtga tgacccagtc tccttccagc ctgagcgcct ctgtgggcga tagggtgacc 60

atcacatgtc gggcttccca gggcatcagc aactacctga attggtatca gcagaagccc 120

aacggcgccc ctaagctgct gatctactat tcttccagcc tgcattctgg cgtgccatcc 180

agattctccg gcagcggctc tggcaccgac tttaccctga caatctcttc cctgcagcca 240

gaggatgtgg ctacatacta ttgccagaag tacaggaagc tgccatggac ctttggcgga 300

ggcacaaagc tggagatcaa g 321

<210> 121

<211> 345

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 121

caggtgcagc tggtgcagtc aggagcagaa gtggtgaaac ccggagccag cgtgaaggtg 60

tcttgcaagg ccagcggcta caccttcacc gagtacacac tgcattgggt ccggcaggct 120

ccaggaagat ctctcgagtg gatgggcgtg gtgaacccta acatcggcgc caccacctac 180

aaccagatgt tcaagggcaa ggtcaccatg acagtggaca ccagcaccag caccgtgtac 240

atggagctga gcagcctgag aagcgaggac acagccgtgt actattgcgc caggagagcc 300

tacctggact attggggcca gggcacaacc ctgaccgtgt ctagc 345

<210> 122

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 122

gagatcgtgc tgacccagag cccagtgttc cagtcagtga cccccaagga gaaggtcacc 60

atcacttgcc gggccagcca gagcatcaac aacaacctgc attggtacca gcagaagccc 120

gaccagagcc ctaagctgct gatcaagtac gatagccaga gcatcagcgg cgtgccttct 180

agattcagcg gaagcggcag cggcacagat ttcaccctga ccatcaacag cctggaggca 240

gaggacgcag gcacctactt ttgccagcag accaactctt ggcccttcac cttcggcagc 300

ggcaccaagc tggagatcaa g 321

<210> 123

<211> 345

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 123

caggtgcagc tggtgcagtc aggagcagaa gtggtgaaac ccggagccag cgtgaaggtg 60

tcttgcaagg ccagcggcta caccttcacc gagtacaccc tgcattgggt gaagcagagc 120

ccaggaagaa gcctcgagtg gatcggagtg gtgaacccta acatcggcgc caccacctac 180

aaccagatgt tcaagggcaa ggtcaccatg acagtggaca ccagcaccag caccgtgtac 240

atggagctga gcagcctgag aagcgaggac acagccgtgt actattgcgc caggagagcc 300

tacctggact attggggcca gggcacaacc ctgaccgtgt ctagc 345

<210> 124

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 124

gacatcgtgc tgacccagtc tccagtgacc ctgagcgtga cacccaagga gaaggtcacc 60

atcacttgcc gggccagcca gagcatcaac aacaacctgc attggtacca gcagaagccc 120

gaccagagcc ctaagctgct gatcaagtac gatagccaga gcatcagcgg cgtgccttct 180

agattcagcg gaagcggcag cggcacagat ttcaccctga ccatcaacag cctggagacc 240

gaggacgccg gcatgtactt ttgccagcag accaactctt ggcccttcac cttcggcagc 300

ggcaccaagc tggagatcaa g 321

<210> 125

<211> 345

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 125

caggtgcagc tggtgcagtc aggagcagaa gtgaagaagc ccggagccag cgtgaaagtg 60

tcttgcaagg ccagcggcta caccttcacc gagtacacac tgcattgggt ccggcaggct 120

ccaggacagt ctctcgagtg gatgggcgtg gtgaacccta acatcggcgc caccacctac 180

aaccagatgt tcaagggccg cgtgaccatg accgtggata ccagcaccag caccgtgtac 240

atggagctga gcagcctgag aagcgaggac acagccgtgt actattgcgc caggagagcc 300

tacctggact attggggcca gggcacaacc ctgaccgtgt ctagc 345

<210> 126

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 126

gacatcgtgc tgacccagag cccagtgttc cagtcagtga cccccaagga gaaggtcacc 60

atcacttgcc gggccagcca gagcatcaac aacaacctgc attggtacca gcagaagccc 120

gaccagagcc ctaagctgct gatcaagtac gatagccaga gcatcagcgg cgtgccttct 180

agattcagcg gaagcggcag cggcacagat ttcaccctga ccatcaacag cctggaggca 240

gaggacgcag gcacctactt ttgccagcag accaactctt ggcccttcac cttcggcagc 300

ggcaccaagc tggagatcaa g 321

<210> 127

<211> 345

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 127

gaagtgcagc tgcagcagag cggaccagaa ctggtgaagc caggagccag cgtgaagatg 60

tcttgcaagg ccagcggcta caccttcacc gagtacaccc tgcattgggt gaagcagaag 120

ccaggacagg gactcgagtg gatcggagtg gtgaacccta acatcggcgc caccacctac 180

aaccagatgt tcaagggcaa ggccaccctg accagcgata agagcagcag caccgcctac 240

atggagctgt ctagcctgac cagcgaggac tcagccgtgt actattgcgc caggagagcc 300

tacctggact attggggcca gggcacaacc ctgaccgtgt ctagc 345

<210> 128

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 128

gacatcgtga tgacccagag cccagccaca ctgagcgtga caccaggcga cagagtgtct 60

ctgtcttgca gggccagcca gagcatcaac aacaacctgc attggtaccg gcagaagagc 120

cacgagagcc ctcggctgct gatcaagtac gacagccaga gcatcagcgg catcccttct 180

agattcagcg gcagcggcag cggaagcgat ttcaccctga gcatcaacag cgtggagcca 240

gaggacgtgg gcgtgtacta ttgccagcag accaactctt ggcccttcac cttcggcagc 300

ggcaccaagc tggagatcaa g 321

<210> 129

<211> 345

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 129

caggtgcagc tggtgcagtc aggagcagaa gtgaagaagc ccggagccag cgtgaaagtg 60

tcttgcaagg ccagcggcta caccttcacc gagtacacac tgcattgggt ccggcaggct 120

ccaggacagg gactcgagtg gatgggagtg gtgaacccta acatcggcgc caccacctac 180

aaccagatgt tcaagggccg cgtgaccatg accagagaca ccagcaccag caccgtgtac 240

atggagctga gcagcctgag aagcgaggac acagccgtgt actattgcgc caggagagcc 300

tacctggact attggggcca gggcacaacc ctgaccgtgt ctagc 345

<210> 130

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 130

gagatcgtgc tgacccagag cccagacttc cagtcagtga cccccaagga gaaggtcacc 60

atcacttgcc gggccagcca gagcatcaac aacaacctgc attggtacca gcagaagccc 120

gaccagagcc ctaagctgct gatcaagtac gatagccaga gcatcagcgg cgtgccttct 180

agattcagcg gaagcggcag cggcacagat ttcaccctga ccatcaacag cctggaggca 240

gaggacgcag ccacctacta ttgccagcag accaactctt ggcccttcac cttcggcagc 300

ggcaccaagc tggagatcaa g 321

<210> 131

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 131

caggtgcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc caggagcttc cgtgaaggtg 60

agctgcaagg cctctgacta caccatcaca tcctattgga tcaactgggt gagacaggct 120

cctggacagc gcctggagtg gatgggaagg atcgacctgt acgattccga gacccactat 180

agccagaagt tcaaggacag ggtgaccatc acacgggata ccagcgcctc tacagcttac 240

atggagctgt ccagcctgag aagcgaggat acagccgtgt actattgtgc taggtaccca 300

gctggacagg gagcttggtt tgcttattgg ggccagggca ccctggtgac agtgtcttcc 360

<210> 132

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 132

gacatccaga tgacacagtc cccttccagc ctgagcgcct ctgtgggcga tagggtgacc 60

atcacatgcc gggccagcgg caacatccac aattacctgg cttggtatca gcagaagccc 120

ggcaaggtgc ctaagctgct gatctacaac gccaagaccc tggctgacgg cgtgccatct 180

aggttctccg gcagcggctc tggcacagac ttcaccctga caatctcttc cctgcagcca 240

gaggacgtgg ctacctacta ttgtcagcat ttctgggata ccccctggac atttggcggc 300

ggcaccaagg tggagatcaa g 321

<210> 133

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 133

caggtgcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc caggagcttc cgtgaaggtg 60

agctgcaagg cctctgacta caccatcaca tcctattgga tcaactggat caggcaggct 120

cctggacagg gactggagtg gatcggaagg atcgacctgt acgattccga gacccactat 180

agccagaagt tcaaggacag agtgaccatc acagtggata caagcgcctc tgccgcttac 240

atggagctgt ccagcctgcg cagcgaggat accgccgtgt actattgtac aaagtaccca 300

gctggccagg gcgcctggtt tgcttattgg ggccagggca ccctggtgac agtgtcttcc 360

<210> 134

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 134

gacatccaga tgacccagtc cccttccagc ctgagcgcct ctgtgggcga tagggtgacc 60

atcacatgcc gggccagcgg caacatccac aattacctgg cttggtatag acagaagccc 120

ggcaaggtgc ctaagctgct ggtgtacaac gccaagaccc tggctgacgg cgtgccatct 180

cgcttttccg gcagcggctc tggcacagat ttcaccctga caatctcttc cctgcagcca 240

gaggacttcg gctcctattt ttgtcagcat ttctgggata ccccctggac atttggcggc 300

ggcacaaagg tggagatcaa g 321

<210> 135

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 135

caggtgcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc caggagcttc cgtgaaggtg 60

agctgcaagg cctctgacta caccatcaca tcctattgga tcaactggat cagacaggct 120

cctggacagg gactggagtg gatcggaagg atcgacctgt acgattccga gacccactat 180

agccagaagt tcaaggacag ggtgaccatc acacgggata ccagcgcctc tacagcttac 240

atggagctgt ccagcctgag gagcgaggat accgccgtgt actattgtac aaagtaccca 300

gctggccagg gcgcctggtt tgcttattgg ggccagggca ccctggtgac agtgtcttcc 360

<210> 136

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 136

gacatccaga tgacacagtc cccttccagc ctgagcgcct ctgtgggcga tagggtgacc 60

atcacatgcc gggccagcgg caacatccac aattacctgg cttggtatag acagaagccc 120

ggcaaggtgc ctaagctgct ggtgtacaac gccaagaccc tggctgacgg agtgccatct 180

cgcttctccg gaagcggctc tggcacagac ttcaccctga caatctcttc cctgcagcca 240

gaggacgtgg ctacctattt ctgtcagcat ttttgggata ccccatggac attcggcgga 300

ggaaccaagg tggagatcaa g 321

<210> 137

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 137

caggtgcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc caggagcttc cgtgaaggtg 60

agctgcaagg cctctgacta caccatcaca tcctattgga tcaactggat caggcaggct 120

cctggacagc ggctggagtg gatcggcaga atcgacctgt acgattccga gacccactat 180

agccagaagt tcaaggaccg cgtgaccatc acagtggata ccagcgcctc tacagcttac 240

atggagctgt ccagcctgag gagcgaggat accgccgtgt actattgtac aaagtaccca 300

gctggccagg gcgcctggtt tgcttattgg ggccagggca ccctggtgac agtgtcttcc 360

<210> 138

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 138

caggtgcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc caggagcttc cgtgaaggtg 60

agctgcaagg cctctgacta caccatcaca tcctattgga tcaactgggt gaggcaggct 120

cctggacagc ggctggagtg gatcggcaga atcgacctgt acgattccga gacccactat 180

agccagaagt tcaaggaccg cgtgaccatc acagtggata ccagcgcctc tacagcttac 240

atggagctgt ccagcctgag gagcgaggat accgccgtgt actattgtac aaagtaccca 300

gctggccagg gcgcctggtt tgcttattgg ggccagggca ccctggtgac agtgtcttcc 360

<210> 139

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 139

caggtgcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc caggagcttc cgtgaaggtg 60

agctgcaagg cctctgacta caccatcaca tcctattgga tcaactgggt gagacaggct 120

cctggacagc gcctggagtg gatcggaagg atcgacctgt acgattccga gacccactat 180

agccagaagt tcaaggacag ggtgaccatc acacgggata ccagcgcctc tacagcttac 240

atggagctgt ccagcctgag aagcgaggat accgccgtgt actattgtac aaagtaccca 300

gctggccagg gcgcctggtt tgcttattgg ggccagggca ccctggtgac agtgtcttcc 360

Claims (11)

1.人源化CD47抗体或其抗原结合片段，其特征在于，其VH和VL序列对为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，当按照Kabat编码规则对抗体CDRs编码时，HCDR1、HCDR2、HCDR3与LCDR1、LCDR2、LCDR3按如下进行配对：SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63与SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66。

2.根据权利要求1所述的人源化CD47抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述人源化CD47抗体的轻链恒定区任选人抗体κ链或λ链恒定区，重链恒定区任选人抗体IgG1或IgG4S228P突变的恒定区。

3.根据权利要求1所述的人源化CD47抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗原结合片段选自Fab、Fab′-SH、Fv、scFv或(Fab′)2片段。

4.一种核酸，其编码权利要求1-3任意一项所述的人源化CD47抗体或其抗原结合片段；核酸序列选自SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:84。

5.一种表达载体，包含权利要求4所述的核酸。

6.一种宿主细胞，包含权利要求5所述的表达载体；所述宿主细胞包括酵母细胞、中国仓鼠卵巢细胞和人胚肾细胞。

7.一种双特异性抗体，包括不同的两个臂，其中的一个臂包括能够与人CD47结合的权利要求1-3任意一项所述的人源化CD47抗体或其抗原结合片段，所述另一个臂与恶性肿瘤细胞/免疫细胞结合的靶向结合的靶点包括：EGFR，HER2，CD47，PD-1，PD-L1，CTLA4，TGFβ，VEGF，HER3，TIGIT，CLAUDIN18.2，CD3，TIM3，LAG3，CD20，CD19，CD33。

8.一种三特异性抗体/融合蛋白，包含权利要求1-3任意一项所述的人源化CD47抗体或其抗原结合片段，三特异性抗体/融合蛋白的另两端靶向肿瘤细胞的肿瘤相关抗原或者靶向免疫细胞的免疫检验靶点，所述靶点包含EGFR，HER2，CD47，PD-1，PD-L1，CTLA4，TGFβ，VEGF，HER3，TIGIT，CLAUDIN18.2，CD3，TIM3，LAG3 CD20，CD19，CD33。

9.一种药物组合物，包括权利要求1-3任意一项所述的人源化CD47抗体或其抗原结合片段或包含权利要求1-3任意一项所述的人源化CD47抗体或其抗原结合片段作为其中一个臂的双特异性抗体，和药学上任选的药用载体。

10.权利要求1-3任意一项所述的人源化CD47抗体或其抗原结合片段在制备***疾患CD47过度表达的药物中的应用。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述肿瘤疾患包括血液瘤、实体瘤疾患中的至少一种，所述血液瘤为急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、成人T-细胞白血病、多发性骨髓瘤、混合白血病、非霍奇金淋巴瘤中的至少一种；实体瘤为淋巴瘤、乳腺癌、头颈癌、胃癌、肺癌、食管癌、肠癌、卵巢癌、***、肝癌、肾癌、胰腺癌、膀胱癌、结直肠癌、神经胶质瘤、黑素瘤中的至少一种。

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