CN116622878A - 西瓜果肉硬度性状的kasp分子标记及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于蔬菜品质性状分子标记开发和分子标记辅助育种技术领域，适用于西瓜果肉硬度快速筛选和分子标记辅助育种，具体涉及一种新型且简便的分子标记及辅助选择方法。本发明公开了一种基于西瓜果肉硬度性状紧密连锁的KASP分子标记ClFH，所述KASP分子标记为InDel***缺失标记，位于西瓜6号染色体的13154621bp处。本发明还同时公开了用于鉴定西瓜果肉硬度性状的KASP分子标记ClFH引物组合。本发明还同时公开了上述分子标记的用途：用于不同果肉硬度的西瓜材料或其后代的分子辅助选择育种。
Description
技术领域
本发明属于蔬菜品质性状分子标记开发和分子标记辅助育种技术领域，适用于西瓜果肉硬度快速筛选和分子标记辅助育种，具体涉及一种新型且简便的分子标记及辅助选择方法。
背景技术
西瓜(Citrullus lanatus)是一种重要的园艺作物。西瓜的果肉硬度是影响西瓜果实品质和货架期的重要因素，同时会影响消费者的选择。果肉硬度会严重影响口感，果实太软会导致口感绵软，爽口度下降且容易空心，不耐贮藏(Risse et al.,1990)；果实太硬又会导致汁水较少，口感变差(Harker et al.,2003)。因此，通过研究调控果肉硬度的基因来实现对西瓜品质的改良越来越受到人们的重视。
果肉硬度的变化受到多种因素的影响，是一个有多个基因参与、多种代谢途径共同调控的复杂过程，其中涉及一系列生理生化的变化，包括细胞壁物质含量的变化及相关植物激素和代谢反应的变化(Brummell and Harpster,2001,Gao et al.,2020)。细胞壁组分包括果胶、纤维素和半纤维素等在西瓜果肉硬度的变化中起到关键的作用。对细胞壁组分和相关酶基因的研究较多集中在番茄(Jiang et al.,2019)、桃(Brummell et al.,2004)和草莓(Villarreal et al.,2008,Figueroa et al.,2010)等作物上。目前对西瓜果肉硬度性状的研究大多集中在QTL定位和转录组研究方面，但基本都局限在对相关基因的初步定位和差异表达基因的转录分析上，使获得的分子标记和目标基因存在一定的遗传距离，没有紧密连锁，从而导致在应用上缺乏与西瓜果肉硬度性状紧密连锁且操作性较强的分子标记来辅助西瓜品质育种的工作。因此，在西瓜分子标记辅助果肉硬度及品种育种方面，仍需进一步确定调控西瓜果肉硬度的目标基因，并开发稳定高通量的分子标记。
上文中涉及的参考文献如下：
BRUMMELL D A,DAL CIN V,CRISOSTO C H,et al.2004.Cell wall metabolismduring maturation,ripening and senescence of peach fruit.Journal ofExperimental Botany[J],55:2029-2039；
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发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种西瓜果肉硬度性状的KASP分子标记及其用途。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基于BSA混池测序定位西瓜果肉硬度性状基因用于鉴定不同西瓜果肉硬度的KASP分子标记；
所述KASP分子标记ClFH为InDel***缺失标记，位于西瓜6号染色体的13154621bp处；分子标记位点前后100bp序列为：
TCGAAACAAAACTTTTAAGTACGAATATATATATACATTAATTCCTTGCTTTAATAAAC TTATAAATTTCAGATAATGGAAACTATAGATCGAAAAGAAA[AAAAAAAAAAG/-]AAAAA AAAAAGAAAAAAAAAAAGTATTGAAGATCTTTATTTGTAAGAGACAAAGGAAAGATAG ACTAAATGATGGGATGGGAAAGAGGG；
其中括号内是InDel的片段，突变型表现为InDel的缺失。
另外，本发明还提供了用于鉴定西瓜果肉硬度性状的KASP分子标记ClFH引物组合，其中的核苷酸序列为5’-3’
正向引物F1：
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAATACTTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTC
正向引物F2：
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAATACTTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTT
反向引物R：
TCAGATAATGGAAACTATAGATCGA
本发明还同时提供了上述分子标记的用途，用于不同果肉硬度的西瓜材料或其后代的分子辅助选择育种。
作为本发明的分子标记的用途的改进：判定西瓜不同西瓜材料及其杂交后代是属于以下的哪种基因型：纯合HH基因型，纯合hh基因型、杂合Hh基因型。
本发明还同时提供了利用上述分子标记鉴定西瓜果肉硬度的方法，包括以下步骤：
(1)、设定突变类型西瓜材料ZJU152(果肉硬度大)为HH(Hard)基因型；
(2)、提取待测西瓜样本基因组DNA；利用上述ClFH分子标记引物组在ABI SteponePCR仪上对西瓜基因组DNA进行PCR扩增；利用ABI Stepone PCR仪检测荧光信号，并分析基因分型；根据PCR产物荧光信号的差异，进而鉴别出每个待测西瓜的基因型，鉴定出纯合HH基因型，纯合hh基因型、杂合Hh基因型；
(3)、当样本的分型结果为纯合HH基因型，鉴定该待测西瓜样本为硬肉性状；
当样本的分型结果为纯合hh基因型，鉴定该待测西瓜样本为软肉性状。
本发明还提供了上述分子标记的开发方法，包括以下步骤：
(1)以硬肉西瓜材料ZJU152和软肉西瓜材料ZJU163为亲本进行杂交，然后自交，从而获得软肉硬肉分离的F6重组自交系群体；
(2)用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵，Hexadecyl trimethyl ammonium bromide)法提取西瓜亲本幼苗及杂交后代F6群体幼苗基因组DNA；
(3)挑选F6群体中极端果肉硬度材料构建软肉、硬肉混池，采用BSA(分离群体分析，Bulked Segregant analysis)定位与果肉硬度性状相关的区域或基因。
(4)鉴定与西瓜果肉硬度性状紧密连锁的SNP变异和InDel***缺失变异。
(5)基于连锁的变异，采用KASP(竞争性等位基因特异性聚合酶链式反应，Kompetitive Allele Specific Polymerase Chain Reaction)方法进行西瓜果肉硬度性状分子标记的筛选；
(6)开发出一个与西瓜果肉硬度性状紧密连锁的KASP分子标记ClFH。
本发明的采用上述分子标记鉴定不同西瓜果肉硬度材料的方法为：
(1)分子标记在硬肉材料ZJU152和软肉材料ZJU163及其后代群体中的多态性分析：
设计开发KASP分子标记，用于检测硬肉软肉亲本材料及其后代的基因型多态性。KASP分子标记引物组合有正向引物F1、F2和反向引物R组成。引物(分子标记)可委托上海生工生物工程股份有限公司合成，在ABI Step One PCR仪上进行扩增。
PCR反应体系为：20-50ng/μl西瓜基因组DNA5.0μl，KASP Master Mix 5.0μl，KASPAssay Mix(F1：F2：R＝2:2:5的体积比，三种引物浓度均为10ng/μl)0.14μl，总体积为10.14μl；
PCR反应程序为：30℃，1分钟(读取荧光信号)；94℃，15分钟(预变性)；94℃，20秒(变性)；61℃(-0.6℃/循环)退火60秒，10个循环；94℃，20秒(变性)；55℃，退火60s秒，31个循环。30℃，1分钟(读取荧光信号)。
扩增结束后，检测荧光信号并分析基因分型情况。若分型不充分，则可以继续扩增。94℃，20秒(变性)；55℃，退火60s秒，3个循环。30℃，1分钟(读取荧光信号)。每增加3个循环读取荧光信号查看分型情况，直至完全分型。
基因分型结果如图1所示，该分子标记能在不同果肉硬度的材料中有明显的分型，可以根据荧光信号的不同来判断基因型。其中红色为硬肉材料ZJU152的纯合基因型HH，蓝色为软肉材料ZJU163的纯合基因型hh，绿色为杂种F1杂合基因型Hh。
说明：在本发明中，ZJU152、ZJU163以及后代以及表1所述的西瓜品种，按照上述PCR反应程序均能实现充分分型。
本发明的利用上述分子标记开展西瓜果肉硬度性状分子辅助选择育种：
设计开发的与果肉硬度性状紧密连锁的KASP分子标记，可以进行西瓜果肉硬度品种的初步筛选，以达到分子标记辅助育种的目的。另外，将软肉材料ZJU163和硬肉材料ZJU152进行杂交，然后回交、自交结合分子标记辅助选择，选择分离群体中适宜果肉硬度的单株用于育种改良，可以定向选择和改良西瓜果肉质地口感和货架期，加速果肉质地目标性状的分子育种进程。
综上，本发明开发了基于西瓜果肉硬度性状的KASP分子标记ClFH(FleshHardness)，即，本发明提供了与西瓜果肉硬度性状紧密连锁的分子标记，该分子标记能用于筛选不同西瓜果肉硬度材料及其后代的辅助选择育种。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1是亲本材料ZJU152和ZJU163及其F1的ClFH分子标记的分型图；
其中ZJU163的基因型是hh，表现为蓝色；ZJU152的基因型是HH，表现为红色；F1的基因型是Hh，表现为绿色；黑色的叉表示无荧光信号的阴性对照。
图2是不同果肉硬度西瓜材料杂交F6代群体的ClFH分子标记的分型图；
其中蓝色表示与软肉材料ZJU163一致的hh基因型；红色表示与硬肉材料ZJU152一致的HH基因型；绿色的表示与F1一致的Hh基因型；黑色的叉表示无荧光信号的阴性对照；
ClFH分子标记在杂交后代材料中表现出明显的分离，说明该标记的可靠性，可用于后代不同硬度材料的筛选。
图3是不同果肉硬度西瓜自然群体材料的ClFH分子标记的分型图；
其中蓝色表示与软肉材料ZJU163一致的hh基因型；红色表示与硬肉材料ZJU152一致的HH基因型；黑色的叉表示无荧光信号的阴性对照。
图4是不同基因型西瓜自然群体的果肉硬度排序(仅仅显示部分品种的信息)。
图5是不同基因型西瓜自然群体的果肉硬度分布；
结果表明纯合hh基因型西瓜的果肉硬度显著低于HH基因型的西瓜。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1、西瓜果肉硬度性状主效QTL定位
从实验室种质资源库中选择亲本材料。ZJU152为野生类型西瓜材料，果肉硬度大；ZJU163为栽培类型西瓜材料，果肉硬度小。利用上述亲本杂交后自交，构建重组自交系群体F6。采用TA.XT-21质构仪(Stable Micro Systems Ltd.,Godalming,Surrey,UK)测定中心果肉的硬度。
用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵，Hexadecyl trimethyl ammonium bromide)法提取西瓜亲本幼苗及杂交后代F6群体幼苗基因组DNA；挑选子代极端表型材料构建BSA混池，进行基因组重测序，通过△SNP-index方法进行关联分析，选取99％置信区间，定位到一个位于6号染色体12236196-15073822的区间。
实施例2、西瓜果肉硬度性状KASP分子标记开发与验证
根据实施例1的基因定位结果，对亲本材料在6号染色体区间内的SNP和InDel进行提取分析，并利用KASP技术开发出相关的分子标记，用于精细定位。
具体如下：
一、DNA提取
用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵，Hexadecyl trimethyl ammonium bromide)法提取西瓜亲本幼苗及杂交后代F6群体幼苗基因组DNA。
二、PCR扩增
PCR反应体系为：20-50ng/μl西瓜基因组DNA5.0μl，KASP Master Mix 5.0μl，KASPAssay Mix(F1：F2：R＝2:2:5的体积比，三种引物浓度均为10ng/μl)0.14μl，总体积为10.14μl；
PCR反应程序为：30℃，1分钟(读取荧光信号)；94℃，15分钟(预变性)；94℃，20秒(变性)；61℃(-0.6℃/循环)退火60秒，10个循环；94℃，20秒(变性)；55℃，退火60s秒，31个循环。30℃，1分钟(读取荧光信号)。
直接在ABI Step One PCR仪上进行PCR扩增，仪器检测荧光信号后可直接获得基因分型情况，所得结果如图1所示。软件将检测样品按照不同的基因型分成纯合HH基因型，纯合hh基因型和杂合Hh基因型。
正向引物F1和F2前分别设置了各自的荧光接头(在分型图上显示为不同颜色，例如HH基因型为红色、hh基因型为蓝色、Hh基因型为绿色)。如果检测的材料是纯合基因型，则在扩增时只会选择其中对应的一个引物进行扩增(例如，纯合hh基因型只能与F1发生反应)。最后根据荧光差异，分辨出所测材料是纯合HH基因型还是hh基因型。如果检测的材料是杂合基因型的，那么两个引物均会发生扩增，则产生的荧光信号不同于纯合基因型的材料，从而实现杂合基因型的区分。
经过分子标记的筛选，最终获得与西瓜果肉硬度性状紧密连锁的KASP分子标记ClFH。所述分子标记为InDel***缺失标记，该分子标记引物组合序列如下：
正向引物F1：
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAATACTTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTC
正向引物F2:
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAATACTTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTT
反向引物R：
TCAGATAATGGAAACTATAGATCGA
其中，InDel标记位于西瓜6号染色体的13154621bp处，分子标记位点前后100bp序列为：
TCGAAACAAAACTTTTAAGTACGAATATATATATACATTAATTCCTTGCTTTAATAAAC TTATAAATTTCAGATAATGGAAACTATAGATCGAAAAGAAA[AAAAAAAAAAG/-]AAAAA AAAAAGAAAAAAAAAAAGTATTGAAGATCTTTATTTGTAAGAGACAAAGGAAAGATAG ACTAAATGATGGGATGGGAAAGAGGG。
其中括号内是InDel的片段，突变型表现为InDel的缺失。
根据图1所示，软肉材料ZJU163为纯合hh基因型，在图中表现为蓝色；硬肉材料ZJU152为纯合HH基因型，在图中表现为红色；ZJU152和ZJU163杂交F1代表现为杂合的Hh基因型，在图中表现为绿色。
根据图2所示，利用ClFH在F6代群体中进行分型，与ZJU163同为蓝色对应材料的基因型为hh；与ZJU152同为红色对应材料的基因型为HH；与F1同为绿色对应材料的基因型为Hh。
实验1、参照实施例1的果肉硬度方法对不同品种的西瓜种质进行果肉硬度的测定，并按照实施例2所述方法及开发的分子标记进行检测，所得结果如表1所示。
表1、126份西瓜种质材料果肉硬度及ClFH分子标记鉴定结果
说明：上述西瓜种质材料在A.Mahmoud et al.,An allelic variant in theACS7 gene promotes primary root growth in watermelon.Theoretical and AppliedGenetics 135,3357-3373(2022)中有告知。
根据理论推测，基因型为hh的西瓜应为软肉材料，而基因型为HH的西瓜应为硬肉材料。理论结果与实测硬度结果相符合。ClFH分子标记在自然群体中可以检测出不同硬度材料的不同基因型，进一步明确该分子标记可以用于不同西瓜硬度材料的分子辅助选择育种。在表1中，由于实验室种质资源材料类型的原因，故，鉴定为HH的西瓜材料较少。
综上，本发明的分子标记可以进行西瓜果肉硬度品种的初期筛选，以达到分子标记辅助育种的目的。本发明的分子标记标记可以筛选极端硬度材料的品种。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (7)
1.基于西瓜果肉硬度性状紧密连锁的KASP分子标记ClFH，其特征在于：所述KASP分子标记为InDel***缺失标记，位于西瓜6号染色体的13154621bp处。
2.根据权利要求1所述的基于西瓜果肉硬度性状紧密连锁的KASP分子标记ClFH，其特征在于：
分子标记位点前后100bp序列为：
TCGAAACAAAACTTTTAAGTACGAATATATATATACATTAATTCCTTGCTTTAATAAACTTATAAATTTCAGATAATGGAAACTATAGATCGAAAAGAAAAAAAAAAAAAG/-AAAAAAAAAAGAAAAAAAAAAAGTATTGAAGATCTTTATTTGTAAGAGACAAAGGAAAGATAGACTAAATGATGGGATGGGAAAGAGGG；
其中下划线对应的是InDel的片段，突变型表现为InDel的缺失。
3.用于鉴定西瓜果肉硬度性状的KASP分子标记ClFH引物组合，其特征在于：核苷酸序列为5’-3’；
正向引物F1：
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAATACTTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTC
正向引物F2:
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAATACTTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTT
反向引物R：
TCAGATAATGGAAACTATAGATCGA。
4.如权利要求1或2所述的分子标记的用途：用于不同果肉硬度的西瓜材料或其后代的分子辅助选择育种。
5.根据权利要求4所述的分子标记的用途：判定西瓜不同西瓜材料及其杂交后代是属于以下的哪种基因型：纯合HH基因型，纯合hh基因型、杂合Hh基因型。
6.利用如权利要求1或2所述的分子标记鉴定西瓜果肉硬度的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)、设定突变类型西瓜材料ZJU152为HH基因型；
(2)、提取待测西瓜样本基因组DNA；利用如权利要求3所述的ClFH分子标记引物组在ABI Stepone PCR仪上对西瓜基因组DNA进行PCR扩增；利用ABI Stepone PCR仪检测荧光信号，并分析基因分型；根据PCR产物荧光信号的差异，进而鉴别出每个待测西瓜的基因型，鉴定出纯合HH基因型，纯合hh基因型、杂合Hh基因型；
(3)、当样本的分型结果为纯合HH基因型，鉴定该待测西瓜样本为硬肉性状；
当样本的分型结果为纯合hh基因型，鉴定该待测西瓜样本为软肉性状。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：
PCR反应体系为：20-50ng/μl西瓜基因组DNA 5.0μl，KASP Master Mix 5.0μl，KASPAssay Mix(F1：F2：R＝2:2:5的体积比，三种引物浓度均为10ng/μl)0.14μl，总体积为10.14μl；
PCR反应程序为：30℃，1分钟；94℃，15分钟；94℃，20秒；61℃(-0.6℃/循环)退火60秒，10个循环；94℃，20秒；55℃，退火60s秒，31个循环；30℃，1分钟。
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|---|---|---|---|---|
| CN117385084A (zh) * | 2023-11-23 | 2024-01-12 | 西北农林科技大学 | 与苹果果实硬度紧密连锁的分子标记、引物及其用途 |
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