CN117385084A - 与苹果果实硬度紧密连锁的分子标记、引物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于遗传育种技术领域，具体涉及一种与苹果果实硬度紧密连锁的分子标记、引物、检测方法和应用。该分子标记为MdPL5基因上游Del2431，位于苹果基因组16号染色体的第7475839到7478270位点，是一个Harbinger逆转座子的***或缺失多态性位点。本发明提供的分子标记可用于辅助判断杂交后代成熟期的果实硬度或用于节省苹果杂交育种的开支，在苹果果实硬度遗传改良上具有较好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于遗传育种技术领域，涉及到一种与苹果果实硬度紧密连锁的分子标记、引物及其用途，该分子标记能够用于辅助苹果杂交后代质地育种，也可用于基因组辅助遗传改良育种。
背景技术
苹果，属蔷薇科苹果亚科苹果属落叶乔木果树，是世界上最受欢迎的温带水果之一。苹果果实质地主要包括果实硬度、脆度和多汁性，作为果品品质评价的重要指标，苹果质地决定消费者的选择和果品的市场竞争力。苹果果实具有较高的硬度则严重影响着商品品质和消费者的选择，当然，果实的过度软化易受到病原菌的侵蚀，也严重降低果实的货架期。果实成熟期硬度作为苹果育种最关键的五大性状之一，它与果实的成熟期以及采后贮藏期硬度的下降紧密连锁，是由多基因控制的复杂遗传性状。研究其遗传调控机理对于辅助杂交后代育种具有重要的理论指导意义。
因为苹果是典型的呼吸跃变型果实，所以果实硬度相关的研究多集中在植物气体激素乙烯方面，乙烯在果实成熟期果实的软化方面起着非常关键的作用，而乙烯生物合成的两个关键限速酶ACS合成酶和ACC氧化酶是关键的限速酶。生产上，育种者常用硬度相关的分子标记MdACS1、MdACO1和MdPG1选育理想的苹果果实质地，然而，这些遗传标记与乙烯的生成紧密相关，但通常只能解释非常有限的硬度表型变异，它们在分子辅助育种中作用十分有限。此外，乙烯作为苹果成熟的关键激素之一，控制着果实的诸多品质性状如果实质地、糖酸及香气物质。利用新技术和新方法，探究特异调控果实硬度的遗传机制而不影响其它众多品质性状对于质地育种方面更有深刻的意义。因此，我们仍然需要更加精确的与果实成熟期硬度紧密连锁的分子标记，以期应用到分子标记辅助选择育种上，从而提高育种效率。
转座子在植物基因组上是非常丰富的，主要包括两类：转座子和逆转座子，它们大多数是没有活性和功能的，通常维持着基因组的稳定。但是部分转座子在植物的进化和基因的调控网络中却起着非常关键的作用。例如，玉米中CCT9基因上游的一个类似Harbinger的长片段逆转座子的***抑制其表达并促进了开花。
由于苹果拥有高度杂合的基因组，并且具有很长的童期，所以杂交育种费时费力。而苹果的众多品质性状均为数量性状，受到多种遗传机制的调控以及环境的调节作用。因此，研究果实关键性状的遗传机制并开发与果实品质性状紧密连锁的分子标记，有助于加速苹果选育的速度，提高果品的核心竞争力。
发明内容
针对并结合苹果高度杂合的遗传背景，本发明提供了一种与苹果果实硬度紧密连锁的分子标记，该分子标记位于苹果基因组第16号染色体果胶裂解酶基因MdPL5上游，为一个Harbinger逆转座子。此转座子在具有极端高硬度表型(果实去皮硬度大于10.8Kg/cm2)的植株中表现多为纯合***的基因型，在极端软组后代中(果实去皮硬度小于6.5Kg/cm2)多表现为纯合缺失的基因型。
本发明提供的具体技术方案如下：
本发明第一方面，提供一种与苹果果实硬度紧密连锁的分子标记，所述分子标记位于苹果基因组16号染色体的第7475839到7478270位点，为一个Harbinger逆转座子的***或缺失多态性位点。
优选地，所述Harbinger逆转座子位于基因MdPL5启动子上游，且其来源于NCBI数据库的OU744557.1。
本发明第二方面，提供一种所述分子标记的检测引物，其包括上游引物及下游引物，上游引物的核苷酸序列Del2431-F为：ACATTAACATCAAACACTTGATAGGC，下游引物的核苷酸序列Del2431-R为：CGAGAAACGATATTAAAATCACTCAC。
本发明第三方面，提供一种与苹果果实硬度紧密连锁的分子标记的检测方法，包括以下步骤：
提取待测样品基因组DNA；
以所述基因组DNA为模板，用所述分子标记的检测引物进行PCR扩增；
将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，并根据电泳结果判定分子标记的多态性及基因型。
优选地，所述PCR扩增体系包括50ng/ul模板DNA 1μL、10×PCR混合酶液5μL、上游引物和下游引物各0.5μL、无菌ddH2O定容至10μL。
优选地，所述PCR程序为：94℃预变性3分钟；94℃变性30sec；58℃复性30sec；72℃延伸2分半，循环35次，72℃终延伸10分钟。
优选地，扩增产物在2641bp处出现特异性条带，表现为纯合***基因型；扩增产物在2641bp与210bp均出现特异性条带，表现为杂合***基因型；扩增产物在210bp处出现特异性条带，表现为纯合缺失基因型。
本发明第四方面，一种所述分子标记或所述引物在判断苹果杂交后代果实硬度中的用途。
优选地，判断苹果杂交后代果实硬度是按照以下步骤进行：
以待测样品基因组DNA为模板，利用所述引物进行PCR扩增；
将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，当杂交后代在2641bp处表现为纯合***基因型时，判定为高硬度植株；当杂交后代在210bp处表型为纯合缺失基因型，判定为低硬度植株。
本发明第五方面，提供一种所述分子标记或所述引物在苹果果实硬度性状杂交育种中的用途。
对比现有技术，本发明的有益效果为：
1、本发明结合多项生物学测序技术，发现了与果实品质性状紧密连锁的一个关键结构变异，该结构变异位点为一个Harbinger逆转座子，位于苹果基因组第16号染色体。此转座子在具有极端高硬度表型(果实去皮硬度大于10.8Kg/cm2)的植株中表现多为纯合***的基因型，在极端软组后代中(果实去皮硬度小于6.5Kg/cm2)多表现为纯合缺失的基因型。
2、结合另一个群体瑞阳和爱妃子代的果实硬度数据，发现本发明提供的结构变异位点有很好的适用性，能够和硬度表型紧密连锁，可作为关键的分子标记辅助苹果果实品质育种，完善硬度遗传的调控机理，以期提高育种效率。鉴于分子标记在基因组辅助育种中具有简便、快捷以及高通量的技术优势，因此本发明提供的关键遗传位点相关联的分子标记在苹果杂交后代品质辅助育种中具有较好的应用前景。
附图说明
图1是关键候选基因MdPL5在极端硬度表型样本中的表达量；(a)热图分析；(b)硬度表型数据；(c)表示候选基因MdPL5在极端软组及极端硬组的平均表达量；**P<0.01；
图2是候选基因启动子前方序列差异比对结果；
图3是2431bp结构变异在富士和粉红女士杂交子代中的Del2431基因型比例结果；
图4是富士和粉红女士及其极端杂交后代在该位点的琼脂糖凝胶电泳检测结果；a中1是富士，2是粉红女士，3是2000分子marker；b中M代表2000marker，2、3、6、8、10、12、13、15、16、17、21、22、23、24、27、31、35、36、37、40为极端硬组；1、4、5、7、9、11、14、18、19、20、25、26、28、29、30、32、33、34、38、39为极端软组样本；
图5是饼图分析极硬组(a)和极软组(b)MdPL5基因上游2431bp不同基因型比例；
图6是瑞阳和爱妃及其杂交后代在该位点的琼脂糖凝胶电泳检测结果；1～17、19～23、26、31为极端硬组；18、24～25、27～30、32～48为极端软组样本，M代表2000marker；
图7是饼图分析瑞阳和爱妃极端硬组(a)和极软组(b)MdPL5基因上游Del2431不同基因型比例。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。
在本发明所涉及的分子生物学方法，如未特殊说明，均为本领域常规技术和方法，所使用试剂、酶剂均为市售，均可通过商业化途径购买获得。
实施例1
苹果果实硬度在富士和粉红女士杂交后代中的分离
对439株富士和粉红女士杂交后代进行两年的成熟期硬度表型测定并收集，结果表明富士和粉红女士杂交后代果实成熟期硬度出现了广泛的分离，构建的极端样本表型差异比较大，能够很好的进行果实硬度的QTL定位分析。此外，果实的硬度频率呈现出正态分布，表明该硬度性状是受多基因控制的复杂性状。
实施例2
遗传定位
通过对极端硬度表型混池进行重测序，遗传定位到苹果第16号染色体上有一主效QTL(6.72Mb～9.52Mb)与果实硬度相关联。
进一步联合极端硬度样本转录组数据，结果显示(图1)，候选基因MdPL5在四个极端软组子代的表达量显著高于四个极端硬组子代的表达。
进一步结合软硬极端组进行候选基因MdPL5 CDS和上游启动子的扩增，经一代Sanger测序数据分析，结果发现(图2)，与参考基因组相比，部分极端软组子代在此位点缺失2431bp。结合苹果基因组进行注释，发现该变异位点为一个逆转座子。
实施例3
2431bp结构变异在富士和粉红女士杂交子代中的验证
在40个富士和粉红女士极端硬度表型子代中对2431bp结构变异进行特异性引物设计。分别提取粉红女士、富士和极端硬度杂交后代的基因组DNA，以此为模板，利用特异性引物进行PCR扩增，根据PCR扩增产物对基因型验证。
特异性引物如下：
上游引物Del2431-F，其核苷酸序列为ACATTAACATCAAACACTTGATAGGC，如SEQ IDNO:1所示；
下游引物Del2431-R，其核苷酸序列为CGAGAAACGATATTAAAATCACTCAC，如SEQ IDNO:2所示。
PCR扩增体系包括50ng/ul模板DNA 1μL、10×PCR混合酶液5μL、上游引物和下游引物各0.5μL、无菌ddH2O定容至10μL，液体石蜡覆盖。
PCR程序为：94℃预变性3分钟；94℃变性30sec；58℃复性30sec；72℃延伸2分半，循环35次，72℃终延伸10分钟。
富士和粉红女士及其极端杂交后代在该遗传变异位点的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图4所示。结果表明富士和粉红女士亲本在此变异位点均表现出Del2431:del2431杂合型。杂交后代应具有***：杂合：缺失为1：2：1的理论遗传分离比。
除了杂合子代外，高硬度植株中该2431bp结构变异位点Del2431:Del2431纯合***基因型与del2431:del2431纯合缺失基因型的比例为9∶1，Del2431:Del2431纯合***基因型占比为90％；而极端软组子代中Del2431:Del2431纯合***基因型与del2431:del2431纯合缺失基因型比为4∶8，纯合缺失基因型占比为66.7％，见图3。
接下来提取更多极端的杂交后代DNA，在100个杂交子代中进行验证，依然呈现相似的一个结果，呈现极端软组普遍呈现del2431:del2431纯合缺失基因型。极端硬组与Del2431:Del2431纯合***基因型紧密连锁。
饼图分析极硬组和极软组MdPL5基因上游2431bp不同基因型比例。结果显示(图5)，在极端硬组中，Del2431杂合基因型子代占50％，Del2431:Del2431纯合***基因型占45％，然而del2431:del2431纯合缺失基因型只占5％。在极端软组中，Del2431杂合子代基因型占40％，del2431:del2431纯合缺失基因型占40％，而Del2431:Del2431纯合***仅占20％，再次表明该遗传变异位点与果实成熟期硬度紧密连锁，可应用于杂交后代的分子标记辅助育种。
由此得出，QTL16位点可能是与果实硬度关联的一个主效位点，候选基因MdPL5可能是与果实硬度紧密相连的主效基因，2431bp结构变异位点的***与果实高硬度性状紧密连锁。
实施例4
瑞阳和爱妃及其杂交后代在2431bp SV(结构变异)位点进行PCR鉴定
以爱妃为父本，以瑞阳为母本，首先对亲本进行基因型验证，发现其均为杂合型。接下来本实例利用瑞阳和爱妃杂交后代进行验证。在苹果成熟期时，通过硬度计对成熟果实进行硬度的测量，每4～6个均匀一致的果子为一个重复，进行三次生物学重复，由于田间误差较大，连续统计两年的杂交后代硬度表型。表型一致的后代进行进一步的研究，选取极端子代进行植株叶片DNA的提取，并以此为模板，利用实施例3中设计的特异性引物并按照实施例3中的方法进行PCR验证，统计分子标记对苹果果实表型的遗传贡献性。
结果显示(图6及图7)，在48个极端子代中对该结构变异进行验证，除了杂合子代外，高硬度植株中该位点Del2431:Del2431纯合***基因型与del2431:del2431纯合缺失的比例为12∶0，占比为100％；而极端软组子代中纯合***基因型与纯合缺失基因型比值为3∶5，del2431:del2431纯合缺失基因型占比为62.5％。表明本发明提供的逆转座子分子标记和高硬度表型紧密连锁。
由于采用的步骤方法与实施例相同，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (10)
1.一种与苹果果实硬度紧密连锁的分子标记，所述分子标记位于苹果基因组16号染色体的第7475839到7478270位点，是一个Harbinger逆转座子的***或缺失多态性位点。
2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，所述Harbinger逆转座子位于基因MdPL5上游，且其来源于NCBI数据库的OU744557.1。
3.一种权利要求1所述分子标记的检测引物，其特征在于，其包括上游引物及下游引物，上游引物的核苷酸序列Del2431-F为：ACATTAACATCAAACACTTGATAGGC，下游引物的核苷酸序列Del2431-R为：CGAGAAACGATATTAAAATCACTCAC。
4.一种权利要求1所述分子标记的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
提取待测样品基因组DNA；
以所述基因组DNA为模板，用所述分子标记的检测引物进行PCR扩增；
将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，并根据电泳结果判定分子标记的多态性及基因型。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增体系包括50ng/ul模板DNA 1μL、10×PCR混合酶液5μL、上游引物和下游引物各0.5μL、无菌ddH2O定容至10μL。
6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述PCR程序为：94℃预变性3分钟；94℃变性30sec；58℃复性30sec；72℃延伸2分半，循环35次，72℃终延伸10分钟。
7.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，扩增产物在2641bp处出现特异性条带，为纯合***基因型；扩增产物在2641bp与210bp均出现特异性条带，为杂合基因型；扩增产物在210bp处出现特异性条带，为纯合缺失基因型。
8.一种权利要求1所述的分子标记或权利要求3所述的引物在判断苹果杂交后代果实硬度中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，判断苹果杂交后代果实硬度是按照以下步骤进行：
以待测样品基因组DNA为模板，利用所述引物进行PCR扩增；
将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，当杂交后代在2641bp处表现为纯合***基因型时，判定为高硬度植株；当杂交后代在210bp处表型为纯合缺失基因型，判定为低硬度植株。
10.一种权利要求1所述的分子标记或权利要求3所述的引物在苹果果实硬度性状杂交育种中的用途。
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| US20150082476A1 (en) * | 2012-04-12 | 2015-03-19 | Syngenta Participations Ag | QTL Responsible for Tomato Fruit Firmness |
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| CN115341048A (zh) * | 2021-11-01 | 2022-11-15 | 西北农林科技大学 | 一种与苹果属植物根皮苷有无性状相关的分子标记及应用 |
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2023
- 2023-11-23 CN CN202311575312.0A patent/CN117385084A/zh active Pending
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