CN117683938B - 与番茄果实宽度紧密连锁的kasp分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供与番茄果实宽度紧密连锁的KASP分子标记及其应用，属于包含核酸的测定方法技术领域，所述KASP分子标记用于特异性检测番茄基因组第4号染色体全长序列的第3154269位的SNP位点，SNP的变异位点为C/T；所述KASP分子标记的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。本发明可利用该标记将不同基因型的番茄材料明显分开，且不同基因型材料的果实宽度差异在P<0.0001水平上显著，CC基因型材料比TT基因型材料的果实宽度更大，根据其基因型判断样本果实宽度的等位变异，可在苗期实现高通量、快速、精准的检测，辅助不同番茄果实宽度的选育，加速番茄品种选育改良进程。
Description
技术领域
本发明属于包含核酸的测定方法技术领域，涉及与番茄果实宽度紧密连锁的KASP分子标记及其应用。
背景技术
番茄（Solanum lycopersicum）原产于南美洲，是一种世界性蔬菜。番茄喜光、喜温并且对栽培的条件不严格、环境适应能力强、生长周期长、结果期长、产量高、风味好，市场需求量大，富含可溶性糖、类胡萝卜素、VC、番茄红素以及有机酸等多种营养成分，在我国南北方广泛栽培，是我国各地设施栽培主要作物之一。
果实宽度是果实重要的经济性状之一，影响作物的产量、品质以及商品性。然而，果实宽度作为一个比较复杂的数量遗传的农艺性状，在发育过程中易受到遗传、激素、外部环境、人为栽培措施等多方面影响。传统育种对果实宽度的选育主要依据表型进行选择，选育结果准确性受环境影响较大，且耗时费力。全基因组关联分析（Genome WideAssociation Study，GWAS）是基于数量性状连锁不平衡理论，通过表现与基因型关联分析获得影响表型性状的显著关联标记。利用GWAS挖掘目标性状相关位点后结合分子标记辅助育种工作进行选育，能显著提高育种者选育品种效率，减轻田间工作量，降低育种成本，还可进一步提高产品质量与品质，促进相关产业发展。
近年来，第三代分子标记技术，SNP标记以覆盖整个基因组，密度高、稳定性好的优点得到了快速发展。其中，竞争性等位变异特异性PCR（Kompetitive Allele SpecificPCR，KASP）可以在广泛的基因组DNA样品中对SNPs和特定位点上的InDels进行精准的双等位基因判断，具有标记成功率高、分型准确、开发与检测费用低、检测通量灵活性强等特点，是目前开展高通量基因分析的主流标记。
现有技术中未见针对番茄果实宽度的KASP分子标记的报道。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提供与番茄果实宽度紧密连锁的KASP分子标记及其应用，实现以下发明目的：基因分型效果好，可用于检测与番茄果实宽度极显著相关的等位基因位点。
为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：
与番茄果实宽度紧密连锁的KASP分子标记，所述KASP分子标记用于特异性检测番茄基因组第4号染色体全长序列的第3154269位的SNP位点，SNP的变异位点为C/T。
所述KASP分子标记的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。
所述KASP分子标记包括3条KASP引物，分别为特异性正向引物1、特异性正向引物2、通用反向引物；所述特异性正向引物1的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示；所述特异性正向引物2的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.3所示；所述通用反向引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示。
特异性正向引物1、特异性正向引物2连接两个不同的荧光标签序列。
所述特异性正向引物1的5’端连接有FAM基团的荧光标签序列；所述特异性正向引物2的5’ 端连接有HEX基团的荧光标签序列。
一种由KASP分子标记制备的检测试剂盒或检测试剂。
所述的KASP分子标记在鉴定番茄果实宽度中的应用
所述的应用，包括以下步骤：
（1）提取待测番茄植株的基因组DNA；
（2）以番茄植株的基因组DNA为模板，利用KASP分子标记对应的KASP引物进行PCR扩增、KASP反应检测；
（3）读取KASP反应检测的荧光信号，当番茄植株样本基因组DNA显示特异性正向引物1所带荧光基团信号，则即可判断该样本携带基因型CC，果实宽度较大；若番茄植株样本基因组DNA显示特异性正向引物2所带荧光基团信号，则即可判断该样本携带基因型TT，果实宽度较小。
与现有技术相比，本发明取得以下有益效果：
（1）本发明提供了一个与番茄果实宽度基因紧密连锁的SNP位点SlFW4_3154269，进一步开发了相关的KASP分子标记和KASP引物，在109份番茄群体中获得了高度一致且界限清晰的群体分型效果，分型效率为100%，为番茄果实宽度性状的遗传改良提供快速、可靠的检测手段。
（2）本发明所述 KASP分子标记用于番茄果实宽度的分型，将不同基因型的番茄材料明显分开，且不同基因型材料的果实宽度差异在P<0.0001水平上显著，CC基因型材料比TT基因型材料的果实宽度更大，根据其基因型判断样本果实宽度的等位变异，可在苗期实现高通量、快速、精准的检测，辅助不同番茄果实宽度的选育，加速番茄品种选育改良进程。
附图说明
图1是群体分析结果；
其中图1A为连锁不平衡分析图，图1B为主成分分析二维图；
图2是本发明实施例1中番茄果实宽度性状全基因组关联分析结果的曼哈顿图和Q-Q图（Quantile-quantile plot）；
其中图2A为曼哈顿图；图2B为Q-Q图；
图3为SlFW4_3154269标记位点在22份材料中的相关基因KASP标记分型图；
图4为SlFW4_2986588标记位点在22份材料中的相关基因KASP标记分型图；
图5为SlFW4_2997658标记位点在22份材料中的相关基因KASP标记分型图；
图6为SlFW4_3116566标记位点在22份材料中的相关基因KASP标记分型图；
图7为SlFW4_3192067标记位点在22份材料中的相关基因KASP标记分型图；
图8为SlFW4_3154269的 KASP分子标记对不同番茄种质的基因分型图；
图9为SlFW4_3154269 的KASP分子标记鉴定的基因型与果实宽度的等位变异差异图。
具体实施方式
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径购买得到；
本发明采用的番茄基因组的版本为SL3.1，具体序列号为GCF_000188115.5。
实施例1与番茄果实宽度相关的SNP位点的筛选
1）材料
本发明采用由野生番茄、小番茄和大番茄组成的共241份番茄核心种质群体材料，材料编号见表1-3。一部分材料由浙江农科院蔬菜所番茄辣椒组收集和创制，一部分材料来源于番茄种质资源库。
表1 第1-81份番茄核心种质群体材料
表2 第82-162份番茄核心种质群体材料
表3 第163-241份番茄核心种质群体材料
。
2）果实表型鉴定
果实宽度表型的鉴定实验于2021年在杭州进行，采用随机区组设计，每份番茄材料种植3穴，每穴保留6株，参照《番茄种质资源描述规范》，每份番茄材料随机选取6个处于商品成熟期的完整、无病害的果实，用游标卡尺精确测量果实的宽度，取平均值作为鉴定结果，最终得到果实宽度的表型数据。
3）高质量SNP位点筛选
利用重测序技术对241份番茄核心种质群体进行重测序，以基因型上GQ值大于20，大于5条reads覆盖；双等位基因；缺失率≤20%；最小等位基因频率MAF (Minor allelefrequency)＞0.05为筛选标准进行SNP位点的过滤，最终得到8668967个高质量SNP位点。
4）GWAS分析
为避免两个亚群混合进行关联分析时，假阳性结果的产生，在进行关联分析之前先进行群体分析（如图1）。将筛选后得到的SNP位点与果实宽度表型进行关联分析和显著性检测，最终得到与目标性状相关的SNP位点。具体方法为利用GEMMA软件进行全基因组关联分析，以P＝1×10-8作为显著相关的阈值水平线选择显著SNP位点，在全基因组范围内鉴定出5个与果实宽度显著相关的区段（如图2），其中4号染色体上的区段对果实宽度的遗传贡献最大。初步挑选4号染色体上的P值（-log10）≥12.0的5个SNP位点，对22份番茄材料进行KASP基因分型，进一步挑选分型效果好的SNP位点。
5个SNP位点命名为：SlFW4_3154269、SlFW4_2986588、SlFW4_2997658、SlFW4_3116566、SlFW4_3192067；
5个SNP位点的具***置为：
SlFW4_3154269，位于番茄基因组第4号染色体全长序列的第3154269位，SNP的变异位点为C/T；
SlFW4_2986588，位于番茄基因组第4号染色体全长序列的第2986588位，SNP的变异位点为A/C；
SlFW4_2997658，位于番茄基因组第4号染色体全长序列的第2997658位，SNP的变异位点为A/G；
SlFW4_3116566，位于番茄基因组第4号染色体全长序列的第3116566位，SNP的变异位点为A/G；
SlFW4_3192067，位于番茄基因组第4号染色体全长序列的第3192067位，SNP的变异位点为T/G。
实施例2 与番茄果实宽度相关的等位变异位点KASP分子标记的开发
根据显著关联SNP位点的物理位置信息参考Phytozome软件里的序列信息，下载SNP位点上下游各80bp的序列进行KASP引物设计，引物包括两条特异性正向引物和一条通用反向引物，引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
具体如下：
（1）SlFW4_3154269的KASP分子标记和KASP引物
KASP分子标记的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示；
KASP引物序列如下：
SlFW4_3154269特异性正向引物1：其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示；
SlFW4_3154269特异性正向引物2：其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.3所示；
SlFW4_3154269通用反向引物：其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示。
（2）SlFW4_2986588的KASP分子标记和KASP引物
KASP分子标记的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.5所示；
KASP引物序列如下：
SlFW4_2986588特异性正向引物1：其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.6所示；
SlFW4_2986588特异性正向引物2：其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.7所示；
SlFW4_2986588通用反向引物：其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.8所示。
（3）SlFW4_2997658的KASP分子标记和KASP引物
KASP分子标记的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.9所示；
KASP引物序列如下：
SlFW4_2997658特异性正向引物1：其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.10所示；
SlFW4_2997658特异性正向引物2：其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.11所示；
SlFW4_2997658 通用反向引物：其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.12所示。
（4）SlFW4_3116566的KASP分子标记和KASP引物
KASP分子标记的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.13所示
SlFW4_3116566特异性正向引物1：其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.14所示；
SlFW4_3116566特异性正向引物2：其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.15所示；
SlFW4_3116566通用反向引物：其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.16所示。
（5）SlFW4_3192067的KASP分子标记和KASP引物
KASP分子标记的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.17所示；
SlFW4_3192067特异性正向引物1：其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.18所示；
SlFW4_3192067特异性正向引物2：其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.19所示；
SlFW4_3192067通用反向引物：其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.20所示。
上述特异性正向引物1的5’端连接有FAM基团的荧光标签序列，特异性正向引物2的5’ 端连接有HEX基团的荧光标签序列。
采取上述5个SNP位点的KASP引物对22份番茄材料进行KASP基因分型，进一步挑选分型效果好的KASP分子标记。
表4 22份番茄材料编号
KASP基因分型的具体操作如下：
取各株系的新鲜叶片，采用CTAB法提取基因组DNA，使用IntelliQube基因分型平台，利用KASP引物对上述群体的基因组DNA样品进行扩增和荧光检测。
KASP反应检测的PCR体系为：DNA 0.8 μl，2x KASP Master mix 0.75 μl（由LGC公司提供），KASP混合引物0.05μl。
KASP混合引物的配制方法为特异性正向引物1、特异性正向引物2、通用反向引物、先分别用双蒸水稀释至100 μM，然后与ddH2O按照12:12:30:46的体积比混合；
KASP反应检测的PCR反应程序为94℃、15min，94℃、20sec， 61~55℃、60sec，每个循环复性温度降低0.6℃，55℃、60sec，共循环10次；94℃、20sec，55℃、60sec，共循环26次。
利用IntelliQube机器进行荧光数据读取和分析，横坐标和纵坐标分别表示FAM和HEX荧光信号量级，靠近纵轴位置的信号点表示仅检测到HEX荧光信号，靠近横轴位置的信号点表示仅检测到FAM信号，中间位置信号点能同时检测到FAM和HEX信号，靠近原点的黑色圆点表示阴性对照（未添加DNA样品）的扩增信号，FAM和HEX信号皆不明显。将扩增信号分别与原点连线，所形成的夹角越接近于直角说明分型效果越好。如图3~7所示，标记SlFW4_2986588、标记SlFW4_2997658和标记SlFW4_3116566均无法分型（见图4~6），标记SlFW4_3192067只有一个分型结果，都是中间型(见图7)，标记SlFW4_3154269分出的均带FAM信号，分型效率为91%，信号点集中（见图3）。因此在剔除无法分型，或分型效果不好的标记后，最终择优选择SlFW4_3154269位点及其相应的分子标记和引物。
实施例3 利用KASP分子标记进行番茄果实宽度选择的应用
首先利用野生番茄、樱桃番茄、大番茄等番茄品种构建了一个含109份番茄自然群体材料，见表5-6，2022年在浙江杭州进行群体表型鉴定，田间试验采用完全随机区组设计，每份材料每个重复种植3穴，每穴保留6株材料。参照《番茄种质资源描述规范》，每份材料随机挑选6个商品成熟期番茄，利用游标卡尺精确测量宽度，取平均值作为鉴定结果，最终得到果实宽度的表型数据，其中16株材料由于栽培管理原因未得到果实宽度数据。
表5 第1-54份番茄自然群体材料
表6 第55-109份番茄自然群体材料
利用KASP分子标记进行番茄果实宽度选择的具体应用方法如下：
取各株系生长两周的幼苗叶片，采用CTAB法提取基因组DNA，使用IntelliQube基因分型平台，利用SlFW4_3154269的KASP分子标记对上述群体的基因组DNA样品进行扩增和荧光检测。PCR反应体系，包含模板DNA 0.8μl，2x KASP Master mix 0.75μl（由LGC公司提供），KASP混合引物0.05μl。
KASP混合引物的配制方法为特异性正向引物1、特异性正向引物2、通用反向引物、先分别用双蒸水稀释至100μM，然后与ddH2O按照12:12:30:46的体积比混合；
PCR反应程序为94℃、15min，94℃、20sec， 61~55℃、60sec，每个循环复性温度降低0.6℃，55℃、60sec，共循环10次；94℃、20sec，55℃、60sec，共循环26次。
利用IntelliQube机器进行荧光数据读取和分析，横坐标和纵坐标分别表示FAM和HEX荧光信号量级，靠近纵轴位置的信号点表示仅检测到HEX荧光信号，对应的番茄基因型为TT；靠近横轴位置的信号点表示仅检测到FAM信号，对应的番茄基因型为CC；靠近原点的黑色圆点表示阴性对照（未添加DNA样品）的扩增信号，FAM和HEX信号皆不明显。
该KASP分子标记在109份番茄群体中获得了高度一致且界限清晰的群体分型效果（如图8所示）。图中每一个圆点代表一个样品，SlFW4_3154269的分型结果中，2种基因型可以明显被区分和聚类，且FAM和HEX两种扩增信号与原点连线成直角，分型效果好。
上述KASP分子标记检测的番茄果实的基因型和田间统计的果实宽度抗性表型的数据见表7-8；结合基因型和果实宽度抗性表型发现，携带CC（HapI）基因型株系平均果实宽度为61.13mm，而携带TT（HapII）基因型株系平均果实宽度为35.49mm，两种基因型株系的果实宽度达到极显著水平（p<0.0001）（如图9所示），SlFW4_3154269位点的等位基因C/T与番茄果实宽度极显著相关，说明该标记可以指示果实宽度的选择。
表7 基因型为CC的株系及表型数据
表8基因型为TT的株系及表型数据
。
最后说明的是，虽然上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (7)
1.与番茄果实宽度紧密连锁的KASP分子标记，其特征在于：扩增所述KASP分子标记的引物用于特异性检测番茄基因组第4号染色体全长序列的第3154269位的SNP位点，SNP的变异位点为C/T；
所述KASP分子标记的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。
2. 根据权利要求1所述的与番茄果实宽度紧密连锁的KASP分子标记，其特征在于：扩增所述KASP分子标记的引物分别为特异性正向引物1、特异性正向引物2、通用反向引物；所述特异性正向引物1的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示；所述特异性正向引物2的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.3所示；所述通用反向引物的核苷酸序列如序列表中SEQID NO.4所示。
3.根据权利要求2所述的与番茄果实宽度紧密连锁的KASP分子标记，其特征在于：特异性正向引物1、特异性正向引物2连接两个不同的荧光标签序列。
4. 根据权利要求2所述的与番茄果实宽度紧密连锁的KASP分子标记，其特征在于：所述特异性正向引物1的5’端连接有FAM基团的荧光标签序列；所述特异性正向引物2的5’ 端连接有HEX基团的荧光标签序列。
5.一种由扩增权利要求1的KASP分子标记的KASP引物制备的检测试剂盒或检测试剂。
6.权利要求4所述的扩增KASP分子标记的引物在鉴定番茄果实宽度中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：包括以下步骤：
（1）提取待测番茄植株的基因组DNA；
（2）以番茄植株的基因组DNA为模板，利用扩增KASP分子标记的引物进行PCR扩增、KASP反应检测；
（3）读取KASP反应检测的荧光信号，当番茄植株样本基因组DNA显示特异性正向引物1所带荧光基团信号，则即可判断该样本携带基因型CC，果实宽度较大；若番茄植株样本基因组DNA显示特异性正向引物2所带荧光基团信号，则即可判断该样本携带基因型TT，果实宽度较小。
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