CN116622872A - 一种鸡沙门氏菌分子检测试剂盒及其非诊断性检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种针对鸡沙门氏菌的分子检测试剂盒及其非诊断性检测方法。所述试剂盒包括多重PCR检测引物组、阳性对照和阴性对照，所述阳性对照包括鼠伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌基因组DNA；所述阴性对照为灭菌双蒸水；所述多重PCR检测引物组包括：沙门氏菌属检测引物序列SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、鸡伤寒血清型检测引物序列SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、鸡伤寒生物型检测引物序列SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6。本发明的试剂盒和检测方法具有快速、简单、特异性强、灵敏度高的优点，相比传统的沙门氏菌生化鉴定结合血清学分型方法，在检测时间与检测成本方面具有较大优势，适用于临床批量检测。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学检测技术领域，涉及一种针对鸡沙门氏菌分子检测试剂盒及其非诊断性检测方法。
背景技术
沙门氏菌是一种重要的人畜共患病原菌，主要寄居于人和动物的肠道中，研究表明由沙门氏菌引起的食物中毒是所有细菌性食物中毒中比例最高、危害最广的一种。全世界因沙门氏菌感染引起的食物中毒病例常年高居首位，其中非伤寒沙门氏菌感染约导致15.5万人死亡，9380万人患病，中国每年的发病人数也超过300万。2015年世界卫生组织对全球食源性疾病的调查报告显示，沙门氏菌发病数在22种细菌、病毒和原虫疾病中排名第一。
沙门氏菌兼具垂直传播和水平传播的能力，给家禽生产、食品安全和公共卫生领域造成了严重的挑战，国家中长期动物疫病防治规划(2012—2020年)中将沙门氏菌病列为优先防治和重点防范的动物疫病。研究表明，家禽是沙门氏菌的最重要的储存库。鸡沙门氏菌病可以归为三类，第一类是由鸡伤寒沙门氏菌血清型中的鸡白痢生物型所引起的鸡白痢，第二类是由鸡伤寒沙门氏菌血清型中的鸡伤寒生物型引起的禽伤寒，第三类是由其他表达鞭毛具有运动性沙门氏菌(如鼠伤寒沙门氏菌等)所引起的禽副伤寒。由于这三类沙门氏菌病在流行病学、病理变化、防控措施方面不尽相同，因而准确鉴别对于快速有效控制疫病具有重要作用。传统的鉴别方法采用细菌学结合血清学分型，但存在诸多缺陷，如：操作步骤烦琐耗时(需依次经过预增菌，选择性增菌，生化鉴定与血清学分型)，灵敏度较低，成本较高，且由于鸡白痢和鸡伤寒沙门氏菌在病原学方面具有诸多相似之处(已被归类为相同血清型所属的2种生物型)，还需要进一步通过一些特定生化指标(如鸟氨酸、卫矛醇等)才能区分，上述原因严重制约了鸡沙门氏菌病的防控。
随着分子生物学的快速发展，分子检测方法在实践检验中不断取得新进展，成为取代传统检测方法最具潜力的检测方法之一。其中多重PCR技术在保留了PCR方法敏感、特异、简便、快速等优点的同时，以其高效性成为了多病原同时检测的重要技术之一。但由于多重PCR实验设计较单一PCR更为复杂，在建立多重PCR反应体系时需考虑引物间的相互干扰，还需对其中的主要成分和反应条件进行繁琐的优化，因而限制了该方法的广泛运用。为了能够快速、准确、简便的鉴别不同类型的鸡沙门氏菌，本发明根据已知的沙门氏菌基因组序列，通过分析筛选出特异性检测靶标，进一步设计多重PCR引物，开发了用于检测鸡沙门氏菌的实用技术。
发明内容
本发明针对传统技术在鉴别鸡沙门氏菌中存在的不足，提供了一种特异性检测鸡沙门氏菌的分子试剂盒及其非诊断性检测方法。
本发明技术方案如下：
本发明提供了一种鸡沙门氏菌分子检测试剂盒及其非诊断性检测方法，所述鸡沙门氏菌分子检测试剂盒包括10×PCR缓冲液、2.5U/μl Taq DNA聚合酶、10Mm dNTPs、多重PCR检测引物组、阳性对照和阴性对照，所述阳性对照物包括鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028、鸡白痢沙门氏菌ATCC10398和鸡伤寒沙门氏菌ATCC 9184基因组DNA；所述阴性对照为灭菌双蒸水；
所述多重PCR检测引物组包括：沙门氏菌属检测引物序列SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、鸡伤寒血清型检测引物序列SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、鸡伤寒生物型检测引物序列SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6。
进一步的，所述多重PCR检测体系的组分为：每25μl反应液中包括10×PCR缓冲液2.5μl、dNTPs 2μl、Taq DNA聚合酶0.25μl、检测引物组3μl、DNA模板1～2μl以及适量的灭菌双蒸水。
进一步的，所述多重PCR检测方法的制作方法程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s；60℃退火30s；72℃延伸25s；共30个循环，最后72℃延伸8min。
进一步的，所述10×PCR缓冲液含有100mM KCl、80mM(NH4)SO4、pH为9.0的100mMTris-HCl、15mM MgCl2和0.5％Tergitol-type NP-40。
进一步的，所述的引物序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示。
进一步的，所述的引物浓度均为10μM，等体积混合后得到检测引物组。
进一步的，所述dNTPs包括dGTP、dCTP、dATP、dTTP，各组分浓度均为2.5mM。
更进一步的，一种使用鸡沙门氏菌分子检测试剂盒进行非诊断性检测的方法，包括以下步骤：
S1：使用煮沸法或商品化试剂盒提取细菌基因组DNA，得到检测模板。
S2：多重PCR扩增，将10×PCR缓冲液、dNTPs、Taq DNA聚合酶、检测引物组以及DNA模板加入灭菌PCR反应管中，添加灭菌双蒸水至总体积25μl，同时设置阳性、阴性对照，使用PCR仪进行扩增反应；采用2％琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行电泳检测并分析结果。
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明通过一次反应，即可对不同类型的鸡沙门氏菌进行快速鉴别，即出现1个条带(383bp)者为引起禽副伤寒的沙门氏菌，出现2个条带(240bp+383bp)者为鸡白痢沙门氏菌，出现3个条带(240bp+383bp+559bp)者为鸡伤寒沙门氏菌。相比传统的血清学分型与普通PCR检测，本发明在检测时间与检测成本方面具有较大优势，适合于批量检测。特别是，本发明的引物可以准确区分鸡白痢和鸡伤寒，相关的内容还记载在同日申请的“鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌分子鉴别试剂盒及其非诊断性检测方法”中，该申请的全部内容被并入本申请并作为本申请说明书的一部分，申请人有权基于该同日申请记载的内容对申请文件进行修改以及答复审查意见。
附图说明
图1为实施例1中多重PCR检测方法的凝胶电泳展示图。图中：M为DL-2000marker，泳道1-3分别为禽副伤寒类沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌，泳道4为阴性对照。
图2为实施例3中多重PCR检测方法灵敏度评价实验凝胶电泳结果图。图中：M为DL-2000marker，泳道1-5为鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028基因组DNA梯度稀释样品，泳道6为阴性对照。
图3为实施例3中多重PCR检测方法灵敏度评价实验凝胶电泳结果图。图中：M为DL-2000marker，泳道1-5为鸡白痢沙门氏菌ATCC10398基因组DNA梯度稀释样品，泳道6为阴性对照。
图4为实施例3中多重PCR检测方法灵敏度评价实验凝胶电泳结果图。图中：M为DL-2000marker，泳道1-5为鸡伤寒沙门氏菌ATCC 9184基因组DNA梯度稀释样品，泳道6为阴性对照。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
实施例1鸡沙门氏菌分子检测方法的建立
多重PCR引物的设计：根据GenBank数据库中已有的沙门氏菌基因组DNA序列，分析比对后分别筛选出用于特异性检测沙门氏菌属、鸡伤寒沙门氏菌血清型(包含鸡白痢和鸡伤寒2种生物型)和鸡伤寒沙门氏菌生物型的引物，如表1所示。
表1.鸡沙门氏菌分子检测引物
多重PCR检测引物组中沙门氏菌属检测引物序列SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、鸡伤寒血清型检测引物序列SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、鸡伤寒生物型检测引物序列SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.6的完整SEQ序列如序列表中所示。
PCR模板制备：鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028、鸡白痢沙门氏菌ATCC10398和鸡伤寒沙门氏菌ATCC9184分别在TSB肉汤培养基中培养12h，使用商品化的试剂盒提取上述沙门氏菌标准菌株基因组，作为待检模板。
多重PCR检测试剂的配制：将不同引物对用灭菌双蒸水分别稀释为10μM浓度，等体积混合后得到检测引物组；
多重PCR扩增试剂包括：10×PCR缓冲液(其组分包括100mM KCl、80mM(NH4)SO4、pH为9.0的100mM Tris-HCl、15mM MgCl2和0.5％Tergitol-type NP-40)、dNTPs(包含dGTP、dCTP、dATP、dTTP，各组分浓度均为2.5mM)、Taq DNA聚合酶(2.5U/μl)、检测引物组。
多重PCR检测体系及扩增程序：检测体系为25μl，具体包括：10×PCR缓冲液2.5μl，dNTPs 2μl，Taq DNA聚合酶0.25μl，检测引物组3μl、DNA模板2μl以及适量的灭菌双蒸水。扩增程序的步骤包括：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s、72℃延伸25s，共30个循环，最后72℃延伸8min；反应结束，取出扩增产物4℃保存。
多重PCR方法检测结果的判定：取5μl扩增产物，加1μl 6×Loadingbuffer混匀，点样于2％琼脂糖凝胶电泳板孔中，100V电压，电泳40min，于凝胶成像仪下拍照判定。将扩增产物回收、克隆至pMD-19T载体，挑取阳性克隆测序，将结果与已知序列进行比对。
结果判定标准如图1所示，图1中，M为DL-2000marker(依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp)，泳道1-3分别为鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028(383bp)、鸡白痢沙门氏菌ATCC10398(240bp+383bp)和鸡伤寒沙门氏菌ATCC9184(240bp+383bp+559bp)，泳道4为阴性对照。
实施例2特异性评价
用实施例1的方法进行本发明多重PCR检测方法的特异性评价，选取656株实验菌株(其中参考菌株46株，分离株610株)，将所有试验菌株进行富集培养后，煮沸法提取基因组DNA，按照实施例2所述方法进行多重PCR检测，结果如表2所示，所有鸡伤寒沙门氏菌(3株参考菌株和12株分离株)均可扩增出3个特异性扩增条带(240bp+383bp+559bp)，鸡白痢沙门氏菌(3株参考菌株和524株分离株)均可扩增出1个特异性扩增条带(240bp+383bp)，其它血清型沙门氏菌(29株参考菌株和74株分离株)均可扩增出1个特异性扩增条带(383bp)，所有非沙门氏菌参考菌株(11株)均无特异性扩增条带。结果表明，本发明建立的方法具有较好的特异性。所用菌株及菌株编号如下表所示，表中检测结果栏目中“－”表示阴性结果。
表2.特异性评价实验结果
实施例3灵敏度测试
用实施例1的方法进行本发明多重PCR检测方法的敏感性评价。将鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028、鸡白痢沙门氏菌ATCC10398和鸡伤寒沙门氏菌ATCC9184分别在TSB肉汤培养基中培养12h，使用商品化试剂盒提取细菌基因组，测定其原始浓度后再混合，10倍梯度稀释，将不同稀释梯度细菌基因组DNA进行灵敏度评价试验。反应结束后取5μl扩增产物，加1μl 6×Loading buffer混匀，使用2％浓度琼脂糖凝胶电泳检测。图2为鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028基因组DNA灵敏度检测结果，图中M为DL-200marker，泳道1-6反应浓度依次为126.3ng/反应、12.63ng/反应、1.263ng/反应、126.3pg/反应、12.63pg/反应、1.263pg/反应)，泳道7为阴性对照；图3为鸡白痢沙门氏菌ATCC10398基因组DNA灵敏度检测结果，图中M为DL-200marker，泳道1-6反应浓度依次为90.8ng/反应、9.08ng/反应、908pg/反应、90.8pg/反应、9.08pg/反应、0.908pg/反应)，泳道7为阴性对照；图4为鸡伤寒沙门氏菌ATCC9184基因组DNA灵敏度检测结果，图中M为DL-200marker，泳道1-5反应浓度依次为142.7ng/反应、14.27ng/反应、1.427ng/反应、142.7pg/反应、14.27pg/反应、1.427pg/反应)，泳道7为阴性对照。从图2-4所示，本发明的分子检测方法对鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028、鸡白痢沙门氏菌ATCC10398和鸡伤寒沙门氏菌ATCC9184基因组DNA的检测灵敏度分别为12.63pg/反应、9.08pg/反应和14.27pg/反应，具有较高的检测灵敏度。
实施例4鸡沙门氏菌分子检测试剂盒的组装
使用试剂盒提取沙门氏菌标准株基因组DNA(包括鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028、鸡白痢沙门氏菌ATCC10398和鸡伤寒沙门氏菌ATCC 9184)，得到本发明的阳性对照；根据实施例1表中的序列合成3对特异性检测引物，用灭菌双蒸水稀释为10μM浓度，等体积混合后得到检测引物组；多重PCR扩增试剂：10×PCR缓冲液(其组分包括100mM KCl、80mM(NH4)SO4、pH为9.0的100mM Tris-HCl、15mM MgCl2和0.5％Tergitol-type NP-40)、dNTPs(包含dGTP、dCTP、dATP、dTTP，各组分浓度均为2.5mM)、Taq DNA聚合酶(2.5U/μl)、检测引物组、阳性对照(沙门氏菌标准菌株DNA模板)以及阴性对照(灭菌双蒸水)。
将以上所涉试剂和产品共同包装，再配以产品使用说明书(包括产品保存条件、反应程序和结果判定方法等)，组装成本发明所述的鸡沙门氏菌分子检测试剂盒。
以上示意性的对本发明及其实施方式进行了描述，该描述没有限制性，附图中所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的结构并不局限于此。所以，如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种鸡沙门氏菌分子检测试剂盒，其特征在于：包括多重PCR检测引物组、阳性对照和阴性对照，所述阳性对照包括鼠伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌基因组DNA；所述阴性对照为灭菌双蒸水；
所述多重PCR检测引物组包括：沙门氏菌属检测引物序列SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、鸡伤寒血清型检测引物序列SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、鸡伤寒生物型检测引物序列SEQID NO.5、SEQ ID NO.6。
2.根据权利要求1所述的鸡沙门氏菌分子检测试剂盒，其特征在于：所述阳性对照为鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028、鸡白痢沙门氏菌ATCC10398和鸡伤寒沙门氏菌ATCC9184基因组DNA。
3.根据权利要求1所述的鸡沙门氏菌分子检测试剂盒，其特征在于：所述多重PCR检测体系的组分为：每25μl反应液中包括10×PCR缓冲液2.5μl、dNTPs 2μl、Taq DNA聚合酶0.25μl、检测引物组3μl、DNA模板1～2μl以及适量的灭菌双蒸水。
4.根据权利要求1所述的鸡沙门氏菌分子检测试剂盒，其特征在于：所述多重PCR检测引物组包括SED ID NO 1、2、3、4、5和6所示的引物。
5.根据权利要求1所述的鸡沙门氏菌分子检测试剂盒，其特征在于：所述检测引物浓度均为10μM，等体积混合后得到检测引物组。
6.根据权利要求1所述的鸡沙门氏菌分子检测试剂盒，其特征在于：所述dNTPs包括dGTP、dCTP、dATP、dTTP，各组分浓度均为2.5mM。
7.一种使用鸡沙门氏菌分子检测试剂盒进行非诊断性检测的方法，包括以下步骤：
S1：使用煮沸法或商品化试剂盒提取细菌基因组DNA，得到检测模板。
S2：多重PCR扩增，将10×PCR缓冲液、dNTPs、Taq DNA聚合酶、检测引物组以及DNA模板加入无菌PCR反应管中，添加灭菌双蒸水至总体积25μl，同时设置阳性、阴性对照，使用PCR仪进行扩增反应；采用2％琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行电泳检测并分析结果；
所述检测引物组包括：沙门氏菌属检测引物序列SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、鸡伤寒血清型检测引物序列SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、鸡伤寒生物型检测引物序列SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6。
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