KR20220110778A - 신규 mad 뉴클레아제 - Google Patents
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Abstract
본 개시는 살아있는 세포에서 핵산을 합리적이고 직접적으로 편집하기 위한 새로운 RNA 유도 뉴클레아제를 제공한다. 본 개시는 포유동물 세포에서 다양한 PAM 선호도 및/또는 다양한 활성을 갖는 채굴된 MAD-시리즈 뉴클레아제(예를 들어, RNA 유도 뉴클레아제 또는 RGN)를 제공한다. 일부 양태에서, MAD-시리즈 시스템 성분은 전사될 서열(gRNA 성분의 경우) 및 전사되고 번역될 서열(MAD-시리즈 뉴클레아제의 경우)로 전달되고, 일부 양태에서, MAD-시리즈 뉴클레아제에 대한 코딩 서열 및 gRNA 성분 서열은 동일한 벡터 상에 있다.
Description
관련 사례
[0001]
본 국제 PCT 출원은 "신규 MAD 뉴클레아제"라는 명칭으로 2019년 12월 10일에 출원된 USSN 62/946,282에 대한 우선권을 주장한다.
발명의 분야
[0002]
본 발명은 살아있는 세포에 대해 합리적이고 지시된 편집을 수행하기 위한 새로운 핵산 유도 뉴클레아제에 관한 것이다.
발명의 배경
[0003]
다음 논의에서 특정 기사 및 방법이 배경 및 소개 목적으로 설명될 것이다. 본원에 포함된 어떠한 것도 선행 기술의 "승인"으로 해석되어서는 안 된다. 출원인은 적절한 경우 본원에 언급된 방법이 적용 가능한 법적 조항에 따라 선행 기술을 구성하지 않음을 입증할 권리를 명시적으로 보유한다.
[0004]
살아있는 세포의 게놈에 정확하고 표적화된 변화를 만드는 능력은 생물의학 연구 및 개발의 오랜 목표였다. 최근에, 유전자 서열, 따라서 유전자 기능의 조작을 허용하는 다양한 뉴클레아제가 확인되었다. 이러한 뉴클레아제는 핵산 유도 뉴클레아제를 포함한다. 그러나, 핵산 유도 뉴클레아제가 인식할 수 있는 표적 서열의 범위는 특정 PAM이 원하는 표적 서열 근처에 위치해야 하는 필요성에 의해 제한된다. PAM은 gRNA/뉴클레아제 복합체에 의해 인식되는 짧은 뉴클레오티드 서열이며, 이 복합체는 표적 서열의 편집을 지시한다. 상이한 핵산 유도 뉴클레아제에 대한 정확한 PAM 서열 및 PAM 길이 요건은 다양하다; 그러나, PAM은 전형적으로 표적 서열에 인접하거나 근접한 2-7개의 염기 쌍 서열이고, 뉴클레아제에 따라, 표적 서열에 대해 5' 또는 3'일 수 있다. 핵산 유도 뉴클레아제를 공학처리하거나 새로운 핵산 유도 뉴클레아제를 채굴함으로써 변경된 PAM 선호도 및/또는 변경된 활성 또는 충실도; 특정 편집 작업에 대한 핵산 유도 뉴클레아제의 다양성을 증가시킬 수 있는 모든 변화를 갖는 뉴클레아제를 제공할 수 있다.
[0005]
따라서, 다양한 PAM 선호도, 포유동물과 같은 상이한 유기체로부터의 세포에서 다양한 활성 및/또는 변경된 효소 충실도를 갖는 신규 뉴클레아제에 대한 핵산 유도 뉴클레아제 유전자 편집 기술이 필요하다. 본원에 기재된 신규 MAD-시리즈 뉴클레아제는 이러한 요구를 충족시킨다.
발명의 개요
[0006]
본 요약은 아래의 상세한 설명에서 추가로 설명되는 개념의 선택을 단순화된 형태로 소개하기 위해 제공된다. 본 요약은 청구된 주제의 핵심 또는 필수 특징을 식별하기 위한 것이 아니며 청구된 주제의 범위를 제한하기 위해 사용된 것도 아니다. 청구된 주제의 다른 특징, 세부 사항, 유용성 및 이점은 첨부된 도면에 예시되고 첨부된 청구 범위에 정의된 양태를 포함하는 다음의 문서화된 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.
[0007]
본 개시는 포유동물 세포에서 다양한 PAM 선호도 및/또는 다양한 활성을 갖는 채굴된 MAD-시리즈 뉴클레아제(예를 들어, RNA 유도 뉴클레아제 또는 RGN)를 제공한다.
[0008]
따라서, 한 구체예에서, SEQ ID No. 1(MAD2001 뉴클레아제), 20(gRNA 반복 서열) 및 21(gRNA tracr 서열)을 포함하는 MAD2001 시스템; SEQ ID No. 1(MAD2001 뉴클레아제), 22(gRNA 반복 서열) 및 23(gRNA tracr 서열)을 포함하는 MAD2001 시스템; SEQ ID No. 1(MAD2001 뉴클레아제), 24(gRNA 반복 서열) 및 25(gRNA tracr 서열)를 포함하는 MAD2001 시스템; SEQ ID No. 7(MAD2007 뉴클레아제), 26(gRNA 반복 서열) 및 27(gRNA tracr 서열)을 포함하는 MAD2007 시스템; SEQ ID No. 7(MAD2007 뉴클레아제), 28(gRNA 반복 서열) 및 29(gRNA tracr 서열)를 포함하는 MAD2007 시스템; SEQ ID No. 7(MAD2007 뉴클레아제), 30(gRNA 반복 서열) 및 31(gRNA tracr 서열)을 포함하는 MAD2007 시스템; SEQ ID No. 8(MAD2008 뉴클레아제), 32(gRNA 반복 서열) 및 33(gRNA tracr 서열)을 포함하는 MAD2008 시스템; SEQ ID No. 8(MAD2008 뉴클레아제), 34(gRNA 반복 서열) 및 35(gRNA tracr 서열)를 포함하는 MAD2008 시스템; SEQ ID No. 8(MAD2008 뉴클레아제), 36(gRNA 반복 서열) 및 37(gRNA tracr 서열)을 포함하는 MAD2008 시스템; SEQ ID No. 9(MAD2009 뉴클레아제), 38(gRNA 반복 서열) 및 39(gRNA tracr 서열)를 포함하는 MAD2009 시스템; SEQ ID No. 9(MAD2009 뉴클레아제), 38(gRNA 반복 서열) 및 40(gRNA tracr 서열)을 포함하는 MAD2009 시스템; SEQ ID No. 9(MAD2009 뉴클레아제), 41(gRNA 반복 서열) 및 42(gRNA tracr 서열)를 포함하는 MAD2009 시스템; SEQ ID No. 11(MAD2011 뉴클레아제), 43(gRNA 반복 서열) 및 44(gRNA tracr 서열)를 포함하는 MAD2011 시스템; SEQ ID No. 11(MAD2011 뉴클레아제), 45(gRNA 반복 서열) 및 46(gRNA tracr 서열)을 포함하는 MAD2011 시스템; 및 SEQ ID No. 11(MAD2011 뉴클레아제), 47(gRNA 반복 서열) 및 48(gRNA tracr 서열)을 포함하는 MAD2011 시스템을 포함하는 핵산 유도 뉴클레아제 편집을 수행하는 MAD-시리즈 뉴클레아제 시스템이 제공된다. 일부 양태에서, MAD-시리즈 시스템 성분은 전사될 서열(gRNA 성분의 경우) 및 전사되고 번역될 서열(MAD-시리즈 뉴클레아제의 경우)로서 전달되고, 일부 양태에서, MAD-시리즈 뉴클레아제에 대한 코딩 서열 및 gRNA 성분 서열은 동일한 벡터 상에 있다. 다른 양태에서, MAD-시리즈 뉴클레아제 및 gRNA 성분 서열에 대한 코딩 서열은 상이한 벡터 상에 있고, 일부 양태에서, gRNA 성분 서열은 또한 공여자 DNA를 포함하는 편집 카세트에 위치한다(예를 들어, 상동성 아암). 다른 양태에서, MAD-시리즈 뉴클레아제는 펩티드로서 세포에 전달되거나, MAD-시리즈 뉴클레아제 및 gRNA 성분은 리보뉴클레아제 복합체로서 세포에 전달된다.
[0009]
추가로, MAD2001 닉카제 1[SEQ ID No. 14]; MAD2001 닉카제 2[SEQ ID No. 15]; 죽은 MAD2001[SEQ ID No. 16]; MAD2007 닉카제 1[SEQ ID No. 17]; MAD2007 닉카제 2[SEQ ID No. 18]; 죽은 MAD2007[SEQ ID No. 19]; MAD2008 닉카제 1[SEQ ID No. 51]; MAD2008 닉카제 2[SEQ ID No. 52]; 죽은 MAD2008[SEQ ID No. 53]; MAD2009 닉카제 1[SEQ ID No. 54]; MAD2009 닉카제 2[SEQ ID No. 55]; 죽은 MAD2009[SEQ ID No. 56]; MAD 2011 닉카제 1[SEQ ID No. 57]; MAD2011 닉카제 2[SEQ ID No. 58]; 및 죽은 MAD2011[SEQ ID No. 2859]을 포함하는 닉카제가 제공된다.
[0010]
또한, SEQ ID No. 60 및 61; SEQ ID No. 62 및 63; SEQ ID No. 64 및 65; SEQ ID No. 66 및 67; SEQ ID No. 68 및 69; SEQ ID No. 70 및 71; SEQ ID No. 72 및 73; SEQ ID No. 74 및 75; SEQ ID No. 76 및 77; SEQ ID No. 78 및 79; SEQ ID No. 80 및 81; SEQ ID No. 82 및 83; SEQ ID No. 84 및 85; SEQ ID No. 86 및 87; SEQ ID No. 88 및 89; SEQ ID No. 90 및 91; SEQ ID No. 92 및 93; SEQ ID No. 94 및 95; SEQ ID No. 96 및 97; SEQ ID No. 98 및 99; SEQ ID No. 100 및 101; SEQ ID No. 102 및 103; SEQ ID No. 104 및 105; SEQ ID No. 106 및 107; SEQ ID No. 108 및 109; SEQ ID No. 110 및 111; SEQ ID No. 112 및 113; SEQ ID No. 114 및 115; SEQ ID No. 116 및 117; SEQ ID No. 118 및 119; SEQ ID No. 120 및 121; SEQ ID No. 122 및 123; SEQ ID No. 124 및 125; 및 SEQ ID No. 126 및 127을 포함하는, MAD2007에 대한 스페이서 서열 및 PAM 서열 쌍이 제공된다. 또한, SEQ ID No. 128 및 129; SEQ ID No. 130 및 131; SEQ ID No. 132 및 133; SEQ ID No. 134 및 135; SEQ ID No. 136 및 137; 및 SEQ ID No. 138 및 139를 포함하는, MAD2001에 대한 스페이서 서열 및 PAM 서열 쌍이 제공된다.
[0011]
또 다른 구체예에서, SEQ ID No. 142; SEQ ID No. 143; 및 SEQ ID No. 144를 포함하는 샤르페아 아자부엔시스(Sharpea azabuensis)로부터의 추가적인 MAD2007 서열이 제공된다.
[0012]
본 발명의 이러한 양태 및 다른 특징 및 이점은 아래에서 보다 상세히 설명된다.
[0013]
도 1은 채굴된 MAD-시리즈 뉴클레아제 또는 RGN을 생성하고 스크리닝하기 위한 예시적인 워크플로우이다.
[0014] 도 2는 발견된 신규 뉴클레아제에 대한 단백질 크기 대 검색 점수의 플롯이다.
[0015] 도 3은 새로운 MAD 뉴클레아제에 대한 gRNA 설계의 개략도이다.
[0016] 도 4는 서열 로고의 형태로 채굴된 MAD-시리즈 뉴클레아제에 의해 절단된 표적의 농축을 보여준다.
[0017] 도 5는 HEK293T 세포에서 MAD2001, MAD2007, MAD2008, MAD2009 및 MAD2011의 활성을 보여주는 일련의 막대 그래프이다.
[0018] 도 6은 MAD2001, MAD2007, MAD2008, MAD2009 및 MAD2011의 인간 게놈 범위를 보여준다.
[0019] 도 7은 음성 대조군에 대한 GFP- HEK293T 세포의 백분율을 보여준다.
[0020] 도 8은 HEK293T 세포에서 MAD2007의 PAM에 대한 서열 로고이다.
[0021] 도 9는 음성 대조군에 대한 GFP- HEK293T 세포의 백분율을 보여준다.
[0022] 도 10은 2개의 상이한 인간 코돈 최적화된 MAD2007 뉴클레아제에 대한 HEK293T 세포에서 기능 상실의 백분율을 보여준다.
[0014] 도 2는 발견된 신규 뉴클레아제에 대한 단백질 크기 대 검색 점수의 플롯이다.
[0015] 도 3은 새로운 MAD 뉴클레아제에 대한 gRNA 설계의 개략도이다.
[0016] 도 4는 서열 로고의 형태로 채굴된 MAD-시리즈 뉴클레아제에 의해 절단된 표적의 농축을 보여준다.
[0017] 도 5는 HEK293T 세포에서 MAD2001, MAD2007, MAD2008, MAD2009 및 MAD2011의 활성을 보여주는 일련의 막대 그래프이다.
[0018] 도 6은 MAD2001, MAD2007, MAD2008, MAD2009 및 MAD2011의 인간 게놈 범위를 보여준다.
[0019] 도 7은 음성 대조군에 대한 GFP- HEK293T 세포의 백분율을 보여준다.
[0020] 도 8은 HEK293T 세포에서 MAD2007의 PAM에 대한 서열 로고이다.
[0021] 도 9는 음성 대조군에 대한 GFP- HEK293T 세포의 백분율을 보여준다.
[0022] 도 10은 2개의 상이한 인간 코돈 최적화된 MAD2007 뉴클레아제에 대한 HEK293T 세포에서 기능 상실의 백분율을 보여준다.
[0023]
첨부된 도면과 관련하여 아래에 제시된 설명은 개시된 주제의 다양한 예시적인 구체예의 설명인 것으로 의도된다. 특정 특징 및 기능은 각각의 예시적인 구체예와 관련하여 설명된다; 그러나, 개시된 구체예는 각각의 이러한 특정 특징 및 기능 없이도 실행될 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 더욱이, 한 구체예와 관련하여 설명된 모든 기능은 명시적으로 언급된 경우 또는 특징 또는 기능이 추가 구체예들과 호환되지 않는 경우를 제외하고는 본원에 설명된 추가 구체예들에 적용 가능하도록 의도된다. 예를 들어, 주어진 특징 또는 기능이 한 구체예와 관련하여 명시적으로 설명되지만 대안적인 구체예와 관련하여 명시적으로 언급되지 않은 경우, 특징 또는 기능이 대안적인 구체예와 호환되지 않는 것이 아닌 한 그 특징 또는 기능은 대안적인 구체예와 관련하여 전개, 활용 또는 구현될 수 있음이 이해되어야 한다.
[0024]
본원에 기재된 기술의 실행은 달리 지시되지 않는 한, 유기 화학, 중합체 기술, 분자 생물학(재조합 기술 포함), 세포 생물학, 생화학, 생물학적 에멀젼 생성 및 시퀀싱 기술의 통상적인 기술 및 설명을 사용할 수 있으며, 이는 당 분야에 종사하는 사람들의 기술 내에 있다. 이러한 통상적인 기술은 중합체 어레이 합성, 폴리뉴클레오티드의 하이브리드화 및 라이게이션, 및 표지를 사용한 하이브리드화의 검출을 포함한다. 적합한 기술의 구체적인 예시는 본원의 실시예를 참조하여 이루어질 수 있다. 그러나, 물론 다른 동등한 통상적인 절차도 사용될 수 있다. 이러한 통상적인 기술 및 설명은 문헌[Green, et al., Eds. (1999), Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (Vols. I-IV); Weiner, Gabriel, Stephens, Eds. (2007), Genetic Variation: A Laboratory Manual; Dieffenbach, Dveksler, Eds. (2003), PCR Primer: A Laboratory Manual; Bowtell and Sambrook (2003), DNA Microarrays: A Molecular Cloning Manual; Mount (2004), Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis; Sambrook and Russell (2006), Condensed Protocols from Molecular Cloning: A Laboratory Manual; and Sambrook and Russell (2002), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (all from Cold Spring Harbor Laboratory Press); Stryer, L. (1995) Biochemistry (4th Ed.) W.H. Freeman, New York N.Y.; Gait, "Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach" 1984, IRL Press, London; Nelson and Cox (2000), Lehninger, Principles of Biochemistry 3rd Ed., W. H. Freeman Pub., New York, N.Y.; Berg et al. (2002) Biochemistry, 5th Ed., W.H. Freeman Pub., New York, N.Y.; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle & Griffiths, eds., John Wiley & Sons 1998); Mammalian Chromosome Engineering - Methods and Protocols (G. Hadlaczky, ed., Humana Press 2011); Essential Stem Cell Methods, (Lanza and Klimanskaya, eds., Academic Press 2011)]과 같은 표준 실험실 매뉴얼에서 찾을 수 있으며, 이들 모두는 모든 목적을 위해 그 전체내용이 본원에 참조로 포함된다. 뉴클레아제-특이적 기술은, 예를 들어, 문헌[Genome Editing and Engineering From TALENs and CRISPRs to Molecular Surgery, Appasani and Church, 2018; and CRISPR: Methods and Protocols, Lindgren and Charpentier, 2015]에서 찾을 수 있으며; 둘 모두는 모든 목적을 위해 그 전체내용이 본원에 참조로 포함된다. 효소 공학을 위한 위한 기본 방법은 문헌[Enzyme Engineering Methods and Protocols, Samuelson, ed., 2013; Protein Engineering, Kaumaya, ed., (2012); and Kaur and Sharma, "Directed Evolution: An Approach to Engineer Enzymes", Crit. Rev. Biotechnology, 26:165-69 (2006)]에서 찾을 수 있다.
[0025]
본원 및 첨부된 청구 범위에서 사용된 단수 형태는 문맥상 명확하게 달리 지시되지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다는 점에 유의한다. 따라서, 예를 들어, "올리고뉴클레오티드"에 대한 언급은 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. "제1", "제2", "제3" 등과 같은 용어는 본원에 개시된 바와 같은 다수의 부분, 성분, 단계, 동작, 기능 및/또는 참조점 중 하나를 식별할 뿐이며, 마찬가지로 본 개시의 구체예를 임의의 특정 구성 또는 배향으로 반드시 제한하는 것은 아니다.
[0026]
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 언급된 모든 간행물은 본원에 기재된 발명과 관련하여 사용될 수 있는 장치, 방법 및 세포 집단을 설명하고 개시할 목적으로 참조로 포함된다.
[0027]
값의 범위가 제공되는 경우, 그 범위의 상한과 하한 사이의 각각의 중간 값 및 언급된 범위 내의 임의의 다른 언급된 값 또는 중간 값이 본 발명에 포함되는 것으로 이해된다. 이러한 더 작은 범위의 상한과 하한은 독립적으로 더 작은 범위에 포함될 수 있고, 언급된 범위 내에서 구체적으로 배제된 임의의 한계에 따라, 또한 본 발명 내에 포함된다. 언급된 범위가 한계 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 경우, 포함된 한계 중 하나 또는 둘 모두를 제외한 범위도 본 발명에 포함된다.
[0028]
다음의 설명에서, 본 발명의 보다 완전한 이해를 제공하기 위해 다수의 특정 세부 사항이 제시된다. 그러나, 본 발명이 이러한 특정 세부 사항 중 하나 이상 없이 실행될 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 다른 예에서, 당업자에게 잘 알려진 특징 및 절차는 본 발명을 모호하게 하는 것을 피하기 위해 설명되지 않았다.
[0029]
본원에서 사용되는 용어 "상보적"은 뉴클레오티드 사이의 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기 페어링을 지칭하고, 구체적으로 2개의 수소 결합에 의해 아데닌 잔기에 연결된 티민 또는 우라실 잔기 및 3개의 수소 결합에 의해 연결된 시토신 및 구아닌 잔기와 함께 서로 수소 결합된 뉴클레오티드를 지칭한다. 일반적으로, 핵산은 특정된 제2 뉴클레오티드 서열에 대해 "상보성 퍼센트" 또는 "상동성 퍼센트"를 갖는 것으로 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 예를 들어, 뉴클레오티드 서열은 특정된 제2 뉴클레오티드 서열에 대해 80%, 90% 또는 100% 상보성을 가질 수 있으며, 이는 서열의 10개 뉴클레오티드 중 8개, 10개 중 9개 또는 10개 중 10개가 특정된 제2 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적임을 나타낸다. 예를 들어, 뉴클레오티드 서열 3'-TCGA-5'는 뉴클레오티드 서열 5'-AGCT-3'에 대해 100% 상보적이며; 뉴클레오티드 서열 3'-TCGA-5'는 뉴클레오티드 서열 5'-TAGCTG-3'의 영역에 대해 100% 상보적이다.
[0030]
용어 DNA "조절 서열"은 수용자 세포에서 코딩 서열의 복제, 전사 및 번역을 집합적으로 제공하는 프로모터 서열, 폴리아데닐화 신호, 전사 종결 서열, 상류 조절 도메인, 복제 기점, 내부 리보솜 진입 부위, 핵 국소화 서열, 인핸서 등을 집합적으로 지칭한다. 선택된 코딩 서열이 적절한 숙주 세포에서 복제되고, 전사되고 -일부 성분의 경우- 번역될 수 있는 한 이러한 유형의 조절 서열이 모두 존재할 필요는 없다.
[0031]
본원에서 사용되는 용어 "공여자 DNA" 또는 "공여자 핵산"은 핵산 유도 뉴클레아제를 사용하는 상동성 재조합에 의해 유전자좌에 DNA 서열 변형(삽입, 결실, 치환)을 도입하도록 설계된 핵산을 지칭한다. 상동성-지시된 복구를 위해, 공여자 DNA는 "절단 부위" 또는 게놈 표적 서열에서 편집될 부위에 측접하는 영역에 대해 충분한 상동성을 가져야 한다. 상동성 아암(들)의 길이는, 예를 들어, 수행되는 변형의 유형 및 크기에 따라 달라질 것이다. 많은 경우 및 바람직하게는, 공여자 DNA는 게놈 표적 유전자좌에 대해 2개의 서열 상동성 영역(예를 들어, 2개의 상동성 아암)을 가질 것이다. 바람직하게는, "삽입" 영역 또는 "DNA 서열 변형" 영역-세포에서 게놈 표적 유전자좌에 도입하고자 하는 핵산 변형-은 2개의 상동성 영역 사이에 위치할 것이다. DNA 서열 변형은 하나의 특정 부위 또는 다수의 특정 부위에서 표적 게놈 DNA 서열의 하나 이상의 염기를 변경할 수 있다. 변경은 표적 서열의 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400 또는 500개 이상의 염기 쌍을 변경하는 것을 포함할 수 있다. 결실 또는 삽입은 표적 서열의 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400 또는 500개 이상의 염기 쌍의 결실 또는 삽입일 수 있다.
[0032]
용어 "가이드 핵산" 또는 "가이드 RNA" 또는 "gRNA"는 1) 게놈 표적 유전자좌에 하이브리드화될 수 있는 가이드 서열, 및 2) 핵산 유도 뉴클레아제와 상호작용하거나 복합체화될 수 있는 스캐폴드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다(예를 들어, 도 1 참조).
[0033]
"상동성" 또는 "동일성" 또는 "유사성"은 2개의 펩티드 사이, 또는 본 개시의 맥락에서 더욱 빈번하게 2개의 핵산 분자 사이의 서열 유사성을 지칭한다. 용어 "상동성 영역" 또는 "상동성 아암"은 표적 게놈 DNA 서열과 어느 정도의 상동성을 갖는 공여자 DNA 상의 영역을 지칭한다. 상동성은 비교를 위해 정렬될 수 있는 각각의 서열 내의 위치를 비교함으로써 결정될 수 있다. 비교된 서열 내의 위치가 동일한 염기 또는 아미노산에 의해 점유될 때, 그 분자는 그 위치에서 상동이다. 서열 간의 상동성 정도는 서열이 공유하는 일치하거나 상동인 위치의 수의 함수이다.
[0034]
"작동 가능하게 연결된"은 그렇게 설명된 성분이 이들의 일반적인 기능을 수행하도록 구성된 요소의 배열을 지칭한다. 따라서, 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 조절 서열은 코딩 서열의 전사, 및 일부 경우에, 번역에 영향을 미칠 수 있다. 조절 서열은 이들이 코딩 서열의 발현을 지시하도록 기능하는 한 코딩 서열과 인접할 필요는 없다. 따라서, 예를 들어, 개재된 아직 번역되지 않은 전사된 서열은 프로모터 서열과 코딩 서열 사이에 존재할 수 있고, 프로모터 서열은 여전히 코딩 서열에 "작동 가능하게 연결된" 것으로 간주될 수 있다. 사실상, 이러한 서열은 동일한 연속 DNA 분자(즉, 염색체)에 존재할 필요가 없으며, 여전히 상호작용을 가질 수 있어 조절이 변경될 수 있다.
[0035]
"프로모터" 또는 "프로모터 서열"은 RNA 중합효소에 결합하여 메신저 RNA, 리보솜 RNA, 소형 핵 또는 핵소체 RNA, 가이드 RNA, 또는 임의의 부류의 모든 RNA 중합효소 I, II 또는 III에 의해 전사된 임의의 종류의 RNA와 같은 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 코딩 서열의 전사를 개시할 수 있는 DNA 조절 영역이다. 프로모터는 항시적이거나 유도적일 수 있으며, 일부 구체예에서-특히 선택이 사용된 많은 구체예에서- 핵산 유도 뉴클레아제 편집 시스템의 적어도 하나의 성분의 전사는 유도적 프로모터의 제어 하에 있다.
[0036]
본원에서 사용되는 용어 "선택 가능한 마커"는 인공 선택에 적합한 형질을 부여하는, 세포로 도입된 유전자를 지칭한다. 일반적으로 사용되는 선택 가능한 마커는 당업자에게 잘 알려져 있다. 암피실린/카르베니실린, 카나마이신, 클로람페니콜, 에리트로마이신, 테트라사이클린, 겐타마이신, 블레오마이신, 스트렙토마이신, 람노스, 퓨로마이신, 하이그로마이신, 블라스티시딘 및 G418과 같은 약물 선택 가능한 마커가 사용될 수 있다. 다른 구체예에서, 선택 가능한 마커는 인간 신경 성장 인자 수용체(미국 특허 번호 6,365,373에 기재된 바와 같이, MAb로 검출됨); 트렁케이션된 인간 성장 인자 수용체(MAb로 검출됨); 돌연변이체 인간 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR; 형광 MTX 기질 이용 가능); 분비된 알칼리성 포스파타제(SEAP; 형광 기질 이용 가능); 인간 티미딜레이트 신타제(TS; 항암제 플루오로데옥시우리딘에 대한 내성 부여); 인간 글루타티온 S-트랜스퍼라제 알파(GSTA1; 글루타티온을 줄기 세포 선택적 알킬화기 부술판에 컨쥬게이션함; CD34+세포에서 화학보호 선택 가능한 마커); 조혈 줄기 세포에서 CD24 세포 표면 항원; N-포스폰아세틸-L-아스파르테이트(PALA)에 대한 내성을 부여하는 인간 CAD 유전자; 인간 다중-약물 내성-1(MDR-1; 증가된 약물 내성에 의해 선택 가능하거나 FACS에 의해 농축된 P-당단백질 표면 단백질); 인간 CD25(IL-2α; Mab-FITC에 의해 검출 가능); 메틸구아닌-DNA 메틸트랜스퍼라제(MGMT; 카르무스틴에 의해 선택 가능); 및 시티딘 데아미나제(CD; Ara-C에 의해 선택 가능)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본원에서 사용되는 "선택적 배지"는 선택 가능한 마커에 대해 또는 이에 반해 선택되는 화학적 화합물 또는 생물학적 모이어티가 첨가된 세포 성장 배지를 지칭한다.
[0037]
용어 "표적 게놈 DNA 서열", "표적 서열" 또는 "게놈 표적 유전자좌"는 시험관 내 또는 생체 내, 또는 세포 또는 세포 집단의 핵산(예를 들어, 게놈) 내의 임의의 유전자좌를 지칭하며, 여기서 핵산 유도 뉴클레아제 편집 시스템을 사용한 적어도 하나의 뉴클레오티드의 변경이 요구된다. 표적 서열은 게놈 유전자좌 또는 염색체 외 유전자좌일 수 있다.
[0038]
"벡터"는 세포로 전달되고/되거나 세포에서 발현될 원하는 서열 또는 서열들을 포함하는 임의의 다양한 핵산이다. 벡터는 전형적으로 DNA로 구성되지만, RNA 벡터도 사용할 수 있다. 벡터는 플라스미드, 포스미드, 파지미드, 바이러스 게놈, 합성 염색체 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본원에서 사용되는 어구 "엔진 벡터"는 본 개시의 핵산 유도 뉴클레아제 시스템 및 방법에 사용되는 뉴클레아제에 대한 코딩 서열을 포함한다. 엔진 벡터는 또한 박테리아 시스템에서 λ Red 재조합 시스템 또는 이와 동등한 것을 포함할 수 있다. 엔진 벡터는 또한 전형적으로 선택 가능한 마커를 포함한다. 본원에서 사용되는 어구 "편집 벡터"는 선택적으로 편집이 일어난 후 표적 서열에서 PAM 또는 스페이서에서 뉴클레아제 결합을 방지하는 표적 서열에 대한 변경을 포함하는 공여자 핵산, 및 gRNA에 대한 코딩 서열을 포함한다. 편집 벡터는 또한 선택 가능한 마커 및/또는 바코드를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 엔진 벡터 및 편집 벡터는 조합될 수 있다; 즉, 엔진 벡터의 내용은 편집 벡터에서 찾을 수 있다. 추가로, 엔진 및 편집 벡터는, 예를 들어, 뉴클레아제 코딩 서열, 재조합 시스템 코딩 서열(존재하는 경우), 공여자 핵산, 가이드 핵산 및 선택 가능한 마커(들)에 작동 가능하게 연결된 조절 서열을 포함한다.
핵산 유도 뉴클레아제 게놈 시스템에서의 편집
[0039]
RNA 유도 뉴클레아제(RGN)는 원핵 생물과 진핵 생물의 게놈 공학을 위한 기초 도구가 되었다. 클러스터링된 빠른 간격으로 배치된 짧은 회문 반복(CRISPR) 시스템은 이동성 유전 요소(MGE)로부터 원핵 생물을 보호하는 적응형 면역 시스템이다. RGN은 MGE를 식별하고 파괴하기 때문에 이 방어 시스템의 주요 부분이다. RGN을 특정 표적 DNA로 유도하는 CRISPR RNA(crRNA)를 재프로그래밍함으로써 다양한 유기체에서 게놈 편집을 위해 RGN을 용도 변경시킬 수 있다. 현재까지 다양한 적용에 대해 다수의 상이한 RGN이 확인되었다; 그러나, 특정 적용에 대해 일부 RGN을 다른 것보다 더 바람직하게 만드는 다양한 특성이 있다. RGN은 특정 이중 가닥 파손(DSB), DNA의 한 가닥의 특정 닉을 생성하기 위해 사용되거나, 다른 모이어티를 특정 DNA 서열로 유도할 수 있다.
[0040]
임의의 게놈 서열을 특이적으로 표적화하는 RGN의 능력은 아마도 RGN의 가장 바람직한 특징이다; 그러나, RGN은 표적 DNA가 모든 RGN에 특이적인 PAM(프로토스페이서 인접 모티프)이라고 하는 짧은 모티프를 또한 함유하는 경우에만 원하는 표적에 접근할 수 있다. MAD7, AsCas12a 및 LbCas12a와 같은 타입 V RGN은 5' 말단에 YTTN/TTTN을 함유하는 DNA 표적에 접근하는 경향이 있는 반면, 타입 II RGN은 3' 말단에 특정 짧은 모티프를 포함하는 DNA 서열을 표적으로 한다. 타입 II RGN에 대해 당 분야에 잘 알려진 예는 표적 DNA의 3' 말단에 NGG를 필요로 하는 SpCas9이다. 타입 II RGN은 타입 V RGN에 비해 실질적으로 다른 도메인 아키텍처를 갖는다. 추가로, 타입 II RGN은 또한 최적의 기능을 위해 crRNA에 추가하여 트랜스활성화 RNA(tracrRNA)를 필요로 한다. 타입 V RGN과 비교하여, 타입 II RGN은 PAM 서열에 더 가까운 이중 가닥 파손을 생성하며, 이는 정확한 게놈 편집 적용에 매우 바람직하다.
[0041]
지금까지 다수의 타입 II RGN이 발견되었다; 그러나, 광범위한 응용 분야에서의 사용은 제한적인 PAM에 의해 제한된다. 예를 들어, SpCas9의 PAM은 게놈의 AT-농축 영역에서 덜 자주 발생한다. 새롭고 덜 제한적인 PAM을 갖는 새로운 RGN이 현장에서 유리하다. 또한, 모든 타입 II 뉴클레아제가 여러 유기체에서 활성인 것은 아니다. 예를 들어, 다수의 RGN이 과학 문헌에서 논의되었지만, 단지 소수만이 시험관 내에서 활성인 것으로 입증되었고 더 소수가 세포, 특히 포유동물 세포에서 여전히 활성이다. 본 개시는 신규한 PAM을 갖고 포유동물 세포에서 활성인 다수의 RGN을 확인한다.
[0042]
핵산 유도 뉴클레아제 편집을 수행할 때, 채굴된 MAD-시리즈 뉴클레아제 또는 RGN은 편집되는 세포에 폴리펩티드로서 전달될 수 있다; 대안적으로, 채굴된 MAD-시리즈 뉴클레아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 편집되는 세포로 형질전환되거나 트랜스펙션된다. 채굴된 MAD-시리즈 뉴클레아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 고세균, 원핵 또는 진핵 세포와 같은 특정 세포에서의 발현을 위해 최적화된 코돈일 수 있다. 진핵 세포는 효모, 진균, 조류, 식물, 동물 또는 인간 세포일 수 있다. 진핵 세포는 인간, 마우스, 래트, 토끼, 개, 또는 비인간 영장류를 포함하는 비인간 포유동물을 포함하나 이에 제한되지 않는 포유동물과 같은 특정 유기체의 세포이거나 그로부터 유래될 수 있다. 사용되는 채굴된 MAD-시리즈 뉴클레아제의 선택은 표적 서열에서 어떤 유형의 편집이 이루어져야 하고 적절한 PAM이 원하는 표적 서열에 가깝게 위치하는지와 같은 많은 요인에 따라 달라진다. 채굴된 MAD-시리즈 뉴클레아제는 벡터(예를 들어, 엔진 벡터) 상의 DNA 서열에 의해 인코딩될 수 있고 항시적 또는 유도적 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다. 일부 구체예에서, 뉴클레아제를 인코딩하는 서열은 유도적 프로모터의 제어 하에 있고, 유도적 프로모터는 가이드 핵산의 전사를 제어하는 유도적 프로모터와는 별개이지만 동일할 수 있다; 즉, 별도의 유도적 프로모터가 뉴클레아제의 전사를 구동하고 핵산 서열을 유도할 수 있지만 2개의 유도적 프로모터는 동일한 유형의 유도적 프로모터일 수 있다(예를 들어, 둘 모두가 pL 프로모터임). 대안적으로, 뉴클레아제의 발현을 제어하는 유도적 프로모터는 가이드 핵산의 전사를 제어하는 유도적 프로모터와 상이할 수 있다; 즉, 예를 들어, 뉴클레아제는 pBAD 유도적 프로모터의 제어 하에 있을 수 있고, 가이드 핵산은 pL 유도적 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다.
[0043]
일반적으로, 가이드 핵산(예를 들어, gRNA)은 호환 가능한 핵산 유도 뉴클레아제와 복합체를 형성한 다음 표적 서열과 하이브리드화될 수 있으며, 이에 의해 뉴클레아제를 표적 서열로 보낼 수 있다. 본원에 기재된 MAD-시리즈 효소와 함께, 핵산 유도 뉴클레아제 편집 시스템은 조합하여 가이드 핵산으로서 기능하는 2개의 개별 가이드 핵산 성분을 사용한다; 즉, CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스활성화 CRISPR RNA(tracrRNA). gRNA는 플라스미드, 선형 작제물과 같은 폴리뉴클레오티드 분자 상의 DNA 서열에 의해 인코딩될 수 있거나, 코딩 서열은 편집 카세트 내에 존재할 수 있고 항시적 프로모터, 또는 일부 구체예에서, 아래에 설명된 대로 유도적 프로모터의 제어 하에 있다.
[0044]
가이드 핵산은 표적 서열과 하이브리화되고 표적 서열에 대한 복합체화된 핵산 유도 뉴클레아제의 서열-특이적 결합을 지시하기에 충분한 표적 서열과의 상보성을 갖는 가이드 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 적합한 정렬 알고리즘을 사용하여 최적으로 정렬될 때 가이드 서열과 상응하는 표적 서열 사이의 상보성의 정도는 약 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99% 이상이거나 이를 초과한다. 최적의 정렬은 서열을 정렬하기 위한 임의의 적합한 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다. 일부 구체예에서, 가이드 서열은 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75개 이상의 뉴클레오티드 길이이거나 이를 초과한다. 일부 구체예에서, 가이드 서열은 약 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20개 미만의 뉴클레오티드 길이이다. 바람직하게는 가이드 서열은 10-30개 또는 15-20개의 뉴클레오티드 길이, 또는 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 길이이다.
[0045]
본 발명의 방법 및 조성물에서, 가이드 핵산의 성분은 플라스미드 또는 벡터로부터 발현되는 서열로서 제공되며, 프로모터, 및 일부 구체예에서, 유도적 프로모터의 제어 하에 단일 전사체로서 가이드 서열 및 스캐폴드 서열 둘 모두를 포함한다. 일반적으로, 표적 서열에서 편집물을 생성하기 위해, gRNA/뉴클레아제 복합체는 가이드 RNA에 의해 결정된 대로 표적 서열에 결합하고, 뉴클레아제는 표적 서열에 인접한 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열을 인식한다. 표적 서열은 원핵 또는 진핵 세포에 대해 내인성 또는 외인성이거나, 시험관 내 임의의 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 예를 들어, 표적 서열은 진핵 세포의 핵에 존재하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 표적 서열은 유전자 생성물(예를 들어, 단백질) 또는 비코딩 서열(예를 들어, 조절 폴리뉴클레오티드, 인트론, PAM 또는 "정크" DNA)을 인코딩하는 서열일 수 있다.
[0046]
가이드 핵산은 공여자 핵산을 인코딩하는 편집 카세트의 일부일 수 있다. 대안적으로, 가이드 핵산은 편집 카세트의 일부가 아닐 수 있고 대신 엔진 또는 편집 벡터 백본에서 인코딩될 수 있다. 예를 들어, 가이드 핵산을 코딩하는 서열은 먼저 벡터 백본에 조립되거나 삽입된 다음, 예를 들어, 편집 카세트에 공여자 핵산을 삽입할 수 있다. 다른 경우에, 예를 들어, 편집 카세트 내의 공여자 핵산은 먼저 벡터 백본에 삽입되거나 조립될 수 있으며, 이어서 가이드 핵산을 코딩하는 서열이 삽입될 수 있다. 또 다른 경우에, 가이드 핵산 및 공여자 핵산(예를 들어, 편집 카세트에 삽입됨)을 인코딩하는 서열은 동시에 그러나 별도로 벡터에 삽입되거나 조립된다. 또 다른 구체예에서, 가이드 핵산을 인코딩하는 서열 및 공여자 핵산을 인코딩하는 서열 둘 모두는 편집 카세트에 포함된다.
[0047]
표적 서열은 gRNA/뉴클레아제 복합체에 의해 인식되는 짧은 뉴클레오티드 서열인 PAM과 관련된다. 상이한 핵산 유도 뉴클레아제에 대한 정확한 PAM 서열 및 길이 요건은 다양하다; 그러나, PAM은 전형적으로 표적 서열에 인접하거나 근접한 2-7개의 염기 쌍 서열이고, 뉴클레아제에 따라, 표적 서열에 대해 5' 또는 3'일 수 있다. 핵산 유도 뉴클레아제의 PAM-상호작용 도메인의 공학처리는 PAM 특이성의 변경을 허용하거나, 충실도를 개선하거나, 충실도를 감소시킬 수 있다. 특정 구체예에서, 표적 서열의 게놈 편집 둘 모두는 표적 서열, 예를 들어, 세포의 게놈 DNA에 원하는 DNA 변화를 도입하고, 표적 서열에서 프로토스페이서 돌연변이(PAM) 영역을 제거, 돌연변이 또는 불활성화시키는 것을 포함한다. 표적 서열에서 PAM을 불활성화시키는 것은, 예를 들어, 후속 편집 라운드에서 합성 가이드 핵산과 복합체화된 핵산 유도 뉴클레아제에 대한 후속 노출시, 그 표적 서열에서 세포 게놈의 추가 편집을 배제한다. 따라서, 원하는 표적 서열 편집 및 변경된 PAM을 갖는 세포는 표적 서열에 상보적인 합성 가이드 핵산과 복합체화된 핵산 유도 뉴클레아제를 사용하여 선택될 수 있다. 첫 번째 편집 이벤트를 겪지 않은 세포는 절단되어 이중 가닥 DNA 파손을 일으키므로, 계속 생존할 수 없을 것이다. 원하는 표적 서열 편집 및 PAM 변경을 함유하는 세포는 절단되지 않을 것인데, 그 이유는 이러한 편집된 세포가 더 이상 필요한 PAM 부위를 함유하지 않기 때문이며 계속 성장하고 증식할 것이다.
[0048]
앞서 언급된 바와 같이, 핵산 유도 뉴클레아제가 인식할 수 있는 표적 서열의 범위는 특정 PAM이 원하는 표적 서열 근처에 위치해야 하는 필요성에 의해 제한된다. 결과적으로, 게놈 편집에 필요한 정밀도로 편집 대상을 지정하는 것이 종종 어려울 수 있다. 뉴클레아제는 일부 PAM을 매우 잘 인식하고(예를 들어, 전형 PAM) 다른 PAM을 덜 잘 인식하거나 불량하게(예를 들어, 비전형 PAM) 인식할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 본원에 개시된 채굴된 MAD-시리즈 뉴클레아제는 상이한 PAM을 인식할 수 있기 때문에, 채굴된 MAD-시리즈 뉴클레아제는 편집을 위해 표적화될 수 있는 표적 서열의 수를 증가시킨다; 즉, 채굴된 MAD-시리즈 뉴클레아제는 게놈에서 "PAM 사막"의 영역을 감소시킨다. 따라서, 채굴된 MAD-시리즈 뉴클레아제는 인식되는 PAM 서열의 수(다양성)를 증가시킴으로써 편집될 수 있는 표적 서열의 범위를 확장시킨다. 더욱이, 채굴된 MAD-시리즈 뉴클레아제의 칵테일은 여러 상이한 PAM에 인접한 표적 서열이 단일 편집 실행에서 편집될 수 있도록 세포에 전달될 수 있다.
[0049]
핵산 유도 뉴클레아제 시스템의 또 다른 성분은 공여자 핵산이다. 일부 구체예에서, 공여자 핵산은 가이드 핵산과 동일한 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 편집 벡터 또는 편집 카세트) 상에 있고 가이드 핵산과 동일한 프로모터(예를 들어, 가이드 핵산 및 공여자 핵산 둘 모두의 전사를 구동시키는 단일 프로모터)의 제어 하에 있을 수 있다(필수적인 것은 아님). 이 유형의 카세트에 대해서는 USPN 10,240,167; 10,266,849; 9,982,278; 10,351,877; 10,364,442; 10,435,715; 및 10,465,207을 참조한다. 공여자 핵산은 gRNA/뉴클레아제 복합체의 일부로서 핵산 유도 뉴클레아제에 의해 닉킹되거나 절단된 표적 서열과의 상동성 재조합을 위한 주형으로서 작용하도록 설계된다. 공여자 핵산 폴리뉴클레오티드는 약 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 500 또는 1000개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 길이와 같은 임의의 적합한 길이일 수 있다. 특정 바람직한 양태에서, 공여자 핵산은 20-300개의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 50-250개의 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드로서 제공될 수 있다. 공여자 핵산은 표적 서열의 일부에 상보적인 영역(예를 들어, 상동성 아암)을 포함한다. 최적으로 정렬될 때, 공여자 핵산은, 예를 들어, 약 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90개 이상의 뉴클레오티드만큼 표적 서열과 중첩된다(상보적이다). 많은 구체예에서, 공여자 핵산은 공여자 핵산과 표적 주형 사이의 돌연변이 또는 차이에 측접한 2개의 상동성 아암(표적 서열에 상보적인 영역)을 포함한다. 공여자 핵산은 표적 서열과 비교하여 적어도 하나의 돌연변이 또는 변경, 예를 들어, 표적 서열과 비교하여 삽입, 결실, 변형 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
[0050]
종종 공여자 핵산은 벡터 백본에 삽입되는 편집 카세트로서 제공되며, 여기서 벡터 백본은 gRNA의 전사를 구동하는 프로모터 및 gRNA의 코딩 서열을 포함할 수 있거나, 벡터 백본은 gRNA 자체가 아닌 gRNA의 전사를 구동하는 프로모터를 포함할 수 있다. 더욱이, 엔진 벡터에 삽입된 하나 초과, 예를 들어, 2개, 3개, 4개 이상의 가이드 핵산/공여자 핵산 카세트가 있을 수 있으며, 여기서 각 가이드 핵산은 별개의 상이한 프로모터, 별개의 유사한 프로모터의 제어 하에 있거나, 모든 가이드 핵산/공여자 핵산 쌍은 단일 프로모터의 제어 하에 있다. 일부 구체예에서, gRNA 및 공여자 핵산의 전사를 구동하는(또는 하나 초과의 gRNA/공여자 핵산 쌍을 구동하는) 프로모터는 유도적 프로모터이다. 유도적 편집은 편집이 시작되기 전에 콜로니를 확립하기 위해 분리된 세포가 수배 내지 많은 세포 배가 동안 성장할 수 있다는 점에서 유리하며, 이는 활성 편집에 의해 야기되는 이중 가닥 절단이 세포에 크게 독성을 나타내기 때문에 편집된 세포가 생존할 가능성을 증가시킨다. 이러한 독성은 편집된 콜로니에서 세포 사멸을 초래할 뿐만 아니라, 생존하지만 편집 후 복구 및 회복되어야 하는 편집된 세포에 대한 성장 지연을 야기한다. 그러나, 일단 편집된 세포가 회복될 기회를 가지면, 편집된 세포의 콜로니의 크기는 결국 편집되지 않은 세포의 콜로니의 크기를 따라 잡을 것이다. 예를 들어, 문헌[USPNs 10,533,152; 10,550,363; 10,532,324; and USSNs 16/597,826, filed 09 October 2019; 16/597,831, filed 09 October 2019; 16/693,630, filed 25 November 2019; 16/687,640, filed 18 November 2019; 및 16/686,066, filed 15 November 2019]을 참조한다. 또한, 가이드 핵산은 편집 카세트에서 하나 초과의 공여자 핵산의 편집을 지시하는데 효과적일 수 있다; 예를 들어, 원하는 편집이 표적 서열에서 서로 가까운 경우.
[0051]
공여자 핵산에 추가하여, 편집 카세트는 하나 이상의 프라이머 부위를 포함할 수 있다. 프라이머 부위는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 편집 카세트를 증폭시키는데 사용될 수 있다; 예를 들어, 프라이머 부위가 편집 카세트의 다른 성분 중 하나 이상에 측접하는 경우.
[0052]
또한, 편집 카세트는 바코드를 포함할 수 있다. 바코드는 바코드로부터 상응하는 표적 서열에 대한 편집을 확인할 수 있는 공여자 DNA 서열에 상응하는 고유한 DNA 서열이다. 바코드는 일반적으로 4개 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 편집 카세트는, 예를 들어, 유전자 전체 또는 게놈 전체의 공여자 핵산 라이브러리를 나타내는 공여자 핵산의 집합체를 포함한다. 편집 카세트의 라이브러리는, 예를 들어, 각각의 상이한 공여자 핵산이 상이한 바코드와 연관된 벡터 백본으로 클로닝된다.
[0053]
추가로, 일부 구체예에서, 핵산 유도 뉴클레아제 시스템의 성분을 인코딩하는 발현 벡터 또는 카세트는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상 또는 그 초과의 핵 국소화 서열(NLS)과 같은 하나 이상의 NLS를 추가로 인코딩한다. 일부 구체예에서, 뉴클레아제는 채굴된 MAD-시리즈 RGN의 아미노-말단 또는 그 부근의 NLS, 채굴된 MAD-시리즈 RGN의 카르복시-말단 또는 그 부근의 NLS, 또는 조합을 포함한다.
[0054]
엔진 및 편집 벡터는 전사될 성분 서열에 작동 가능하게 연결된 조절 서열을 포함한다. 상기 언급된 바와 같이, 채굴된 MAD-시리즈 뉴클레아제 편집 시스템의 하나 이상의 성분의 전사를 구동하는 프로모터는 유도적일 수 있고, 선택이 수행되어야 하는 경우 유도적 시스템이 사용될 가능성이 있다. 포유동물 세포를 포함하는 식물, 미생물 및 동물 세포에서 유전자의 제어된 발현을 위한 pL 프로모터(CI857 리프레서의 열 불활성화에 의해 유도됨), pBAD 프로모터(세포 성장 배지에 대한 아라비노스의 첨가에 의해 유도됨) 및 람노스 유도적 프로모터(세포 성장 배지에 대한 람노스의 첨가에 의해 유도됨)를 포함하는 다수의 유전자 조절 제어 시스템이 개발되었다. 다른 시스템은 테트라사이클린-제어 전사 활성화 시스템(Tet-On/Tet-Off, Clontech, Inc. (Palo Alto, CA); Bujard and Gossen, PNAS, 89(12):5547-5551 (1992)), Lac 스위치 유도적 시스템(Wyborski et al., Environ Mol Mutagen, 28(4):447-58 (1996); DuCoeur et al., Strategies 5(3):70-72 (1992); U.S. Patent No. 4,833,080), 엑디손-유도적 유전자 발현 시스템(No et al., PNAS, 93(8):3346-3351 (1996)), 쿠메이트 유전자-스위치 시스템(Mullick et al., BMC Biotechnology, 6:43 (2006)), 및 타목시펜-유도적 유전자 발현(Zhang et al., Nucleic Acids Research, 24:543-548 (1996))뿐만 아니라 다른 것들을 포함한다.
[0055]
전형적으로, 살아있는 세포에서 게놈 편집을 수행하는 것은 핵산 유도 뉴클레아제 편집을 수행하는데 필요한 성분으로 세포를 형질전환시키는 것을 수반한다. 예를 들어, 세포는 별도의 엔진 및 편집 벡터로 동시에 형질전환될 수 있다; 세포는 이미 채굴된 MAD-시리즈 뉴클레아제를 발현하고 있을 수 있어서(예를 들어, 세포는 이미 엔진 벡터로 형질전환되었거나 채굴된 MAD-시리즈 뉴클레아제에 대한 코딩 서열은 세포 게놈에 안정적으로 통합될 수 있음) 편집 벡터만이 세포로 형질전환될 필요가 있거나; 세포는 핵산 유도 뉴클레아제 게놈 편집을 수행하는데 필요한 모든 성분을 포함하는 단일 벡터로 형질전환될 수 있다.
[0056]
다양한 전달 시스템을 사용하여 핵산 유도 뉴클레아제 편집 시스템 성분을 숙주 세포에 도입(예를 들어, 형질전환 또는 트랜스펙션)시킬 수 있다. 이러한 전달 시스템은 효모 시스템, 리포펙션 시스템, 미세주사 시스템, 생물학적 시스템, 바이로솜, 리포솜, 면역리포솜, 폴리양이온, 지질:핵산 컨쥬게이트, 비리온, 인공 비리온, 바이러스 벡터, 전기천공, 세포 투과성 펩티드, 나노입자, 나노와이어, 엑소솜의 사용을 포함한다. 대안적으로, 분자 트로이 목마 리포솜은 혈액 뇌 장벽을 통해 핵산 유도 뉴클레아제 성분을 전달하는데 사용될 수 있다. 특히, 예를 들어, USPN 10,435,713; 10,443,074; 10,323,258; 및 10,415,058에 기재된 바와 같은 전기천공, 특히 유동-통과 전기천공(독립형 기기로서 또는 자동화된 다중 모듈 시스템의 모듈로서)의 사용이 흥미롭다.
[0057]
핵산 유도 뉴클레아제 편집을 수행하는데 필요한 성분으로 세포를 형질전환시킨 후, 세포를 편집을 촉진하는 조건 하에 배양한다. 예를 들어, 항시적 프로모터가 채굴된 MAD-시리즈 뉴클레아제 및/또는 gRNA의 전사를 구동하는데 사용되는 경우, 형질전환된 세포는 전형적인 조건(예를 들어, 온도, CO2 분위기 등)에서 전형적인 배양 배지에서 배양만 하면 된다. 대안적으로, 편집이 유도적인 경우-예를 들어, 핵산 유도 뉴클레아제 편집에 필요한 하나 이상의 성분의 전사, 예를 들어, gRNA, 공여자 DNA, 뉴클레아제, 또는 박테리아의 경우, 재조합 시스템의 전사를 제어하는 유도적 프로모터를 활성화함으로써-세포는 유도 조건에 노출된다.
실시예
[0058]
하기 실시예는 본 발명을 제조하고 사용하는 방법에 대한 완전한 개시 및 설명을 당업자에게 제공하기 위해 제시된 것이고, 본 발명자들이 그들의 발명으로 간주하는 범위를 제한하려는 의도이거나 아래의 실험이 수행된 실험의 전부 또는 유일한 실험임을 나타내거나 암시하려는 의도가 아니다. 당업자는 광범위하게 기술된 바와 같은 본 발명의 사상 또는 범위를 벗어나지 않으며 특정 양태에 제시된 바와 같이 본 발명에 대해 다양한 변형 및/또는 수정이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 본 양태는 모든 측면에서 제한적이지 않고 예시적인 것으로 간주되어야 한다.
실시예 1: 예시적인 워크플로우 개요
[0059]
도 1은 채굴된 MAD-시리즈 효소의 생성 및 시험관 내 스크리닝을 위한 예시적인 워크플로우(100)를 보여준다. 제1 단계(101)에서, 벡터를 제조하고 클로닝하여 채굴된 MAD-시리즈 RGN에 대한 코딩 서열이 삽입되는 주형 벡터를 만들었다. 다른 단계(103)에서, 예를 들어, 서열, 잠재적 PAM 및 활성 가능성에 기초하여 관심 추정 RGN을 확인하기 위해 메타게놈 채굴을 수행하였다. 관심 추정 RGN이 인 실리코 확인되면, 카세트를 작제하고(105) 벡터 백본으로 클로닝한 다음 세포로 형질전환하여, 채굴된 MAD-시리즈 RGN의 라이브러리를 생성하였다. 채굴된 MAD-시리즈 RGN으로 형질전환된 세포를 저장을 위해 96-웰 플레이트에 배열시켰다(107).
[0060]
단계(109)에서, 각 웰로부터 세포의 분취량을 취하고, 채굴된 MAD-시리즈 RGN을 각 분취량으로부터 증폭시켰다. 동시에, gRNA 라이브러리를 각각의 채굴된 MAD-시리즈 RGN에 대해 증폭시켰다(110). 단계(111)에서, gRNA 라이브러리를 발현하는 증폭된 PCR 단편을 증폭된 채굴된 MAD-시리즈 RGN과 조합하여 시험관 내 전사 및 번역을 수행하여 활성 리보뉴클레아제 단백질 복합체를 만들었다(113). 각각의 채굴된 MAD-시리즈 RGN에 대한 표적 고갈을 시험하기 위해(117) 합성 표적 라이브러리를 작제하였다(115). 표적 고갈 후, 차세대 시퀀싱을 사용한 분석을 위해 앰플리콘을 생산하고(119) 표적 고갈을 결정하기 위해 시퀀싱 데이터 분석을 수행하였다(121).
실시예 2: 메타게놈 채굴
[0061]
Genbank Bioproject 수탁 번호 PRJNA348753, PRJNA385857, PRJNA432584 및 PRJNA434545를 포함하는 다양한 공급원의 메타게놈-조립된 게놈(MAG)을 사용하여 HMMER 은닉 마르코프 모델 검색을 사용하여 신규한 추정 CRISPR 뉴클레아제를 검색하였다. 수백 개의 잠재적인 뉴클레아제가 확인되었다. 도 2는 발견된 신규한 RGN을 보여주며, 단백질 크기 대 HMMER 검색 점수를 플롯팅한다. 뉴클레아제가 존재하는 각 MAG에 대해, 추정 CRISPR 어레이를 확인하고 스페이서 서열을 추출하였다. 이러한 스페이서는 이후 JGI IMG/VR 바이러스 메타게놈 데이터베이스(Paez-Espino et al, Nucleic Acids Res. 2017 Jan 4;45(D1):D457-D465)를 검색하고 스페이서 히트에 인접한 바이러스 서열에 기반한 추정 PAM 서열을 예측하기 위한 쿼리로 사용되었다. 서열, 잠재적 PAM, 및 뉴클레아제가 활성일 가능성이 있다는 확신에 기초하여, 시험관 내 검증을 위한 13개의 뉴클레아제가 확인되었다(표 1). 13개의 뉴클레아제 각각의 서열은 표 2에 제시되어 있다.
표 1
표 2
실시예 3: 벡터 클로닝, MAD-시리즈 RGN 라이브러리 작제 및 PCR
[0062]
채굴된 MAD-시리즈 RGN 코딩 서열을 코딩 서열의 5'-말단에 부착된 T7-프로모터 서열 및 코딩 서열의 3-말단에 부착된 T7-종결자 서열을 갖는 pUC57 벡터로 클로닝하였다. 100 ng의 플라스미드 혼합물을 E. cloni® SUPREME 전기적격 솔로 세포(Lucigen, Middleton, WI)로 형질전환시켰다. 세포를 진탕 인큐베이터에서 1시간 동안 37℃에서 5 mL의 회수 배지에서 회수한 후, 1 mL의 50% 글리세롤을 첨가하고 세포를 100 μL 분취량으로서 -80℃에서 저장하였다.
[0063]
저장된 세포를 포스페이트 완충 염수에서 희석하고 100 μg/mL의 카르베니실린을 갖는 LB 한천 플레이트에 스프레딩하였다. 이후 세포를 인큐베이터에서 37℃에서 밤새 성장시켰다. 콜로니를 취하여 96-웰 배양 블록에서 1 mL의 LB 배지(100 μg/mL의 카르베니실린)에 접종하였다. 배양물을 37℃의 진탕 인큐베이터에서 밤새 성장시켰다. 다음으로, 1 μL의 세포를 500 μL의 PCR 등급 수로 희석하고, 희석된 배양물의 25 μl 분취량을 열 사이클러를 사용하여 95℃에서 5분 동안 비등시켰다. 세포를 사용하여 상이한 채굴된 MAD-시리즈 RGN 코딩 서열을 PCR 증폭시켰다. 나머지 배양물은 10% v/v 농도의 글리세롤을 첨가하여 -80℃에서 저장하였다.
[0064]
먼저, Q5 Hot Start 2x 마스터 믹스 시약(NEB, Ipswich, MA)을 사용하여 채굴된 MAD-시리즈 RGN 주형의 공급원으로서 비등 세포를 사용하여 채굴된 MAD-시리즈 RGN 서열을 증폭시켰다. 정방향 프라이머 5'-TTGGGTAACGCCAGGGTTTT[SEQ ID No. 49] 및 역방향 프라이머 5'-TGTGTGGAATTGTGAGCGGA[SEQ ID No. 50]는 각각 채굴된 MAD 시리즈 RGN의 5'- 및 3'-말단에 T7-프로모터 및 T7-종결자 성분을 포함하는 pUC57 벡터에서 채굴된 MAD-시리즈 RGN에 측접한 서열을 증폭시켰다. 1 μM 프라이머는 96 웰 PCR 플레이트에서 주형으로서 3.3 μL 비등 세포 샘플을 사용한 10 μL PCR 반응에 사용되었다. 표 3에 제시된 PCR 조건이 사용되었다:
표 3:
실시예 4: gRNA 라이브러리 작제
[0065]
RGN이 기능하기 위해 다중 RNA가 필요할 수 있고 전사된 RNA의 길이 또한 매우 가변적일 수 있기 때문에 각 RGN과 관련된 기능성 gRNA는 예측하기 어려울 수 있다. 따라서, 각 RGN에 대해 384-구성원 gRNA 라이브러리가 생성되었다. gRNA는 가변 스페이서 서열, CRISPR 반복 서열, 링커 서열 및 tracrRNA 서열로 구성되었다. 도 3은 채굴된 MAD-시리즈 RGN에 대한 gRNA 설계의 개략도이다. tracrRNA는 항-반복 서열을 식별함으로써 발견되었다. crRNA는 GAAA 링커를 사용하여 tracrRNA에 공유적으로 연결되었다. 초기 gRNA 설계는 5' 영역, 3' 영역 및 반복/항-반복 이중체를 트렁케이션하여 gRNA의 라이브러리를 생성함으로써 최적화되었다. 최적의 gRNA 길이를 찾기 위해, 상이한 길이의 스페이서, 반복:항-반복 이중체 및 tracrRNA의 3' 말단이 포함되었다. 라이브러리는 또한 gRNA의 전체 길이를 기준으로 6개의 풀로 세분화되었다. 이를 통해 뉴클레아제 활성에 최적인 가장 짧은 gRNA를 식별할 수 있었다. 이후 이러한 gRNA는 T7 프로모터의 하류에 클로닝되었다.
[0066]
표적 라이브러리는 이들 뉴클레아제의 PAM이 3' 말단에 존재할 것이라는 가정에 기초하여 설계되었다. 상이한 GC 함량을 갖는 2개의 인공 프로토스페이서가 선택되었다. PAM 서열은 3-7개 또는 3-10개 범위의 뉴클레오티드 길이일 수 있으므로, 각 프로토스페이서에 대해 3개의 상이한 PAM 표적 라이브러리를 제조하였다. 라이브러리 1은 PAM NNNNATGC를 함유하였고; 라이브러리 2는 PAM ATNNNNGC로 구성되었고; 라이브러리 3은 PAM ATGCNNNN을 함유하였다. 슬라이딩 PAM 라이브러리는 4 nt 내지 8 nt 범위의 PAM이 포획되도록 한다. 표적 라이브러리를 절단되지 않은 표적의 차세대 시퀀싱에 필요한 이러한 서열을 함유하는 표적 플라스미드로 클로닝하였다.
실시예 5: MAD-시리즈 뉴클레아제 및 gRNA의 생산을 위한 시험관 내 전사 및 번역
[0067]
MAD-시리즈 RGN은 시험관 내 전사 및 번역(txtl)에 의해 활성에 대해 시험되었다. gRNA 플라스미드 및 뉴클레아제 플라스미드 둘 모두가 각각의 txtl 반응에 포함되었다. PURExpress® 시험관 내 단백질 합성 키트(NEB, Ipswich, MA)를 사용하여 PCR-증폭된 MAD-시리즈 RGN 라이브러리로부터 채굴된 MAD-시리즈 RGN을 생산하고 또한 gRNA 라이브러리를 생산하였다. 96-웰 플레이트의 각 웰에서, 표 4에 나열된 시약을 혼합하여 채굴된 MAD-시리즈 RGN 및 gRNA의 생산을 시작하였다:
표 4:
[0068]
PCR-증폭된 T7-MAD-시리즈 RGN을 제외하고 모든 시약과 함께 마스터 믹스를 얼음에서 혼합하여 검정을 위해 충분한 96-웰 플레이트를 덮었다. 7.3 μL의 마스터 믹스를 96 웰 플레이트의 각 웰에 분배한 후, T7 프로모터의 제어 하에 1 μL의 PCR 증폭된 MAD-시리즈 RGN을 첨가하였다. 96-웰 플레이트를 밀봉하고 열 사이클러에서 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 표적 고갈 반응을 수행하기 위해 표적 풀이 첨가될 때까지 플레이트를 실온에서 유지하였다.
[0069]
채굴된 MAD-시리즈 RGN 및 gRNA의 생산을 허용하기 위해 4시간 인큐베이션한 후, 4 μL의 표적 라이브러리 풀(10 ng/μL)을 시험관 내 전사/번역 반응 혼합물에 첨가하고 37℃에서 30분, 3시간 또는 밤새 고갈되도록 하였다. 표적 고갈 반응 혼합물을 RNAse A를 함유하는 PCR-등급 수로 희석한 다음 95℃에서 5분 동안 비등시켰다. 이후 혼합물을 증폭시키고 시퀀싱하였다. PCR 조건은 표 5에 제시되어 있다:
표 5
실시예 5: 결과
[0070]
NNNNATGC, ATNNNGC 및 ATGCNNNN PAM을 함유하는 3개의 표적 풀에서 스크린이 수행되었다. 도 4는 시험관 내에서 측정된 NNNNATGC 3' PAM을 함유하는 표적에 대한 MAD2001의 고갈 지도를 보여준다; 도 5는 시험관 내에서 측정된 NNNNATGC 3' PAM(상부) 및 ATNNNNGC 3' PAM(하부)을 함유하는 표적에 대한 MAD2007의 고갈 지도를 보여준다; 도 6은 시험관 내에서 측정된 NNNNATGC 3' PAM을 함유하는 표적에 대한 MAD2008의 고갈 지도를 보여준다; 도 7은 시험관 내에서 측정된 NNNNATGC 3' PAM을 함유하는 표적에 대한 MAD2008의 고갈 지도를 보여준다; 도 8은 시험관 내에서 측정된 NNNNATGC 3' PAM을 함유하는 표적에 대한 MAD2011의 고갈 지도를 보여준다; 도 9는 시험관 내 스크린에서 활성이었던 채굴된 MAD-시리즈 RGN의 PAM을 요약하는, 서열 로고의 형태로 나타낸 MAD에 의해 절단된 표적의 농축을 보여준다. 따라서, 도 4-9에서 볼 수 있는 바와 같이, MAD2001, MAD2007, MAD2008, MAD2009 및 MAD2011 뉴클레아제가 활성이었다. MAD2001은 NNRC PAM을 함유하는 표적을 절단하였고, MAD2007은 NNAA PAM을 선호하였고, MAD2008 및 MAD2009는 NNAA PAM을 갖는 표적을 고갈시켰다. PAM NNNNATGC, ATNNNGC 및 ATGCNNNN은 인간 게놈 편집을 위해 NGG 또는 TTTV PAM보다 실질적으로 덜 제한적이다(도 11 참조). 마지막으로, MAD2011은 SpCas9와 유사한 NGG PAM을 갖는다. 가장 활성이었던 gRNA 서브풀이 확인되었다. 각 gRNA 서브풀은 64개의 서로 다른 gRNA 조합을 함유하기 때문에, 최적의 gRNA 서열을 확인하기 위해 가장 활성이거나 가장 짧은 서브풀 내의 각 gRNA를 시험하였다. 시험관 내 검정에서 가장 높은 고갈을 나타내는 3개의 gRNA가 확인되었다. 이러한 서열은 표 6에 나열되어 있다.
표 6
[0071]
PAM 정보 및 상위 3개의 gRNA 설계를 사용하여, MAD2001, MAD2007, MAD2008, MAD2009 및 MAD2011의 활성을 HEK293T 세포에서 시험하였다. 세포를 뉴클레아제 플라스미드 및 gRNA 플라스미드로 공동-트랜스펙션시켰다. 뉴클레아제는 강한 CAG 프로모터로부터 발현된 반면, gRNA는 U6 프로모터로부터 발현되었다. 세포는 T7E1 검정에 의해 인델에 대해 분석되었다. 도 10에 도시된 바와 같이, 5개의 MAD 중 4개가 활성을 나타내었다. MAD2001은 다중 내인성 표적에서 활성이었으며, GAGC PAM을 함유하는 표적에서 최대 20%의 인델을 나타내었다. 이는 포유동물 세포에서 활성인 고세균 CRISPR 뉴클레아제의 첫 번째 입증이다. MAD2007, MAD2008 및 MAD2011은 시험된 표적에서 더 낮고 다양한 수준의 인델을 보여준다. 도 11은 정확한 편집을 위해 새로 발견된 뉴클레아제의 인간 게놈 범위를 예시하며, 인간 세포에서 정확한 편집을 위한 범위를 제공한다.
[0072]
또한, MAD-시리즈 뉴클레아제의 닉카제 및 뉴클레아제 죽은 변이체, 즉, MAD2001, MAD2007, MAD2008, MAD2009 및 MAD2011이 또한 이러한 닉카제 및 죽은 변이체가 다양한 닉카제 기반 정밀 편집에 적용에 사용되는 경우에서 확인되었다. 닉카제 및 뉴클레아제 죽은 변이체의 서열은 하기 표 7에 나열되어 있으며, 여기서 야생형 MAD2001[SEQ ID NO. 1] 뉴클레아제 아미노산 서열(SEQ ID No. 14-16의 경우) 및 MAD2007[SEQ ID No. 7] 뉴클레아제 아미노산 서열(SEQ ID No. 17-19의 경우)과 다른 아미노산 잔기는 강조 표시되고 굵게 표시된다.
표 7
실시예 6: GFP 기능 상실을 측정함으로써 HEK293T-GFP 세포에서 활성 MAD2001 및 MAD2007 스페이서에 대한 스크리닝:
[0073]
MAD2007 및 MAD2001이 포유동물 세포에서 활성인지 시험하기 위해, HEK293t-GFP 세포에서 GFP 유전자좌를 표적으로 하는 스페이서 라이브러리가 설계되었다. MAD2001의 경우, NNRC PAM을 표적으로 하는 23개의 스페이서가 2개의 gRNA 스캐폴드(g1 및 g3)에서 설계되었다. MAD2007의 경우, NNNSR PAM을 표적으로 하는 43개의 스페이서가 3개의 gRNA 스캐폴드(g1, g2 및 g3)에서 설계되었다. gRNA를 pComplete 플라스미드(CMV-MAD200x-U6-gRNA)로 클로닝하고 E. 콜리(E. coli)(NEB5 알파 균주)로 형질전환시켰다. 생성된 콜로니를 96-웰 미드웰 플레이트로 취하고 밤새 성장시켰다. E. 콜리 배양물은 CMV 프로모터 구동 MAD2007/MAD2001 및 U6 구동 gRNA를 함유하는 7 kb 단편을 증폭시키기 위한 PCR 주형으로서 사용되었다. 150 ng의 정제되지 않은 PCR 반응을 사용하여 96 웰에서 20,000개의 HEK293T-GFP 세포를 1 μL의 PolyFect 트랜스펙션 시약으로 트랜스펙션시켰다. 이후 세포를 37℃에서 96시간 동안 인큐베이션한 다음, 유세포 분석을 수행하였다. 유세포 분석을 사용하여, 각 웰의 GFP- 세포 및 GFP+ 세포를 측정하였다. 각 웰에서 GFP- 세포의 백분율을 플롯팅하였다(도 7 참조). 음성 대조군과 비교하여, MAD2001 및 MAD2007에 대한 다수의 gRNA 스페이서가 기능하는 것으로 밝혀졌다. 전반적으로, MAD2001용으로 설계된 스페이서 23개 중 6개가 기능성이었다. MAD2007용으로 설계된 34개/43개 스페이서가 기능성이었다. 이 GFP 스크린을 사용하여 확인된 스페이서 및 PAM 서열은 표 8에 제시되어 있다.
표 8
[0074]
추가로, HEF293T 세포에서 기능성이었던 34개의 MAD2007 스페이서의 PAM 영역을 사용하여 서열 로고를 생성하였으며, 이는 도 8에 제시되어 있다. 결과는 HEK293T 세포에서 MAD2007의 PAM이 NNNSR임을 보여준다.
[0075]
다음으로, 검증을 위해 HEK293T-GFP 세포에서 플라스미드 트랜스펙션을 사용하여 스크린에서 확인된 MAD2007 스페이서 히트 중 일부를 시험하였다. 결과는 도 9에 도시되어 있다. gRNA이 없는 대조군과 비교하여, 히트는 활성인 것으로 밝혀졌다. 그러나, 스페이서 서열에 따라 다양한 수준의 활성이 존재하였다. MAD2007의 활성은 MAD7과 비슷하지만 SpCas9보다 낮았다.
실시예 7: MAD2007의 코돈 최적화
[0076]
지금까지 논의된 모든 데이터는 E. 콜리 코돈 최적화된 MAD2007을 사용하여 생성되었다. MAD2007은 인간 세포에 대해 최적화되었고 2개의 코돈 최적화된 버전(hsMAD2007v1[SEQ ID NO. 140] 및 hsMAD2007v2[SEQ ID No. 141])이 설계되었다. 이후 설계를 CMV 구동 MAD2007-T2A-dsRed 및 U6 구동 gRNA(위로부터 스캐폴드 1을 갖는 g11)를 함유하는 pComplete 벡터로 클로닝하였다. 각 설계에 대해, 4개의 개별 클론(c1, c2, c3 및 c4)을 취하고 GFP 기능 상실에 대해 HEK293T-GFP 세포에서 시험하였다. 결과는 도 9에 도시되어 있다. dsRed 발현에 기초하여, hsMAD2007v2는 EcMAD2007에 비해 더 높은 발현을 나타내었다. 또한, GFP-의 백분율에 기초하여, hsMAD2007v2는 EcMAD2007에 비해 더 높은 활성을 나타내었다.
실시예 8: MAD2007 호몰로그
MAD2007-유사 단백질 서열에 대한 생물정보학적 검색이 공개 데이터베이스에서 수행되었고, 샤르페아 아자부엔시스로부터의 3개의 서열이 MAD2007과 ≥98% 동일한것으로 확인되었다. 이러한 서열이 표 9에 제시되어 있다.
표 9
[0077]
본 발명은 본 발명의 바람직한 구체예와 관련하여 상세하게 기술된 바와 같이 많은 상이한 형태의 구체예에 의해 충족되지만, 본 개시는 본 발명의 원리의 예시로서 고려되어야 하고 본 발명을 본원에 예시되고 기술된 특정 구체예로 제한하려는 의도가 아니라는 것이 이해된다. 본 발명의 사상에서 벗어나지 않고 당업자에 의해 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 본 발명의 범위는 첨부된 청구 범위 및 그 등가물에 의해 판단될 것이다. 요약서 및 명칭은 적절한 권위자뿐만 아니라 일반 대중이 본 발명의 일반적인 특성을 신속하게 파악할 수 있도록 하는 것이기 때문에 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 다음의 청구 범위에서, "수단"이라는 용어가 사용되지 않는 한, 그 안에 언급된 특징 또는 요소는 35 U.S.C. §112, ¶6에 따른 수단-플러스-기능 제한으로 해석되어서는 안 된다.
SEQUENCE LISTING
<110> INSCRIPTA INC.
<120> NOVEL MAD NUCLEASES
<130> INSC036PCT
<140> PCT/US20/26095
<141> 2020-04-01
<150> 62/946,282
<151> 2019-12-10
<160> 144
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1322
<212> PRT
<213> Eubacterium rectale
<400> 1
Met Lys Asn Thr Asn Glu Asp Tyr Tyr Leu Gly Leu Asp Ile Gly Thr
1 5 10 15
Asp Ser Val Gly Trp Ala Val Thr Asp Lys Glu Tyr Asn Ile Leu Glu
20 25 30
Phe Arg Arg Lys Pro Met Trp Gly Ile His Leu Phe Glu Gly Gly Ser
35 40 45
Thr Ala Gln Lys Thr Arg Val Tyr Arg Thr Ser Arg Arg Arg Leu Lys
50 55 60
Arg Arg Ala Glu Arg Ile Ala Leu Leu Arg Asp Ile Phe Ser Glu Glu
65 70 75 80
Ile Gly Lys Val Asp Pro Gly Phe Phe Glu Arg Leu Asp Glu Ser Asp
85 90 95
Leu His Leu Glu Asp Arg Val Thr Ser Gln Lys Asn Ser Leu Phe Asp
100 105 110
Asp Pro Glu Phe Asn Asp Lys Asp Leu His Lys Arg Phe Pro Thr Ile
115 120 125
Tyr His Leu Arg Arg His Leu Met His Ser Asn Arg Lys Glu Asp Ile
130 135 140
Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Ala His His Ile Ile Lys Phe Arg Gly His
145 150 155 160
Phe Leu Tyr Lys Gly Ile Gly Asp Glu Glu Ile Pro Ser Phe Glu Ile
165 170 175
Val Leu Asn Ser Leu Ile Asp Asn Leu Arg Asp Glu Tyr Gly Met Glu
180 185 190
Leu Glu Val Ser Asp Arg Asp Leu Val Lys Ala Leu Leu Ser Asp Phe
195 200 205
Ser Ile Gly Ile Arg Glu Lys Ser Arg Glu Leu Ser Ser Cys Leu Asn
210 215 220
Ala Glu Ser Glu Asn Glu Lys Ala Leu Val Asp Phe Ile Ser Gly Lys
225 230 235 240
Lys Thr Asn Met Lys Lys Leu Phe Asp Asp Glu Ala Leu Asp Lys Met
245 250 255
Ser Phe Ser Leu Arg Asp Ser Gly Phe Glu Asp Gln Leu Arg Glu Asn
260 265 270
Glu Gly Val Leu Gly Pro Glu Arg Val His Thr Leu Glu Leu Ser Arg
275 280 285
Gln Ile Phe Glu Trp Ala Arg Leu Ser Ser Ile Leu Lys Asp Ser Asp
290 295 300
Ser Ile Ser Glu Ala Lys Ile Lys Asp Tyr Asp Gln His Arg Glu Asp
305 310 315 320
Leu Arg Met Leu Lys Arg Ala Val Lys Lys Tyr Ala Pro Asp Lys Tyr
325 330 335
Ser Glu Val Phe Lys Ser Lys Glu His Thr Gly Asn Tyr Cys Ser Tyr
340 345 350
Val Tyr Val Cys Gly Lys Gly Leu Pro Asp Lys Lys Cys Ser Thr Glu
355 360 365
Glu Phe Gln Lys Tyr Leu Lys Lys Ile Leu Asp Asp Ser Gly Val Arg
370 375 380
Asp Asp Glu Glu Phe Lys Thr Leu Ile Gln Arg Leu Asp Ala Gly Ile
385 390 395 400
Leu Cys Pro Lys Gln Arg Thr Gly Glu Asn Ser Val Ile Pro Tyr Ser
405 410 415
Val His Arg Lys Glu Leu Ile Gly Ile Leu Asn Asn Ala Ala Glu His
420 425 430
Tyr Pro Ser Leu Ser Arg Lys Gly Glu Asp Gly Phe Ser Ser Ile Asp
435 440 445
Lys Ile Leu Met Leu Glu Glu Phe Arg Ile Pro Tyr Tyr Val Gly Pro
450 455 460
Leu Asp Asp Arg Ser Ser Arg Ser Trp Leu Ile Arg Asn Ser Phe Glu
465 470 475 480
Ala Ile Thr Pro Trp Asn Phe Asn Glu Ile Val Asp Glu Asp Glu Thr
485 490 495
Ser Glu Arg Phe Ile Gly Asn Leu Thr Ser Met Cys Thr Tyr Leu Gly
500 505 510
Gly Glu Lys Val Leu Pro Lys Asn Ser Leu Leu Tyr Ser Arg Phe Met
515 520 525
Leu Tyr Asn Glu Ile Asn Asn Leu Arg Val Gly Gly Glu Lys Ile Pro
530 535 540
Ala Ala Leu Lys Asn Lys Met Val Ser Glu Leu Phe Ala Asn Arg Ala
545 550 555 560
Thr Ser Ser Lys Val Thr Leu Lys Glu Leu Lys Ala Phe Leu Lys Gly
565 570 575
Glu Gly Val Leu Thr Asp Ala Asp Glu Ile Ser Gly Ile Asp Asp Gly
580 585 590
Val Lys Ser Thr Leu Arg Ser Glu Ile Leu Ile Arg Lys Ile Ile Gly
595 600 605
Asp Lys Ile Ser Asp Arg Glu Met Ala Glu Glu Ile Val Arg Ile Leu
610 615 620
Thr Val Phe Gly Asp Glu Arg Arg Arg Ser Lys Ala Lys Leu Lys Lys
625 630 635 640
Glu Phe Ser Asp Lys Leu Thr Glu Lys Glu Ile Glu Lys Leu Ser Ser
645 650 655
Leu Lys Phe Asp Gly Trp Gly Arg Leu Ser Glu Lys Phe Leu Thr Gly
660 665 670
Leu Arg Gln Glu Val Asn Gly Arg Ser Met Ser Ile Ile Glu Ile Leu
675 680 685
Glu Asp Thr Asn Tyr Asn Leu Gln Glu Thr Leu Ser Lys Tyr Ser Phe
690 695 700
Asn Glu Ile Ile Asp Ser Tyr Asn Glu Val Leu Thr Ser Gly Pro Arg
705 710 715 720
Ser Ile Ser Tyr Asp Ile Leu Lys Asp Ser Tyr Leu Ser Pro Ala Val
725 730 735
Lys Arg Gly Val Trp Arg Ala Leu Ser Val Val Lys Asp Ile Leu Lys
740 745 750
Ala Val Gly Arg Pro Pro Lys Lys Ile Phe Val Glu Thr Thr Arg Glu
755 760 765
Glu Arg Glu Lys Lys Arg Thr Glu Ser Arg Lys Asp Ala Leu Met Tyr
770 775 780
Leu Tyr Lys Ser Cys Lys Glu Thr Glu Trp Glu Lys Arg Leu Asp Ser
785 790 795 800
Val Glu Glu Ser Ser Leu Arg Asn Arg Ser Leu Tyr Leu Tyr Tyr Thr
805 810 815
Gln Leu Gly Lys Cys Met Tyr Cys Gly Lys Asn Ile Asp Ile Gly Glu
820 825 830
Leu Asn Thr Asp Leu Ala Asp Arg Asp His Ile Tyr Pro Gln Ser Lys
835 840 845
Thr Lys Asp Asp Ser Ile Arg Asn Asn Leu Val Leu Val Cys Arg Gly
850 855 860
Cys Asn Gln Ala Lys Gly Asp Arg Tyr Pro Leu Pro Gln Glu Trp Val
865 870 875 880
Ser Arg Met His Ala Phe Trp Thr Met Leu Lys Asp Lys Gly Tyr Ile
885 890 895
Ser Ser Glu Lys Tyr Arg Arg Leu Thr Arg Arg Gly Glu Leu Thr Glu
900 905 910
Glu Glu Phe Gly Ala Phe Ile Asn Arg Gln Leu Val Glu Thr Ser Gln
915 920 925
Ser Ala Lys Ala Val Ile Thr Val Leu Lys Asn Ala Phe Lys Asp Ser
930 935 940
Asp Ile Val Tyr Val Lys Gly Ser Asn Val Ser Asp Phe Arg Ser Ser
945 950 955 960
Tyr Asn Phe Ile Lys Cys Arg Ser Val Asn Asp Tyr His His Ala Lys
965 970 975
Asp Ala Tyr Leu Asn Ile Val Val Gly Asn Val Leu Asp Thr Lys Phe
980 985 990
Thr Lys Asn Pro Ser Tyr Val Leu Lys Asn Arg Glu Gln Tyr Asn Ile
995 1000 1005
Gly Arg Met Tyr Asp Arg Asn Val Ser Arg Phe Gly Val Asp Ala
1010 1015 1020
Trp Val Ala Gly Asp Arg Gly Ser Ile Ala Thr Val Arg Lys Tyr
1025 1030 1035
Met Arg Arg Asn Asn Ile Leu Phe Thr Arg Tyr Ala Thr Lys Ser
1040 1045 1050
Lys Gly Ala Leu Phe Lys Glu Thr Val His Arg Lys Lys Glu Gly
1055 1060 1065
Leu Phe Glu Arg Lys Lys Gly Leu Glu Thr Glu Lys Tyr Gly Gly
1070 1075 1080
Tyr Ser Asp Ile Ser Thr Ser Tyr Leu Thr Leu Leu Glu Tyr Asp
1085 1090 1095
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Ile Gln Leu Leu Leu Pro Glu Asn Leu Tyr Ala Tyr Cys Lys Ser
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Ile Glu Asn Asn Glu Lys Asp Ser Gln Arg Arg Ser Glu Lys Pro
1190 1195 1200
Leu Gln Asn Tyr Gly Phe Ser Ser Glu Met Asn Ile Glu Leu Phe
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Lys Cys Leu Met Asp Lys Ala Ala Lys Pro Pro Tyr Asp Val Lys
1220 1225 1230
Leu Ser Thr Leu Ser Lys Asn Leu Glu Glu Gly Phe Glu Lys Phe
1235 1240 1245
Lys Ala Leu Glu Leu Gly Pro Gln Val Lys Val Leu Gln Gln Ile
1250 1255 1260
Leu Asp Ile Tyr Ser Cys Asp Arg Lys Ser Gly Asp Leu Ser Val
1265 1270 1275
Leu Gly Ser Ala Arg Asn Ala Gly Arg Leu Asp Met Asn Gly Val
1280 1285 1290
Leu Ser Glu Ala Asp Gly Glu Gln Val Thr Met Ile Cys Gln Ser
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Pro Ser Gly Leu Phe Glu Lys Arg Val Pro Met Asn Glu Lys
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<210> 2
<211> 997
<212> PRT
<213> Eubacterium rectale
<400> 2
Met Lys Lys Arg Ile Phe Gly Phe Asp Ile Gly Ile Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Trp Ala Val Val Asp Phe Asp Asp Thr Ala Asp Pro Glu Asn Asp Ile
20 25 30
Tyr Pro Thr Gly Glu Ile Val Lys Ser Gly Val Arg Cys Phe Pro Val
35 40 45
Ala Glu Asn Pro Lys Asp Gly Ser Ser Leu Ala Gln Pro Arg Arg Gln
50 55 60
Lys Arg Leu Leu Arg Arg Leu Cys Arg Arg Lys Ala Arg Arg Met Ala
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Gly Ile Lys Asn Leu Phe Val Ala Asn Gly Leu Ile Gly Lys Asp Ala
85 90 95
Leu Phe Asn Glu Lys Ser Asn Ile Tyr Lys Ala Arg Asp Asn Ala Asp
100 105 110
Val Trp Asp Leu Arg Val Lys Ala Leu Thr Asp Lys Leu Thr Thr Ile
115 120 125
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130 135 140
Ser Tyr Arg Ile Ala Ala Glu Lys Ala Asp Ala Glu Ser Gly Lys Val
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Leu Glu Ala Val Lys Ala Asn Arg Ala Leu Leu Glu Asn Gly Lys Thr
165 170 175
Leu Ala Gln Ile Ile Val Glu Lys Gly Gly Gln Lys Arg Asn Arg Glu
180 185 190
Lys Met Ile Val Lys Asn Gly Lys Thr Glu Lys Gln Ala Ser Tyr Glu
195 200 205
Asn Ser Ile Pro Arg Asp Glu Ile Glu Arg Glu Thr Arg Leu Ile Phe
210 215 220
Glu Lys Gln Arg Ala Phe Gly Leu Glu Ala Ala Asn Glu Lys Leu Gln
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Arg Asp Phe Glu Lys Ile Ala Phe Arg Phe Arg Glu Ile Lys Ser Lys
245 250 255
Asn Ile Glu Lys Met Ile Gly Lys Cys Glu Phe Glu Lys Asp Glu Pro
260 265 270
Arg Ala Pro Lys Asn Ala Pro Ser Ala Glu Phe Phe Val Ala Trp Thr
275 280 285
Lys Ile Asn Asn Cys Arg Val Arg Glu Pro Asp Gly Lys Ile Arg Phe
290 295 300
Leu Thr Gln Glu Glu Lys Glu Asn Val Phe Asn Leu Leu Lys Asp Gln
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Lys Glu Val Lys Tyr Ser Ala Leu Lys Lys Ala Leu Phe Ala Lys Arg
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Pro Asp Val Gln Phe Thr Asp Ile Glu Tyr Asn Pro Lys Pro Val Tyr
340 345 350
Asp Lys Lys Thr Gly Glu Ile Ile Glu Lys Thr Glu Asn Pro Glu Asn
355 360 365
Gln Lys Phe Phe Ser Leu Lys Gly Trp His Asp Leu Lys Ser Val Ile
370 375 380
Asp Val Ser Ser Tyr Pro Val Glu Thr Leu Asp Lys Ile Ala Thr Val
385 390 395 400
Ile Ala Thr Lys Lys Asn Asp Thr Asp Ile Ala Lys Gly Leu Lys Glu
405 410 415
Leu Asn Leu Pro Asp Ala Glu Ile Glu Lys Leu Thr Ser Leu Ser Phe
420 425 430
Ser Lys Phe Ile Arg Leu Ser Leu Lys Ala Leu Tyr Lys Ile Leu Pro
435 440 445
Glu Met Gln Lys Gly Met Lys Tyr Asn Glu Ala Cys Asp Ala Val Gly
450 455 460
Tyr Asp Phe Lys Ser Thr Gly Glu Ser Phe Ala Ala Gln Lys Gly Lys
465 470 475 480
Phe Leu Pro Pro Ile Pro Glu Ala Leu Ala Thr Thr Val Pro Val Val
485 490 495
Asn Arg Ala Met Thr Gln Phe Arg Lys Val Tyr Asn Ala Leu Ala Arg
500 505 510
Glu Tyr Gly Thr Pro Asp Gln Ile Asn Ile Glu Leu Ala Arg Asp Val
515 520 525
Tyr Asn Thr His Asp Glu Arg Lys Lys Ile Ala Asp Lys Gln Lys Glu
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Tyr Gly Glu Glu Arg Lys Lys Ala Arg Asp Leu Ala Gln Glu Lys Met
545 550 555 560
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Ser Arg Glu Asn Arg Arg Lys Ser Asp Lys Thr Pro Leu Glu Tyr Ile
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Ile Asp Pro Val Lys Gln Ala Glu Phe Ile Ala Arg Val Lys Ser Met
645 650 655
Lys Gly Leu Ser Ala Pro Lys Arg Asp Arg Leu Leu Ile Arg Asp Phe
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Lys Glu Lys Glu Leu Glu Phe Arg Asp Arg Asn Ile Asn Asp Thr Arg
675 680 685
Tyr Met Ala Arg Tyr Ile Met Lys Tyr Leu Asp Asp Cys Ile Asp Phe
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725 730 735
Asn Glu Asn Asp Arg His His Ala Gln Asp Ala Ile Val Ile Ala Cys
740 745 750
Ala Thr Asn Gly Tyr Thr Gln Tyr Leu Ala His Leu Ser Lys Ile Phe
755 760 765
Glu Asn Lys Gln Ala Tyr Ala Asn Lys Tyr Gly Gln Pro Trp Tyr Lys
770 775 780
Ala Phe Lys Gln His Val Lys Gln Pro Trp Asp Gly Phe Tyr Gln Asp
785 790 795 800
Val Gln Ala Ser Leu Ala Glu Ile Phe Val Ser Arg Pro Pro Arg Lys
805 810 815
Asn Ala Thr Gly Glu Val His Gln Asp Thr Ile Arg Thr Leu Asn Pro
820 825 830
Asn Lys Pro Gln Tyr Ser Glu Lys Asp Val Lys Ser Gly Ile Lys Leu
835 840 845
Arg Gly Gly Leu Ala Asn Asn Gly Asp Met Leu Arg Val Asp Val Phe
850 855 860
Ser Lys Lys Asn Ala Lys Gly Lys Glu Gln Phe Tyr Leu Val Pro Ile
865 870 875 880
Tyr Leu Ala Asp Arg Ile Lys Pro Glu Leu Pro Asn Lys Ala Ile Val
885 890 895
Ala Asn Lys Ser Glu Ser Glu Trp Ile Ile Met Asp Ala Thr Tyr Ser
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Phe Lys Phe Ser Leu Tyr Met Asp Asp Leu Val Ser Val Ile Lys Gly
915 920 925
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Ser Ile Thr Ile Glu Gly His Asp Arg Asn Phe Ile Gln Pro Ser Ile
945 950 955 960
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<210> 3
<211> 1392
<212> PRT
<213> Eubacterium rectale
<400> 3
Met Lys Lys Val Leu Gly Leu Asp Leu Gly Ser Ser Ser Ile Gly Trp
1 5 10 15
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Leu Arg Ala Lys Ala Ala Val Ala Glu Ile Ser Leu Glu Glu Leu Ala
115 120 125
Arg Val Leu Leu Met Ile Asn Lys Lys Arg Gly Tyr Lys Ser Ser Arg
130 135 140
Lys Asn Arg Gly Gly Asp Glu Gly Lys Phe Ile Asp Gly Ile Ser Val
145 150 155 160
Ala Lys Gln Leu Tyr Asp Arg Gly Ile Thr Pro Gly Gln Phe Ser Leu
165 170 175
Glu Leu Leu Lys Glu Gly Lys Arg His Leu Pro Asp Tyr Tyr Arg Ser
180 185 190
Asp Leu Gln Asn Glu Leu Asp Arg Ile Trp Asn Phe Gln Gln Ser Phe
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Tyr Pro Glu Ile Leu Thr Gln Asn Phe Arg Glu Gln Ile Arg Asp Lys
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Gly Gln Lys Asn Thr Ser Gln Ile Phe Leu Arg Glu Tyr Gln Ile Tyr
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Thr Ala Asp Asn Lys Gly Ala Asp Lys Leu Ser Arg Ala Leu Gln Trp
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Arg Val Glu Gly Leu Ser Arg Lys Leu Ser Val Glu Glu Leu Ala Phe
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Val Met Ser Asp Leu Asn Gly Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Tyr Leu
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Thr Lys Glu Glu Arg Glu Lys Arg Val Leu Lys Glu Arg Leu Asp Ile
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Gln Met Val His Val Val Asn Gly Val Ile Asn Lys Tyr Gly Lys Pro
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Asp Glu Ile Arg Ile Glu Leu Ala Arg Glu Leu Lys Lys Asn Ala Lys
690 695 700
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Leu Phe Phe Lys Glu Phe Asp Ile Glu His Ile Ile Pro Gln Ser Arg
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Asn Ala Ile Asn Leu Lys Asp Ile Ser Asp Phe Arg Gly Leu Pro Val
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Asp Thr Val Ile Lys Asn Thr Val Lys Ser Met Ser Lys Tyr His Gly
835 840 845
Phe Ser Glu Asp Tyr Ile Arg Ser Leu Met Ser Lys Asn His Ile Pro
850 855 860
Ala Ile Cys Lys Asn Leu Ser Asp Glu Val Gln Ile Arg Ile Pro Leu
865 870 875 880
Lys Phe Asn Thr Asp Tyr Asp Asn Leu Gly Tyr Arg Phe Thr Asp Asp
885 890 895
Gln Tyr His Tyr Lys Lys Leu Tyr Ile Ala Phe Lys Glu Ala Gln Asn
900 905 910
Ala Leu Lys Glu Lys Glu Thr Leu Glu Lys Glu Leu Ile Glu Arg Phe
915 920 925
Asn Asn Glu Ala Gln Ile Leu Asn Ala Asn Ile Ile Leu Thr Tyr Thr
930 935 940
Gly Phe Glu Ser Asn Asn Glu Leu Ile Asp Ile Lys Lys Ala Lys Lys
945 950 955 960
Val Thr Asp Thr Leu Lys Pro Asn Leu Lys Asn Tyr Ile Lys Ala Ile
965 970 975
Asp Ile Leu Thr Gln Glu Glu Tyr Thr Lys Arg Cys Leu Glu Tyr Tyr
980 985 990
Asn Asp Ser Glu Phe Ala Thr Gln Leu Lys Ile Pro Tyr Val Asn Phe
995 1000 1005
Lys Ile Asn Lys Arg Phe Arg Gly Lys Ile Gln Gly Ser Glu Asn
1010 1015 1020
Ala Val Ser Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Thr Lys Leu Asn Ser
1025 1030 1035
Phe Glu Glu Phe Glu Ser Tyr Leu Lys Ser Glu Asp Gly Ile Lys
1040 1045 1050
Ser Pro Tyr Tyr Ile Lys Tyr Thr Lys Asn Thr Leu Gly Lys Glu
1055 1060 1065
Ser Tyr Thr Ile Tyr Glu Ala Asn Ser Tyr Tyr Cys Ala Glu Ile
1070 1075 1080
Tyr Thr Asp Ser Gln Asn Lys Pro Gln Leu Arg Gly Ile Arg Tyr
1085 1090 1095
Val Asp Val Arg Lys Glu Asp Gly Lys Leu Val Leu Leu Lys Pro
1100 1105 1110
Leu Pro Ser Thr Cys Lys His Ile Thr Tyr Leu Phe His Asn Glu
1115 1120 1125
Tyr Ile Ala Ile Tyr Lys Asp Ser Asn Tyr Lys Arg Leu Lys Asn
1130 1135 1140
Asn Gly Phe Gly Ala Tyr Arg Ser Ile Asn Asn Val Asn Val Asn
1145 1150 1155
Lys Ile Ile Ile Arg Leu Phe Ala Asn Gln Asn Leu Asn Asp Asn
1160 1165 1170
Asp Val Val Ile Thr Ser Ser Ile Phe Ile Lys Lys Tyr Ser Leu
1175 1180 1185
Asp Val Phe Gly His Ile Asn Gly Glu Ile Lys Cys Gly Asp Gln
1190 1195 1200
Ser Leu Phe Thr Ile Lys Lys Arg
1205 1210
<210> 19
<211> 1211
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificially mutated sequence
<400> 19
Met Glu Asn Tyr Arg Gln Lys His Arg Phe Val Leu Ala Thr Ala Leu
1 5 10 15
Gly Ile Gly Ser Asn Gly Trp Ala Ile Ile Asp Leu Asp Ala His Arg
20 25 30
Val Glu Asp Leu Gly Val Gln Ile Phe Glu Ser Gly Glu Glu Gly Ala
35 40 45
Lys Lys Ala Ser Ala Arg Ala Ser Gln Gln Arg Arg Leu Lys Arg Ser
50 55 60
Ala His Arg Leu Asn Arg Arg Lys Lys Gln Arg Lys Glu Ala Leu Ile
65 70 75 80
Lys Phe Leu Gln Glu Ile Glu Phe Pro Asp Leu Val Glu Ile Leu Asn
85 90 95
Ser Phe Lys Lys Gln Lys Asn Pro Asn Asp Ile Leu Ser Leu Arg Val
100 105 110
Lys Gly Leu Asp Asn Lys Leu Ser Pro Leu Glu Leu Phe Ser Ile Leu
115 120 125
Ile Tyr Met Ser Asn Asn Arg Gly Tyr Lys Asp Phe Tyr Asp Asn Asp
130 135 140
Ile Asn Asp Asn Asn Thr Asp Lys Asp Glu Lys Glu Met Glu Lys Ala
145 150 155 160
Lys Ser Thr Ile Glu Lys Leu Phe Ala Ser Asn Ser Tyr Arg Thr Val
165 170 175
Gly Glu Met Ile Ala Thr Asp Pro Thr Phe Ile Val Asp Lys Ser Gly
180 185 190
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195 200 205
Ile Pro Arg Lys Leu Leu Glu Asn Glu Met Ser Leu Ile Leu His Lys
210 215 220
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225 230 235 240
Leu Asp Lys Ile Phe Phe Gln Arg Asn Phe Glu Asp Gly Pro Gly Pro
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Lys Asn Lys Arg Asp Asp Tyr Lys Asn Asn Ser Lys Gly Asn Gln Phe
260 265 270
Tyr Thr Gly Phe Asn Glu Met Ile Gly Leu Cys Pro Phe Tyr Pro Asn
275 280 285
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305 310 315 320
Met Ser Phe Ser Lys Ser Leu Leu His Asp Leu Met Leu Tyr Phe Phe
325 330 335
Asp His Lys Gly Glu Leu Thr Asn Lys Glu Leu Ser Ser Phe Leu Leu
340 345 350
Lys His Gly Leu Glu Leu Asn Ser Lys Glu Lys Ser Asn Lys Lys Tyr
355 360 365
Arg Leu Asn Tyr Met Lys Gln Leu Thr Asp Ser Thr Ile Phe Glu Thr
370 375 380
Glu Met Ile Ala Ser Phe Arg Glu Glu Ile Glu Thr Ser Ser Tyr Arg
385 390 395 400
Ser Val Asn Ser Leu Ser Asn Lys Ile Gly Asn Cys Ile Gly Gln Phe
405 410 415
Ile Thr Pro Leu Lys Arg Lys Glu Glu Leu Thr Asn Ile Leu Ile Asp
420 425 430
Thr Asn Tyr Pro Lys Glu Leu Ala Ser Lys Leu Ala Asp Ser Ile Lys
435 440 445
Val Ile Lys Ser Gln Ser Val Ala Asn Ile Ser Asn Lys Tyr Met Leu
450 455 460
Glu Ala Ile His Ala Phe Glu Ser Gly Lys Lys Tyr Gly Asp Phe Gln
465 470 475 480
Ala Glu Phe Asn Glu Thr Arg Glu Leu Glu Asp His His Phe Met Lys
485 490 495
Asn Asn Lys Leu Ile Ala Phe Gln Asp Ser Asp Leu Ile Arg Asn Pro
500 505 510
Val Val Tyr Arg Thr Ile Asn Gln Ser Arg Lys Ile Ile Asn Ala Ala
515 520 525
Ile Asn Lys Tyr Asn Ile Val Arg Ile Asn Ile Glu Val Ala Ser Asp
530 535 540
Val Asn Lys Ser Phe Glu Gln Arg Asp Asn Asp Lys Lys Tyr Gln Asn
545 550 555 560
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565 570 575
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580 585 590
Arg Tyr Lys Leu Tyr Leu Ser Gln Asn Lys His Cys Ile Tyr Thr Asn
595 600 605
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645 650 655
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660 665 670
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675 680 685
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705 710 715 720
Thr Arg Tyr Ile Thr Arg Tyr Ile Ala Asn Tyr Leu Lys Thr Ala Phe
725 730 735
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740 745 750
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835 840 845
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850 855 860
Ala Ile Cys Lys Asn Leu Ser Asp Glu Val Gln Ile Arg Ile Pro Leu
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885 890 895
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900 905 910
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Lys Ile Asn Lys Arg Phe Arg Gly Lys Ile Gln Gly Ser Glu Asn
1010 1015 1020
Ala Val Ser Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Thr Lys Leu Asn Ser
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Phe Glu Glu Phe Glu Ser Tyr Leu Lys Ser Glu Asp Gly Ile Lys
1040 1045 1050
Ser Pro Tyr Tyr Ile Lys Tyr Thr Lys Asn Thr Leu Gly Lys Glu
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Ser Tyr Thr Ile Tyr Glu Ala Asn Ser Tyr Tyr Cys Ala Glu Ile
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Tyr Thr Asp Ser Gln Asn Lys Pro Gln Leu Arg Gly Ile Arg Tyr
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Tyr Ile Ala Ile Tyr Lys Asp Ser Asn Tyr Lys Arg Leu Lys Asn
1130 1135 1140
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Asp Val Phe Gly His Ile Asn Gly Glu Ile Lys Cys Gly Asp Gln
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Ser Leu Phe Thr Ile Lys Lys Arg
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<210> 20
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> REPEAT
<400> 20
gtttgagagt gttgtcaaat aagagtcgga ccaatc 36
<210> 21
<211> 97
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRACR
<400> 21
gatagacaaa tgtgtctttg acaacacaag ttcaaataag gcattgccgt aatcgttctt 60
atgaaccccg cagttggcgg gaaaccttct gttgtca 97
<210> 22
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> REPEAT
<400> 22
gtttgagagt gttgtcaaat aagagtcgga cc 32
<210> 23
<211> 93
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRACR
<400> 23
gacaaatgtg tctttgacaa cacaagttca aataaggcat tgccgtaatc gttcttatga 60
accccgcagt tggcgggaaa ccttctgttg tca 93
<210> 24
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> REPEAT
<400> 24
gtttgagagt gtt 13
<210> 25
<211> 67
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRACR
<400> 25
aacacaagtt caaataaggc attgccgtaa tcgttcttat gaaccccgca gttggcggga 60
aaccttc 67
<210> 26
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> REPEAT
<400> 26
gttttagtcg tctgttattt attggtaagg ttat 34
<210> 27
<211> 92
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRACR
<400> 27
ataactttac cagtgaatat cagacggcta agataaagct ataagctgtg gggtcgcgca 60
tccccaattt cgcgcacgag cgttagctcg tt 92
<210> 28
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> REPEAT
<400> 28
gttttagtcg tctgttattt attggt 26
<210> 29
<211> 84
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRACR
<400> 29
accagtgaat atcagacggc taagataaag ctataagctg tggggtcgcg catccccaat 60
ttcgcgcacg agcgttagct cgtt 84
<210> 30
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> REPEAT
<400> 30
gttttagtcg 10
<210> 31
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRACR
<400> 31
cggctaagat aaagctataa gctgtggggt cgcgcatccc caatttcgcg cacgagcgtt 60
agc 63
<210> 32
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> REPEAT
<400> 32
cctgtgaata gtca 14
<210> 33
<211> 78
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRACR
<400> 33
tataaaaaat aattatagaa ccaaactaac caattatgaa aaaaatatta ggacttgact 60
taggaaccaa ctctattg 78
<210> 34
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> REPEAT
<400> 34
cctgtgaata gtcaac 16
<210> 35
<211> 80
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRACR
<400> 35
tatataaaaa ataattatag aaccaaacta accaattatg aaaaaaatat taggacttga 60
cttaggaacc aactctattg 80
<210> 36
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> REPEAT
<400> 36
cctgtgaata gt 12
<210> 37
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRACR
<400> 37
taaaaaataa ttatagaacc aaactaacca attatgaaaa aaatattagg acttga 56
<210> 38
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> REPEAT
<400> 38
gttgtgaatt gcttt 15
<210> 39
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRACR
<400> 39
aaagcaattc acaataagga ttattccgtt gtgaaaacat ttaaggcggt gcgaaagcat 60
cgtcct 66
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRACR
<400> 40
aaagcaattc acaataagga ttattccgtt gtgaaaacat ttaaggcggt gcgaaaa 57
<210> 41
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> REPEAT
<400> 41
gttgtgaatt gc 12
<210> 42
<211> 61
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRACR
<400> 42
gcaattcaca ataaggatta ttccgttgtg aaaacattta aggcggtgcg aaagcatcgt 60
c 61
<210> 43
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> REPEAT
<400> 43
gttttagagc ta 12
<210> 44
<211> 61
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRACR
<400> 44
tagcaagtta aaataaggct agtccgttat caacttgaaa aagtggcaca gagtcggtgc 60
t 61
<210> 45
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> REPEAT
<400> 45
gttttagagc 10
<210> 46
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRACR
<400> 46
gcaagttaaa ataaggctag tccgttatca acttgaaaaa gtggcacaga gtcggtgct 59
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<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> REPEAT
<400> 47
gttttagagt catgttgttt agaatgg 27
<210> 48
<211> 84
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRACR
<400> 48
ccattttaaa cgaaaaactc ctctaaaacg attgcagctt atcgtaaaaa tgaaggaacc 60
tatgattaaa gaaagccgac tgca 84
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 49
ttgggtaacg ccagggtttt 20
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 50
tgtgtggaat tgtgagcgga 20
<210> 51
<211> 1490
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificially mutated sequence
<400> 51
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1 5 10 15
Ala Leu Ile Glu His Asn Phe Asp Lys Lys Glu Gly Arg Ile Asp Asp
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Leu Gly Val Arg Ile Ile Pro Met Ser Ala Asp Ile Leu Gly Lys Phe
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Asp Ala Gly Gln Ser His Ser Gln Thr Ala Glu Arg Thr Gly Tyr Arg
50 55 60
Gly Val Arg Arg Leu Tyr Gln Arg Asp Asn Leu Arg Arg Glu Arg Leu
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His Arg Val Leu Asn Ile Leu Asp Phe Leu Pro Glu His Tyr Ala Glu
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His Ile Asp Phe Glu Lys Arg Leu Gly Gln Phe Lys Glu Gly Lys Glu
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Ile Lys Leu Asn Tyr Lys Ser Asn Lys Asp Ser Lys Phe Glu Phe Ile
115 120 125
Phe Lys Ala Ser Tyr Asn Glu Met Leu Ala Ala Phe Lys Lys Tyr Gln
130 135 140
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145 150 155 160
Tyr Asp Trp Thr Ile Tyr Tyr Leu Arg Lys Lys Ala Leu Ser Gln Pro
165 170 175
Leu Thr Lys Gln Glu Leu Ala Trp Ile Ile Leu Asn Phe Asn Gln Lys
180 185 190
Arg Gly Tyr Tyr Gln Leu Arg Gly Glu Glu Ile Asp Asp Asp Lys Asn
195 200 205
Lys Gln Phe Val Gln Leu Lys Val Lys Glu Val Ile Asp Ser Gly Glu
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Ala Val Lys Gly Lys Lys Leu Phe Asn Val Ile Phe Glu Asn Gly Trp
225 230 235 240
Lys Tyr Asp Lys Gln Val Val Lys Thr Glu Asp Trp Ile Gly Arg Thr
245 250 255
Lys Glu Phe Ile Val Thr Thr Lys Thr Leu Lys Ser Gly Glu Ile Lys
260 265 270
Arg Thr Tyr Lys Ala Val Asp Ser Glu Lys Asp Trp Ala Ala Ile Lys
275 280 285
Ala Lys Thr Glu Gln Asp Ile Glu Arg Ser Asn Lys Thr Val Gly Glu
290 295 300
Phe Ile Tyr Glu Ala Leu Leu Gln Asp Pro Thr Gln Lys Ile Arg Gly
305 310 315 320
Lys Leu Val Lys Thr Ile Glu Arg Lys Phe Tyr Lys Ala Glu Leu Arg
325 330 335
Glu Ile Leu Arg Lys Gln Ile Glu Leu Gln Pro Gln Leu Phe Thr Thr
340 345 350
Lys Leu Tyr Asn Ala Cys Ile Lys Glu Leu Tyr Pro Asn Asn Glu Ala
355 360 365
His Arg Asn Ser Ile Lys Asn Arg Asp Phe Leu Tyr Leu Phe Leu Asp
370 375 380
Asp Ile Ile Phe Tyr Gln Arg Pro Leu Lys Ser Gln Lys Ser Asn Ile
385 390 395 400
Ser Gly Cys His Leu Glu Gln Arg Ile Tyr Thr Lys Ile Asn Pro Val
405 410 415
Ser Gly Lys Lys Glu Glu Val Lys Gln Ala Val Lys Ala Ile Pro Lys
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Ser His Pro Ile Phe Gln Glu Phe Arg Ile Trp Gln Trp Leu Gln Asn
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Gln Ala Thr Tyr Leu Val Tyr Gly Arg His Ser Glu Val Gly Asp Ile
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755 760 765
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Arg Asn Glu Tyr Asn Thr Glu Ile Val Thr Leu Ser Gly Leu Glu Glu
580 585 590
Asp Gln Phe Asn Ala Ser Phe Ser Thr Tyr Gln Asp Leu Leu Lys Cys
595 600 605
Gly Leu Thr Arg Ala Glu Leu Asp His Pro Asp Asn Ala Glu Lys Leu
610 615 620
Glu Asp Ile Ile Lys Ile Leu Thr Ile Phe Glu Asp Arg Gln Arg Ile
625 630 635 640
Arg Thr Gln Leu Ser Thr Phe Lys Gly Gln Phe Ser Glu Glu Val Leu
645 650 655
Lys Lys Leu Glu Arg Lys His Tyr Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Lys
660 665 670
Lys Leu Ile Asn Gly Ile Tyr Asp Lys Glu Ser Gly Lys Thr Ile Leu
675 680 685
Asp Tyr Leu Ile Lys Asp Asp Gly Val Ser Lys His Tyr Asn Arg Asn
690 695 700
Phe Met Gln Leu Ile Asn Asp Ser Gln Leu Ser Phe Lys Asn Ala Ile
705 710 715 720
Gln Lys Ala Gln Ser Ser Glu His Glu Glu Thr Leu Ser Glu Thr Val
725 730 735
Asn Glu Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly Ile Tyr Gln Ser
740 745 750
Leu Lys Ile Val Asp Glu Leu Val Ala Ile Met Gly Tyr Ala Pro Lys
755 760 765
Arg Ile Val Val Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln Thr Thr Ser Thr Gly
770 775 780
Lys Arg Arg Ser Ile Gln Arg Leu Lys Ile Val Glu Lys Ala Met Ala
785 790 795 800
Glu Ile Gly Ser Asn Leu Leu Lys Glu Gln Pro Thr Thr Asn Glu Gln
805 810 815
Leu Arg Asp Thr Arg Leu Phe Leu Tyr Tyr Met Gln Asn Gly Lys Asp
820 825 830
Met Tyr Thr Gly Asp Glu Leu Ser Leu His Arg Leu Ser Ala Tyr Asp
835 840 845
Ile Asp His Ile Ile Pro Gln Ser Phe Met Lys Asp Asp Ser Leu Asp
850 855 860
Asn Leu Val Leu Val Gly Ser Thr Glu Asn Arg Gly Lys Ser Asp Asp
865 870 875 880
Val Pro Ser Lys Glu Val Val Lys Lys Met Lys Ala Tyr Trp Glu Lys
885 890 895
Leu Tyr Ala Ala Gly Leu Ile Ser Gln Arg Lys Phe Gln Arg Leu Thr
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Lys Gly Glu Gln Gly Gly Leu Thr Leu Glu Asp Lys Ala His Phe Ile
915 920 925
Gln Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys Asn Val Ala Gly
930 935 940
Ile Leu Asp Gln Arg Tyr Asn Ala Lys Ser Lys Glu Lys Lys Val Gln
945 950 955 960
Ile Ile Thr Leu Lys Ala Ser Leu Thr Ser Gln Phe Arg Ser Ile Phe
965 970 975
Gly Leu Tyr Lys Val Arg Glu Val Asn Asp Tyr His His Gly Gln Asp
980 985 990
Ala Tyr Leu Asn Cys Val Val Ala Thr Thr Leu Leu Lys Val Tyr Pro
995 1000 1005
Asn Leu Ala Pro Glu Phe Val Tyr Gly Glu Tyr Pro Lys Phe Gln
1010 1015 1020
Ala Phe Lys Glu Asn Lys Ala Thr Ala Lys Ala Ile Ile Tyr Thr
1025 1030 1035
Asn Leu Leu Arg Phe Phe Thr Glu Asp Glu Pro Arg Phe Thr Lys
1040 1045 1050
Asp Gly Glu Ile Leu Trp Ser Asn Ser Tyr Leu Lys Thr Ile Lys
1055 1060 1065
Lys Glu Leu Asn Tyr His Gln Met Asn Ile Val Lys Lys Val Glu
1070 1075 1080
Val Gln Lys Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Lys Pro Lys Gly
1085 1090 1095
Pro Ser Asn Lys Leu Ile Pro Val Lys Asn Gly Leu Asp Pro Gln
1100 1105 1110
Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Val Val Ala Tyr Thr Val Leu
1115 1120 1125
Phe Thr His Glu Lys Gly Lys Lys Pro Leu Ile Lys Gln Glu Ile
1130 1135 1140
Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Lys Thr Arg Phe Glu Gln Asn Pro
1145 1150 1155
Ile Leu Phe Leu Glu Glu Lys Gly Phe Leu Arg Pro Arg Val Leu
1160 1165 1170
Met Lys Leu Pro Lys Tyr Thr Leu Tyr Glu Phe Pro Glu Gly Arg
1175 1180 1185
Arg Arg Leu Leu Ala Ser Ala Lys Glu Ala Gln Lys Gly Asn Gln
1190 1195 1200
Met Val Leu Pro Glu His Leu Leu Thr Leu Leu Tyr His Ala Lys
1205 1210 1215
Gln Cys Leu Leu Pro Asn Gln Ser Glu Ser Leu Ala Tyr Val Glu
1220 1225 1230
Gln His Gln Pro Glu Phe Gln Glu Ile Leu Glu Arg Val Val Asp
1235 1240 1245
Phe Ala Glu Val His Thr Leu Ala Lys Ser Lys Val Gln Gln Ile
1250 1255 1260
Val Lys Leu Phe Glu Ala Asn Gln Thr Ala Asp Val Lys Glu Ile
1265 1270 1275
Ala Ala Ser Phe Ile Gln Leu Met Gln Phe Asn Ala Met Gly Ala
1280 1285 1290
Pro Ser Thr Phe Lys Phe Phe Gln Lys Asp Ile Glu Arg Ala Arg
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<223> SPACER
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<212> DNA
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<220>
<223> PAM
<400> 139
cagcacgact 10
<210> 140
<211> 3633
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HUMANIZED MAD 2007 V1
<400> 140
atggaaaatt ataggcaaaa gcacagattc gtcctcgcca cagatctggg aatcggaagc 60
aacggctggg ctatcatcga cctcgacgcc catagagtcg aggatctcgg cgtgcagatc 120
tttgagtccg gagaggaggg agccaagaaa gccagcgcta gagccagcca gcaaagaagg 180
ctcaagagga gcgcccacag actgaataga aggaagaaac aaaggaagga agccctcatc 240
aaattcctcc aagagatcga gtttcccgat ctcgtcgaga ttctcaactc cttcaagaag 300
cagaaaaacc ctaacgacat tctgtctctg agagtcaagg gactcgacaa caagctgtcc 360
cctctggagc tgttcagcat tctgatctac atgagcaaca acagaggata caaagacttc 420
tacgacaatg acattaacga caataatacc gacaaagacg aaaaggagat ggaaaaggcc 480
aagtccacca ttgagaagct cttcgcttcc aatagctaca gaaccgtggg agagatgatt 540
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aacaaaaagg gataccagta tctgattcct agaaagctgc tggagaacga gatgtccctc 660
attctgcaca agcaagagga gttctacgat tgcctcagca tcgacaacat cacaattatt 720
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<210> 141
<211> 3633
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HUMANIZED MAD2007 V2
<400> 141
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Lys Lys Ala Ser Ala Arg Ala Ser Gln Gln Arg Arg Leu Lys Arg Ser
50 55 60
Ala His Arg Leu Asn Arg Arg Lys Lys Gln Arg Lys Glu Ala Leu Ile
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Lys Phe Leu Gln Glu Ile Glu Phe Pro Asp Leu Val Glu Ile Leu Asn
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Ser Phe Lys Lys Gln Lys Asn Pro Asn Asp Ile Leu Ser Leu Arg Val
100 105 110
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210 215 220
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Leu Asp Lys Ile Phe Phe Gln Arg Asn Phe Glu Asp Gly Pro Gly Pro
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Lys Asn Lys Arg Asp Asp Tyr Lys Asn Asn Ser Lys Gly Asn Gln Phe
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Ile Asn Lys Tyr Asn Ile Val Arg Ile Asn Ile Glu Val Ala Ser Asp
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Val Asn Lys Ser Phe Glu Gln Arg Asp Asn Asp Lys Lys Tyr Gln Asn
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805 810 815
Ile Lys Ile Asp Arg Asn Leu Ser Lys Glu Gln Lys Gln Arg Asp Ile
820 825 830
Asp Thr Val Ile Lys Asn Thr Val Lys Ser Met Ser Lys Tyr His Gly
835 840 845
Phe Ser Glu Asp Tyr Ile Arg Ser Leu Met Ser Lys Asn His Ile Pro
850 855 860
Ala Ile Cys Lys Asn Leu Ser Asp Glu Val Gln Ile Arg Ile Pro Leu
865 870 875 880
Lys Phe Asn Thr Asp Tyr Asp Asn Leu Gly Tyr Arg Phe Thr Asp Asp
885 890 895
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Ala Leu Lys Glu Lys Glu Ile Leu Glu Lys Glu Leu Thr Glu Arg Phe
915 920 925
Asn Asn Glu Ala Gln Ile Leu Asn Ala Asn Ile Ile Leu Thr Tyr Thr
930 935 940
Gly Phe Glu Ser Asn Asn Glu Leu Ile Asp Ile Lys Lys Ala Lys Lys
945 950 955 960
Val Ile Asp Thr Leu Lys Pro Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Lys Ala Ile
965 970 975
Asp Ile Leu Thr Gln Glu Glu Tyr Thr Lys Arg Cys Leu Glu Tyr Tyr
980 985 990
Asn Asp Ser Glu Phe Ala Glu Gln Leu Lys Ile Pro Tyr Val Asn Phe
995 1000 1005
Lys Ile Asn Lys Arg Phe Arg Gly Lys Ile Gln Gly Ser Glu Asn
1010 1015 1020
Ala Val Ser Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Thr Lys Leu Asn Ser
1025 1030 1035
Phe Glu Glu Phe Glu Ser Tyr Leu Lys Ser Glu Asp Gly Ile Lys
1040 1045 1050
Ser Pro Tyr Tyr Ile Lys Tyr Thr Lys Asn Thr Leu Gly Lys Glu
1055 1060 1065
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Tyr Thr Asp Ser Gln Asn Lys Pro Gln Leu Arg Gly Ile Arg Tyr
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1100 1105 1110
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1160 1165 1170
Asp Val Val Ile Thr Ser Ser Ile Phe Ile Lys Lys Tyr Ser Leu
1175 1180 1185
Asp Val Phe Gly His Ile Asn Gly Glu Ile Lys Cys Gly Asp Gln
1190 1195 1200
Ser Leu Phe Thr Ile Lys Lys Arg
1205 1210
<210> 144
<211> 1211
<212> PRT
<213> Sharpea azabuensis
<400> 144
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1 5 10 15
Gly Ile Gly Ser Asn Gly Trp Ala Ile Ile Asp Leu Asp Ala His Arg
20 25 30
Val Glu Asp Leu Gly Val Gln Ile Phe Glu Ser Gly Glu Glu Gly Ala
35 40 45
Lys Lys Ala Ser Ala Arg Ala Ser Gln Gln Arg Arg Leu Lys Arg Ser
50 55 60
Ala His Arg Leu Asn Arg Arg Lys Lys Gln Arg Lys Glu Ala Leu Ile
65 70 75 80
Lys Phe Leu Gln Glu Ile Glu Phe Pro Asp Leu Val Glu Ile Leu Asn
85 90 95
Ser Phe Lys Lys Gln Lys Asn Pro Asn Asp Ile Leu Ser Leu Arg Val
100 105 110
Lys Gly Leu Asp Asn Lys Leu Ser Pro Leu Glu Leu Phe Ser Val Leu
115 120 125
Ile Tyr Met Ser Asn Asn Arg Gly Tyr Lys Asp Phe Tyr Asp Asn Asp
130 135 140
Ile Asn Glu Asp Lys Lys Asp Ser Asp Glu Lys Glu Met Gln Lys Ala
145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
Ser Lys Lys Val Ile Lys Tyr His Asn Lys Lys Gly Tyr Gln Tyr Leu
195 200 205
Ile Pro Arg Lys Leu Leu Glu Asn Glu Met Ser Leu Ile Leu His Lys
210 215 220
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225 230 235 240
Leu Asp Lys Ile Phe Phe Gln Arg Asn Phe Glu Asp Gly Pro Gly Pro
245 250 255
Lys Asn Lys Arg Asp Asp Tyr Lys Asn Asn Ser Lys Gly Asn Gln Phe
260 265 270
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275 280 285
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305 310 315 320
Met Ser Phe Ser Lys Ser Leu Leu His Asp Leu Met Leu Tyr Phe Phe
325 330 335
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355 360 365
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370 375 380
Glu Met Ile Ala Ser Phe Arg Glu Glu Ile Glu Thr Ser Ser Tyr Arg
385 390 395 400
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420 425 430
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485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
Ile Asn Lys Tyr Asn Ile Val Arg Ile Asn Ile Glu Val Ala Ser Asp
530 535 540
Val Asn Lys Ser Phe Glu Gln Arg Asp Asn Asp Lys Lys Tyr Gln Asn
545 550 555 560
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565 570 575
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580 585 590
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Asp Val Val Ile Thr Ser Ser Ile Phe Ile Lys Lys Tyr Ser Leu
1175 1180 1185
Asp Val Phe Gly His Ile Asn Gly Glu Ile Lys Cys Gly Asp Gln
1190 1195 1200
Ser Leu Phe Thr Ile Lys Lys Arg
1205 1210
Claims (6)
- 핵산 유도 뉴클레아제 편집을 수행하도록 구성된 뉴클레아제 시스템으로서, 상기 뉴클레아제 시스템이 SEQ ID No. 7(MAD2007 뉴클레아제), SEQ ID No. 26(gRNA 반복 서열) 및 SEQ ID No. 27(gRNA tracr 서열)을 포함하는 뉴클레아제 시스템; SEQ ID No. 7(MAD2007 뉴클레아제), SEQ ID No. 28(gRNA 반복 서열) 및 SEQ ID No. 29(gRNA tracr 서열)를 포함하는 뉴클레아제 시스템; 및 SEQ ID No. 7(MAD2007 뉴클레아제), SEQ ID No. 30(gRNA 반복 서열) 및 SEQ ID No. 31(gRNA tracr 서열)을 포함하는 뉴클레아제 시스템으로부터 선택되는, 뉴클레아제 시스템.
- 제1항에 있어서, SEQ ID No. 7(MAD2007 뉴클레아제), SEQ ID No. 26(gRNA 반복 서열) 및 SEQ ID No. 27(gRNA tracr 서열)을 포함하는 뉴클레아제 시스템.
- 제1항에 있어서, SEQ ID No. 7(MAD2007 뉴클레아제), SEQ ID No. 28(gRNA 반복 서열) 및 SEQ ID No. 29(gRNA tracr 서열)를 포함하는 뉴클레아제 시스템.
- 제1항에 있어서, SEQ ID No. 7(MAD2007 뉴클레아제), SEQ ID No. 30(gRNA 반복 서열) 및 SEQ ID No. 31(gRNA tracr 서열)을 포함하는 뉴클레아제 시스템.
- SEQ ID No. 17 및 18로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 닉카제.
- SEQ ID No. 19로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 죽은 뉴클레아제.
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